TW201736596A - 在微流裝置中ｔ淋巴球之選擇及選殖 - Google Patents

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Abstract

本發明提供在微流裝置中擴增T淋巴球之方法。該等方法包括將一或更多個T淋巴球引入至微流裝置內；使該等一或更多個T淋巴球與活化劑接觸；及使培養基灌注通過該微流裝置，歷時一段足以讓該等一或更多個T淋巴球經歷至少一輪有絲分裂細胞分裂之時間。該擴增可為非特異性或抗原特異性。本發明亦提供根據本發明揭示方法所產生之T淋巴球，及治療個體之癌症之方法。治療癌症之方法包括從獲自該個體之組織樣品中分離出T淋巴球；在微流裝置中擴增該等經分離之T淋巴球；自該微流裝置輸出該等經擴增之T淋巴球；及將該等經擴增之T淋巴球再引入至該個體內。

Description

在微流裝置中T淋巴球之選擇及選殖
本發明大體上係關於用於在微流環境中選擇及擴增T淋巴球之方法、系統及裝置。
免疫療法係使用病患之免疫系統幫助對抗疾病之新興領域。已評估各種免疫療法策略以抵抗癌症，該等策略包括刺激該病患之自身免疫系統以攻擊癌細胞及投與來自外源之免疫系統組分。例如，經設計以活體內攻擊癌細胞之單株抗體已經單獨投與或以經基因改造之構築體投與。另外，已研究各種T細胞療法。自體T細胞療法涉及自個體獲得T細胞，活體外擴增該等T細胞，及將該等經擴增之T細胞再引入至該個體內。嵌合抗原受體T細胞(CAR-T)療法涉及基因改造T細胞以於其等表面上表現含有嵌合抗體之融合蛋白，其靶向所述癌症並讓該等T細胞殺死該等癌細胞。兩種類型的T細胞療法均提供優勢。然而，該等療法仍需進一步改進。 自體T細胞療法及CAR-T療法兩者之關鍵問題中之一係缺乏用於以選擇性擴增具有最高腫瘤殺死潛能之T細胞之方式活體外擴增T細胞之方法。本發明提供用於活體外選擇性擴增T細胞之解決方案。本發明亦提供使用根據本文揭示之方法活體外擴增之T細胞治療罹患癌症之個體之經改善方法。
本文揭示在微流裝置(或「晶片」)中擴增T淋巴球之方法。該微流裝置可包括微流通道及流體連接至該通道之封存圈(sequestration pen)，及該封存圈經組態以支持T淋巴球之培養及擴增。在某些實施例中，該微流裝置可為奈流裝置。該封存圈可具有(例如)約0.5x106 至約5.0x106 立方微米，或約0.5x106 至約2.0x106 立方微米之體積。此外，該微流裝置可具有多於一個微流通道及複數個流體連接至各微流通道之封存圈，及該等複數個封存圈中之各封存圈經組態以支持T淋巴球之培養及擴增。該(等)封存圈之一或更多個表面可經調整。 擴增T淋巴球之方法可包括：將一或更多個T淋巴球引入至微流裝置中之封存圈內；及使該等一或更多個T淋巴球與活化劑接觸。在一些實施例中，20或更少、10或更少、6至10、5或更少、約5、約4、約3、約2或1個T淋巴球係經引入至該封存圈內。若該微流裝置包括複數個封存圈，則一或更多個T淋巴球(例如，20或更少、10或更少、6至10、5或更少、約5、約4、約3、約2或1個T淋巴球)可經引入至一或更多個封存圈中之各者內。擴增T淋巴球之方法可進一步包括使培養基灌注通過該微流裝置之微流通道。該灌注可為連續或間歇的且可持續一段足以使該等一或更多個T淋巴球引入至該封存圈(或該等封存圈)內以經歷至少一輪有絲分裂細胞分裂之時間。 在某些實施例中，該等一或更多個T淋巴球係來自分離自個體之外周血液之T淋巴球之群。在其他實施例中，該等一或更多個T淋巴球係來自分離自個體之實體腫瘤樣品之T淋巴球之群。該實體腫瘤樣品可為細針吸取物(FNA)或腫瘤活體組織切片(例如，核心活體組織切片)。該實體腫瘤可為乳癌、泌尿生殖系統癌症(例如，起源於以下之癌症：尿路，諸如起源於腎(例如，腎細胞癌)、輸尿管、膀胱或尿道；男性生殖道之癌症(例如，睾丸癌、前列腺癌或儲精囊、輸精管或陰莖之癌症)；或女性生殖道(例如，卵巢癌、子宮癌、子宮頸癌、陰道癌或輸卵管之癌症))之癌症；神經系統之癌症(例如，神經母細胞瘤、視網膜母細胞瘤)、腸癌(例如，結腸直腸癌)、肺癌、黑色素瘤或癌症之其他類型。在特定實施例中，該實體腫瘤可為髓樣乳癌、間皮瘤或黑色素瘤。 在一些實施例中，T淋巴球之群係針對CD3+ T淋巴球加以富集。在一些實施例中，T淋巴球之群係針對CD3+ CD4+ T淋巴球加以富集。在一些實施例中，T淋巴球之群係針對CD3+ CD8+ T淋巴球加以富集。在一些實施例中，T淋巴球之群係針對CD45RA+ T淋巴球加以富集。在一些實施例中，T淋巴球之群係針對CD45RO+ T淋巴球加以富集。在一些實施例中，T淋巴球之群係針對CCR7+ T淋巴球加以富集。在一些實施例中，T淋巴球之群係針對CD62L+ T淋巴球加以富集。在一些實施例中，T淋巴球之群係針對CD45RA+ /CD7+ /CD62L+ T淋巴球加以富集。在一些實施例中，T淋巴球之群係針對CD45RO+ /CD7+ /CD62L+ T淋巴球加以富集。在一些實施例中，T淋巴球之群係針對PD-1+ T淋巴球加以富集。在一些實施例中，T淋巴球之群係針對CD137+ T淋巴球加以富集。在一些實施例中，T淋巴球之群係針對PD-1+ /CD137+ T淋巴球加以富集。 在一些實施例中，T淋巴球之群係耗盡CD4+ T淋巴球。在一些實施例中，T淋巴球之群係耗盡CD8+ T淋巴球。在一些實施例中，T淋巴球之群係耗盡CD45RO+ T淋巴球。在一些實施例中，T淋巴球之群係耗盡CD45RA+ T淋巴球。在一些實施例中，T淋巴球之群係耗盡CCR7+ T淋巴球。在一些實施例中，T淋巴球之群係耗盡CD62L+ T淋巴球。在一些實施例中，T淋巴球之群係耗盡CD45RO+ /CD7+ /CD62L+ T淋巴球。在一些實施例中，T淋巴球之群係耗盡CD45RA+ /CD7+ /CD62L+ T淋巴球。在一些實施例中，T淋巴球之群係耗盡PD-1+ T淋巴球。在一些實施例中，T淋巴球之群係耗盡CD137+ T淋巴球。在一些實施例中，T淋巴球之群係耗盡PD-1+ /CD137+ T淋巴球。 在一些實施例中，T淋巴球之群中之主要細胞類型係天然T細胞(Tnaïve )、記憶T細胞(諸如中心記憶T細胞(TCM )或效應記憶T細胞(TEM ))或效應T細胞(TEFF )。 在一些實施例中，該方法包括預處理含有T淋巴球之樣品以富含天然T淋巴球、記憶T淋巴球(例如，TCM 細胞及/或TEM 細胞)、TEFF 淋巴球或其任何組合。該處理可包括自樣品中移除殘渣及/或非淋巴球細胞類型。或者或另外，該處理可包括耗盡樣品之天然T淋巴球、記憶T淋巴球(諸如TCM 及/或TEM 淋巴球)、TEFF 淋巴球或其組合。 樣品可來自個體(諸如罹患癌症(例如，本文描述或此項技術中已知的任何類型之癌症)之個體)。該樣品可為外周血液樣品或其衍生物(例如，具有PBMC之樣品)。或者，該樣品可為實體腫瘤活體組織切片或FNA。在一些實施例中，外周血液樣品係經處理以富集天然T淋巴球。在其他實施例中，腫瘤樣品係經處理以富集記憶T淋巴球(特定言之TCM 淋巴球)，然而可富集TEF 淋巴球。在又其他實施例中，腫瘤樣品係經處理以富集TEFF 淋巴球。為富集所需T淋巴球細胞類型，可採用特異性結合至一或更多種細胞表面抗原之結合劑(例如，抗體或類似物)。藉由結合劑結合之該等細胞表面抗原可為本文描述之細胞表面抗原中之任何一者，其等包括CD4、CD8、CD45RO、CD45RA、CCR7、CD62L、PD-1及CD137T或其組合。該處理可包括使該樣品與一或更多個經螢光標記之結合劑接觸及進行FACS以選擇經標記之細胞(例如，若基於一或更多種結合劑所特異性結合之細胞表面抗原富集)或移除經標記之細胞(例如，若基於一或更多種結合劑所特異性結合之細胞表面抗原耗盡)。或者或另外，該處理可包括使該樣品與連接至固體支撐物之一或更多種結合劑接觸，及移除結合至該固體支撐物之細胞(例如，若基於一或更多種結合劑所特異性結合之細胞表面抗原耗盡)或移除未結合至該固體支撐物之細胞(例如，若基於一或更多個結合劑所特異性結合之細胞表面抗原富集)。該固體支撐物可為(例如)一或更多個珠(例如，其等可為磁珠之群)。若使用磁珠，則可將磁力施加至樣品使得該等磁珠形成團塊(pellet)，從而使上清液與該團塊分開。 在某些實施例中，將一或更多個T淋巴球引入至封存圈內包括使含有該等一或更多個T淋巴球之流體流動進入微流裝置之微流通道內。將該等一或更多個T淋巴球引入至該封存圈內可進一步包括使用介電泳(DEP)以選擇及移動至少一個位於微流通道中之T淋巴球至該封存圈內。該至少一個T淋巴球可基於標記物(諸如CD3、CD4、CD8、CD45RO、CD45RA、CCR7、CD62L、PD-1、CD137T或其任何組合)之細胞表面表現而經選擇。或者，將一或更多個T淋巴球引入至封存圈內可進一步包括傾斜該微流晶片使得重力將至少一個T淋巴球拉入該封存圈內。在其他替代實施例中，將一或更多個T淋巴球引入至封存圈內可進一步包括離心該微流裝置使得離心力將至少一個T淋巴球拉入該封存圈內。 在一些實施例中，該至少一個經選擇之T淋巴球係至少部分因為其細胞表面係CD4+ 或CD3+ CD4+ 而經選擇。在一些實施例中，該至少一個經選擇之T淋巴球係至少部分因為其細胞表面係CD8+ 或CD3+ CD8+ 而經選擇。在一些實施例中，該至少一個經選擇之T淋巴球係至少部分因為其細胞表面係CD45RA+ (例如，CD45RA+ CD45RO- )而經選擇。在一些實施例中，該至少一個經選擇之T淋巴球係至少部分因為其細胞表面係CD45RA- (例如，CD45RA- CD45RO+ )而經選擇。在一些實施例中，該至少一個經選擇之T淋巴球係至少部分因為其細胞表面係CCR7+ 及/或CD62L+ 而經選擇。在一些實施例中，該至少一個經選擇之T淋巴球係至少部分因為其細胞表面係CCR7- 及/或CD62L- 而經選擇。在一些實施例中，該至少一個經選擇之T淋巴球係至少部分因為其細胞表面係CD45RA+ 、CD45RO- 、CD45RA+ CCR7+ 、CD45RO- CCR7+ 、CD45RA+ CD45RO- CCR7+ 、CD45RA+ CD62L+ 、CD45RO- CD62L+ 、CD45RA+ CD45RO- CD62L+ 、CD45RA+ CCR7+ CD62L+ 、CD45RO- CCR7+ CD62L+ 或CD45RA+ CD45RO- CCR7+ CD62L+ 而經選擇。在一些實施例中，該至少一個經選擇之T淋巴球係至少部分因為其細胞表面係CD45RO+ 、CD45RA- 、CD45RO+ CCR7+ 、CD45RA- CCR7+ 、CD45RO+ CD45RA- CCR7+ 、CD45RO+ CD62L+ 、CD45RA- CD62L+ 、CD45RO+ CD45RA- CD62L+ 、CD45RO+ CCR7+ CD62L+ 、CD45RA- CCR7+ CD62L+ 或CD45RO+ CD45RA- CCR7+ CD62L+ 而經選擇。在一些實施例中，該至少一個經選擇之T淋巴球係至少部分因為其細胞表面係CD45RO+ CCR7- 、CD45RA- CCR7- 、CD45RO+ CD45RA- CCR7- 、CD45RO+ CD62L- 、CD45RA- CD62L- 、CD45RO+ CD45RA- CD62L- 、CD45RO+ CCR7- CD62L- 、CD45RA- CCR7- CD62L- 、CD45RO+ CD45RA- CCR7- CD62L- 而經選擇。在一些實施例中，該至少一個經選擇之T淋巴球係至少部分因為其細胞表面係CD69- 而經選擇。在一些實施例中，該至少一個經選擇之T淋巴球係至少部分因為其細胞表面係PD-1+ 及/或CD137+ 而經選擇。在一些實施例中，該至少一個經選擇之T淋巴球係至少部分因為其細胞表面係PD-1- 及/或CD137- 而經選擇。 在一些實施例中，該選擇步驟包括使至少一個T淋巴球與一或更多種結合劑(例如，抗體、經肽結合之MHC複合體之四聚物或類似物)接觸及基於一或更多種結合劑與該至少一個T淋巴球之間之結合之存在(或缺乏)將該至少一個T淋巴球移動至封存圈內。在一些實施例中，該等一或更多種結合劑中之各者包含標記(諸如螢光團)。 在某些實施例中，將一或更多個T淋巴球引入至封存圈內進一步包括將活化劑引入至該封存圈內。該等一或更多個T淋巴球可在引入至封存圈內前與該活化劑接觸。例如，該等T淋巴球可在引入至該微流裝置內前用該活化劑培養至少一小時(例如，至少2、3、4、5或更多小時)之時間。或者，該等一或更多個T淋巴球可在引入至封存圈內後與該活化劑接觸。 在某些實施例中，該活化劑可包括CD3及CD28促效劑。該CD3及/或CD28促效劑可為抗體。在一些實施例中，該抗-CD3促效劑(例如，抗體)係結合至固體支撐物。在一些實施例中，該抗-CD28促效劑(例如，抗體)係結合至固體支撐物。在一些實施例中，該抗-CD28促效劑(例如，抗體)係溶於水溶液中之溶質。因此，例如，該活化劑可包含結合至抗-CD3及抗-CD28促效劑抗體之一或更多個珠。或者，該活化劑可包含結合至抗-CD3促效劑抗體之一或更多個珠及可溶性抗-CD28促效劑抗體之溶液。在又其他替代實施例中，該等CD3及/或CD28促效劑可連接(共價或非共價)至封存圈之一或更多個表面。該封存圈之該(等)表面可以促進該等CD3及/或CD28促效劑鍵聯至該(等)表面之方式進行調整。 在某些實施例中，該活化劑可包含樹突狀細胞(DC)。該樹突狀細胞可在與一或更多個T淋巴球接觸前經受關注之抗原(例如，癌症相關抗原、傳染性疾病相關抗原或與一些其他類型之病症相關聯之抗原)脈衝。該癌症相關抗原(其可為熟知的抗原或新抗原)可透過獲自腫瘤活體組織切片之腫瘤細胞之基因體分析進行識別。 在某些實施例中，該活化劑可包含肽抗原與MHC分子所形成之複合體。此等複合體可(如在肽-MHC四聚物複合體之情況下)經連接。該等肽-MHC複合體可結合至固體支撐物。在一些實施例中，該固體支撐物可為一或更多個珠。在其他實施例中，該固體支撐物可為封存圈之一或更多個表面。因此，封存圈之該(等)表面可以促進該等肽-MHC複合體鍵聯至該(等)表面之方式進行調整。 在某些實施例中，培養基係灌注通過微流裝置之微流通道至少24小時(例如，至少48、72、96、110或更多小時或於其間之任何數量)之時間。在某些實施例中，該培養基包括哺乳動物血清，其可為人類血清(例如，人類AB血清)，視需要與牛血清(例如，胎牛血清或小牛血清)組合。在某些實施例中，該培養基進一步包含介白素2 (IL2)、介白素7 (IL7)、介白素21 (IL21)、介白素15 (IL15)或其任何組合。在一些實施例中，該培養基包含約50 U/ml IL2 (例如，約1 U/ml至約10 U/ml IL2)。在一些實施例中，該培養基包含約5 ng/ml IL7 (例如，約1 ng/ml至約10 ng/ml IL7)。在一些實施例中，該培養基包含約30 ng/ml IL21 (例如，約10 ng/ml至約50 ng/ml IL21)。 在一些實施例中，該方法包括分析一或更多個T淋巴球之圈內增殖速率。在一些實施例中，該方法包括分析該封存圈中該等一或更多個T淋巴球之一或更多種細胞介素(例如，INFγ、TNFα、IL2或其組合)之表現。在一些實施例中，該方法包括分析該封存圈中該等一或更多個T淋巴球之一或更多個調節T細胞標記物(諸如CTLA4)之表現。 在一些實施例中，T淋巴球係(例如，擴增後)自該微流裝置輸出。輸出可為選擇性的，例如，至少部分基於增殖速率、細胞介素表現、調節T細胞標記物之表現或其組合。在一些實施例中，具有經輸出之T淋巴球之樣品係經基因體圖譜分析。 在某些實施例中，揭示治療個體之癌症之方法。該個體可為哺乳動物(諸如人類)。該癌症可為乳癌、泌尿生殖系統癌症(例如，起源於以下之癌症：尿路(諸如起源於腎(例如，腎細胞癌))、輸尿管、膀胱或尿道；男性生殖道之癌症(例如，睾丸癌、前列腺癌或儲精囊、輸精管或陰莖之癌症)；或女性生殖道之癌症(例如，卵巢癌、子宮癌、子宮頸癌、陰道癌或輸卵管之癌症))、神經系統之癌症(例如，神經母細胞瘤)、腸癌(例如，結腸直腸癌)、肺癌、黑色素瘤或其他類型之癌症。在特定實施例中，該癌症可為髓樣乳癌、間皮瘤或黑色素瘤。 治療癌症之方法可包括：自獲得自個體之組織樣品中分離T淋巴球；根據本文揭示之方法中之任何一者在微流裝置中擴增經分離之T淋巴球；自該微流裝置輸出該等經擴增之T淋巴球；及將該等經擴增之T淋巴球再引入至該個體內。 在某些實施例中，該組織樣品係外周血液之樣品。在某些實施例中，該組織樣品係來自實體腫瘤。該組織樣品(例如)可為來自該實體腫瘤之FNA或活體組織切片(例如，核心活體組織切片)。該實體腫瘤樣品可來自上文討論之癌症中之任何一者。 在某些實施例中，自組織樣品分離T淋巴球包括於該組織樣品中進行針對CD3+ 細胞之選擇。在一些實施例中，該選擇可基於標記物CD3、CD4、CD8、CD45RA、CD45RO、CCR7、CD62L、PD-1、PD-L1及CD137中之一或更多者(如上文及本文別處討論)。該選擇可包括使用珠(諸如磁珠)，該等珠具有結合至其等之CD3-結合劑 (或其他標記物-結合劑)。在某些實施例中，自該組織樣品分離T淋巴球進一步包括在於腫瘤樣品中進行針對CD3+ (或其他標記物-陽性)細胞之選擇前分離該組織樣品。 在某些實施例中，將經分離之T淋巴球引入至微流裝置內。該微流裝置可為奈流裝置。在某些實施例中，擴增該等經分離之T淋巴球包括將一或更多個經分離之T淋巴球引入至該微流(或奈流)裝置之封存圈內。該封存圈可(例如)具有約0.5x106 至約5x106 立方微米，或約0.5x106 至約2.0x106 立方微米之體積。 在某些實施例中，擴增經分離之T淋巴球包括使該等經分離之T淋巴球與活化劑接觸。在一些實施例中，該活化劑包含CD3及/或CD28促效劑。該CD3及/或CD28促效劑可為抗體。在一些實施例中，該抗-CD3促效劑係結合至固體支撐物。在一些實施例中，該抗-CD28促效劑係結合至固體支撐物。因此，該活化劑可包含(例如)一或更多個固體支撐物(例如，一或更多個珠)，其等中之各者可結合至抗-CD3及/或抗-CD28促效劑抗體。在一些實施例中，該抗-CD28促效劑(例如，抗體)係以溶於水溶液中之溶質之形式提供。在其他實施例中，該活化劑包含樹突狀細胞(DC)。該等DC可自治療中之個體獲得及/或可在與該等經分離之T淋巴球接觸前經腫瘤抗原脈衝。該腫瘤抗原可透過來自獲自該個體之癌細胞之核酸分子(例如，gDNA、mRNA等)之定序進行識別。在又其他實施例中，該活化劑可為肽-MHC複合體或複合體(諸如肽-MHC四聚物複合體)之團簇，其等可連接至固體支撐物，諸如該封存圈之一或更多個珠或一或更多個表面(例如，經調整之表面)。 在某些實施例中，T淋巴球係在引入至微流裝置內前經活化劑培養至少一小時(例如，至少2、3、4、5或更多小時)之時間。在某些實施例中，將該等經分離之T淋巴球引入至該封存圈內進一步包括將該活化劑引入至該封存圈內。 在某些實施例中，經擴增以回應於與活化劑之接觸之經分離之T淋巴球顯示至少100倍(例如，至少200倍、至少500倍、至少1000倍等)擴增。在某些實施例中，該等經擴增之T淋巴球係在自微流裝置輸出後但在再引入至個體內前經進一步「晶片外(off chip)」擴增。 本文描述之方法中之任何一者可使用具有一或更多個內表面(例如，基板表面、蓋表面及/或環路材料之表面)之微流裝置進行，該等一或更多個內表面已經調整或塗佈以便於呈現有機及/或親水性分子層，其在該微流裝置與其中生長之T細胞之間提供主要界面。例如，該流動路徑及該(等)封存圈可經塗佈溶液處理，該塗佈溶液結合至一或更多個內表面並呈現有機及/或親水性分子層。因此，該塗佈溶液可包含結合至該等一或更多個內表面之塗佈劑(諸如血清、血清白蛋白(例如，BSA)、聚合物、清潔劑、酶或其任何組合)。 在某些實施例中，該微流裝置可包含包括塗佈材料之內基板表面(及/或內蓋表面及/或環路材料之內表面)。在一些實施例中，該塗佈材料包括具有連接基團及烷基部分之分子。該連接基團可共價結合至該內基板表面，且可(例如)為矽烷氧基連接基團。該烷基部分可為(例如)未經取代之烷基部分或經取代之烷基部分(諸如氟烷基部分或全氟烷基部分)。該烷基部分可包括直鏈碳，其包含至少10個碳原子(例如，至少12、14、16、18、20、22或更多個碳原子)。該塗佈材料之分子可形成共價結合至內基板表面(及/或內蓋表面及/或環路材料之內表面)之密集單層結構。 在一些實施例中，該塗佈材料包含具有連接基團及陽離子部分及/或陰離子部分之分子，其中該連接基團係共價結合至內基板表面(及/或內蓋表面及/或環路材料之內表面)。陽離子部分可包括四級銨基團。陰離子部分可包括膦酸、羧酸或磺酸。在一些相關實施例中，該塗佈材料可包含具有連接基團及兩性離子部分之分子，其中該連接基團係共價結合至內基板表面(及/或內蓋表面及/或環路材料之內表面)。兩性離子部分係選自羧基甜菜鹼、磺基甜菜鹼、胺磺酸及胺基酸。在一些實施例中，該等陽離子、陰離子或兩性離子部分可與阻斷劑離子鍵結合)。 在一些實施例中，該塗佈材料包含包含伸烷基醚部分、醣部分或胺基酸部分之聚合物。例如，該塗佈材料可包含聚葡萄糖或聚乙二醇(PEG)。或者或另外，該塗佈材料可包含蛋白質聚合物(例如，促進T細胞活化之蛋白質)。 本文亦提供根據本文揭示之方法產生之T淋巴球。本文亦提供包含一或更多個(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20)根據本文揭示之方法(例如，在微流裝置之一或更多個封存圈中)產生之T淋巴球之微流裝置。本文亦提供包含根據本文揭示之方法產生之T淋巴球及視需要醫藥上可接受之載劑之醫藥組合物。 額外之目標及優勢將部分闡述於以下說明中，及部分將自該說明中顯而易見或可藉由實務獲悉。該等目標及優勢將藉助於隨附申請專利範圍中特別指出之元件及組合實現及獲得。 將瞭解前述一般描述及下列詳細描述兩者均僅出於例示及說明之目的及非限制隨附申請專利範圍。 併入及構成本說明書之一部分之隨附圖式繪示一個(數個)實施例及連同該說明書有助於闡述本文描述之原理。
本申請案依35 U.S.C. § 119主張2016年3月17日申請之美國專利申請案第62/309,454號；2016年4月22日申請之美國專利申請案第62/326,667號；2016年10月24日申請之美國專利申請案第62/412,212號；及2017年3月13日申請之美國專利申請案第62/470,744號之權利，其等中之各者以全文引用之方式併入本文中。 本說明書描述本發明之例示性實施例及應用。然而，本發明不限於此等例示性實施例及應用或不限於其中本文操作或描述例示性實施例及應用之方式。此外，圖式可顯示簡化或局部視圖，及該等圖式中之元件尺寸可經放大或否則不成比例。另外，如本文使用之術語「上」、「結合至」、「連接至」、「偶合至」或類似單詞，一個元件(例如，材料、層、基板等)可位於另一元件「上」、可「結合至」另一元件、可「連接至」另一元件或可「偶合至」另一元件，無論該一元件是否係直接位於該另一元件上、直接結合至該另一元件、直接連接至該另一元件或直接偶合至該另一元件，或在該一元件與該另一元件之間是否存在一或更多個中間元件。同樣地，除非內文另有指示，否則(若提供)方位(例如，在上、在下、頂部、底部、側面、上、下、在下方、在上方、上部、下部、水平、垂直、「x」、「y」、「z」等)為相對的且藉助於實例單獨提供及為便於闡述及討論而非限制之方式。另外，文中參考元件列表(例如，元件a、b、c)處，此等參考係意欲包括所列元件本身中之任何一者；少於所列元件之所有之任何組合及/或所列元件之所有之組合。說明書中之段章節(Section division)僅為便於回顧且非限制討論之元件之任何組合。 在將微流特徵之尺寸描述為具有寬度或面積之情況下，該尺寸通常相對於x軸及/或y軸尺寸描述，x軸及/或y軸兩者均位於平行於該微流裝置之基板及/或蓋之平面內。微流特徵之高度可相對於z軸方向描述，z軸係垂直於平行於該微流裝置之基板及/或蓋之平面。在一些實例中，微流特徵(諸如通道或通路)之橫截面積可參考x軸/z軸、y軸/z軸或x軸/y軸區。 如本文使用，「大體上」意謂足以為預期目的起作用。術語「大體上」因此容許絕對或最佳狀態、尺寸、量測、結果或類似物(諸如一般技術者將預期但不明顯影響整體性能之類似物)之較小、不重要之改變。當針對參考數值或可表現為數值之參數或特性使用時，「大體上」意謂在百分之十以內。 術語「幾個(ones)」意謂多於一個。 如本文使用，術語「複數個」可為2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個。 如本文使用，術語「配置」包含「位於」於其意義內。 如本文使用，「微流裝置」或「微流設備」係包括一或更多個經組態以容納流體之離散微流環路之裝置，各微流環路由流體互連之環路元件(包括但不限於區、流動路徑、通道、室及/或圈)及至少一個經組態以容許該流體(及視需要，懸浮於該流體中之微小物件)流入及/或流出該微流裝置之出入口組成。通常，微流裝置之微流環路將包括流動路徑，其可包括微流通道及至少一個室，及將容納小於約1 mL，例如，小於約750、500、250、200、150、100、75、50、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3或2 µL之體積之流體。在某些實施例中，該微流環路容納約1至2、1至3、1至4、1至5、2至5、2至8、2至10、2至12、2至15、2至20、5至20、5至30、5至40、5至50、10至50、10至75、10至100、20至100、20至150、20至200、50至200、50至250或50至300 µL。該微流環路可經組態以具有與該微流裝置中之第一出入口(例如，入口)流體連接之第一端及與該微流裝置中之第二出入口(例如，出口)流體連接之第二端。 如本文使用，「奈流裝置」或「奈流設備」係具有微流環路之微流裝置之一種類型，該微流環路含有至少一個經組態以容納小於約1 µL，例如，小於約750、500、250、200、150、100、75、50、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1 nL或更少之體積之流體之環路元件。奈流裝置可包含複數個環路元件(例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、75、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、6000、7000、8000、9000、10,000或更多個)。在某些實施例中，該等至少一個環路元件中之一或更多者(例如，所有)係經組態以容納約100 pL至1 nL、100 pL至2 nL、100 pL至5 nL、250 pL至2 nL、250 pL至5 nL、250 pL至10 nL、500 pL至5 nL、500 pL至10 nL、500 pL至15 nL、750 pL至10 nL、750 pL至15 nL、750 pL至20 nL、1至10 nL、1至15 nL、1至20 nL、1至25 nL或1至50 nL之體積之流體。在其他實施例中，該等至少一個環路元件中之一或更多者(例如，所有)係經組態以容納約20 nL至200nL、100至200 nL、100至300 nL、100至400 nL、100至500 nL、200至300 nL、200至400 nL、200至500 nL、200至600 nL、200至700 nL、250至400 nL、250至500 nL、250至600 nL或250至750 nL之體積之流體。 如本文使用之「微流通道」或「流動通道」係指微流裝置之流動路徑，其具有比水平及垂直尺寸兩者顯著更長之長度。例如，該流動通道可為水平或垂直尺寸之長度之至少5倍，例如，該長度之至少10倍、該長度之至少25倍、該長度之至少100倍、該長度之至少200倍、該長度之至少500倍、該長度之至少1,000倍、該長度之至少5,000倍或更長。在一些實施例中，流動通道之長度係在約100,000微米至約500,000微米之範圍內，包括於其間之任何範圍。在一些實施例中，該水平尺寸係在約100微米至約1000微米(例如，約150至約500微米)之範圍內及垂直尺寸係在約25微米至約200微米之範圍內，例如，自約40至約150微米。應注意流動通道於微流裝置中可具有各種不同空間組態，及因此不限於最佳線性元件。例如，流動通道可為或包括一或更多個具有下列組態之區段：曲線、彎曲、螺旋、傾斜、下降、分叉(例如，多個不同流動路徑)及其任何組合。另外，流動通道沿其路徑可具有不同橫截面積，其等變寬及收縮以使所需流體於其中流動。該流動通道可包括閥，及該等閥可為具有微流領域中已知的任何類型。包括閥之微流通道之實例係揭示於美國專利案第6,408,878及9,227,200號，其等中之各者以全文引用之方式併入本文中。 如本文使用，術語「障礙」通常係指隆起物或足夠大以便於部分(但非完全)阻礙目標微小物件在微流裝置中之兩個不同區或環路元件之間運動之類似類型結構。該等兩個不同區/環路元件可為(例如)微流封存圈之連接區及分離區。 如本文使用，術語「收縮」通常係指微流裝置中之環路元件(或兩個環路元件間之界面)之寬度變窄。該收縮可(例如)位於本發明之微流封存圈之分離區與連接區間之界面處。 如本文使用，術語「透明」係指容許可見光穿過而當該光穿過時不大體上改變光之材料。 如本文使用，術語「微小物件」通常係指可根據本發明分離及/或操作之任何微觀物件。微小物件之非限制性實例包括：無生命微小物件，諸如微粒；微珠(例如，聚苯乙烯珠，Luminex™珠或類似物)；磁珠；微棒；微線；量子點及類似物；生物微小物件，諸如細胞；生物胞器；囊泡或複合體；合成囊泡；脂質體(例如，合成或衍生自膜製劑)；脂質奈米筏及類似物；或無生命微小物件及生物微小物件之組合(例如，結合至細胞之微珠、經脂質體塗佈之微珠、經脂質體塗佈之磁珠或類似物)。珠可包括經共價或非共價結合之部分/分子，諸如螢光標記、蛋白質、醣、抗原、小分子傳訊部分或可用於分析中之其他化學/生物物質。脂質奈米筏已描述(例如)於Ritchie等人，(2009) 「Reconstitution of Membrane Proteins in Phospholipid Bilayer Nanodiscs」，Methods Enzymol., 464:211- 231中。 如本文使用，術語「細胞」係可與術語「生物細胞」交換使用。生物細胞之非限制性實例包括真核細胞、植物細胞、動物細胞(諸如哺乳動物細胞、爬蟲動物細胞、鳥類細胞、魚類細胞或類似物)、原核細胞、細菌細胞、真菌細胞、原生動物細胞或類似物、分離自組織(諸如肌肉、軟骨、脂肪、皮膚、肝、肺、神經組織及類似物)之細胞、免疫細胞(諸如T細胞、B細胞、自然殺手細胞、巨噬細胞及類似物)、胚胎(例如，受精卵)、卵母細胞、卵細胞、精子細胞、融合瘤、經培養之細胞、來自細胞系之細胞、癌細胞、受感染之細胞、經轉染及/或轉形之細胞、報導細胞及類似物。哺乳動物細胞可(例如)來自人類、小鼠、大鼠、馬、山羊、綿羊、奶牛、靈長類動物或類似物。 若群落中可複製活細胞中之所有均係衍生自單一親代細胞之子細胞，則生物細胞之群落係「純系」的。在某些實施例中，純系群落中之所有子細胞係自單一親代細胞衍生不超過10次分裂。在其他實施例中，純系群落中之所有子細胞係自單一親代細胞衍生不超過14次分裂。在其他實施例中，純系群落中之所有子細胞係自單一親代細胞衍生不超過17次分裂。在其他實施例中，純系群落中之所有子細胞係自單一親代細胞衍生不超過20次分裂。術語「純系細胞」係指相同純系群落之細胞。 如本文使用，生物細胞之「群落」係指2或更多個細胞(例如，約2至約20、約4至約40、約6至約60、約8至約80、約10至約100、約20至約200、約40至約400、約60至約600、約80至約800、約100至約1000或大於1000個細胞)。 如本文使用，術語「維持細胞」係指提供包含流體及氣體組分兩者及視需要提供一表面(其提供保持細胞存活及/或擴增所需之條件)之環境。 如本文使用，術語「擴增」在涉及細胞時係指細胞數量之增加。 流體介質之「組分」係存在於該介質中之任何化學或生化分子，其包括溶劑分子、離子、小分子、抗生素、核苷酸及核苷、核酸、胺基酸、肽、蛋白質、糖、醣、脂質、脂肪酸、膽固醇、代謝物或類似物。 如本文使用，「捕獲部分」係為提供針對微小物件之識別位點之化學或生物物質、官能或模體(motif)。所選類別之微小物件可識別原位產生之捕獲部分且可結合該原位產生之捕獲部分或具有針對該原位產生之捕獲部分之親和力。非限制性實例包括抗原、抗體及細胞表面結合模體。 如本文使用，「可流動聚合物」係可溶性或可分散於流體介質(例如，預聚合物溶液)內之聚合物單體或巨分子單體。該可流動聚合物可輸入於微流流動路徑內，在該微流流動路徑中，該可流動聚合物可與其中之流體介質之其他組分一起流動。 如本文使用，「光引發聚合物」係指一經曝露於光即可共價交聯，形成特異性共價鍵，改變剛化化學模體周圍之區域化學或形成引起物理狀態改變之離子對及藉此形成聚合物網路之聚合物(或可用以產生該聚合物之單體分子)。在一些實例中，光引發聚合物可包括結合至一或更多個可共價交聯，形成特異性共價鍵，改變剛化化學模體周圍之區域化學或形成引起物理狀態改變之離子對之化學部分之聚合物嵌段。在一些實例中，光引發聚合物可能需要可光活化自由基引發劑以引發聚合物網路之形成(例如，經由該聚合物之聚合作用)。 如本文使用，「抗體」係指免疫球蛋白(Ig)且包括多株抗體及單株抗體兩者；靈長類化(例如，人類化)；鼠科；小鼠-人類；小鼠-靈長類動物；及嵌合抗體；及可為完整分子、其片段(諸如scFv、Fv、Fd、Fab、Fab'及F(ab)'2片段)或完整分子及/或片段之多聚物或聚集物；且可天然生成或可(例如)藉由免疫作用、合成或基因改造產生。如本文使用之「抗體片段」係指衍生自或涉及抗體之片段，其等結合抗原及在一些實施例中可經衍生化以顯示(例如)藉由併入半乳糖殘基促進廓清及攝取之結構特徵。此包括(例如)F(ab)、F(ab)'2、scFv、輕鏈可變區(VL)、重鏈可變區(VH)及其組合。 如本文涉及流體介質使用之「擴散」及「擴散作用」係指流體介質之組分沿濃度梯度向下之熱力學運動。 片語「介質之流動」意謂流體介質主要因除擴散作用外之任何機制引起之整體運動。例如，介質之流動可涉及該流體介質因點間之壓力差自一點運動至另一點。此流動可包括液體或其任何組合之連續、脈衝、週期性、無規則、間歇性或往復流動。當一種流體介質流入另一種流體介質內時，可導致該介質之湍流及混合。 片語「大體上無流動」係指流體介質經時平均之流動速率係小於材料(例如，受關注之分析物)之組分擴散至該流體介質內或於該流體介質內擴散之速率。此材料之組分之擴散速率可取決於(例如)溫度、該等組分之尺寸及該等組分與該流體介質之間之相互作用之強度。 如本文涉及微流裝置內之不同區使用，片語「流體連接」意謂當該等不同區係大體上經流體(諸如流體介質)填充時，該等區之各者中之流體係連接以便於形成單一流體。此不意謂該等不同區中之流體(或流體介質)在組成上必定相同。而是，微流裝置之不同流體連接區中之流體可具有處於變化中之不同組成(例如，不同濃度之溶質，諸如蛋白質、醣、離子或其他分子)，因溶質沿其等各自濃度梯度向下運動及/或流體流動通過該微流裝置。 如本文使用，「流動路徑」或「流動區」係指一或更多個流體連接之環路元件(例如，通道、區、室及類似物)，其等界定並及經受介質之流動軌跡。流動路徑因此係微流裝置之掃及區之實例。其他環路元件(例如，未掃及區)可與包含流動路徑之環路元件流體連接而不經受介質在流動路徑中之流動。 如本文使用，「分離微小物件」將微小物件限制於微流裝置內指定區域。該微小物件可能仍可於原位產生之捕獲結構內運動。 微流(或奈流)裝置可包含「掃及」區及「未掃及」區。如本文使用，「掃及」區係由微流環路之一或更多個流體互連之環路元件組成，各環路元件在流體流動通過該微流環路時經驗介質流動。掃及區之環路元件可包括(例如)區、通道及室之所有或部分。如本文使用，「未掃及」區係由微流環路之一或更多個流體互連之環路元件組成，各環路元件在流體流動通過該微流環路時大體上不經驗流體通量。未掃及區可以流體連接至掃及區，但是該等流體連接經結構化以可擴散但在掃及區與未掃及區之間大體上無介質流動。該微流裝置可因此經結構化以大體上分離未掃及區與掃及區中之介質流，同時使得在該掃及區與該未掃及區之間大體上僅擴散性流體連通。例如，微流裝置之流動通道係掃及區之實例而微流裝置之分離區(下文中進一步詳細描述)係未掃及區之實例。 如本文使用，「富集」意謂在組合物或群體中相對於其他組分(諸如諸如其他細胞類型)，增加組分(諸如受關注之細胞類型)之濃度。該富集可為減少該組合物或群體中之其他組分(例如，其他細胞類型)之濃度之結果。例如，如本文使用，針對樣品中之T淋巴球之特定子群「富集」意謂相對於該樣品中之細胞總量增加該子群之比例。 如本文使用，「耗盡」意謂在組合物或群中相對於其他組分(諸如一或更多個所需細胞類型)，減小組分(諸如非所需細胞類型)之濃度。該耗盡可為增加該等其他組分中之一或更多者之濃度之結果。例如，如本文使用，「耗盡」樣品之T淋巴球之特定子群意謂相對於該樣品中之細胞總量，減小該子群之比例。 生物微小物件(例如，生物細胞)產生特異性生物材料(例如，蛋白質，諸如抗體)之能力可於此微流裝置中分析。在分析之一特定實施例中，包含待分析產生受關注之分析物之生物微小物件(例如，細胞)之樣品材料可裝載於該微流裝置之掃及區內。該等生物微小物件(例如，哺乳動物細胞，諸如人類細胞)中之幾個可針對特定特徵加以選擇並配置於未掃及區中。剩餘樣品材料可然後流出該掃及區及分析材料流入該掃及區內。因為該等經選擇之生物微小物件係位於未掃及區中，所以該等經選擇之生物微小物件非大體上受剩餘樣品材料之流出或分析材料之流入之影響。可讓該等經選擇之生物微小物件產生受關注之分析物，其可自未掃及區擴散至掃及區內，在掃及區中，該受關注之分析物可與該分析材料反應以產生局部可偵測反應，其等中之各者可與特定未掃及區相關。與經偵測之反應相關聯之任何未掃及區可經分析以判定該未掃及區中之該等生物微小物件(若存在)之哪一者受關注之分析物之充足產生者。在微流 / 奈流裝置中培養、選擇及擴增 T 淋巴球。 可在本文描述之微流及奈流裝置中培養、選擇及擴增T淋巴球。除此部分中之討論外，培養、選擇及擴增之方法係描述於發明內容(上文)、實例(下文)及其隨附申請專利範圍中。例示性工作流程係繪示於圖8A至C中。於本文揭示之微流裝置內擴增生物細胞(包括T細胞)之方法亦已描述於2016年4月22日美國專利申請案第15/135,707號中，該案之全部內容以引用之方式併入本文中。 T淋巴球之群可透過已知方法獲得。在一些實施例中，包含T淋巴球之外周血液單核細胞(PBMC)係分離自血液樣品(諸如全血樣品)。在一些實施例中，T淋巴球係分離自實體腫瘤樣品，例如，細針吸取物或活體組織切片。經分離之T淋巴球之群可針對所需細胞類型加以富集或耗盡非所需細胞類型。富集及耗盡可使用例如流動式細胞測量術、T細胞富集管柱、結合抗體之珠(例如，磁珠)等進行及可使用陽性或陰性選擇，諸如分別自群中分離所需細胞或自群中移除非所需細胞。例如，可使用結合至針對CD45RO之抗體之磁珠以耗盡群中之CD45RO+ 細胞。作為另一實例，可使用結合至針對CD45RA之抗體之磁珠以耗盡群中之CD45RA+ 細胞。 在一些實施例中，T淋巴球係針對CD3+ T淋巴球加以富集。在一些實施例中，該等一或更多個T淋巴球係來自分離自外周血液樣品或實體腫瘤樣品之CD3+ T淋巴球之群。在一些實施例中，該等T淋巴球係針對CD3+ CD4+ 細胞(例如，援助T細胞)加以富集。在一些實施例中，該等T淋巴球係針對CD3+ CD8+ 細胞(例如，細胞毒性T細胞) 加以富集。在一些實施例中，該等T淋巴球係針對CD3+ CD4+ 及CD3+ CD8+ 細胞兩者加以富集。在一些實施例中，該等T淋巴球係針對CCR7+ 細胞(例如，CD3+ CCR7+ 、CD3+ CD4+ CCR7+ 或CD3+ CD8+ CCR7+ 細胞)加以富集。在一些實施例中，該等T淋巴球係針對CD45RA+ 細胞(例如，CD3+ CD45RA+ 、CD3+ CD4+ CD45RA+ 或CD3+ CD8+ CD45RA+ 細胞)加以富集。在一些實施例中，該等T淋巴球係針對CD45RO+ 細胞(例如，CD3+ CD45RO+ 、CD3+ CD4+ CD45RO+ 或CD3+ CD8+ CD45RO+ 細胞)加以富集。 在一些實施例中，T淋巴球係耗盡CD45RO+ 、CD45RO+ CCR7+ 、CD45RO+ CD62L+ 或CD45RO+ CCR7+ CD62L+ 細胞。在一些實施例中，該等T淋巴球係耗盡CD45RA+ 、CD45RA+ CCR7+ 、CD45RA+ CD62L+ 或CD45RA+ CCR7+ CD62L+ 細胞。 微流裝置中之T淋巴球亦可基於所需或非所需標記物之存在或缺乏進行選擇或者或另外如上文討論富集或耗盡。介電泳可用以將位於該微流通道內之T淋巴球移動至該封存圈內。例如，T淋巴球可經選擇以至少部分佈置在微流裝置之封存圈中，因為細胞表面係CD3+ 、CD4+ 、CD8+ 或其任何組合(例如，CD3+ CD4+ 或CD3+ CD8+ )。選擇可包括用抗體(例如，螢光抗體)標記及將與該抗體相結合之T淋巴球移動至該封存圈內。 在一些實施例中，T淋巴球可經選擇以至少部分佈置在微流裝置之封存圈中，因為細胞表面係CD45RA+ 、CCR7+ 及/或CD62L+ 或兩者。CD45RA+ 係視為天然T淋巴球(Tnaïve 細胞)之標記物，而CCR7+ 及CD62L+ 係視為與Tnaïve 狀態(取決於CD45RA+ 是否亦存在)一致之標記物。在一些實施例中，T淋巴球係經選擇以至少部分佈置在微流裝置之封存圈中，因為細胞表面缺乏至少一種與T天然狀態不一致之標記物。例如，可選擇缺乏CD45RO+ 、PD-1+ 、PD-L1+ 、CD137+ 或CD69+ 細胞表面或其任何組合之T淋巴球。在一些實施例中，亦選擇具有CD4+ 細胞表面之T淋巴球。在一些實施例中，選擇具有CD8+ 細胞表面之T淋巴球。 在一些實施例中，T淋巴球可經選擇以至少部分佈置在微流裝置之封存圈中，因為細胞表面係CD45RO+ 、CCR7+ 及/或CD62L+ 或兩者。CD45RO+ 及CCR7+ 及/或CD62L+ 標記物之組合係視為與記憶T淋巴球(例如，TCM 細胞)一致。在一些實施例中，T淋巴球係經選擇以至少部分佈置在微流裝置之封存圈中，因為細胞表面缺乏至少一種與記憶T淋巴球狀態不一致之標記物。例如，可選擇缺乏CD45RA+ 、PD-1+ 、PD-L1+ 、CD137+ 或CD69+ 細胞表面或其任何組合之T淋巴球。在一些實施例中，亦選擇具有CD4+ 細胞表面之T淋巴球。在一些實施例中，亦選擇具有CD8+ 細胞表面之T淋巴球。 在一些實施例中，T淋巴球可經選擇以至少部分佈置在微流裝置之封存圈中，因為細胞表面係CD45RO+ 、PD-1+ 及/或PD-L1+ 、CD137+ 或其組合。CD45RO結合PD-1、PD-L1及/或CD137標記物之存在係視為與效應T淋巴球(TEFF 細胞)一致。在一些實施例中，T淋巴球係經選擇以至少部分佈置在微流裝置之封存圈中，因為細胞表面缺乏至少一種與TEFF 狀態不一致之標記物。例如，T淋巴球可經針對CD45RA、CCR7、CD62L或其任何組合之抗體標記，及可將與針對CD45RA、CCR7、CD62L或其組合之抗體無關之T淋巴球移動(例如，使用介電泳)至該微流裝置之該封存圈內(例如，自該微流通道)。 在一些實施例中，T淋巴球係經選擇以至少部分佈置在微流裝置之封存圈中，因為細胞表面缺乏至少一種、至少兩種或至少三種與T天然不一致之標記物。在一些實施例中，T淋巴球係經選擇以至少部分佈置在該微流裝置之封存圈中，因為細胞表面缺乏至少一種、至少兩種或至少三種與記憶T淋巴球 (例如，TCM 或TEM )狀態不一致之標記物。在一些實施例中，T淋巴球係經選擇以至少部分佈置在該微流裝置之封存圈中，因為細胞表面缺乏至少一種、至少兩種或至少三種與TEFF 狀態不一致之標記物。 因此，本文揭示之方法可包括將T淋巴球移動至封存圈內，其係CD3+ CD45RA+ CCR7+ CD62L+ CD45RO- 中之至少一者、至少兩者、至少三者、至少四者或所有，例如，CD3+ CD45RA+ CCR7+ CD62L+ ；CD3+ CD45RA+ CCR7+ CD45RO- ；CD3+ CD45RA+ CD62L+ CD45RO- ；CD45RA+ CCR7+ CD62L+ CD45RO- ；CD3+ CCR7+ CD62L+ CD45RO- ；CD3+ CD45RA+ CCR7+ ；CD3+ CD45RA+ CD62L+ ；CD45RA+ CCR7+ CD62L+ ；CD3+ CCR7+ CD45RO- ；CD3+ CD62L+ CD45RO- ；CCR7+ CD62L+ CD45RO- ；CD45RA+ CCR7+ ；CD45RA+ CD62L+ ；CCR7+ CD45RO- ；CD62L+ CD45RO- 。T淋巴球之前述類型中之任何一者可額外為CD4+ 或CD8+ 及/或CD69- PD-1- PD-L1- CD137- 中之至少一者、兩者、三者或所有，例如，CD69- PD-L1- PD-1- ；CD69- PD-1- CD137- ；CD69- PD-L1- CD137- ；PD-1- PD-L1- CD137- ；CD69- PD-1- ；CD69- PD-L1- ；CD69- CD137- ；PD-1- PD-L1- ；PD-1- CD137- ；PD-L1- CD137- ；CD69- , PD-1- ；PD-L1- 或CD137- 。 本文揭示之方法可包括將T淋巴球移動至封存圈內，其係CD3+ CD45RA- CCR7+ CD62L+ CD45RO+ 中之至少一者、至少兩者、至少三者、至少四者或所有，例如，CD3+ CD45RA- CCR7+ CD62L+ ；CD3+ CD45RA- CCR7+ CD45RO+ ；CD3+ CD45RA- CD62L+ CD45RO+ ；CD3+ CCR7+ CD62L+ CD45RO+ ；CD45RA- CCR7+ CD62L+ CD45RO+ ；CD3+ CD45RA- CCR7+ ；CD3+ CD45RA- CD62L+ ；CD45RA- CCR7+ CD62L+ ；CD3+ CCR7+ CD45RO+ ；CD3+ CD62L+ CD45RO+ ；CCR7+ CD62L+ CD45RO+ ；CD45RA- CCR7+ ；CD45RA- CD62L+ ；CCR7+ CD45RO+ ；CD62L+ CD45RO+ 。T淋巴球之前述類型中之任何一者可額外為CD4+ 或CD8+ 及/或CD69- PD-1- PD-L1- CD137- 中之至少一者、兩者、三者或所有，例如，CD69- PD-L1- PD-1- ；CD69- PD-1- CD137- ；CD69- PD-L1- CD137- ；PD-1- PD-L1- CD137- ；CD69- PD-1- ；CD69- PD-L1- ；CD69- CD137- ；PD-1- PD-L1- ；PD-1- CD137- ；PD-L1- CD137- ；CD69- ；PD-1- ；PD-L1- 或CD137- 。 本文揭示之方法可包括將T淋巴球移動至封存圈內，其係CD3+ CD45RA- PD-1+ CD137+ CD45RO+ 中之至少一者、至少兩者、至少三者、至少四者或所有，例如，CD3+ CD45RA- PD-1+ CD137+ ；CD3+ CD45RA- PD-1+ CD45RO+ ；CD3+ CD45RA- CD137+ CD45RO+ ；CD3+ PD-1+ CD137+ CD45RO+ ；CD45RA- PD-1+ CD137+ CD45RO+ ；CD3+ CD45RA- PD-1+ ；CD3+ CD45RA- CD137+ ；CD3+ PD-1+ CD137+ ；CD45RA- PD-1+ CD137+ ；CD3+ CD45RA- CD45RO+ ；CD3+ PD-1+ CD45RO+ ；CD45RA- PD-1+ CD45RO+ ；CD3+ CD137+ CD45RO+ ；CD45RA- CD137+ CD45RO+ ；PD-1+ CD137+ CD45RO+ ；CD45RA- PD-1+ ；CD45RA- CD137+ ；CD137+ CD45RO+ 或PD-1+ CD45RO+ 。T淋巴球之前述類型中之任何一者可額外為CD4+ 或CD8+ 及/或CD69+ PD-L1+ CCR7- CD62L- 中之至少一者、兩者、三者或所有，例如，CD69+ PD-L1+ CCR7- ；CD69+ PD-L1+ CD62L- ；CD69+ CCR7- CD62L- ；PD-L1+ CCR7- CD62L- ；CD69+ PD-L1+ ；CD69+ CCR7- ；PD-L1+ CCR7- ；CD69+ CD62L- ；PD-L1+ CD62L- ；CCR7- CD62L- ；CD69+ ；PD-L1+ ；CCR7- 或CD62L- 。 本文揭示之方法可包括將T淋巴球引入至微流裝置之封存圈內，例如，藉由介電泳；藉由重力(諸如傾斜該微流裝置使得重力將該等一或更多個T淋巴球拉入該封存圈內)；藉由離心力；或藉由局部流動。 在一些實施例中，本文揭示之方法包括使一或更多個T淋巴球與活化劑接觸。此接觸可(例如)在將該等T淋巴球引入至該微流裝置內前發生，例如，在引入至該裝置內前至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9或10小時，或在0.5至2、2至4、4至6、6至8或8至10個小時之時間。該活化劑可與該等T淋巴球一起引入至該封存圈內。或者或另外，接觸(例如，活化劑之添加)可在該等T淋巴球係於該封存圈中時發生。在一些實施例中，使用抗-CD3抗體或促效劑以接觸該等淋巴球。在一些實施例中，使用抗-CD28抗體或促效劑以接觸該等淋巴球，例如，組合該抗-CD3抗體或促效劑。活化劑可以可溶性形式或結合至珠之形式提供。例如，珠及經結合之抗-CD3抗體或促效劑可與可溶性抗-CD28抗體或促效劑組合使用。或者，可使用抗-CD3抗體或促效劑及抗-CD28抗體或促效劑，其中兩者均係結合至珠(例如，兩種抗體可結合至相同之珠或一些珠可結合至抗-CD3抗體及其他珠可結合至抗-CD28抗體)。在一些實施例中，至少一種活化劑(例如，抗體) (例如，抗-CD3抗體)係結合至封存圈之表面，使得刺激在T淋巴球位於該圈內時發生。在一些實施例中，抗-CD3抗體及抗-CD28抗體兩者係均結合至封存圈之表面。在一些實施例中，抗-CD3抗體係結合至封存圈之表面及至少一個T淋巴球當在封存圈中時係亦接觸可溶性抗-CD28抗體。通常，抗-CD3及抗-CD28抗體當用作活化劑時將係促效劑抗體。 在一些實施例中，經擴增以回應於與活化劑接觸之經分離之T淋巴球顯示至少100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍擴增或更大。 在一些實施例中，T淋巴球係經樹突狀細胞(例如，自體樹突狀細胞)刺激。在一些實施例中，該等樹突狀細胞係與一或更多個抗原(例如，癌症衍生之肽，諸如分離自與該等T淋巴球為自體性之癌細胞之抗原或肽)一起裝載(例如，脈衝)。參見，例如，下文實例3。該等樹突狀細胞亦可與該等T淋巴球為自體性的。或者，樹突狀細胞可與合成抗原一起裝載(例如，脈衝)。 在一些實施例中，T淋巴球係用可結合至MHC分子以形成肽-MHC複合體之抗原刺激。該等肽-MHC複合體可以MHC四聚物結構之方式連接在一起。該抗原(或抗原性複合體)可結合至固體支撐物(諸如一或更多個珠)。或者，該固體支撐物可為封存圈之至少一個表面，及該抗原可共價結合至該至少一個表面或經非共價結合(例如，經由生物素-鏈黴親和素結合相互作用)。 在一些實施例中，培養基係灌注通過微流裝置之微流通道。灌注可為間歇性的，例如，以包含處於不同灌注速率之兩個或三個階段之循環。在一些實施例中，灌注包含具有以約0.002至0.1 µl/sec之灌注速率之第一階段及約0.5至10 µl/sec之灌注之第二階段之一或更多個循環。該等循環可進一步包含第三階段，例如，其中該灌注係以小於約0.01 µl/sec之速率，例如，係大體上停止。處於較高灌注速率之階段之長度可為(例如)約1至10分鐘(諸如1至2分鐘)。處於較低灌注速率之階段之長度可為(例如)約0.5 min至約3小時(例如，約1 min至約2小時)。當存在時，其中該灌注係以小於約0.01 µl/sec之速率之階段之長度可為(例如)約2至30或2至20分鐘或約5至10分鐘。培養基可灌注通過微流裝置之流動路徑至少24、48、72、96、120或更多個小時之時間，或自0.5至10天之時間長度，諸如0.5至1、1至2、2至3、3至4、4至5、5至7、6至8、7至9或8至10天。 在一些實施例中，培養基係用細胞介素(例如，IL7、IL15、IL21或其組合(諸如IL15及IL21))補充。在一些實施例中，該培養基包含IL2。灌注(其可包括在其中該介質引入至該等封存圈內之主動灌注後之培養期)可進行一或更多個T淋巴球足夠經歷擴增之時間週期，例如，至少一、二、三或更多輪有絲分裂細胞分裂。在一些實施例中，該培養基包含血清，諸如人類AB血清，視需要與FBS或小牛血清組合。 在一些實施例中，20或更少、10或更少、6至10、5或更少、約5、約4、約3、約2或1個T淋巴球係經引入至微流裝置中之封存圈內。在一些實施例中，20或更少、10或更少、6至10、5或更少、約5、約4、約3、約2或1個T淋巴球係經引入至該微流裝置中之複數個封存圈內。 封存圈可包含塗層，例如，使得該圈中之T淋巴球與硬質表面非直接接觸。在一些實施例中，該圈表面係用聚葡萄糖或聚乙二醇塗佈。在一些實施例中，該封存圈具有約5x105 至約5x106 立方微米之體積。 在一些實施例中，一或更多個T淋巴球之增殖速率係經監測。例如，此可在灌注期間藉由觀察給定封存圈中細胞分裂之頻率完成，例如，藉由週期性觀察該圈中之細胞數量完成。 在一些實施例中，T淋巴球之一或更多種細胞介素(例如，INFγ、TNFα、IL2或其組合)之表現係經監測。在一些實施例中，一或更多個調節T細胞標記物(例如，CTLA4)之表現係經監測。 如上文描述之監測可(例如)在T淋巴球於封存圈中表現後進行。例如，具有經擴增之T淋巴球之樣品可使用晶片上表現分析針對於調節T細胞標記物及/或細胞介素之表現進行表徵，該等分析已描述(例如)於美國專利申請公開案第2015/0151298及2015/0165436號及美國專利申請案系列第15/372,094 (2016年12月7日申請)號中，其等案件中之各者之內容係以引用之方式併入本文中。 在一些實施例中，在擴增後，T淋巴球係自微流裝置輸出。在一些實施例中，具有經擴增之T淋巴球之樣品係自該微流裝置輸出以用於基因體圖譜分析(genomic profiling)，例如，基因體序列分析及/或表現分析(例如，RNA-Seq)。在一些實施例中，T淋巴球係經選擇以用於下游用途，諸如基於基因體圖譜分析結果(例如，缺乏官能突變、細胞介素表現或類似物之損失)之癌症治療。在一些實施例中，T淋巴球係至少部分基於具有增殖速率大於或等於既定臨限值，例如，具有增殖之所示至少臨限值水平；諸如在小於或等於至約一週之時間中已經至少100倍擴增來選擇性輸出。選擇性輸出可或者或另外係至少部分基於一或更多種細胞介素(諸如INFγ、TNFα、IL2或其組合)之表現。選擇性輸出或者或另外係至少部分基於一或更多種調節T細胞標記物(諸如CTLA4或類似物)之表現。 在一些實施例中，自微流裝置輸出之T淋巴球係用以治療癌症，例如，藉由將其等引入至個體內，諸如從中獲得該等T淋巴球之該個體。該個體可為哺乳動物，例如，人類或非人類哺乳動物。 微流裝置及用於操作及觀察此等裝置之系統。圖1A闡述微流裝置100及可用於選擇、活化、擴增及/或選殖T淋巴球之系統150之實例。該微流裝置100之透視圖係經顯示部分切割其蓋110以提供該微流裝置100內之局部視圖。該微流裝置100大體上包含微流環路120，其包含流動路徑106，流體介質180可流動通過該路徑，視需要將一或更多個微小物件(未顯示)攜載至該微流環路120內及/或通過該微流環路120。儘管單一微流環路120係闡述於圖1A中，但合適之微流裝置可包括複數個(例如，2或3個)此等微流環路。無論如何，該微流裝置100可經組態成奈流裝置。如闡述於圖1A中，該微流環路120可包括複數個微流封存圈124、126、128及130，其中各封存圈可具有一或更多個與流動路徑106流體連通之開口。在圖1A之裝置之一些實施例中，該等封存圈可具有僅與該流動路徑106流體連通之單一開口。如下文進一步討論，該等微流封存圈包含各種特徵及結構，其等已經最佳化以將微小物件保留在該微流裝置(諸如微流裝置100)中，甚至在介質180流動通過該流動路徑106時。然而，在轉向前述前，提供微流裝置100及系統150之簡要描述。 如圖1A中大體上繪示，微流環路120係藉由外殼102界定。儘管該外殼102可在物理上構造成不同組態，但在圖1A中顯示之實例中，該外殼102繪示成包含支持結構104 (例如，基座)、微流環路結構108及蓋110。該支持結構104、微流環路結構108及蓋110可彼此結合。例如，該微流環路結構108可配置於該支持結構104之內表面109上，及該蓋110可配置於該微流環路結構108上。連同該支持結構104及蓋110，該微流環路結構108可界定該微流環路120之元件。 支持結構104可為處於底部及在微流環路120頂部之蓋110，如闡述於圖1A中。或者，該支持結構104及該蓋110可在其他方向上經組態。例如，該支持結構104可為處於頂部及該蓋110處於該微流環路120之底部。無論如何，可存在一或更多個出入口107，各包含進入或輸出該外殼102之通道。通道之實例包括閥、門、貫通孔或類似物。如圖所示，出入口107係藉由該微流環路結構108中之間隙產生之貫通孔。然而，該出入口107可位於該外殼102之其他組件(諸如該蓋110)中。僅一個出入口107係闡述於圖1A中，但該微流環路120可具有兩個或更多個出入口107。例如，可存在充當用於使流體進入該微流環路120中之入口之第一出入口107，及可存在充當用於使該流體流出該微流環路120之出口之第二出入口107。出入口107充當入口還是出口可取決於流體流動通過流動路徑106之方向。 支持結構104可包含一或更多個電極(未顯示)及基板或複數個互連基板。例如，該支持結構104可包含一或更多個半導體基板，各基板係電連接至電極(例如，該等半導體基板中之所有或子組可電連接至單一電極)。該支持結構104可進一步包含印刷電路板總成(「PCBA」)。例如，該(等)半導體基板可安裝於PCBA上。 微流環路結構108可界定微流環路120之環路元件。此等環路元件可包含當微流環路120經流體填充時可流體互連之空間或區，諸如流動路徑(其等可包括或可為一或更多個流動通道)、室、圈、阱及類似物。在圖1A中闡述之微流環路120中，該微流環路結構108包含框架114及微流環路材料116。該框架114可部分或完全封閉該微流環路材料116。該框架114可為(例如)大體上圍繞該微流環路材料116之相對剛性結構。例如，該框架114可包含金屬材料。 微流環路材料116可經圖案化以具有空腔或類似物以界定環路元件及該微流環路120之互連。該微流環路材料116可包含可撓性材料，諸如可撓性聚合物(例如，橡膠、塑膠、彈性體、聚矽氧、聚二甲基矽氧烷(「PDMS」)或類似物)，其可為氣體可滲透。可組成微流環路材料116之材料之其他實例包括模製玻璃、可蝕刻材料，諸如聚矽氧(例如，光可圖案化聚矽氧或「PPS」)、光致抗蝕劑(例如，SU8)或類似物。在一些實施例中，此等材料(及因此該微流環路材料116)可為剛性的及/或大體上不透氣。無論如何，微流環路材料116可配置於該支持結構104上及該框架114內。 蓋110可為框架114及/或微流環路材料116之整體部分。或者，該蓋110可為結構不同之元件，如闡述於圖1A中。該蓋110可包含與該框架114及/或該微流環路材料116相同或不同之材料。同樣地，該支持結構104可為獨立於如闡述之該框架114或微流環路材料116之結構，或該框架114或微流環路材料116之整體部分。同樣地，該框架114及微流環路材料116可為如圖1A顯示之單獨結構或該相同結構之整體部分。 在一些實施例中，蓋110可包含剛性材料。該剛性材料可為玻璃或具有類似性質之材料。在一些實施例中，該蓋110可包含可變形材料。該可變形材料可為聚合物，諸如PDMS。在一些實施例中，該蓋110可包含剛性材料及可變形材料兩者。例如，蓋110之一或更多個部分(例如，定位於封存圈124、126、128、130上之一或更多個部分)可包含與該蓋110之剛性材料相互作用之可變形材料。在一些實施例中，該蓋110可進一步包括一或更多個電極。該等一或更多個電極可包含導電性氧化物，諸如氧化銦錫(ITO)，其可塗佈於玻璃或類似絕緣材料上。或者，該等一或更多個電極可為可撓性電極，諸如單壁奈米管、多壁奈米管、奈米線、導電性奈米顆粒之團簇或其組合，其等可嵌入於可變形材料諸如聚合物(例如，PDMS)中。可用於微流裝置中之可撓性電極已經描述(例如)於U.S. 2012/0325665 (Chiou等人)中，該案之內文以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，該蓋110可經改進(例如，藉由調整向內面向該微流環路120之表面之所有或部分)以支持細胞黏附、存活率及/或生長。該改進可包括合成或天然聚合物之塗佈。在一些實施例中，該蓋110及/或該支持結構104可透光。該蓋110亦可包括至少一種透氣材料(例如，PDMS或PPS)。 圖1A亦顯示用於操作及控制微流裝置(諸如微流裝置100)之系統150。系統150包括電源192、成像裝置194 (併入成像模組164內，其中裝置194本身係非闡述於圖1A中)及傾斜裝置190 (傾斜模組166之部分，其中裝置190係非闡述於圖1A中)。 電源192可向微流裝置100及/或傾斜裝置190提供電源，視需要提供偏壓或電流。該電源192可(例如)包含一或更多個交流電流(AC)及/或直流電流(DC)電壓或電流源。成像裝置194 (成像模組164之部分，下文討論)可包含用於捕獲微流環路120內部之影像之裝置，諸如數位相機。在一些實例中，該成像裝置194進一步包含具有快速幀速率及/或高靈敏度(例如，用於低光應用)之偵測器。該成像裝置194亦可包括用於將刺激性輻射及/或光束引入至該微流環路120內及收集反射或發射自該微流環路120 (或其中含有之微小物件)之輻射及/或光束之機制。該等經發射之光束可為位於可見光譜中且可(例如)包括螢光發射。該等經反射之光束可包括源自LED或寬譜燈(諸如水銀燈(例如，高壓水銀燈)或氙弧燈)之反射輻射。如針對圖3B討論，該成像裝置194可進一步包括顯微鏡(或光學元件串)，其可包括或不包括目鏡。 系統150進一步包含經組態以使微流裝置100繞一或更多個旋轉軸旋轉之傾斜裝置190 (傾斜模組166之部分，下文討論)。在一些實施例中，傾斜裝置190係經組態以支持及/或固持包含微流環路120之外殼102繞至少一個軸使得該微流裝置100 (及因此該微流環路120)可保持在水平方向(即，相對於x軸及y軸呈0°)、垂直方向(即，相對於x軸及/或y軸呈90°)或其間之任何方向上。該微流裝置100 (及該微流環路120)相對於軸之方向在文中被稱為該微流裝置100 (及該微流環路120)之「傾斜」。例如，該傾斜裝置190可相對於x軸將傾斜該微流裝置100傾斜0.1°、0.2°、0.3°、0.4°、0.5°、0.6°、0.7°、0.8°、0.9°、1°、2°、3°、4°、5°、10°、15°、20°、25°、30°、35°、40°、45°、50°、55°、60°、65°、70°、75°、80°、90°或其間之任何角度。水平方向(及因此x軸及y軸)係定義為垂直於藉由重力界定之垂直軸。該傾斜裝置亦可相對於x軸及/或y軸將該微流裝置100 (及該微流環路120)傾斜至大於90°之任何角度或相對於x軸或y軸將該微流裝置100 (及該微流環路120)傾斜180°以完全倒置該微流裝置100 (及該微流環路120)。同樣地，在一些實施例中，該傾斜裝置190繞藉由流動路徑106界定之旋轉軸或微流環路120之一些其他部分傾斜該微流裝置100 (及該微流環路120)。 在一些實例中，微流裝置100係傾斜至垂直方向使得該流動路徑106定位於一或更多個封存圈上方或下方。如本文使用之術語「上方」指示該流動路徑106係定位高於藉由重力(即，流動路徑106上方封存圈中之物件將具有比該流動路徑中之物件更高之重力勢能)界定之垂直軸上之一或更多個封存圈。如本文使用之術語「下方」指示該流動路徑106係定位低於藉由重力(即，流動路徑106下方封存圈中之物件將具有比該流動路徑中之物件更低之重力勢能)界定之垂直軸上之一或更多個封存圈。 在一些實例中，傾斜裝置190繞平行於流動路徑106之軸傾斜微流裝置100。此外，該微流裝置100可經傾斜至小於90°之角度使得該流動路徑106位於一或更多個封存圈上方或下方而不直接位於該等封存圈上方或下方。在其他實例中，該傾斜裝置190繞垂直於該流動路徑106之軸傾斜該微流裝置100。在又其他實例中，該傾斜裝置190繞既非平行亦非垂直於該流動路徑106之軸傾斜該微流裝置100。 系統150可進一步包括介質源178。該介質源178 (例如，容器、儲器或類似物)可包含多個部分或容器，各用於容納不同流體介質180。因此，該介質源178可為於微流裝置100外部並獨立於該微流裝置100之裝置，如闡述於圖1A中。或者，該介質源178可整體或部分位於該微流裝置100之該外殼102內部。例如，該介質源178可包含係微流裝置100之部分之儲器。 圖1A亦闡述控制及監測構成系統150之部分及可結合微流裝置100一起使用之裝備152之實例之簡化方框圖描述。如顯示，此控制及監測裝備152之實例包括包含用於控制介質源178之介質模組160之主控制器154、用於控制微小物件(未顯示)及/或介質(例如，介質液滴)在微流環路120中之運動及/或選擇之驅動模組162、用於控制用於捕獲影像(例如，數位影像)之成像裝置194 (例如，相機、顯微鏡、光源或其任何組合)之成像模組164及用於控制傾斜裝置190之傾斜模組166。該控制裝備152亦可包括控制、監測或執行針對該微流裝置100之其他功能之其他模組168。如顯示，該裝備152可進一步包括顯示裝置170及輸入/輸出裝置172。 主控制器154可包含控制模組156及數位記憶體158。該控制模組156可包含(例如)經組態以根據在該記憶體158中作為非暫態資料或信號儲存之機器可執行指令(例如，軟體、固件、源代碼或類似物)操作之數位處理器。或者或另外，該控制模組156可包含硬連線數位電路及/或類比電路。介質模組160、驅動模組162、成像模組164、傾斜模組166及/或其他模組168亦可經類似組態。因此，本文討論之如針對微流裝置100或任何其他微流設備進行之方法之功能、處理行為、作用或步驟可藉由如上文討論經組態之主控制器154、介質模組160、驅動模組162、成像模組164、傾斜模組166及/或其他模組168中之一或更多者進行。同樣地，主控制器154、介質模組160、驅動模組162、成像模組164、傾斜模組166及/或其他模組168可經連通偶合以傳輸及接收用於本文討論之任何功能、處理、行為、作用或步驟中之資料。 介質模組160控制介質源178。例如，該介質模組160可控制該介質源178以將經選擇之流體介質180輸入至外殼102 (例如，通過入口107)內。該介質模組160亦可控制介質自該外殼102 (例如，通過出口 (未顯示))之移除。一或更多個介質可因此選擇性輸入該微流環路120中及自該微流環路120移除。該介質模組160亦可控制流體介質180在微流環路120內部之流動路徑106中之流動。例如，在一些實施例中，介質模組160停止介質180在該流動路徑106中之流動及在傾斜模組166前通過該外殼102使得該傾斜裝置190將該微流裝置100傾斜至所需傾斜角度。 驅動模組162可經組態以控制微小物件(未顯示)在微流環路120中之選擇、捕獲及運動。如下文針對圖1B及1C討論，外殼102可包含介電泳(DEP)、光電子鑷子(OET)及/或光電濕潤(OEW)組態(未顯示於圖1A中)及該驅動模組162可控制電極及/或電晶體(例如，光電晶體)之活化以在流動路徑106及/或封存圈124、126、128、130中選擇及移動微小物件(未顯示)及/或介質液滴(未顯示)。 成像模組164可控制成像裝置194。例如，該成像模組164可接收及處理來自該成像裝置194之影像資料。來自該成像裝置194之影像資料可包含藉由該成像裝置194捕獲之任何類型資訊(例如，微小物件之存在或缺乏、介質液滴、標記(諸如螢光標記)之聚集等)。使用藉由該成像裝置194捕獲之資訊，該成像模組164可進一步計算物件(例如，微小物件、介質液滴)之位置及/或此等物件於該微流裝置100內之運動速率。 傾斜模組166可控制傾斜裝置190之傾斜運動。或者或另外，該傾斜模組166可控制傾斜速率及定時以最佳化經由重力將微小物件轉移至一或更多個封存圈。該傾斜模組166係與該成像模組164連通偶合以接收描述微小物件及/或介質液滴在該微流環路120中之運動之資料。使用此資料，該傾斜模組166可調節該微流環路120之傾斜以調節其中微小物件及/或介質液滴在該微流環路120中之速率。該傾斜模組166亦可使用此資料以反復調節微小物件及/或介質液滴在該微流環路120中之位置。 在圖1A顯示之實例中，微流環路120繪示為包含微流通道122及封存圈124、126、128、130。各圈包含與通道122連通之開口，但其他方面經封閉使得該等圈可大體上將微小物件自流體介質180分離在圈內部及/或將微小物件分離在通道122之流動路徑106或其他圈中。該封存圈之壁自基座之內表面109延伸至蓋110之表面內部以提供外殼。圈之與該微流通道122連通之開口係相對於流體介質180之流動106呈角度定向使得流動106係非定向至該等圈內。該流動可與該圈之開口之平面呈正切或正交。在一些實例中，圈124、126、128、130係經組態以將一或更多個微小物件物理圍於該微流環路120內。根據本發明之封存圈可包含各種形狀、表面及特徵，其等經最佳化以與DEP、OET、OEW、流體流動、重力及/或離心力一起使用，如下文將詳細討論及顯示。 微流環路120可包含任何數量之微流封存圈。儘管顯示五個封存圈，但微流環路120可具有更少或更多個封存圈。如顯示，微流環路120之微流封存圈124、126、128及130各包含不同特徵及形狀，其等可提供一或更多個適用於維持、分離、分析、刺激(例如，活化)或培養生物微小物件之優勢。在一些實施例中，該微流環路120包含複數個相同微流封存圈。 在圖1A闡述之實施例中，顯示單一通道122及流動路徑106。然而，其他實施例可含有多個通道122，各經組態以包含流動路徑106。該微流環路120進一步包含與該流動路徑106及流體介質180流體連通之入口閥或出入口107，藉此流體介質180可經由入口107進入通道122。在一些實例中，該流動路徑106包含單一路徑。在一些實例中，該單一路徑係呈之字形圖案配置，藉此該流動路徑106在替代方向上穿過該微流裝置100兩次或更多次。 在一些實例中，微流環路120包含複數個平行通道122及流動路徑106，其中各流動路徑106內之流體介質180在相同方向上流動。在一些實例中，各流動路徑106內之流體介質在正向或反向方向之至少一者上流動。在一些實例中，複數個封存圈係經組態(例如，相對於通道122)使得該等封存圈可平行裝載目標微小物件。 在一些實施例中，微流環路120進一步包含一或更多個微小物件阱132。該等阱132係通常形成於壁中，該壁形成通道122之邊界，及該等阱132可相對於微流封存圈124、126、128、130之一或更多者之開口放置。在一些實施例中，該等阱132係經組態以自該流動路徑106接收或捕獲單一微小物件。在一些實施例中，該等阱132係經組態以自該流動路徑106接收或捕獲複數個微小物件。在一些實例中，該等阱132包含約等於單一目標微小物件之體積之體積。 阱132可進一步包含開口，其經組態以有助於目標微小物件流動至該等阱132內。在一些實例中，該等阱132包含具有約等於單一目標微小物件之尺寸之高度及寬度之開口，藉此阻止較大微小物件進入該微小物件阱內。該等阱132可進一步包含經組態以有助於靶向微小物件保留於該阱132內之其他特徵。在一些實例中，該阱132係相對於微流封存圈之開口對齊及位於通道122之對面，使得倘若繞平行於該微流通道122之軸傾斜該微流裝置100，則經捕獲之微小物件以使得該微小物件落入該封存圈之開口內之軌跡離開該阱132。在一些實例中，該阱132包含小於目標微小物件之側通路134以促進流動通過該阱132及藉此增加將微小物件捕獲在阱132中之可能性。 在一些實施例中，介電泳(DEP)力係經由一或更多個電極(未顯示)跨流體介質180 (例如，在流動路徑中及/或在封存圈中)施加以操作、傳輸、分離及分選位於其中之微小物件。例如，在一些實施例中，DEP力係施加至微流環路120之一或更多個部分上以將單一微小物件自該流動路徑106轉移至所需微流封存圈內。在一些實施例中，DEP力係用以阻止封存圈(例如，封存圈124、126、128或130)內之微小物件被移走。此外，在一些實施例中，DEP力係用以自先前根據本發明之實施例收集之封存圈中選擇性移除微小物件。在一些實施例中，該等DEP力包含光電子鑷子(OET)力。 在其他實施例中，光電濕潤(OEW)力係經由一或更多個電極(未顯示)施加至微流裝置100之支持結構104 (及/或蓋110)中之一或更多個位置(例如，有助於界定流動路徑及/或封存圈之位置)以操作、傳輸、分離及分選位於該微流環路120中之液滴。例如，在一些實施例中，OEW力係施加至支持結構104 (及/或蓋110)中之一或更多個部分以將單一液滴自流動路徑106轉移至所需微流封存圈內。在一些實施例中，OEW力係用以阻止封存圈(例如，封存圈124、126、128或130)內之液滴被移走。此外，在一些實施例中，OEW力係用以自先前根據本發明之實施例收集之封存圈中選擇性移除液滴。 在一些實施例中，DEP及/或OEW力係與其他力(諸如流動力及/或重力)組合以便於在微流環路120內操作、傳輸、分離及分選微小物件及/或液滴。例如，外殼102可經傾斜(例如，藉由傾斜裝置190)以將流動路徑106及位於其中之微小物件定位於該等微流封存圈上方，及重力可將該等微小物件及/或液滴傳輸至該等圈內。在一些實施例中，該等DEP及/或OEW力可在施加其他力前施加。在其他實施例中，該等DEP及/或OEW力可在施加其他力後施加。在又其他實例中，該等DEP及/或OEW力可在施加其他力之同時施加或以與其他力交替的方式施加。 圖1B、1C及2A至2H闡述可用於本發明之實施例之實務中之微流裝置之各種實施例。圖1B繪示其中微流裝置200係經組態成光學驅動型電動裝置之實施例。此項技術中已知各種光學驅動型電動裝置，其等包括具有光電子鑷子(OET)組態之裝置及具有光電濕潤(OEW)組態之裝置。合適之OET組態之實例係闡述於下列美國專利文件中，其等中之各者係以全文引用之方式併入本文中：美國專利案第RE 44,711號(Wu等人) (最初作為美國專利案第7,612,355號發證)；及美國專利案第7,956,339號(Ohta等人)。OEW組態之實例係闡述於美國專利案第6,958,132號(Chiou等人)及美國專利申請公開案第2012/0024708號(Chiou等人)中，其等中之兩者係以全文引用之方式併入本文中。光學驅動型電動裝置之又另一實例包括經組合之OET/OEW組態，其等之實例係顯示於美國專利公開案第20150306598 (Khandros等人)及20150306599 (Khandros等人)號及其等相應之PCT公開案WO2015/164846及WO2015/164847中，其等中之所有係以全文引用之方式併入本文中。 具有其中可放置、培養及/或監測生物微小物件之圈之微流裝置之實例已描述(例如)於US 2014/0116881 (2013年10月22日申請之申請案第14/060,117號)、US 2015/0151298 (2014年10月22日申請之申請案第14/520,568號)及US 2015/0165436 (2014年10月22日申請之申請案第14/521,447號)中，其等中之各者係以全文引用之方式併入本文中。美國申請案第14/520,568及14/521,447號亦描述分析培養於微流裝置中之細胞之分泌物之例示性方法。前述申請案中之各者進一步描述經組態以產生介電泳(DEP)力之微流裝置(諸如光電子鑷子(OET)或經組態以提供光電濕潤(OEW)之微流裝置。例如，闡述於US 2014/0116881之圖2中之光電子鑷子裝置係可用於本發明之實施例中以選擇及移動個別生物微小物件或生物微小物件之群之裝置之實例。 微流裝置驅動組態。如上文描述，系統之控制及監測裝備可包含用於在微流裝置之微流環路中選擇及移動物件(諸如微小物件或液滴)之驅動模組。該微流裝置可具有各種驅動組態，此取決於移動中之物件之類型及其他考量。例如，可利用介電泳(DEP)組態以在該微流環路中選擇及移動微小物件。因此，該微流裝置100之支持結構104及/或蓋110可包含用於對微流環路120之流體介質180中之微小物件選擇性誘導DEP力及藉此選擇、捕獲及/或移動個別微小物件或微小物件之群之DEP組態。或者，該微流裝置100之該支持結構104及/或蓋110可包含用於對微流環路120之流體介質180中之液滴選擇性誘導EW力及藉此選擇、捕獲及/或移動個別液滴或液滴之群之電濕潤(EW)組態。 包含DEP組態之微流裝置200之一個實例係闡述於圖1B及1C中。儘管出於簡化之目的，圖1B及1C分別顯示具有區/室202之該微流裝置200之外殼102之一部分之側面橫截面圖及頂部橫截面圖，但應瞭解該區/室202可為具有更詳細結構(諸如生長室、封存圈、流動路徑或流動通道)之流體環路元件之部分。此外，該微流裝置200可包括其他流體環路元件。例如，該微流裝置200可包括複數個生長室或封存圈及/或一或更多個流動區或流動通道，諸如彼等本文針對微流裝置100描述者。DEP組態可併入該微流裝置200之任何此等流體環路元件或其選擇部分內。應進一步知曉上文或下文描述之微流裝置組件及系統組件中之任何一者可併入該微流裝置200中及/或與該微流裝置200組合使用。例如，上文描述之包括控制及監測裝備152之系統150可與微流裝置200一起使用，系統150包括介質模組160、驅動模組162、成像模組164、傾斜模組166及其他模組168中之一或更多者。 如在圖1B中可見，微流裝置200包括具有底部電極204及上覆於該底部電極204之電極活化基板206之支持結構104及具有頂部電極210之蓋110，及該頂部電極210與該底部電極204隔開。該頂部電極210及該電極活化基板206界定區/室202之相對表面。該區/室202中含有之介質180因此在該頂部電極210與該電極活化基板206之間提供電阻連接。亦顯示經組態以連接至該底部電極204及該頂部電極210及在該等電極之間產生偏壓(如在區/室202中產生DEP力所需)之電源212。該電源212可為(例如)交流電流(AC)電源。 在某些實施例中，闡述於圖1B及1C中之微流裝置200可具有光學驅動型DEP組態。因此，來自光源216之光218之變化圖案(其可藉由驅動模組162控制)可選擇性活化及去活化DEP電極於電極活化基板206之內表面208之區214處之變化圖案。(下文中將具有DEP組態之微流裝置之區214稱為「DEP電極區」)。如圖1C中闡述，經定向至該電極活化基板206之內表面208上之光圖案218可以圖案(諸如正方形)照亮選擇DEP電極區214a (以白色顯示)。下文中將未經照亮之DEP電極區214 (交叉影線)稱為「暗」 DEP電極區214。通過該DEP電極活化基板206之相對電阻抗(即，自底部電極204直至在流動路徑106中與介質180相互作用之該電極活化基板206之內表面208)係大於在各暗DEP電極區214處通過在區/室202中之介質180之相對電阻抗(即，自該電極活化基板206之內表面208至蓋110之頂部電極210)。然而，經照亮之DEP電極區214a顯示通過電極活化基板206之減小之相對阻抗係小於通過在區/室202中之介質180在各經照亮之DEP電極區214a處之相對阻抗。 隨著電源212啟動，前述DEP組態在經照亮之DEP電極區214a與相鄰暗DEP電極區214之間之流體介質180中產生電場梯度，其進一步產生吸引或排斥流體介質180中之鄰近微小物件(未顯示)之局部DEP力。吸引或排斥流體介質180中之微小物件之DEP電極可因此在區/室202之內表面208處之許多不同此DEP電極區214處藉由改變自光源216投射至該微流裝置200內之光圖案218而加以選擇性活化或去活化。該等DEP力吸引或排斥鄰近微小物件可取決於此等參數，諸如該電源212之頻率及介質180及/或微小物件(未顯示)之介電性質。 闡述於圖1C中經照亮之DEP電極區214a之正方形圖案220僅為實例。DEP電極區214之任何圖案可藉由經投射至微流裝置200內之光218之圖案照亮(及藉此活化)，及經照亮/活化之DEP電極區214之圖案可藉由改變或移動該光圖案218來重複改變。 在一些實施例中，電極活化基板206可包含光導材料或由光導材料組成。在此等實施例中，該電極活化基板206之內表面208可為無特徵的。例如，該電極活化基板206可包含氫化非晶矽(a-Si:H)層或由氫化非晶矽(a-Si:H)層組成。該a-Si:H可包含(例如)約8%至40%之氫(計算為100 *氫原子數量/氫原子及矽原子之總數量)。a-Si:H層可具有約500 nm至約2.0 □m之厚度。在此等實施例中，該等DEP電極區214可根據該光圖案218產生於該電極活化基板206之內表面208上任何地方並呈任何圖案形式。該等DEP電極區214之數量及圖案因此無需固定，但可對應於該光圖案218。諸如上文討論具有包含光導層之DEP組態之微流裝置已經描述(例如)於美國專利案第RE 44,711號(Wu等人) (最初作為美國專利案第7,612,355號發證)中，該案係以全文引用之方式併入本文中。 在其他實施例中，電極活化基板206可包含包括形成諸如半導體領域已知的半導體積體環路之複數個摻雜層、電絕緣層(或區)及導電層之基板。例如，該電極活化基板206可包含複數個光電晶體，其等包括(例如)橫向雙極光電晶體，各光電晶體對應於DEP電極區214。或者，該電極活化基板206可包含藉由光電晶體開關控制之電極(例如，導電金屬電極)，及各此電極對應於DEP電極區214。該電極活化基板206可包括此光電晶體或受光電晶體控制之電極之圖案。該圖案(例如)可為以行列形式配置之大體上正方形光電晶體或受光電晶體控制之電極之陣列，諸如圖2B中顯示。或者，該圖案可為形成六角形晶格之大體上六角形光電晶體或受光電晶體控制之電極之陣列。無論圖案如何，電性環路元件在電極活化基板206之內表面208之DEP電極區214與底部電極210之間形成電連接，及彼等電連接(即，光電晶體或電極)可藉由光圖案218選擇性活化及去活化。當未經活化時，各電連接可具有高阻抗使得通過電極活化基板206之相對阻抗(即，自底部電極204至在區/室202中與介質180相互作用之電極活化基板206之內表面208)係大於在相應DEP電極區214處通過介質180之相對阻抗(即，自電極活化基板206之內表面208至蓋110之頂部電極210)。然而，當藉由光圖案218中之光活化時，通過該電極活化基板206之相對阻抗係小於在各經照亮之DEP電極區214處通過該介質180之相對阻抗，藉此活化如上文討論之相應DEP電極區214處之DEP電極。吸引或排斥該介質180中之微小物件(未顯示)之DEP電極可因此在區/室202中之電極活化基板206之內表面208之許多不同DEP電極區214處以藉由光圖案218決定之方式加以選擇性活化及去活化。 具有包含光電晶體之電極活化基板之微流裝置之實例已經描述(例如)於美國專利案第7,956,339號(Ohta等人) (參見，例如，圖21及22繪示之裝置300及其說明)及美國專利公開案第2016/0184821號(Hobbs等人) (參見，例如，整個圖式中繪示之裝置200、502、504、600及700及其說明)中，該等案件中之各者係以全文引用之方式併入本文中。具有包含由光電晶體開關控制之電極之電極活化基板之微流裝置之實例已經描述(例如)於美國專利公開案第2014/0124370號(Short等人) (參見，例如，整個圖式中繪示之裝置200、400、500、600及900及其說明)中，該案係以全文引用之方式併入本文中。 在DEP組態微流裝置之一些實施例中，頂部電極210係外殼102之第一壁(或蓋110)之部分，及電極活化基板206及底部電極204係外殼102之第二壁(或支持結構104)之部分。區/室202可在該第一壁與該第二壁之間。在其他實施例中，該電極210係該第二壁(或支持結構104)之部分及該電極活化基板206及/或該電極210中之一者或兩者係該第一壁(或蓋110)之部分。此外，該光源216可或者用以自下方照亮外殼102。 由於圖1B至1C之微流裝置200具有DEP組態，因此驅動模組162可藉由將光圖案218投射至該微流裝置200內以活化電極活化基板206之內表面208之DEP電極區214a處之第一組一或更多個DEP電極以圍繞及捕獲該微小物件之圖案(例如，正方形圖案220)選擇區/室202中之介質180中之微小物件(未顯示)。該驅動模組162可然後藉由相對於該微流裝置200移動該光圖案218以活化DEP電極區214處之第二組一或更多個DEP電極來移動原位產生之經捕獲之微小物件。或者，該微流裝置200可相對於該光圖案218移動。 在其他實施例中，該微流裝置200可具有非依賴於電極活化基板206之內表面208處之DEP電極之光活化之DEP組態。例如，該電極活化基板206可包含相對於包括至少一個電極之表面(例如，蓋110)定位之選擇性可定址及可通電電極。開關(例如，在半導體基板中之電晶體開關)可經選擇性開啟及閉合以活化或去活化DEP電極區214處之DEP電極，藉此對區/室202中之於經活化之DEP電極附近之微小物件(未顯示)產生淨DEP力。取決於諸如電源212之頻率及在區/室202中之介質(未顯示)及/或微小物件之介電性質之特性，該DEP力可吸引或排斥相鄰微小物件。藉由選擇性活化及去活化一組DEP電極(例如，在形成正方形圖案220之一組DEP電極區214處)，區/室202中之一或更多個微小物件可經捕獲並在該區/室202內移動。圖1A中之驅動模組162可控制此等開關及因此活化及去活化DEP電極中之個別電極以在該區/室202周圍選擇、捕獲及移動特定微小物件(未顯示)。具有包括選擇性可定址及可通電電極之DEP組態之微流裝置係此項技術中已知且已經描述(例如)於美國專利案第6,294,063號(Becker等人)及6,942,776號(Medoro)中，該等案件以全文引用之方式併入本文中。 作為又另一實例，微流裝置200可具有電濕潤(EW)組態，其可取代DEP組態或可位於微流裝置200之自具有該DEP組態之部分分離之一部分上。該EW組態可為光電濕潤組態或介電濕潤(electrowetting on dielectric，EWOD)組態，其等均為此項技術中已知。在一些EW組態中，支持結構104具有夾在介電層(未顯示)與底部電極204之間之電極活化基板206。如下文描述，該介電層可包含疏水性材料及/或可用疏水性材料塗佈，就具有EW組態之微流裝置200而言，該支持結構104之內表面208係該介電層之內表面或其疏水性塗層。 介電層(未顯示)可包含一或更多個氧化物層，且可具有約50 nm至約250 nm (例如，約125 nm至約175 nm)之厚度。在某些實施例中，該介電層可包含氧化物層，諸如金屬氧化物(例如，氧化鋁或氧化鉿)。在某些實施例中，該介電層可包含除金屬氧化物外之介電材料，諸如氧化矽或氮化矽。無論精確組成及厚度如何，該介電層可具有約10 kOhm至約50 kOhm之阻抗。 在一些實施例中，介電層之向內面向區/室202之表面係用疏水性材料塗佈。該疏水性材料可包含(例如)氟化碳分子。氟化碳分子之實例包括全氟聚合物，諸如聚四氟乙烯(例如，TEFLON®)或聚(2,3-二氟甲烯基-全氟四氫呋喃) (例如，CYTOP™)。組成該疏水性材料之分子可共價結合至該介電層之表面。例如，該疏水性材料之分子可藉助於諸如矽氧烷基團、膦酸基團或硫醇基團之連接子共價結合至該介電層之表面。因此，在一些實施例中，該疏水性材料可包含烷基封端之矽氧烷、烷基封端之膦酸或烷基封端之硫醇。該烷基可為長鏈烴(例如，具有至少10個碳或至少16、18、20、22或更多個碳之鏈)。或者，氟化(或全氟化)碳鏈可用以取代烷基。因此，例如，該疏水性材料可包含氟烷基封端之矽氧烷、氟烷基封端之膦酸或氟烷基封端之硫醇。在一些實施例中，該疏水性塗層具有約10 nm至約50 nm之厚度。在其他實施例中，該疏水性塗層具有小於10 nm (例如，小於5 nm或約1.5至3.0 nm)之厚度。 在一些實施例中，具有電濕潤組態之微流裝置200之蓋110亦係用疏水性材料(未顯示)塗佈。該疏水性材料可為用以塗佈支持結構104之介電層之相同疏水性材料及該疏水性塗層可具有與該支持結構104之介電層上之疏水性塗層之厚度大體上相同之厚度。此外，該蓋110可以該支持結構104之方式包含夾在介電層與頂部電極210之間之電極活化基板206。該蓋110之電極活化基板206及介電層可具有與該支持結構104之電極活化基板206及介電層相同之組成及/或尺寸。因此，該微流裝置200可具有兩個電濕潤表面。 在一些實施例中，電極活化基板206可包含諸如上文描述之光導材料。因此，在某些實施例中，該電極活化基板206可包含氫化非晶矽(a-Si:H)層或由氫化非晶矽(a-Si:H)層組成。該a-Si:H可包含(例如)約8%至40%氫(計算為100 *氫原子數量/氫原子及矽原子之總數量)。該a-Si:H層可具有約500 nm至約2.0 □m之厚度。或者，如上文描述，該電極活化基板206可包含由光電晶體開關控制之電極(例如，導電金屬電極)。具有光電濕潤組態之微流裝置係此項技術中已知及/或可用此項技術中已知之電極活化基板構築。例如，美國專利案第6,958,132號(Chiou等人)(該案以全文引用之方式併入本文中)揭示具有光導材料諸如a-Si:H之光電濕潤組態，而上文參考之美國專利公開案第2014/0124370號(Short等人)揭示具有由光電晶體開關控制之電極之電極活化基板。 微流裝置200因此可具有光電濕潤組態，及光圖案218可用以活化在電極活化基板206中之光導EW區或光響應EW電極。該電極活化基板206之此等經活化之EW區或EW電極可於支持結構104之內表面208(即，上覆介電層之內表面或其疏水性塗層)產生電濕潤力。藉由改變入射於電極活化基板206上之光圖案218 (或相對於光源216移動微流裝置200)，與支持結構104之內表面208接觸之液滴(例如，含有水性介質、溶液或溶劑)可移動通過區/室202中存在之不相混流體(例如，油介質)。 在其他實施例中，微流裝置200可具有EWOD組態，及電極活化基板206可包含非依賴於用於活化之光之選擇性可定址及可通電電極。該電極活化基板206因此可包括此等電濕潤(EW)電極之圖案。該圖案(例如)可為以行列形式配置之大體上正方形EW電極之陣列，諸如圖2B中顯示。或者，該圖案可為形成六角形晶格之大體上六角形EW電極之陣列。無論該圖案如何，該等EW電極可藉由電開關(例如，半導體基板中之電晶體開關)選擇性活化(或去活化)。藉由選擇性活化及去活化該電極活化基板206中之EW電極，與上覆介電層之內表面208或其疏水性塗層接觸之液滴(未顯示)可在區/室202內移動。圖1A中之驅動模組162可控制此等開關及因此活化及去活化個別EW電極以繞區/室202選擇及移動特定液滴。具有具有選擇性可定址及可通電電極之EWOD組態之微流裝置係此項技術中已知及已經描述(例如)於美國專利案第8,685,344號(Sundarsan等人)中，該等案件以全文引用之方式併入本文中。 無論微流裝置200之組態如何，電源212可用以提供勢能(例如，AC電壓勢能)，其可向該微流裝置200之環路供電。該電源212可與圖1中參考之電源192相同或係圖1中參考之電源192之組件。電源212可經組態以向頂部電極210及底部電極204提供提供AC電壓及/或電流。就AC電壓而言，該電源212可提供足以產生足夠強以至於可捕獲及移動區/室202中之個別微小物件(未顯示)之淨DEP力(或電濕潤力) (如上文討論)及/或足以改變區/室202中之支持結構104之內表面208 (即，介電層及/或該介電層上之疏水性塗層)之濕潤性質(亦如上文討論)之頻率範圍及平均或峰值功率(例如，電壓或電流)範圍。此項技術中已知此等頻率範圍及平均或峰值功率範圍。參見，例如，美國專利案第6,958,132號(Chiou等人)、美國專利案第RE44,711號(Wu等人) (最初作為美國專利案第7,612,355號發證)及美國專利申請公開案第US2014/0124370 (Short等人)號、US2015/0306598 (Khandros等人)及US2015/0306599 (Khandros等人)。封存圈。 一般封存圈224、226及228之非限制性實例係顯示於圖2A至2C中繪示之微流裝置230內。各封存圈224、226及228可包含分離結構232，其界定分離區240及將分離區240流體連接至通道122之連接區236。該連接區236可包含與微流通道122連通之近側開口234及與分離區240連通之遠端開口238。該連接區236可經組態使得流體介質(未顯示)之流自該微流通道122流動進入封存圈224、226、228內之最大滲透深度不延伸至該分離區240內。因此，由於該連接區236，配置於封存圈224、226、228之分離區240中之微小物件(未顯示)或其他材料(未顯示)可因此自該微流通道122中之介質180之流分離及不大體上受該微流通道122中之介質180之流之影響。 圖2A至2C之封存圈224、226及228各具有單一開口，其直接向微流通道122敞開。該等封存圈之開口自該微流通道122橫向敞開。電極活化基板206下伏於該微流通道122及該等封存圈224、226及228。電極活化基板206之位於封存圈外殼內之上表面(形成封存圈之基底)係配置於與電極活化基板206之位於微流通道122 (或若不存在通道則為流動路徑)內之上表面(形成該微流裝置之流動通道(或分別流動路徑)之基底)之相同水平面或大體上相同水平面。該電極活化基板206可為無特徵的或可具有無規則或圖案化表面，其自其最高高程至其最低凹陷改變小於約3微米、2.5微米、2微米、1.5微米、1微米、0.9微米、0.5微米、0.4微米、0.2微米、0.1微米或更小。基板之上表面跨該微流通道122 (或流動路徑)及封存圈兩者之高程變化可小於封存圈之壁或微流裝置之壁之高度之約3%、2%、1%. 0.9%、0.8%、0.5%、0.3%或0.1%。當針對微流裝置200更詳細描述時，此亦適用至本文描述之微流裝置100、230、250、280、290、320、400、450、500、700中之任何一者。 微流通道122可因此係掃及區之實例，及封存圈224、226、228之分離區240可為未掃及區之實例。注意，微流通道122及封存圈224、226、228可經組態以含有一或更多個流體介質180。在圖2A至2B顯示之實例中，出入口222係連接至該微流通道122及容許流體介質180引入至該微流裝置230內或自該微流裝置230移除。在引入至該流體介質180前，該微流裝置可用諸如二氧化碳氣體之氣體啟動。當該微流裝置230含有該流體介質180時，該微流通道122中之流體介質180之流242可經選擇性產生及停止。例如，如顯示，該等出入口222可配置於該微流通道122之不同位置(例如，相對端)處，及可自充當入口之一個出入口222至充當出口之另一出入口222產生介質之流242。 圖2C闡述根據本發明之封存圈224之實例之詳細視圖。亦顯示微小物件246之實例。 眾所周知，微流通道122中之流體介質180之流242流經封存圈224之近側開口234可引起介質180之第二流244流入及/或流出該封存圈224。為自該第二流244中分離封存圈224之分離區240中之微小物件246，封存圈224之連接區236之長度Lcon (即，自近側開口234至遠端開口238)應大於第二流244於連接區236內之滲透深度Dp 。該第二流244之滲透深度Dp 取決於流體介質180在該微流通道122中之流動速度及有關微流通道122之組態之各種參數及連接區236之與該微流通道122連通之近側開口234。就給定微流裝置而言，該微流通道122之組態及該開口234將固定，而流體介質180在該微流通道122中之流242之速率將係可變的。因此，就各封存圈224而言，針對流體介質180在通道122中之流242之最大速度Vmax 可經識別以確保該第二流244之滲透深度Dp 不超過該連接區236之長度Lcon 。只要流體介質180在該微流通道122中之流242之速率不超過最大速度Vmax ，則所得第二流244可限制於該微流通道122及該連接區236及保持在該分離區240外。介質180在該微流通道122中之流242因此不將微小物件246拉出該分離區240。相反，位於該分離區240中之微小物件246無論流體介質180在該微流通道122中之流242如何皆將停留在該分離區240中。 此外，只要介質180在該微流通道122中之流242之速率不超過Vmax ，則流體介質180在該微流通道122中之流242將不使混雜微粒(例如，微粒及/或奈米微粒)自該微流通道122移動至封存圈224之該分離區240內。使該連接區236之長度Lcon 大於該第二流244之最大滲透深度Dp 可因此防止一個封存圈224受來自微流通道122或另一封存圈(例如，圖2D中之封存圈226、228)之混雜微粒污染。 因微流通道122及封存圈224、226、228之連接區236可受介質180在微流通道122中之流242之影響，因此該微流通道122及連接區236可被視為微流裝置230之掃及(或流動)區。在另一方面，該等封存圈224、226、228之分離區240可被視為未掃及(或非流動)區。例如，該微流通道122中之第一流體介質180之組分(未顯示)可與該分離區240中之第二流體介質248混合，該混合大體上僅藉由第一介質180之組分自該微流通道122擴散通過該連接區236及進入該分離區240中之該第二流體介質248內來實現。同樣地，該分離區240中之該第二介質248之組分(未顯示)可與該微流通道122中之該第一介質180混合，該混合大體上僅藉由該第二介質248之組分自該分離區240擴散通過該連接區236及進入該微流通道122中之該第一介質180內來實現。在一些實施例中，在封存圈之該分離與該流動路徑之間藉由擴散進行之流體介質交換程度係大於流體交換之約90%、91%、92%、93%、94% 95%、96%、97%、98%或大於約99%。該第一介質180可為與該第二介質248相同之介質或與該第二介質248不同之介質。此外，該第一介質180及該第二介質248可起始時相同，然後變得不同(例如，通過藉由該分離區240中之一或更多個元件調整該第二介質248，或改變流動通過該微流通道122之該介質180)。 如上文提及，由流體介質180在微流通道122之流242引起之第二流244之最大滲透深度Dp 可取決於許多參數。此等參數之實例包括：該微流通道122之形狀(例如，該微流通道可將介質引入至該連接區236內，轉移介質使其遠離該連接區236，或在大體上垂直於該連接區236之近側開口234之方向上將介質引向該微流通道122)；該微流通道122在該近側開口234處之寬度Wch (或橫截面積)；及該連接區236在該近側開口234處之寬度Wcon (或橫截面積)；流體介質180在該微流通道122中之流242之速度V；第一介質180及/或第二介質248或類似物之黏度。 在一些實施例中，微流通道122及封存圈224、226、228之尺寸可如下相對於流體介質180在該微流通道122中之流242之向量而加以定向：微流通道寬度Wch (或該微流通道122之橫截面積)可大體上垂直於介質180之流242；連接區236在開口234處之寬度Wcon (或橫截面積)可大體上平行於介質180在該微流通道122中之流242；及/或該連接區之長度Lcon 可大體上垂直於介質180在該微流通道122中之流242。前述內容僅為實例，及該微流通道122及封存圈224、226、228之相對位置可相對於彼此呈其他定向。 如圖2C中闡述，連接區236之寬度Wcon 自近側開口234至遠端開口238可為均勻的。連接區236在該遠端開口238處之寬度Wcon 可因此在本文針對該連接區236在該近側開口234處之寬度Wcon 識別之範圍之任何一者中。或者，該連接區236在該遠端開口238處之寬度Wcon 可大於該連接區236在該近側開口234處之寬度Wcon 。 如圖2C中闡述，分離區240在遠端開口238處之寬度可與連接區236在近側開口234處之寬度Wcon 大體上相同。該分離區240在該遠端開口238處之寬度可因此在本文針對該連接區236在該近側開口234處之寬度Wcon 識別之範圍之任何一者中。或者，該分離區240在該遠端開口238處之寬度可大於或小於該連接區236在該近側開口234處之寬度Wcon 。此外，該遠端開口238可小於該近側開口234及該連接區236之寬度Wcon 可在該近側開口234與遠端開口238之間逐漸變窄。例如，該連接區236可在該近側開口與該遠端開口之間逐漸變窄，其使用各種不同幾何(例如，去角斜切該連接區，斜切該連接區)。此外，該連接區236之任何部分或子部分可逐漸變窄(例如，該連接區之一部分與該近側開口234相鄰)。 圖2D至2F繪示含有微流環路262及流動通道264之微流裝置250之另一例示性實施例，其等係圖1A之各自微流裝置100、環路132及通道134之變更。該微流裝置250亦具有複數個封存圈266，其為上文描述之封存圈124、126、128、130、224、226或228之額外變更。特定言之，應該知曉圖2D至2F中顯示之裝置250之封存圈266可置換裝置100、200、230、280、290、300中之上文描述之封存圈124、126、128、130、224、226或228中之任何一者。同樣地，該微流裝置250係該微流裝置100之另一變體，且亦可具有與上文描述之微流裝置100、200、230、280、290、300相同或不同之DEP組態，及本文描述之其他微流系統組件中之任何一者。 圖2D至2F之微流裝置250包含支持結構(圖2D至2F中不可見，但可與圖1A中繪示之裝置100之支持結構104相同或大體上相似)、微流環路結構256及蓋(圖2D至2F中不可見，但可與圖1A中繪示之裝置100之蓋122相同或大體上相似)。該微流環路結構256包括框架252及微流環路材料260，其等可與圖1A中顯示之裝置100之框架114及微流環路材料116相同或大體上相似。如圖2D中顯示，藉由該微流環路材料260界定之微流環路262可包含流體連接多個封存圈266之多個通道264 (顯示兩個但可存在更多)。 各封存圈266可包含分離結構272、該分離結構272內之分離區270及連接區268。自微流通道264處之近側開口274至該分離結構272處之遠端開口276，該連接區268將該微流通道264流體連接至該分離區270。通常，根據圖2B及2C之上述討論，通道264中之第一流體介質254之流278可產生第一介質254自該微流通道264流入及/或流出該等封存圈266之各自連接區268之第二流282。 如圖2E中闡述，各封存圈266之連接區268通常包括在通道264之近側開口274與分離結構272之遠端開口276之間延伸之區域。該連接區268之長度Lcon 可大於第二流282之最大滲透深度Dp ，在該情況下，該第二流282將延伸進入該連接區268內而不重定向該分離區270 (如圖2D中顯示)。或者，如圖2F中闡述，該連接區268可具有小於最大滲透深度Dp 之長度Lcon ，在該情況下該第二流282將延伸通過該連接區268及重定向該分離區270。在此後者情況下，連接區268之長度Lc1 及Lc2 之總和係大於最大滲透深度Dp ，使得第二流282將不延伸至分離區270內。無論連接區268之長度Lcon 是否大於該滲透深度Dp 或連接區268之長度Lc1 及Lc2 之總和是否大於該滲透深度Dp ，第一介質254在通道264中不超過Vmax 之最大速度之流278將產生具有滲透深度Dp 之第二流，及封存圈266之該分離區270中之微小物件(未顯示但可與圖2C中顯示之微小物件246相同或大體上相似)未被第一介質254在通道264中之流278拉出該分離區270。通道264中之流278亦未將混雜材料(未顯示)自通道264拉入封存圈266之分離區270內。因此，擴散係使微流通道264中之第一介質254中之組分可自該微流通道264移動至封存圈266之分離區270中之第二介質258內之唯一機制。同樣地，擴散係使封存圈266之分離區270中之第二介質258中之組分可自該分離區270移動至該微流通道264中之第一介質254內之唯一機制。該第一介質254可與該第二介質258相同，或該第一介質254可與該第二介質258不同。或者，該第一介質254及該第二介質258可初始時相同，然後變得不同，例如，通過藉由該分離區270中之一或更多個元件調整該第二介質，或藉由改變流動通過該微流通道264之介質。 如圖2E中闡述，微流通道264中微流通道264之寬度Wch (即，截取流體介質流動通過該微流通道之方向(在圖2D中由箭頭278指示)之橫向上)可大體上垂直於近側開口274之寬度Wcon1 及因此大體上平行於遠端開口276之寬度Wcon2 。然而，該近側開口274之寬度Wcon1 及該遠端開口276之寬度Wcon2 無需大體上彼此垂直。例如，在該近側開口274之寬度Wcon1 定向之軸(未顯示)與該遠端開口276之寬度Wcon2 定向之另一軸之間之角度可為除垂直外及因此除90°外。經替代定向之角度之實例包括在下列範圍之任何一者中之角度：自約30°至約90°；自約45°至約90°；自約60°至約90°或類似角度。 在封存圈(例如，124、126、128、130、224、226、228或266)之各種實施例中，分離區(例如，240或270)係經組態以含有複數個微小物件。在其他實施例中，該分離區可經組態以含有僅一、二、三、四、五或類似相對較小數量之微小物件。因此，分離區之體積可為(例如)至少2x105 、4x105 、8x105 、1x106 、2x106 、4x106 、8x106 立方微米或更大。 在封存圈之各種實施例中，微流通道(例如，122)於近側開口(例如，234)處之寬度Wch 可於下列範圍之任何一者內：約50至1000微米、50至500微米、50至400微米、50至300微米、50至250微米、50至200微米、50至150微米、50至100微米、70至500微米、70至400微米、70至300微米、70至250微米、70至200微米、70至150微米、90至400微米、90至300微米、90至250微米、90至200微米、90至150微米、100至300微米、100至250微米、100至200微米、100至150微米及100至120微米。在一些其他實施例中，該微流通道(例如，122)於近側開口(例如，234)處之寬度Wch 可在約200至800微米、200至700微米或200至600微米之範圍內。前述內容僅為實例，及該微流通道122之寬度Wch 可在其他範圍(例如，藉由上文列舉之端點中之任何一者界定之範圍)內。此外，該微流通道122之Wch 可經選擇以落於該微流通道除於封存圈之近側開口處外之區中之此等範圍之任何一者內。 在一些實施例中，封存圈具有約30至約200微米或約50至約150微米之高度。在一些實施例中，該封存圈具有約1 x104 至3 x106 平方微米、2 x104 至2 x106 平方微米、4 x104 至1 x106 平方微米、2 x104 至5 x105 平方微米、2 x104 至1 x105 平方微米或約2 x105 至2x106 平方微米之橫截面積。 在封存圈之各種實施例中，微流通道(例如，122)於近側開口(例如，234)處之高度Hch 可於下列範圍之任何一者內：20至100微米、20至90微米、20至80微米、20至70微米、20至60微米、20至50微米、30至100微米、30至90微米、30至80微米、30至70微米、30至60微米、30至50微米、40至100微米、40至90微米、40至80微米、40至70微米、40至60微米或40至50微米。前述內容僅為實例，及微流通道(例如，122)之高度Hch 可在其他範圍(例如，例如，藉由上文列舉之端點中之任何一者界定之範圍)內。該微流通道122之高度Hch 可經選擇以落於該微流通道除於封存圈之近側開口處外之區中之此等範圍之任何一者內。 在封存圈之各種實施例中，微流通道( 例如，122)於近側開口(例如，234)處之橫截面積可於下列範圍之任何一者內：500至50,000平方微米、500至40,000平方微米、500至30,000平方微米、500至25,000平方微米、500至20,000平方微米、500至15,000平方微米、500至10,000平方微米、500至7,500平方微米、500至5,000平方微米、1,000至25,000平方微米、1,000至20,000平方微米、1,000至15,000平方微米、1,000至10,000平方微米、1,000至7,500平方微米、1,000至5,000平方微米、2,000至20,000平方微米、2,000至15,000平方微米、2,000至10,000平方微米、2,000至7,500平方微米、2,000至6,000平方微米、3,000至20,000平方微米、3,000至15,000平方微米、3,000至10,000平方微米、3,000至7,500平方微米或3,000至6,000平方微米。前述內容僅為實例，及該微流通道(例如，122)於近側開口(例如，234)處之橫截面積可在其他範圍(例如，例如，藉由上文列舉之端點中之任何一者界定之範圍)內。 在封存圈之各種實施例中，連接區(例如，236)之長度Lcon 可於下列範圍之任何一者內：約1至600微米、5至550微米、10至500微米、15至400微米、20至300微米、20至500微米、40至400微米、60至300微米、80至200微米或約100至150微米。前述內容僅為實例，及連接區(例如，236)之長度Lcon 可在與前述實例不同之範圍(例如，例如，藉由上文列舉之端點中之任何一者界定之範圍)內。 在封存圈之各種實施例中，連接區(例如，236)於近側開口(例如，234)處之寬度Wcon 可於下列範圍之任何一者內：20至500微米、20至400微米、20至300微米、20至200微米、20至150微米、20至100微米、20至80微米、20至60微米、30至400微米、30至300微米、30至200微米、30至150微米、30至100微米、30至80微米、30至60微米、40至300微米、40至200微米、40至150微米、40至100微米、40至80微米、40至60微米、50至250微米、50至200微米、50至150微米、50至100微米、50至80微米、60至200微米、60至150微米、60至100微米、60至80微米、70至150微米、70至100微米及80至100微米。前述內容僅為實例，及連接區(例如，236)於近側開口(例如，234)處之寬度Wcon 可與前述實例不同(例如，例如，藉由上文列舉之端點中之任何一者界定之範圍)。 在封存圈之各種實施例中，連接區(例如，236)於近側開口(例如，234)處之寬度Wcon 可至少與該封存圈意欲裝載之微小物件(例如，生物細胞，諸如經活化之T細胞)之最大尺寸一樣大。前述內容僅為實例，及連接區(例如，236)於近側開口(例如，234)處之寬度Wcon 可與前述實例(例如，例如，藉由上文列舉之端點中之任何一者界定之範圍)不同。 在封存圈之各種實施例中，連接區(例如，236)之長度Lcon 相對於連接區(例如，236)於近側開口234處之寬度Wcon 之比率可大於或等於下列比率中之任何一者：0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0或更大。前述內容僅為實例，及連接區236之長度Lcon 相對於連接區236於近側開口234處之寬度Wcon 之比率可與前述實例不同。 在微流裝置100、200、23、250、280、290、300之各種實施例中，Vmax 可設定為約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.7、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、10、11、12、13、14、15微升/sec或更大。 在具有封存圈之微流裝置之各種實施例中，封存圈之分離區(例如，240)之體積可為(例如)至少1x105 、2x105 、4x105 、8x105 、1x106 、2x106 、4x106 、6x106 、8x106 、1x107 、5x107 、1x108 、5x108 或8x108 立方微米或更大。在具有封存圈之微流裝置之各種實施例中，封存圈之體積可為約2x105 、5x105 、8x105 、1x106 、2x106 、4x106 、8x106 、1x107 、3x107 、5x107 或約8x107 立方微米或更大。在一些其他實施例中，封存圈之體積可為約0.1奈升至約50奈升、0.2奈升至約25奈升、0.5奈升至約20奈升、約0.8奈升至約15奈升或約1奈升至約10奈升。 在各種實施例中，該微流裝置具有如本文討論之實施例之任何一者中組態之封存圈，其中該微流裝置具有約5至約10個封存圈、約10至約50個封存圈、約100至約500個封存圈、約200至約1000個封存圈、約500至約1500個封存圈、約1000至約2000個封存圈、約1500至約3000、約2000至約4000、約2500至約5000、約3000至約6000、約3500至約7000、約4000至約8000、約4500至約9000或約5000至約10,000個封存圈。該等封存圈無需全部相同尺寸及可包括各種組態(例如，於該封存圈內之不同寬度、不同特徵)。 圖2G闡述根據一個實施例之微流裝置280。圖2G中闡述之微流裝置280係微流裝置100之程式化圖。在實務中，該微流裝置280及其構成環路元件(例如，通道122及封存圈128)將具有本文討論之尺寸。圖2G中闡述之微流環路120具有兩個出入口107、四個不同通道122及四個不同流動路徑106。該微流裝置280進一步包含向各通道122開啟之複數個封存圈。在圖2G闡述之微流裝置中，該等封存圈具有類似於圖2C中闡述之圈之幾何結構及因此具有連接區及分離區兩者。因此，該微流環路120包括掃及區(例如，通道122及連接區236之位於第二流244之最大滲透深度Dp 內之部分)及未掃及區(例如，分離區240及連接區236之非位於第二流244之最大滲透深度Dp 內之部分)兩者。 圖3A至3B顯示可用以操作及觀察根據本發明之微流裝置(例如，100、200、230、250、280、290、300)之系統150之各種實施例。如圖3A中闡述，該系統150可包括經組態以容納微流裝置100 (未顯示)或本文描述之任何其他微流裝置之結構(「嵌套」) 300。該嵌套300可包括可與微流裝置320 (例如，光學驅動之電動裝置100)相互作用並提供自電源192至微流裝置320之電連接之插座302。該嵌套300可進一步包括積體電信號產生子系統304。該電信號產生子系統304可經組態以向插座302供應偏壓使得在微流裝置320藉由插座302固持時跨越微流裝置320中之電極對施加該偏壓。因此，該電信號產生子系統304可為電源192之部分。向微流裝置320施加偏壓之能力不意謂在該微流裝置320係藉由該插座302固持時將隨時施加偏壓。相反，在大多數情況下，將間歇性施加該偏壓，例如，僅在需要於該微流裝置320中促進電動力(諸如介電泳或電濕潤)之產生時施加。 如圖3A中闡述，該嵌套300可包括印刷電路板總成(PCBA) 322。該電信號產生子系統304可安裝於該PCBA 322上及電整合於該PCBA 322內。例示性支持件包括亦安裝於PCBA 322上之插座302。 通常，電信號產生子系統304將包括波形發生器(未顯示)。該電信號產生子系統304可進一步包括經組態以放大接收自該波形發生器之波形之示波器(未顯示)及/或波形放大電路(未顯示)。該示波器(若存在)可經組態以量測向藉由插座302固持之微流裝置320供應之波形。在某些實施例中，該示波器量測在接近微流裝置320之位置(及遠離波形發生器)處之波形，因此確保量測實際施加至該裝置之波形之較大精確度。自該示波器量測獲得之資料可(例如)作為對該波形發生器之回饋提供，及該波形發生器可經組態以基於此回饋調節其輸出。合適之組合波形發生器及示波器之實例係Red Pitaya™。 在某些實施例中，嵌套300進一步包含控制器308，諸如用以感測及/或控制電信號產生子系統304之微處理器。合適之微處理器之實例包括Arduino™微處理器，諸如Arduino Nano™。該控制器308可用以進行功能及分析或可與外部主控制器154 (圖1A中顯示)通訊以執行功能及分析。在圖3A闡述之實施例中，該控制器308通過界面310 (例如，插頭或連接器)與主控制器154通訊。 在一些實施例中，嵌套300可包含電信號產生子系統304，其包含Red Pitaya™波形發生器/示波器單元(「Red Pitaya單元」)及放大由該Red Pitaya單元產生之波形及將經放大之電壓傳送至該微流裝置100之波形放大電路。在一些實施例中，該Red Pitaya單元係經組態以量測於該微流裝置320處之經放大之電壓及然後視需要調節其自身輸出電壓使得於該微流裝置320處之經量測之電壓係所需值。在一些實施例中，該波形放大電路可具有由一對安裝於該PCBA 322上之DC-DC轉換器產生之+6.5V至-6.5V電源供應，其於微流裝置100處導致高達13 Vpp之信號。 如圖3A中闡述，支持結構300 (例如，嵌套)可進一步包括熱控制子系統306。該熱控制子系統306可經組態以調節藉由該支持結構300固持之微流裝置320之溫度。例如，該熱控制子系統306可包括帕耳帖(Peltier)熱電裝置(未顯示)及冷卻單元(未顯示)。該帕耳帖熱電裝置可具有經組態以與該微流裝置320之至少一個表面相互作用之第一表面。該冷卻單元可為(例如)冷卻塊(未顯示)，諸如經液體冷卻之鋁塊。該帕耳帖熱電裝置之第二表面(例如，與該第一表面相對之表面)可經組態以與此冷卻塊之表面相互作用。該冷卻塊可連接至經組態以循環經冷卻之流體使該流體通過該冷卻塊之流體路徑314。在圖3A闡述之實施例中，該支持結構300包含入口316及出口318以接收來自外部儲器(未顯示)之經冷卻之流體，將該經冷卻之流體引入至該流體路徑314內及通過該冷卻塊，及然後使該經冷卻之流體返回至該外部儲器。在一些實施例中，該帕耳帖熱電裝置、冷卻單元及/或該流體路徑314可安裝於該支持結構300之外殼312上。在一些實施例中，該熱控制子系統306係經組態以調節該帕耳帖熱電裝置之溫度以便於針對該微流裝置320達成目標溫度。該帕耳帖熱電裝置之溫度調節可(例如)藉由熱電源供應諸如Pololu™熱電源供應(Pololu Robotics and Electronics Corp.)達成。該熱控制子系統306可包括回饋電路，諸如由類比電路提供之溫度值。或者，該回饋電路可由數位電路提供。 在一些實施例中，嵌套300可包括具有回饋電路之熱控制子系統306，該回饋電路係包括電阻器(例如，具有電阻1 kOhm+/-0.1 %，溫度係數+/-0.02 ppm/C0)及NTC熱阻器(例如，具有標稱電阻1 kOhm+/-0.01 %)之類比電壓除法器電路(未顯示)。在一些實例中，該熱控制子系統306量測來自該回饋電路之電壓及然後使用經計算之溫度值作為對板上PID控制回路演算法之輸入。來自該PID控制回路演算法之輸出可驅動(例如) Pololu™馬達驅動(未顯示)上之方向性及脈衝寬度經調節之信號針以致動熱電源供應，藉此控制該帕耳帖熱電裝置。 嵌套300可包括串列出入口324，其容許控制器308之微處理器經由界面310 (未顯示)與外部主控制器154通訊。另外，該控制器308之該微處理器可(例如，經由Plink工具(未顯示))與該電信號產生子系統304及熱控制子系統306通訊。因此，經由該控制器308、該界面310及該串列出入口324之組合，該電信號產生子系統304及該熱控制子系統306可與該外部主控制器154通訊。以此方式，該主控制器154可(尤其)藉由針對輸出電壓調節進行成比例計算而輔助該電信號產生子系統304。經由偶合至該外部主控制器154之顯示裝置170所提供之圖解使用者介面(GUI) (未顯示)可經組態以繪製分別獲得自該熱控制子系統306及該電信號產生子系統304之溫度及波形資料。或者或另外，該GUI可容許該控制器308、該熱控制子系統306及該電信號產生子系統304之更新。 如上文討論，系統150可包括成像裝置194。在一些實施例中，該成像裝置194包含光調節子系統330 (參見圖3B)。該光調節子系統330可包括數位鏡裝置(DMD)或微快門陣列系統(MSA)，其等中之任何一者可經組態以接收來自光源332之光及將該經接收之光之子組傳輸至顯微鏡350之光學元件串內。或者，該光調節子系統330可包括產生其自身光(及因此需針對光源332進行分配)之裝置，諸如有機發光二極體陣列(OLED)、矽載液晶(LCOS)裝置、矽載鐵電體液晶裝置(FLCOS)或透射式液晶顯示器(LCD)。該光調節子系統330可為(例如)投影機。因此，該光調節子系統330可發射結構化及非結構化光兩者。在某些實施例中，系統150之成像模組164及/或驅動模組162可控制該光調節子系統330。 在某些實施例中，成像裝置194進一步包含顯微鏡350。在此等實施例中，嵌套300及光調節子系統330可經個別組態以安裝於該顯微鏡350上。該顯微鏡350可為(例如)標準研究級光顯微鏡或螢光顯微鏡。因此，該嵌套300可經組態以安裝於該顯微鏡350之載物台344上及/或該光調節子系統330可經組態以安裝於顯微鏡350之埠上。在其他實施例中，本文描述之該嵌套300及該光調節子系統330可為顯微鏡350之整體組件。 在某些實施例中，顯微鏡350可進一步包括一或更多個偵測器348。在一些實施例中，該偵測器348係藉由成像模組164控制。該偵測器348可包括目鏡、電荷耦合裝置(CCD)、相機(例如，數位相機)或其任何組合。若存在至少兩個偵測器348，則一個偵測器可為(例如)快速幀速率相機而另一偵測器可為高靈敏度相機。此外，該顯微鏡350可包括經組態以接收來自該微流裝置320之反射光及/或發射光並使該反射光及/或發射光之至少一部分聚焦至該等一或更多個偵測器348上之光學元件串。顯微鏡之光學元件串亦可包括用於不同偵測器之不同管透鏡(未顯示)，使得各偵測器上之最終放大倍率不同。 在某些實施例中，成像裝置194係經組態以使用至少兩個光源。例如，第一光源332可用以產生結構化光(例如，經由光調節子系統330)及第二光源334可用以提供非結構化光。該第一光源332可產生用於光學驅動之電動及/或螢光激發之結構化光，及該第二光源334可用以提供亮場照明。在此等實施例中，驅動模組164可用以控制該第一光源332及成像模組164可用以控制該第二光源334。該顯微鏡350之光學元件串可經組態以(1)接收來自該光調節子系統330之結構化光及當裝置係藉由嵌套300固持時，將該結構化光聚焦於該微流裝置(諸如光學驅動之電動裝置)中之至少第一區上，及(2)接收來自該微流裝置之反射光及/或發射光及使此反射光及/或發射光之至少一部分聚焦於偵測器348上。該光學元件串可經進一步組態以接收來自第二光源之非結構化光及當該裝置係藉由該嵌套300固持時，使該非結構化光聚焦於該微流裝置之至少第二區上。在某些實施例中，該微流裝置之第一及第二區可為重疊區。例如，該第一區可為該第二區之子組。在其他實施例中，該第二光源334可額外或或者包括雷射，其可具有光之任何合適波長。圖3B中顯示之光學系統之圖僅係示意圖，及該光學系統可包括額外之濾色片、陷波濾色片、透鏡及類似物。當該第二光源334包括用於亮場及/或螢光激發之一或更多個光源及雷射照亮時，該(等)光源之物理配置可自圖3B中顯示之配置改變，及該雷射照亮可引入至該光學系統內之任何合適之物理位置處。光源432及光源402/光調節子系統404之示意位置亦可經互換。 在圖3B中，顯示第一光源332向光調節子系統330供應光，光調節子系統330向系統355 (未顯示)之顯微鏡350之光學元件串提供結構化光。顯示第二光源334經由分光器336向該光學元件串提供非結構化光。來自該光調節子系統330之結構化光及來自該第二光源334之非結構化光自該分光器336穿過該光學元件串一起到達第二分光器(或雙向濾色片338，其取決於由該光調節子系統330提供之光)，其中該光經向下反射通過物鏡336到達樣品平面342。來自樣品平面342之反射光及/或發射光然後穿回通過該物鏡340，通過該分光器及/或雙向濾色片338，及返回至雙向濾色片346。到達雙向濾色片346之光之僅一部分穿過及到達該偵測器348。 在一些實施例中，第二光源334發射藍光。憑藉適當之雙向濾色片346，自樣品平面342反射之藍光可穿過雙向濾色片346及到達偵測器348。相比之下，來自該光調節子系統330之結構化光自該樣品平面342反射，但不穿過該雙向濾色片346。在此實例中，雙向濾色片346將具有波長長於495 nm之可見光濾除。將來自該光調節子系統330之光之此濾除僅在發射自該光調節子系統之光不包括短於495 nm之任何波長之情況下完成(如所示)。在實務中，若來自該光調節子系統330之光包括短於495 nm之波長(例如，藍光波長)，則來自該光調節子系統之一些光將穿過濾色片346以到達該偵測器348。在此實施例中，該濾色片346發揮作用以改變在自該第一光源332及該第二光源334到達該偵測器348之光之數量之間的平衡。若該第一光源332係顯著強於該第二光源334則此可為有利的。在其他實施例中，該第二光源334可發射紅光，及該雙向濾色片346可濾除除紅光外之可見光(例如，具有短於650 nm波長之可見光)。塗佈溶液及塗佈劑。 非意欲受理論束縛，當該微流裝置之至少一個或更多個內表面已經調整或塗佈以便於呈現在該微流裝置與維持於其中之生物微小物件之間提供主要界面之有機及/或親水性分子之層時，可促進生物微小物件(例如，生物細胞)於微流裝置(例如，DEP組態及/或EW組態之微流裝置)內之維持(即，該生物微小物件於微流裝置內顯示增加之存活率、較大之擴增及/或較大之可攜性)。在一些實施例中，該微流裝置之該等內表面之一或更多者(例如，DEP組態之微流裝置之電極活化基板之內表面、該微流裝置之蓋及/或環路材料之表面)可藉由塗佈溶液及/或塗佈劑來處理或改進以產生所需有機及/或親水性分子層。 塗層可在引入生物微小物件之前或之後施加或可在引入該(等)生物微小物件之同時施加。在一些實施例中，該(等)生物微小物件可輸入至微流裝置內之包括一或更多種塗佈劑之流體介質中。在其他實施例中，該微流裝置(例如，DEP組態微流裝置)之內表面係在將該(等)生物微小物件引入該微流裝置內前經包含塗佈劑之塗佈溶液處理或「底塗」。 在一些實施例中，微流裝置之至少一個表面包括提供適用於生物微小物件之維持及/或擴增之有機及/或親水性分子層(例如，提供如下文描述經調整之表面)之塗佈材料。在一些實施例中，該微流裝置之大體上所有內表面包括該塗佈材料。該(等)經塗佈之內表面可包括流動路徑(例如，通道)、室或封存圈或其組合之表面。在一些實施例中，複數個封存圈中之各者具有至少一個經塗佈材料塗佈之內表面。在其他實施例中，複數個流動路徑或通道中之各者具有至少一個經塗佈材料塗佈之內表面。在一些實施例中，複數個封存圈中之各者及複數個通道中之各者之至少一個內表面係經塗佈材料塗佈。塗佈劑 / 溶液。 可使用任何便利之塗佈劑/塗佈溶液，其包括(但不限於)：血清或血清因子、牛血清白蛋白(BSA)、聚合物、清潔劑、酶及其任何組合。基於聚合物之塗佈材料。 該至少一個內表面可包括包含聚合物之塗佈材料。該聚合物可共價或非共價結合(或可非特異性黏附)至該至少一個表面。該聚合物可具有各種結構性模體，諸如於嵌段聚合物(及共聚物)、星形聚合物(星形共聚物)及接枝或梳形聚合物(接枝共聚物)中發現之模體，其等中之所有皆可適用於本文揭示之方法中。 聚合物可包括包含伸烷基醚部分之聚合物。各種含有伸烷基醚之聚合物可適用於本文描述之微流裝置中。含有伸烷基醚之聚合物之一個非限制性例示性類別係兩親性非離子嵌段共聚物，其等包括以不同比率及位置位於聚合物鏈內之聚環氧乙烷(PEO)及聚環氧丙烷(PPO)子單元之嵌段。Pluronic®聚合物(BASF)係此類型之嵌段共聚物及此項技術中已知當接觸活細胞時適用。該等聚合物可在自約2000Da至約20KDa之平均分子質量Mw 之範圍內變化。在一些實施例中，PEO-PPO 嵌段共聚物可具有大於約10 (例如，12至18)之親水性-親脂性平衡(HLB)。適用於產生經塗佈之表面之特定Pluronic®聚合物包括Pluronic® L44、L64、P85及F127 (包括F127NF)。含有伸烷基醚之聚合物之另一類別係聚乙二醇(PEG Mw ＜100,000Da)或或者聚環氧乙烷(PEO, Mw ＞100,000)。在一些實施例中，PEG可具有約1000Da、5000Da、10,000Da或20,000Da之Mw 。 在其他實施例中，該塗佈材料可包括含有羧酸部分之聚合物。該羧酸子單元可為含有烷基、烯基或芳族部分之子單元。一個非限制性實例係聚乳酸(PLA)。在其他實施例中，該塗佈材料可包括在該聚合物主鏈之末端或該聚合物主鏈之側鏈處含有磷酸部分之聚合物。在又其他實施例中，該塗佈材料可包括含有磺酸部分之聚合物。該磺酸子單元可為含有烷基、烯基或芳族部分之子單元。一個非限制性實例係聚苯乙烯磺酸(PSSA)或聚茴香腦磺酸。在其他實施例中，該塗佈材料可包括包括胺部分之聚合物。該聚胺基聚合物可包括天然聚胺聚合物或合成聚胺聚合物。天然聚胺之實例包括精胺、精三胺及腐胺。 在其他實施例中，該塗佈材料可包括含有醣部分之聚合物。在非限制性實例中，聚醣(諸如黃原膠或聚葡萄糖)可適合形成減少或防止細胞黏附於微流裝置中之材料。例如，具有約3kDa尺寸之聚葡萄糖可用以向微流裝置內之表面提供塗佈材料。 在其他實施例中，該塗佈材料可包括含有核苷酸部分(即核酸)之聚合物，其等具有核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸，以提供聚電解質表面。該核酸可含有僅天然核苷酸部分或可含有非天然核苷酸部分，其等包含核鹼基、核糖或磷酸部分類似物，諸如(但不限於)7-去氮腺嘌呤、戊醣、膦酸甲酯或硫代磷酸甲酯部分。 在又其他實施例中，該塗佈材料可包括含有胺基酸部分之聚合物。該含有胺基酸部分之聚合物可包括含有天然胺基酸之聚合物或含有非天然胺基酸之聚合物，其等中之任何一者可包括肽、多肽或蛋白質。在一個非限制性實例中，該蛋白質可為牛血清白蛋白(BSA)及/或血清(或多種不同血清之組合)，其包含作為塗佈劑之白蛋白及/或一或更多種相似蛋白質。該血清可來自任何便利之來源，其包括(但不限於)胎牛血清、綿羊血清、山羊血清、馬血清及類似物。在某些實施例中，塗佈溶液中之BSA係以介於自約1 mg/mL至約100 mg/mL之範圍內，包括5 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL、30 mg/mL、40 mg/mL、50 mg/mL、60 mg/mL、70 mg/mL、80 mg/mL、90 mg/mL或更大或該範圍內之任何值存在。在某些實施例中，塗佈溶液中之血清可以介於自約20% (v/v)至約50% v/v之範圍內，包括25%、30%、35%、40%、45%或更大或該範圍內之任何值存在。在一些實施例中，BSA可作為塗佈劑以5 mg/mL存在於塗佈溶液中，而在其他實施例中，BSA可作為塗佈劑以70 mg/mL存在於塗佈溶液中。在某些實施例中，血清係作為塗佈劑以30%存在於塗佈溶液中。在一些實施例中，細胞外基質(ECM)蛋白可提供於塗佈材料內以用於最佳化細胞黏附以培養細胞生長。可包括於塗佈材料中之細胞基質蛋白可包括(但不限於)膠原、彈性蛋白、含有RGD之肽(例如，纖連蛋白)或層黏連蛋白。在又其他實施例中，生長因子、細胞介素、激素或其他細胞傳訊物質可提供於該微流裝置之塗佈材料內。 在一些實施例中，該塗佈材料可包括含有環氧烷部分、羧酸部分、磺酸部分、磷酸部分、醣部分、核苷酸部分或胺基酸部分中之多於一者之聚合物。在其他實施例中，經該聚合物調整之表面可包括多於一種聚合物之混合物，各聚合物具有環氧烷部分、羧酸部分、磺酸部分、磷酸部分、醣部分、核苷酸部分及/或胺基酸部分，該等聚合物可獨立或同時併入該塗佈材料內。共價連接之塗佈材料。 在一些實施例中，該至少一個內表面包括共價連接之分子，其等在微流裝置內提供適用於生物微小物件之維持/擴增之有機及/或親水性分子層，以針對此等細胞提供經調整之表面。 如下文描述，共價連接之分子包括連接基團，其中該連接基團係共價連接至微流裝置之一或更多個表面。該連接基團係亦共價連接至經組態以提供適用於生物微小物件之維持/擴增之有機及/或親水性分子層之部分。 在一些實施例中，該經組態以提供適用於生物微小物件之維持/擴增之有機及/或親水性分子層之共價連接之部分可包括烷基或氟烷基(其包括全氟烷基)部分；單醣或聚醣(其可包括但不限於聚葡萄糖)；醇(其包括但不限於丙炔醇)；多元醇，其等包括但不限於聚乙烯醇；伸烷基醚，其等包括但不限於聚乙二醇；聚電解質(其等包括但不限於聚丙烯酸或聚乙烯基膦酸)；胺基(包括其衍生物，諸如但不限於烷基化胺、羥基烷基化胺基、胍及含有未芳族化氮環原子之雜環基，其等包括但不限於嗎啉基或哌嗪基)；羧酸，其等包括但不限於丙炔酸(其可提供羧酸陰離子表面)；膦酸，其等包括但不限於乙炔基膦酸(其可提供膦酸陰離子表面)；磺酸鹽陰離子；羧基甜菜鹼；磺基甜菜鹼；胺磺酸；或胺基酸。 在各種實施例中，該經組態以在微流裝置中提供適用於生物微小物件之維持/擴增之有機及/或親水性分子層之共價連接之部分可包括非聚合物部分，諸如烷基部分，經取代之烷基部分，諸如氟烷基部分(其包括但不限於全氟烷基部分)；胺基酸部分；醇部分；胺基部分；羧酸部分；膦酸部分；磺酸部分；胺磺酸部分或醣部分。或者，該共價連接之部分可包括聚合部分，其等可為上文描述之部分中之任何一者。 在一些實施例中，該共價連接之烷基部分可包含形成直鏈(例如，具有至少10個碳或至少14、16、18、20、22或更多個碳之直鏈)之碳原子及可為無分支烷基部分。在一些實施例中，烷基可包括經取代之烷基(例如，該烷基中之一些碳可經氟化或全氟化)。在一些實施例中，該烷基可包括第一嵌段，其可包括連接至第二嵌段之全氟烷基，該第二嵌段可包括未經取代之烷基，其中該等第一及第二嵌段可直接或間接(例如，藉助於醚鍵聯)連接。該烷基之該第一嵌段可位於連接基團遠端，及該烷基之該第二嵌段可位於該連接基團之近端。 在其他實施例中，該共價連接之部分可包括至少一個胺基酸，其可包括多於一種類型之胺基酸。因此，該共價連接之部分可包括肽或蛋白質。在一些實施例中，該共價連接之部分可包括可提供兩性離子表面以支持細胞生長、存活率、可攜性或其任何組合之胺基酸。 在其他實施例中，該共價連接之部分可包括至少一個環氧烷部分，且可包括如上文描述之任何環氧烷聚合物。含有伸烷基醚之聚合物之一種有用類別係聚乙二醇(PEG Mw ＜100,000Da)或或者聚環氧乙烷(PEO, Mw ＞100,000)。在一些實施例中，PEG可具有約1000Da、5000Da、10,000Da或20,000Da之Mw 。 該共價連接之部分可包括一或更多個醣。該等共價連接之醣可為單醣、二醣或聚醣。該等共價連接之醣可經改進以引入反應性配對部分，其允許偶合或修飾以結合至表面。例示性反應性配對部分可包括醛、炔烴或鹵素部分。聚醣可以無規方式加以改進，其中該等醣單體中之各者可經改進或該聚醣內之該等醣單體之僅一部分係經改進以提供反應性配對部分，其可直接或間接偶合至表面。一個實例可包括聚葡萄糖聚醣，其可經由無分支連接子間接偶合至表面。 該共價連接之部分可包括一或更多個胺基。該胺基可為經取代之胺部分、胍部分、含有氮之雜環部分或雜芳基部分。含有胺基之部分可具有允許改進微流裝置內及視需要於封存圈及/或流動路徑(例如，通道)內之環境之pH之結構。 提供經調整之表面之塗佈材料可包含僅一種類型之共價連接之部分或可包括多於一種不同類型之共價連接之部分。例如，經氟烷基(包括全氟烷基)調整之表面可具有複數個完全相同之共價連接之部分，例如，其等具有相同連接基團及共價結合至該表面；相同整體長度及相同數量包含氟烷基部分之氟亞甲基單元。或者，該塗佈材料可具有多於一種類型之結合至該表面之共價連接之部分。例如，該塗佈材料可包括具有共價連接之具有指定數量之亞甲基或氟亞甲基單元之烷基或氟烷基部分之分子，及可進一步包括具有共價結合至具有較大數量之亞甲基或氟亞甲基單元之烷基或氟烷基鏈之帶電部分之分子之其他組，其等可提供於經塗佈之表面呈現大型部分之能力。在此實例中，具有不同、更少空間需求末端及較少主鏈原子之分子之第一組可有助於官能化整個基板表面及藉此防止與組成基板本身之矽/氧化矽、氧化鉿或氧化鋁之非所需黏附或接觸。在另一實例中，該等共價連接之部分可提供在該表面上以無規方式呈現交替電荷之兩性離子表面。經調整之表面性質。 除經調整之表面之組成外，其他因素(諸如疏水性材料之物理厚度)可影響DEP力。各種因素可改變該經調整之表面之物理厚度，諸如其中該經調整之表面形成於該基板上之方式(例如，氣相沈積、液相沈積、旋轉塗佈、溢流塗佈及靜電塗佈)。在一些實施例中，該經調整之表面具有在約1 nm至約10 nm；約1 nm至約7 nm；約1 nm至約5 nm或在其中之任何個別值之範圍內之厚度。在其他實施例中，藉由共價連接之部分所形成之經調整之表面可具有約10 nm至約50 nm之厚度。在各種實施例中，如本文描述製備之經調整之表面具有小於10 nm之厚度。在一些實施例中，經調整之表面之共價連接之部分在共價連接至微流裝置之表面(例如，DEP組態基板表面)時可形成單層及可具有小於10 nm (例如，小於5 nm或約1.5至3.0 nm)之厚度。此等值係與藉由旋轉塗佈製備之表面之厚度(例如，該表面可通常具有在約30 nm之範圍內之厚度)形成對比。在一些實施例中，該經調整之表面無需完全形成之單層以適用於DEP組態微流裝置內之操作。 在各種實施例中，提供微流裝置之經調整之表面之塗佈材料可提供所需電性質。非意欲受理論束縛，影響用特定塗佈材料之塗佈之表面之堅固性之一個因素係固有電荷捕獲。不同塗佈材料可捕獲電子，此可導致該塗佈材料之分解。該塗佈材料之缺點可增加電荷捕獲及導致該塗佈材料之進一步分解。同樣地，不同塗佈材料具有不同介電強度(即，導致介電材料分解之最小施加電場)，其可影響電荷捕獲。在某些實施例中，該塗佈材料可具有減少或限制電荷捕獲之量之整體結構(例如，密集單層結構)。 除經調整之表面之電性質外，該經調整之表面亦可具有有利於與生物分子一起使用之性質。例如，含有氟化(或全氟化)碳鏈之經調整之表面可相對於烷基封端之鏈提供減少表面污染之量之優點。如本文使用之表面污染係指微流裝置之表面上之無差別材料沈積之量，其可包括生物材料(諸如蛋白質及其降解產物、核酸及其個別降解產物及類似物)之永久或半永久沈積。經單一或多部分調整之表面。 如下文描述，共價連接之塗佈材料可藉由已含有經組態以在微流裝置中提供適用於生物微小物件之維持/擴增之有機及/或親水性分子層之部分之分子之反應來形成。或者，該共價連接之塗佈材料可藉由使經組態以提供適用於生物微小物件之維持/擴增之有機及/或親水性分子層之部分偶合至本身已共價連接至表面之表面改進配體而以兩部分順序形成。製備共價連接之塗佈材料之方法。 在一些實施例中，共價連接至微流裝置之表面(例如，包括封存圈及/或流動路徑之至少一個表面)之塗佈材料具有式1或式2結構。當該塗佈材料係以一個步驟引入至該表面時，其具有式1結構，而當該塗佈材料係以多個步驟方法引入時，其具有式2結構。塗佈材料可共價連接至DEP組態或EW組態基板之表面之氧化物。該DEP組態或EW組態基板可包含矽、氧化矽、氧化鋁或氧化鉿。氧化物可作為該基板之天然化學結構之部分存在或可如下文討論引入。 塗佈材料可經由連接基團(「LG」)結合至氧化物，其可為形成自矽氧烷或膦酸基團與該等氧化物之反應之矽烷氧基或膦酸酯基。經組態以在微流裝置中提供適用於生物微小物件之維持/擴增之有機及/或親水性分子層之部分可為本文描述之部分中之任何一者。該連接基團LG可直接或間接連接至經組態以在該微流裝置中提供適用於生物微小物件之維持/擴增之有機及/或親水性分子層之部分。當該連接基團LG係直接連接至該部分時，可選連接子(「L」)不存在且n為0。當該連接基團LG係間接連接至該部分時，連接子L存在且n為1。該連接子L可具有直鏈部分，其中該直鏈部分之主鏈可包括1至200個選自矽、碳、氮、硫及磷原子之任何組合之非氫原子，受限於如此項技術中已知的化學結合限制。其可間插選自由醚、胺基、羰基、醯胺基或膦酸酯基、伸芳基、伸雜芳基或雜環基組成之群之一或更多個部分之任何組合。在一些實施例中，該連接子L之主鏈可包括10至20個原子。在其他實施例中，該連接子L之主鏈可包括約5個原子至約200個原子；約10個原子至約80個原子；約10個原子至約50個原子；或約10個原子至約40個原子。在一些實施例中，該等主鏈原子全部係碳原子。 在一些實施例中，經組態以提供適用於生物微小物件之維持/擴增之有機及/或親水性分子層之部分可以多步驟方法添加至基板表面，及具有式2結構(如上文顯示)。該部分可為上文描述之部分中之任何一者。 在一些實施例中，偶合基團CG表示反應性部分Rx 與反應性配對部分Rpx (即，經組態以與反應性部分Rx 反應之部分)反應所得之基團。例如，一個典型偶合基團CG可包括甲醯胺基，其係胺基與羧酸衍生物(諸如活性酯、酸氯化物或類似物)反應之結果。其他CG可包括伸三唑基、甲醯胺基、硫醯胺基、肟基、巰基、二硫鍵、醚或烯基或反應性部分與其個別反應性配對部分一經反應即可形成之任何其他合適基團。該偶合基團CG可位於連接子L之第二端處(即，接近經組態以在微流裝置中提供適用於生物微小物件之維持/擴增之有機及/或親水性分子層之部分之端)，其可包括如上文描述之元素之任何組合。在一些其他實施例中，該偶合基團CG可間插該連接子L之主鏈。當該偶合基團CG係伸三唑基時，其可為產生自點擊偶合反應之產物及可經進一步取代(例如，二苯并環辛烯基稠合伸三唑基)。 在一些實施例中，塗佈材料(或表面改進配體)係使用化學氣相沈積於微流裝置之內表面上。該氣相沈積方法可視需要(例如)藉由預清潔蓋110、微流環路材料116及/或基板(例如，DEP組態基板之電極活化基板206之內表面208或EW組態基板之支持結構104之介電層)；藉由曝露於溶劑浴、聲波降解法或其組合來改善。或者或另外，此預清潔可包括在氧電漿清潔劑中處理該蓋110、該微流環路材料116及/或該基板，其可移除各種雜質，而同時引入經氧化之表面(例如，於該表面處之氧化物，其可如本文描述來共價改進)。或者，可使用液相處理諸如鹽酸及過氧化氫之混合物或硫酸及過氧化氫之混合物(例如，食人魚溶液，其可具有硫酸相對於過氧化氫在約3:1至約7:1之範圍內之比率)替代氧電漿清潔劑。 在一些實施例中，使用氣相沈積以在微流裝置200已經組裝以形成界定微流環路120之外殼102後塗佈該微流裝置200之內表面。非意欲受理論束縛，將此塗佈材料沈積於經完全組裝之微流環路120上可有利於防止由在微流環路材料116與電極活化基板206介電層及/或蓋110之間之弱化鍵引起之分層。在其中採用兩個步驟方法之實施例中，表面改進配體可經由如上文描述之氣相沈積引入，及接著引入經組態以提供適用於生物微小物件之維持/擴增之有機及/或親水性分子層之部分。後續反應可藉由將表面經改進之微流裝置曝露於溶液中合適之偶合試劑進行。 圖2H繪示具有提供經調整之表面之例示性共價連接之塗佈材料之微流裝置290之橫截面圖。如闡述，塗佈材料298 (示意性顯示)可包含具有共價結合至基座286(其可為DEP基板)之內表面294及共價結合至該微流裝置290之蓋288之內表面292兩者之密集分子之單層。該塗佈材料298可配置於大體上所有內表面294、292上，該等內表面接近該微流裝置290之外殼284並向內面向該微流裝置290之該外殼284，在一些實施例中及如上文討論，該等內表面包括用以於該微流裝置290內界定環路元件及/或結構之微流環路材料(未顯示)之表面。在替代實施例中，該塗佈材料298可配置於該微流裝置290之該等內表面之僅一者或一些上。 在圖2H顯示之實施例中，塗佈材料298可包括有機矽氧烷分子單層，各分子經由矽烷氧基連接子296共價結合至微流裝置290之內表面292、294。可使用上文討論之塗佈材料298中之任何一者(例如，烷基封端、氟烷基封端之部分、PEG封端之部分、聚葡萄糖封端之部分或針對有機矽烷氧基部分含有正電荷或負電荷之末端部分)，其中該末端部分係配置於面向其外殼之末端處(即，該塗佈材料298單層之部分係未結合至內表面292、294及係接近該外殼284)。 在其他實施例中，用以塗佈微流裝置290之內表面292、294之塗佈材料298可包括陰離子、陽離子或兩性離子部分或其任何組合。非意欲受理論束縛，藉由使該微流環路120之外殼284之內表面呈現陽離子部分、陰離子部分及/或兩性離子部分，該塗佈材料298可與水分子形成牢固之氫鍵，使得具有水合作用之所得水充當自與非生物分子(例如，基板之矽及/或氧化矽)之相互作用分離該等生物微小物件之層(或「擋板」)。另外，在其中該塗佈材料298係結合塗佈劑一起使用之實施例中，該塗佈材料298之陰離子、陽離子及/或兩性離子可與存在於外殼284中之介質180 (例如，塗佈溶液)中之非共價塗佈劑(例如，溶液中之蛋白質)之帶電部分形成離子鍵。 在又其他實施例中，該塗佈材料可包含或經化學改進以在其面向外殼之末端處呈現親水性塗佈劑。在一些實施例中，該塗佈材料可包括含有伸烷基醚之聚合物，諸如PEG。在一些實施例中，該塗佈材料可包括聚醣，諸如聚葡萄糖。如同上文討論之帶電部分(例如，陰離子、陽離子及兩性離子部分)，該親水性塗佈劑可與水分子形成牢固之氫鍵使得具有水合作用之所得水充當自與非生物分子(例如，基板之矽及/或氧化矽)之相互作用分離該等生物微小物件之層(或「擋板」)。 適當之塗佈處理及改進之其他細節可參見美國專利申請公開案第US2016/0312165號，該案以全文引用之方式併入本文中。 用於維持細胞於微流裝置之封存圈內之存活率之額外系統組件。為促進細胞群之生長及/或擴增，有利於維持官能細胞之環境條件可藉由系統之額外組件提供。例如，此等額外組件可提供營養素、細胞生長傳訊物質、pH調節、氣體交換、溫度控制及自細胞中移除廢棄產物。額外組件之此等類型已經描述(例如)於美國專利申請公開案第US2016/0312165中。 實例實例 1 ： OptoSelect™ 晶片中之人類 T 細胞擴增 T細胞擴增係於OptoSelect晶片內達成，OptoSelect晶片係由Berkeley Lights, Inc.製造且由亦由Berkeley Lights, Inc製造之光學儀器控制之奈流裝置。該儀器包括：用於使晶片耦合至溫度控制器之顯微鏡載物台；調整泵及流體介質之組件；及光學元件串，其包括相機及適用於在該晶片內活化光電晶體之結構化光源。該OptoSelect™晶片包括OptoElectroPositioning (OEP™)技術組態之基板，其提供光電晶體活化之OET力。該晶片亦包括複數個微流通道，各具有複數個與其流體連接之NanoPen™室(或封存圈)。各封存圈之體積係約1x106 立方微米。 自外周血液分離之CD3+ 人類T淋巴球係與抗-CD3/抗-CD28磁珠(DYNABEADS™, Thermo Fisher Scientific, Inc.)以1個珠/1個細胞之比率混合。將混合物在37℃下在5% CO2 培養器中培養5小時。培養後，使該T細胞/珠混合物重懸浮，然後流動通過流體入口及進入晶片中之微流通道內。使該流動停止及T細胞/珠藉由傾斜該晶片及容許重力將該等T細胞/珠拉入封存圈內而隨機裝載於該等圈內。 將T細胞及珠裝載於封存圈內後，將T細胞培養基(RPMI，10% FBS，2%人類AB血清，50 U/ml IL2；R&D系統)灌注通過晶片之微流通道，歷時4天時間。該等封存圈及其中含有之任何T細胞及珠每30分鐘成像，歷時整個4天培養期。 圖4係單一圈於培養之0、24、48、72及96小時之一系列延時影像，其中CD3+ 人類T淋巴球根據前述方法於晶片上成功擴增。如可見，在時間t=0時之少量T細胞導致T細胞在晶片上培養96小時後之寡株群。 替代1：前述實驗可用無動物組分T細胞培養基重複。例如，前述T細胞培養基中之FBS可經移除及RPMI可經advanced RPMI (具有高濃度磷酸鹽且包括胰島素及鐵蛋白補充劑之類似基礎培養基)置換及所得T細胞擴增將係大體上相同。另外，該T細胞培養基可用IL7 (例如，5 ng/ml之IL7)補充。 替代2：前述實驗可重複而無需T細胞及珠之5小時晶片外預培養。相反，一或更多個珠可在將該等T細胞裝載於封存圈內之前或之後放置於各封存圈中，及所得T細胞擴增將係大體上相同。實例 2 ：人類 T 細胞在 OptoSelect™ 晶片中之選擇性擴增 如實例1中描述，T細胞擴增係於OptoSelect晶片(Berkeley Lights, Inc.)內達成，OptoSelect晶片係由亦由Berkeley Lights, Inc製造之光學儀器進行控制。 最初，將自外周血液分離之人類CD14+ 單核細胞於DC培養基(RPMI，10% FBS，2%人類AB血清，100 ng/ml GM-CSF, 50 ng/ml IL-4；R&D系統)中培養7天以促進樹突狀細胞(DC)之分化。在培養之最後2天期間將250 μg/ml LPS (R&D系統)添加至該培養基中以促進DC活化。 將同種異體供體T淋巴球與來自前述培養之DC以~10個T細胞/1個DC之比率混合並在37℃的5% CO2 培養器中培養5小時。培養後，使該T細胞/DC混合物重懸浮，然後流動通過流體入口及進入晶片中之微流通道內。使該流動停止及T細胞/DC藉由傾斜該晶片及容許重力將該等T細胞/DC拉入封存圈內而隨機裝載於該等圈內。 將T細胞/DC裝載於封存圈內後，將T細胞培養基(RPMI，10% FBS，2%人類AB血清，50 U/ml IL2；R&D系統)灌注通過晶片之微流通道，歷時4天時間。該等封存圈及其中含有之任何T細胞及DC每30分鐘成像，歷時整個4天培養期。 圖5A係單一圈於培養之0、24、48、72及96小時之一系列延時影像，其中CD3+ 人類T淋巴球根據前述方法於晶片上選擇性擴增。如可見，該等DC刺激T細胞在晶片上培養96小時後之顯著擴增。然而，封存圈之僅1%至2%最初接種至少一個T細胞及其至少一個DC顯示T細胞擴增，其證實圖5A中可見之擴增係選擇性的。 在4天培養期之最後16小時期間，用以灌注晶片之培養基係用Click-It EdU試劑(Thermo Fisher Scientific, Inc.)補充，此容許該等T細胞吸收該試劑及將其併入其等DNA內。在培養期後，清洗該等細胞，用3.7%甲醛固定，及用0.1% Triton-X透性化。EdU併入係藉由監測德克薩斯紅通道中之螢光進行偵測。圖6A提供顯示於經選擇性擴增之T細胞之明視野像上覆蓋之EdU螢光信號之影像。該EdU資料顯示圈中自細胞生長及分裂所導致之T細胞數量之增加，此與經最初圈住之T細胞係藉由該等DC活化之結論一致。 替代：前述實驗可用無動物組分T細胞培養基重複。例如，前述T細胞培養基中之FBS可經移除及RPMI可經advanced RPMI (具有高濃度磷酸鹽且包括胰島素及鐵蛋白補充劑之類似基礎培養基)置換及所得T細胞擴增將係大體上相同。另外，該T細胞培養基可用IL7 (例如，5 ng/ml之IL7)補充。實例 3 ：人類 T 細胞在 OptoSelect™ 晶片中之抗原特異性擴增 如實例1中描述，T細胞擴增係於OptoSelect晶片(Berkeley Lights, Inc.)內達成，OptoSelect晶片係由亦由Berkeley Lights, Inc製造之光學儀器進行控制。 最初，將自外周血液分離之人類CD14+ 單核細胞於DC培養基(RPMI，10% FBS，2%人類AB血清，100 ng/ml GM-CSF, 50 ng/ml IL-4；R&D系統)中培養7天以促進樹突狀細胞(DC)之分化。在培養之最後2天期間將250 μg/ml LPS (R&D系統)添加至該培養基中以促進DC活化。在添加LPS之同時，該等DC係亦經10 μM破傷風毒素(TT)抗原(Sigma-Aldrich Co.)及10 μM愛波斯坦巴爾病毒(EBV)抗原(EastCoast Bio, Inc.)脈衝。 使自體供體T淋巴球與來自前述培養之經TT-及EBV-脈衝之DC以~10個T細胞/1個DC之比率混合及在37℃的5% CO2 培養器中培養5小時。培養後，使該T細胞/DC混合物重懸浮，然後流動通過流體入口及進入晶片中之微流通道內。使該流動停止及T細胞/DC藉由傾斜該晶片及容許重力將該等T細胞/DC拉入封存圈內而隨機裝載於該等圈內。 將T細胞/DC裝載於封存圈內後，將T細胞培養基(RPMI，10% FBS，2%人類AB血清，50 U/ml IL2；R&D系統)灌注通過晶片之微流通道，歷時5天時間。該等封存圈及其中含有之任何T細胞及珠每30分鐘成像，歷時整個5天培養期。 圖5B係單一圈於培養之0、24、48、72及96及110小時之一系列延時影像，其中CD3+ 人類T淋巴球根據前述方法於晶片上選擇性擴增。如可見，該等DC刺激T細胞在晶片上培養110小時後之顯著擴增。然而，封存圈之僅1%至2%最初接種至少一個T細胞及其至少一個DC顯示T細胞擴增，其證實圖5B中可見之擴增係抗原特異性的。 在5天培養期之最後16小時期間，用以灌注晶片之培養基係用Click-It EdU試劑(Thermo Fisher Scientific, Inc.)補充，此容許該等T細胞吸收該試劑及將其併入其等DNA內。在培養期後，清洗該等細胞，用3.7%甲醛固定，及用0.1% Triton-X透性化。EdU併入係藉由監測德克薩斯紅通道中之螢光進行偵測。圖6B提供顯示經選擇性擴增之T細胞之明視野像上覆蓋之EdU螢光信號之影像。該EdU資料顯示圈中自細胞生長及分裂所導致之T細胞數量之增加，此與經最初圈住之T細胞係藉由該等DC活化之結論一致。 替代：前述實驗可用無動物組分T細胞培養基重複。例如，前述T細胞培養基中之FBS可經移除及RPMI可經advanced RPMI (具有高濃度磷酸鹽且包括胰島素及鐵蛋白補充劑之類似基礎培養基)置換及所得T細胞擴增將係大體上相同。另外，該T細胞培養基可用IL7 (例如，5 ng/ml之IL7)補充。實例 4 ： T 淋巴球在具有經調整之表面之 OptoSelect™ 晶片中之培養及輸出 材料。CD3+ 細胞係來自AllCells Inc。抗-CD3/抗-CD28抗體係結合至磁珠(Dynabeads®, Thermofisher Scientific, Cat. No. 11453D)。培養基係RPMI-1640 (GIBCO®, ThermoFisher Scientific, Cat. No. 11875-127)，其用10% FBS，2%人類AB血清及50 U/ml IL2 (R&D系統)補充。 系統及微流裝置。大體上如實例1中描述，T細胞擴增係於OptoSelect晶片(Berkeley Lights, Inc.)內達成，OptoSelect晶片係由亦由Berkeley Lights, Inc製造之光學儀器進行控制。然而，在此實例中，該OptoSelect晶片之內表面係用共價連接之聚葡萄糖調整。 微流裝置啟動。使250微升100%二氧化碳以12微升/sec之速率流入，接著250微升含有0.1% Pluronic® F27 (Life Technologies® Cat# P6866)之PBS以12微升/sec之速率流入，及最後250微升PBS以12微升/sec流入。該培養基之引入如下。 介質灌注。介質係根據下列兩種方法中之任何一者灌注通過微流裝置： 1.以0.01微升/sec灌注2 h；以2微升/sec灌注64 sec；及重複。 2.以0.02微升/sec灌注100 sec；停止流動500 sec；以2微升/sec灌注64 sec；及重複。 實驗：使CD3+ 細胞與抗-CD3/抗-CD28磁珠以1個珠/細胞之比率混合。混合物係在37℃的5% CO2 培養器中於培養基中培養5小時，接著使該T細胞/珠混合物重懸浮以備使用。 T細胞懸浮液(包括抗-CD3/抗-CD28珠)係藉由使該重懸浮液流動通過流體入口及進入微流通道內而引入至微流裝置內。使該流動停止及T細胞/珠藉由傾斜該晶片及容許重力將該等T細胞/珠拉入室內而隨機裝載於該等封存室內。 將T細胞/珠裝載於封存室內後，將培養基灌注通過奈流晶片之微流通道，歷時4天時間。圖7A顯示T細胞在微流裝置之封存室之經聚葡萄糖調整之表面上之生長。T細胞在該經聚葡萄糖調整之表面上之生長係相對於相似微流裝置之未經調整之表面(資料未顯示)得到改善。 T細胞係然後藉由傾斜微流裝置及容許重力將該等T細胞自封存室拉出而自該等封存室移除。圖7B顯示重力卸載二十分鐘後，自封存室移除之T細胞之代表性影像。該等經擴增之T細胞係容易自經聚葡萄糖調整之封存圈輸出，此係相對於使用缺乏經聚葡萄糖調整之表面(資料未顯示)之OptoSelect晶片達成之T細胞輸出程度得到改善。實例 5 ： T 淋巴球在具有經調整之表面之 OptoSelect™ 晶片上之活化及擴增 大體上如實例1中描述，T細胞擴增係於OptoSelect晶片(Berkeley Lights, Inc.)內達成，OptoSelect晶片係由亦由Berkeley Lights, Inc製造之光學儀器進行控制。類似於實例4，該OptoSelect晶片具有經調整之表面之特徵。在此實例中，該經調整之表面包括含有經鏈黴親和素連接之聚乙二醇(PEG, ~1kD)之聚合物，其係結合至生物素化抗-CD3促效劑抗體。 OptoSelect晶片係用游離鏈黴親和素(1 mg/mL，藉由注射至出口內來裝載)沖洗，在室溫下培養1小時，然後用PBS (藉由注射) x1沖洗。接著，使生物素化抗-CD3抗體(5微克/mL, Miltenyi 130-093-377)流入該晶片內，使流動停止，及在37℃及加濕情況下將該晶片培養1小時。該晶片係然後藉由使培養基通過該裝置加以沖洗。 T細胞係藉由使T細胞培養物流動通過入口及進入晶片內之微流通道內而裝載於該晶片(如上文描述製備)內，然後使流動停止。傾斜該晶片以容許重力將T細胞裝載於晶片中之封存圈內。重力裝載後，將T細胞在該晶片之該等封存圈內培養3至4天。用於T細胞培養之培養基含有2 ug/mL可溶性功能級抗-CD28抗體(純系15E8, Miltenyi 130-093-375)。 培養於如上文描述之微流裝置中之T細胞係藉由延時影像進行監測。所得影像顯示該等T細胞在周圍運動及分裂，藉此證實T細胞活化之特性。 前述實驗之變更可包括：改變經結合之抗-CD3促效劑抗體之表面密度；改變PEG聚合物之長度；使抗-CD28抗體結合至經調整之表面；改變抗-CD3促效劑抗體相對於抗-CD28抗體之比率；及/或用肽-MHC複合體置換抗-CD3抗體。此後者改變可用以達成T細胞之抗原特異性活化及擴增。實例 6 ：在微流裝置內引入 T 細胞活化表面 OptoSelect™晶片(Berkeley Lights, Inc.)之內表面(其包括形成基座之第一矽電極活化基板、形成蓋之第二ITO基板及形成分離該等兩種基板之壁之光圖案化聚矽氧微流環路材料)係經共價改進以包括疊氮基部分，如描述於美國專利申請公開案第US20160312165號中。基本上，該OptoSelect晶片係使用100 W電源、240 mTorr電壓及440 sccm氧流動速率於氧電漿清潔劑(Nordson Asymtek)中處理1 min。將經電漿處理之晶片在真空反應器中在該真空反應器之底部中之箔船中，在在該真空反應器之底部中之各別箔船中作為水反應物源之七水合硫酸鎂(0.5 g, Acros Cat. # 10034-99-8)之存在下，用3-疊氮基十一基)三甲氧基矽烷(自11-溴十一基三甲氧基矽烷(Gelest Cat. # SIB1908.0)藉由與300微升疊氮化鈉反應合成)處理。然後使用真空泵將室泵吸至750毫托及將其密封。將該真空反應器放置在加熱至110℃之烘箱中24至48 h。此導致該晶片之內表面之改進，使得該等經改進之表面具有以下結構：在冷卻至室溫及將氬引入至經排空之室後，微流裝置係自該反應器移除及係適用於其他反應。 接著，為用鏈黴親和素官能化表面，OptoSelect晶片係首先用100%二氧化碳重複沖洗，及然後裝載DBCO-鏈黴親和素溶液。該DBCO-鏈黴親和素溶液係藉由將共價結合至DBCO部分(NANOCS Cat # SV1-DB-1)之鏈黴親和素之凍乾粉重懸浮於1X PBS (pH 7.4, Gibco)中至1.0微莫耳濃度製得。在培養15至30分鐘(在此期間DBCO及疊氮基偶合)後，該OptoSelect晶片係用1X PBS重複清洗以沖洗凈未結合之DBCO-鏈黴親和素。雖然以1微莫耳濃度製備經DBCO改進之鏈黴親和素溶液，但在約0.5至約2微莫耳之範圍內之濃度可有效用於改進OptoSelect晶片之具有疊氮基部分之內表面。 此經鏈黴親和素官能化之表面係用生物素化抗-CD3抗體(OKT3純系，功能級，Miltenyi, Cat. #130-093-377)及生物素化抗-CD28抗體(15E8純系，功能級，Miltenyi, Cat. #130-093-386)進一步改進。此等抗體係以約1至10微克/mL之濃度以1:1比率懸浮於PBS + 2%牛血清白蛋白中。將此抗體溶液灌注通過具有經鏈黴親和素官能化之表面之OptoSelect晶片，促進該等抗體經由生物素-鏈黴親和素結合相互作用結合至該晶片之內表面。在培養一小時後，該OptoSelect晶片係用PBS及然後係用細胞培養基沖洗，此時該晶片可準備用於細胞裝載。 儘管前述實例集中於用抗體官能化OptoSelect晶片之內表面，但其他受關注之生物分子亦可以相同方式(即，經由該等生物分子之生物素改進及生物素-鏈黴親和素介導之對鏈黴親和素官能化之表面之結合)來結合。此外，生物素化抗體(或其他生物分子)可在與OptoSelect晶片經疊氮基改進之表面反應前與鏈黴親和素反應。如下文描述，DBCO-鏈黴親和素及生物素化生物分子可以在0.5至2微莫耳之範圍內之濃度分別製備於PBS溶液中，然後以任何所需比率混合。如上文描述，在容許該等生物素化生物分子結合至該鏈黴親和素至少15分鐘後，所得複合體可用以改進經疊氮基改進之OptoSelect晶片之表面。 若使用多於一種類型之抗體/生物分子之以改進OptoSelect晶片之表面，則兩種(或更多種)類型之抗體/生物分子之混合可在與DBCO-鏈黴親和素之結合步驟前發生，或數種個別類型之生物分子之DBCO-鏈黴親和素結合物可經製備及在表面官能化前經混合。因此，雖然上文實例中之經生物分子改進之表面係抗-CD3及抗-CD28抗體之1:1比率，但該比率可為約1:5至約5:1 (例如，約2:1至約1:2)。更通常，適用於活化T細胞之經生物分子改進之表面可包括兩個活化T細胞之生物分子，其等中之任何一者可為CD3促效劑、CD28促效劑或MHC蛋白(例如，MBL International, Catalog # MR01008)，及該等兩個生物分子相對於彼此可以約1:10至約10:1之範圍存在。此外，該等經生物改進之表面可包括3、4、5或更多種活化T細胞之生物分子之混合物。 前述實驗之其他變更可包括：改變經結合之抗-CD3促效劑抗體及/或經結合之抗-CD28促效劑抗體之表面密度；改變用以初始官能化內晶片表面之含有疊氮基部分之分子中之烴鏈之長度；提供呈可溶形式之抗-CD28抗體；及/或用肽-MHC複合體置換抗-CD3抗體。此後者改進可用以達成T細胞之抗原特異性活化及擴增。 等效物 前述所寫說明書視為足夠使一般技術者實踐實施例。前述說明及實例詳述某些實施例及描述預期最佳模式。然而，將知曉內文中呈現之前述內容無論如何詳細，實施例仍可以許多方式實踐及應視為根據隨附申請專利範圍及其任何等效物。
100‧‧‧微流裝置
102‧‧‧外殼
104‧‧‧支持結構
106‧‧‧流動路徑
107‧‧‧出入口
108‧‧‧微流環路結構
109‧‧‧內表面
110‧‧‧蓋
114‧‧‧框架
116‧‧‧微流環路材料
120‧‧‧微流環路
122‧‧‧微流通道
124‧‧‧微流封存圈
126‧‧‧微流封存圈
128‧‧‧微流封存圈
130‧‧‧微流封存圈
132‧‧‧阱
134‧‧‧側通路
150‧‧‧可用於選擇、活化、擴增及/或選殖T淋巴球之系統
152‧‧‧控制及監測裝備
154‧‧‧外部主控制器
156‧‧‧控制模組
158‧‧‧數位記憶體
160‧‧‧介質模組
162‧‧‧驅動模組
164‧‧‧成像模組
166‧‧‧傾斜模組
168‧‧‧其他模組
170‧‧‧顯示裝置
172‧‧‧輸入/輸出裝置
178‧‧‧介質源
180‧‧‧流體介質
190‧‧‧傾斜裝置
192‧‧‧電源
200‧‧‧微流裝置
202‧‧‧區/室
204‧‧‧底部電極
206‧‧‧電極活化基板
208‧‧‧內表面
210‧‧‧頂部電極
212‧‧‧電源
214‧‧‧暗DEP電極區
214a‧‧‧經照亮之DEP電極區
216‧‧‧光源
218‧‧‧光圖案
220‧‧‧正方形圖案
222‧‧‧出入口
224‧‧‧封存圈
226‧‧‧封存圈
228‧‧‧封存圈
230‧‧‧微流裝置
232‧‧‧分離結構
234‧‧‧近側開口
236‧‧‧連接區
238‧‧‧遠端開口
240‧‧‧分離區
242‧‧‧流體介質180之流
244‧‧‧第二流
246‧‧‧微小物件
248‧‧‧第二流體介質
250‧‧‧微流裝置
252‧‧‧框架
254‧‧‧第一流體介質
256‧‧‧微流環路結構
258‧‧‧第二介質
260‧‧‧微流環路材料
262‧‧‧微流環路
264‧‧‧流動通道
266‧‧‧封存圈
268‧‧‧連接區
270‧‧‧分離區
272‧‧‧分離結構
274‧‧‧近側開口
276‧‧‧遠端開口
278‧‧‧第一流體介質254之流
280‧‧‧微流裝置
282‧‧‧第二流
284‧‧‧外殼
286‧‧‧基座
288‧‧‧蓋
290‧‧‧微流裝置
292‧‧‧內表面
294‧‧‧內表面
296‧‧‧矽烷氧基連接子
298‧‧‧塗佈材料
300‧‧‧微流裝置
302‧‧‧插座
304‧‧‧積體電信號產生子系統
306‧‧‧熱控制子系統
308‧‧‧控制器
312‧‧‧外殼
314‧‧‧流體路徑
316‧‧‧入口
318‧‧‧出口
320‧‧‧微流裝置
322‧‧‧印刷電路板總成(PCBA)
324‧‧‧串列出入口
330‧‧‧光調節子系統
332‧‧‧光源
334‧‧‧第二光源
336‧‧‧分光器
338‧‧‧雙向濾色片
340‧‧‧物鏡
342‧‧‧樣品平面
344‧‧‧載物台
346‧‧‧雙向濾色片
348‧‧‧偵測器
350‧‧‧顯微鏡
圖1A繪示用於與根據本發明之一些實施例之微流裝置及相關控制儀器一起使用之系統之實例。 圖1B及1C繪示根據本發明之一些實施例之微流裝置。 圖2A及2B繪示根據本發明之一些實施例之分離圈。 圖2C繪示根據本發明之一些實施例之詳細封存圈。 圖2D至F繪示根據本發明之一些其他實施例之封存圈。 圖2G繪示根據本發明之一實施例之微流裝置。 圖2H繪示根據本發明之一實施例之微流裝置之經塗佈表面。 圖3A繪示用於與根據本發明之一些實施例之微流裝置及相關控制儀器一起使用之系統之特定實例。 圖3B繪示根據本發明之一些實施例之成像裝置。 圖4提供在含有經抗-CD3/抗-CD28 T細胞活化珠培養之人類T淋巴球之奈流晶片中之單一奈孔之一系列延時影像。該等影像顯示在培養之0、24、48、72及96小時下之奈孔。 圖5A提供在含有經同種異體樹突狀細胞(DC)培養之人類T淋巴球之奈流晶片中之單一奈孔之一系列延時影像。該等影像顯示在培養之0、24、48、72及96小時之奈孔。 圖5B提供在含有用已經破傷風毒素(tetanus toxin)及愛波斯坦巴爾(Epstein bar)病毒抗原脈衝之樹突狀細胞(DC)培養之人類T淋巴球之奈流晶片中之單一奈孔之一系列延時影像。該等影像顯示在培養之0、24、48、72、96及110小時之奈孔。 圖6A提供顯示在圖6A之奈孔中將EdU (螢光信號)併入T細胞內之影像。EdU併入係針對96小時培養時間點顯示(紅)及重疊於經選擇性擴增之T細胞之明視野像上。 圖6B提供顯示在圖6B之奈孔中將EdU (螢光信號)併入T細胞內之影像。EdU併入係針對110小時培養時間點顯示(紅)及於經選擇性擴增之T細胞之明視野像上重疊。 圖7A及7B係在具有至少一個經調整之表面之微流裝置中培養T細胞之實施例之攝影表現。 圖8A繪示用於自樣品獲得T淋巴球並將其等引入至微流裝置中之封存圈內，藉此提供被圈之細胞之例示性工作流程。 圖8B繪示用於擴增被圈之T淋巴球(諸如根據如圖8A中繪示之工作流程被圈之T淋巴球)之例示性工作流程。 圖8C繪示用於輸出經擴增之T淋巴球(諸如根據如圖8B中繪示之工作流程經擴增之T淋巴球)之例示性工作流程。
100‧‧‧微流裝置
102‧‧‧外殼
104‧‧‧支持結構
106‧‧‧流動路徑
107‧‧‧出入口
108‧‧‧微流環路結構
109‧‧‧內表面
110‧‧‧蓋
114‧‧‧框架
116‧‧‧微流環路材料
120‧‧‧微流環路
122‧‧‧微流通道
124‧‧‧微流封存圈
126‧‧‧微流封存圈
128‧‧‧微流封存圈
130‧‧‧微流封存圈
132‧‧‧阱
134‧‧‧側通路
150‧‧‧可用於選擇、活化、擴增及/或選殖T淋巴球之系統
152‧‧‧控制及監測裝備
154‧‧‧外部主控制器
156‧‧‧控制模組
158‧‧‧數位記憶體
160‧‧‧介質模組
162‧‧‧驅動模組
164‧‧‧成像模組
166‧‧‧傾斜模組
168‧‧‧其他模組
170‧‧‧顯示裝置
172‧‧‧輸入/輸出裝置
178‧‧‧介質源
180‧‧‧流體介質
190‧‧‧傾斜裝置
192‧‧‧電源
202‧‧‧區/室

Claims (129)

  1. 一種在具有流動路徑及流體連接至該流動路徑之封存圈之微流裝置中擴增T淋巴球之方法，該方法包括： 將一或更多個T淋巴球引入至該微流裝置中之該封存圈內； 使該等一或更多個T淋巴球與活化劑接觸；及 灌注培養基通過該微流裝置之該流動路徑，歷時一段足以容許將該等一或更多個T淋巴球引入至該封存圈內以經歷擴增之時間。
  2. 如請求項1之方法，其中該封存圈具有約5x105 至約5x106 立方微米之體積。
  3. 如請求項1或2之方法，其中該封存圈之至少一個內表面包含塗佈材料。
  4. 如請求項3之方法，其中該塗佈材料係共價結合至該封存圈之該至少一個內表面，且其中該塗佈材料包含含有伸烷基醚部分、醣部分、胺基酸部分或其組合之聚合物。
  5. 如請求項4之方法，其中該塗佈材料包含聚葡萄醣。
  6. 如請求項4之方法，其中該塗佈材料包含聚乙二醇部分。
  7. 如請求項4至6中任一項之方法，其中該塗佈材料包含一或更多種蛋白質。
  8. 如請求項3之方法，其中該塗佈材料包含分子，其等中之各者包括連接基團及烷基部分，其中該連接基團係共價結合至該封存圈之該至少一個內表面。
  9. 如請求項8之方法，其中該連接基團係矽烷氧基連接基團。
  10. 如請求項8或9之方法，其中該烷基部分包含碳之直鏈，其包含至少10個碳原子。
  11. 如請求項8至10中任一項之方法，其中該烷基部分係氟烷基部分。
  12. 如請求項8至10中任一項之方法，其中該烷基部分係全氟烷基部分。
  13. 如請求項8至12中任一項之方法，其中該塗佈材料之分子形成共價結合至該內基板表面之密集單層結構。
  14. 如請求項3之方法，其中該塗佈材料包含具有連接基團及陽離子部分及/或陰離子部分之分子，其中該連接基團係共價結合至該內基板表面。
  15. 如請求項14之方法，其中該陽離子部分包含四級銨基團。
  16. 如請求項14或15之方法，其中該陰離子部分包含膦酸、羧酸或磺酸。
  17. 如請求項14至16中任一項之方法，其中該塗佈材料包含具有連接基團及兩性離子部分之分子。
  18. 如請求項17之方法，其中該兩性離子部分係選自羧基甜菜鹼、磺基甜菜鹼、胺磺酸及胺基酸。
  19. 如請求項3至18中任一項之方法，其中該活化劑係共價連接至該塗佈材料。
  20. 如請求項3至18中任一項之方法，其中該活化劑係穩定結合至該塗佈材料。
  21. 如請求項20之方法，其中該活化劑係經由生物素-鏈黴親和素鍵聯穩定結合至該塗佈材料。
  22. 如請求項1至21中任一項之方法，其中該等一或更多個T淋巴球係分離自從個體取樣之外周血液樣品。
  23. 如請求項1至21中任一項之方法，其中該等一或更多個T淋巴球係分離自個體之實體腫瘤樣品。
  24. 如請求項23之方法，其中該實體腫瘤樣品係細針吸取物(fine needle aspirate；FNA)。
  25. 如請求項23之方法，其中該實體腫瘤樣品係活體組織切片。
  26. 如請求項23至25中任一項之方法，其中該實體腫瘤係乳癌、起源於尿路、輸尿管、膀胱或尿道之癌症、腎細胞癌、睾丸癌、前列腺癌或儲精囊、輸精管或陰莖之癌症、卵巢癌、子宮癌、子宮頸癌、陰道癌或輸卵管之癌症、神經系統之癌症、神經母細胞瘤、視網膜母細胞瘤、腸癌、結腸直腸癌、肺癌或黑色素瘤。
  27. 如請求項23至25中任一項之方法，其中該實體腫瘤係髓樣乳癌、間皮瘤或黑色素瘤。
  28. 如請求項22至27中任一項之方法，其中該等一或更多個T淋巴球係來自從該外周血液樣品或該實體腫瘤樣品所分離之T淋巴球之群。
  29. 如請求項28之方法，其中該群係針對CD3+ T淋巴球加以富集。
  30. 如請求項28之方法，其中該群係針對CD3+ CD4+ T淋巴球加以富集。
  31. 如請求項28之方法，其中該群係針對CD3+ CD8+ T淋巴球加以富集化。
  32. 如請求項28至31中任一項之方法，其中該群係針對CD45RA+ CD45RO- T淋巴球加以富集。
  33. 如請求項28至31中任一項之方法，其中該群係針對CD45RA- CD45RO+ T淋巴球加以富集。
  34. 如請求項28至33中任一項之方法，其中該群係針對 CCR7+ T淋巴球加以富集。
  35. 如請求項28至34中任一項之方法，其中該群係針對CD62L+ T淋巴球加以富集。
  36. 如請求項28至35中任一項之方法，其中該群係耗盡CD69+ T-淋巴球。
  37. 如請求項28至36中任一項之方法，其中該群係耗盡PD-1+ 及/或PD-L1+ T-淋巴球。
  38. 如請求項28至37中任一項之方法，其中該方法包括藉由使T淋巴球與針對CD45RO、CD45RA、CD69、PD-1及/或PD-L1之抗體接觸及自結合至該等抗體之該等群T淋巴球移除來耗盡CD45RO+ T淋巴球、CD45RA+ T淋巴球、CD69+ T淋巴球、PD-1+ T淋巴球及PD-L1+ T淋巴球中之一、二、三或四種。
  39. 如請求項38之方法，其中該等抗體係與固體支撐物相結合。
  40. 如請求項39之方法，其中該固體支撐物係磁珠之群。
  41. 如請求項1至40中任一項之方法，其中將該等一或更多個T淋巴球引入至該封存圈內包括使含有該等一或更多個T淋巴球之流體流動進入該微流裝置之微流通道內，其中該微流通道係該微流裝置之該流動路徑之一部分，且其中該封存圈通向該微流通道。
  42. 如請求項41之方法，其中將該等一或更多個T淋巴球引入至該封存圈內進一步包括使用介電泳(dielectrophoresis；DEP)以選擇位於該微流通道內之至少一個T淋巴球及將其移動至該封存圈內。
  43. 如請求項42之方法，其中該至少一個經選擇之T淋巴球係至少部分因為其細胞表面包含標記物CD3+ 、CD4+ 、CD8+ 或其任何組合而經選擇。
  44. 如請求項42之方法，其中該至少一個經選擇之T淋巴球係至少部分因為其細胞表面包含標記物CD3+ 及CD4+ 而經選擇。
  45. 如請求項42之方法，其中該至少一個經選擇之T淋巴球係至少部分因為其細胞表面包含標記物CD3+ 及CD8+ 而經選擇。
  46. 如請求項42至45中任一項之方法，其中該至少一個經選擇之T淋巴球係至少部分因為其細胞表面包含標記物CD45RA+ 、CD45RO+ 、CCR7+ 、CD62L+ 或其任何組合而經選擇。
  47. 如請求項42至46中任一項之方法，其中選擇該至少一個T淋巴球包括用特異性結合至CD3、CD4、CD8、CD45RA、CD45RO、CCR7或CD62L之抗體標記包含該至少一個T淋巴球之T淋巴球之群，及基於該至少一個T淋巴球與該抗體之結合而將該其移動至該封存圈內。
  48. 如請求項47之方法，其中該抗體包含螢光團。
  49. 如請求項42至48中任一項之方法，其中該至少一個經選擇之T淋巴球係至少部分因為其細胞表面不為CD45RO+ 而經選擇。
  50. 如請求項42至48之方法，其中將一或更多個T淋巴球引入至該封存圈內包括標記CD45RO+ T淋巴球及將與指示CD45RO之標記無關之一或更多個T淋巴球引入至該封存圈內。
  51. 如請求項42至48中任一項之方法，其中該至少一個經選擇之T淋巴球係至少部分因為其細胞表面不為CD45RA+ 而經選擇。
  52. 如請求項42至48中任一項之方法，其中將一或更多個T淋巴球引入至該封存圈內包括標記CD45RA+ T淋巴球及將與指示CD45RA之標記無關之一或更多個T淋巴球引入至該封存圈內。
  53. 如請求項42至52中任一項之方法，其包括標記CCR7+ 及CD62L+ T淋巴球及將與指示CCR7之標記相關聯及/或與指示CD62L之標記結合之一或更多個T淋巴球移動至該封存圈內。
  54. 如請求項42至52中任一項之方法，其包括標記CCR7+ 及CD62L+ T淋巴球及將與指示CCR7之標記無關及/或與指示CD62L之標記無關之一或更多個T淋巴球移動至該封存圈內。
  55. 如請求項42至54中任一項之方法，其中該至少一個經選擇之T淋巴球係至少部分因為其細胞表面不為CD69+ 而經選擇。
  56. 如請求項42至55中任一項之方法，其中該至少一個經選擇之T淋巴球係至少部分因為其細胞表面不為PD-1+ 而經選擇。
  57. 如請求項42至56中任一項之方法，其中該至少一個經選擇之T淋巴球係至少部分因為其細胞表面不為PD-L1+ 而經選擇。
  58. 如請求項42至57中任一項之方法，其中該至少一個經選擇之T淋巴球係至少部分因為其經與螢光標記結合之抗原標記而經選擇。
  59. 如請求項58之方法，其中該抗原包含與MHC蛋白複合之肽。
  60. 如請求項42至59中任一項之方法，其中該至少一個經選擇之T淋巴球係至少部分因其經一或更多種與螢光標記結合之抗體標記而經選擇。
  61. 如請求項60之方法，其中該等一或更多種抗體包括針對CD45RA或CD45RO之抗體；針對CCR7之抗體；針對 CD62L之抗體或其任何組合。
  62. 如請求項60或61之方法，其中該等一或更多種抗體包括針對CD4之抗體。
  63. 如請求項60或61之方法，其中該等一或更多種抗體包括針對CD8之抗體。
  64. 如請求項41之方法，其中將該等一或更多個T淋巴球引入至該封存圈內進一步包括傾斜該微流裝置，以使得重力將該等一或更多個T淋巴球拉入該封存圈內。
  65. 如請求項1至64中任一項之方法，其中該等一或更多個T淋巴球係在引入至該封存圈內前與該活化劑接觸。
  66. 如請求項65之方法，其中該等一或更多個T淋巴球係在引入至該微流裝置內前經活化劑培養至少一小時之時間。
  67. 如請求項65之方法，其中該等一或更多個T淋巴球係在引入至該微流裝置內前經活化劑培養至少五小時之時間。
  68. 如請求項65至67中任一項之方法，其中將該等一或更多個T淋巴球引入至該封存圈內進一步包括將該活化劑引入至該封存圈內。
  69. 如請求項1至64中任一項之方法，其中該等一或更多個T淋巴球係在引入至該封存圈內後與該活化劑接觸。
  70. 如請求項1至69中任一項之方法，其中該活化劑包含抗-CD3及/或抗-CD28促效劑抗體。
  71. 如請求項70之方法，其中該活化劑包含抗-CD3促效劑抗體，其係結合至固體支撐物。
  72. 如請求項70或71之方法，其中該活化劑包含抗-CD28促效劑抗體，其係結合至固體支撐物。
  73. 如請求項70或71之方法，其中該活化劑包含可溶性抗-CD28促效劑抗體。
  74. 如請求項1至69中任一項之方法，其中該活化劑包含樹突狀細胞(dendritic cell；DC)。
  75. 如請求項74之方法，其中該DC係在與該等一或更多個T淋巴球接觸前經腫瘤抗原脈衝。
  76. 如請求項75之方法，其中該腫瘤抗原係分離自與該等一或更多個T淋巴球係為自體性之腫瘤細胞。
  77. 如請求項75之方法，其中該腫瘤抗原係透過腫瘤細胞之基因體分析進行識別。
  78. 如請求項77之方法，其中該等經分析之腫瘤細胞與該等一或更多個T淋巴球係為自體性的。
  79. 如請求項74至78中任一項之方法，其中該DC及該等一或更多個T淋巴球係自體性的細胞。
  80. 如請求項1至79中任一項之方法，其中該培養基係通過該微流裝置灌注該流動路徑至少24小時之時間。
  81. 如請求項1至79中任一項之方法，其中該培養基係通過該微流裝置灌注該流動路徑至少48小時之時間。
  82. 如請求項1至79中任一項之方法，其中該培養基係通過該微流裝置灌注該流動路徑至少96小時之時間。
  83. 如請求項1至66中任一項之方法，其中該培養基包含人類血清及IL2。
  84. 如請求項1至67中任一項之方法，其中該培養基包含IL7、IL15、IL21或其任何組合。
  85. 如請求項1至84中任一項之方法，其中20或更少、10或更少、6至10、5或更少、約5、約4、約3、約2或1個T淋巴球係經引入至該微流裝置中之該封存圈內。
  86. 如請求項1至85中任一項之方法，其中該擴增包含至少三輪有絲分裂細胞分裂。
  87. 如請求項1至86中任一項之方法，其中該方法包括自該微流裝置輸出該等經擴增之T淋巴球。
  88. 如請求項1至87中任一項之方法，其中該微流裝置包含複數個封存圈，且其中一或更多個T淋巴球係經引入至該等複數個封存圈之各封存圈內及與該活化劑接觸。
  89. 如請求項88之方法，其中20或更少、10或更少、6至10、5或更少、約5、約4、約3、約2或1個T淋巴球係經引入至該微流裝置中之複數個封存圈之各者內。
  90. 一種T淋巴球，其係根據如請求項1至89中任一項之方法產生。
  91. 一種微流裝置，其包含根據如請求項1至89中任一項之方法產生之T淋巴球。
  92. 如請求項91之微流裝置，其中該微流裝置包含封存圈，且其中該T淋巴球係位於該封存圈中。
  93. 一種醫藥組合物，其包含根據如請求項1至89中任一項之方法產生之T淋巴球及醫藥上可接受之載劑。
  94. 一種治療個體之癌症之方法，該方法包括將T淋巴球引入至該個體內，其中該等T淋巴球係藉由如請求項1至89中任一項之方法產生。
  95. 一種治療個體之癌症之方法，該方法包括： 從獲自該個體之組織樣品中分離出T淋巴球； 根據如請求項1至89中任一項之方法在微流裝置中擴增該等經分離之T淋巴球； 自該微流裝置輸出該等經擴增之T淋巴球；及 將該等經擴增之T淋巴球再引入至該個體內。
  96. 如請求項94或95之方法，其中該個體係哺乳動物。
  97. 如請求項96之方法，其中該個體係人類。
  98. 如請求項95至97中任一項之方法，其中該組織樣品係外周血液之樣品。
  99. 如請求項95至97中任一項之方法，其中該組織樣品係來自實體腫瘤。
  100. 如請求項99之方法，其中該組織樣品係來自該實體腫瘤之FNA或活體組織切片。
  101. 如請求項99或100之方法，其中該實體腫瘤係乳癌、起源於尿路、輸尿管、膀胱或尿道之癌症、腎細胞惡性腫瘤、睾丸癌、前列腺癌或儲精囊、輸精管或陰莖之癌症、卵巢癌、子宮癌, 子宮頸癌、陰道癌或輸卵管之癌症、神經系統之癌症、神經母細胞瘤、視網膜母細胞瘤、腸癌、結腸直腸癌、肺癌或黑色素瘤。
  102. 如請求項99或100之方法，其中該實體腫瘤係髓樣乳癌、間皮瘤或黑色素瘤。
  103. 如請求項95至102中任一項之方法，其中自該組織樣品中分離T淋巴球包括在該組織樣品中針對CD3+ 細胞、CD4+ 細胞、CD8+ 細胞或其任何組合進行選擇。
  104. 如請求項103之方法，其中自該組織樣品中分離T淋巴球進一步包括在於該組織樣品中針對CD3+ 細胞、CD4+ 細胞、CD8+ 細胞或其任何組合進行選擇前分離該組織樣品。
  105. 如請求項95至104中任一項之方法，其中擴增該等經分離之T淋巴球包括使該等經分離之T淋巴球與活化劑接觸。
  106. 如請求項105之方法，其中該活化劑包含CD3促效劑及/或CD28促效劑。
  107. 如請求項106之方法，其中該活化劑包含抗-CD3促效劑抗體。
  108. 如請求項106或107之方法，其中該活化劑包含抗-CD28促效劑抗體。
  109. 如請求項105至108中任一項之方法，其中該活化劑係結合至一或更多個珠。
  110. 如請求項105至108中任一項之方法，其中該微流裝置包含至少一個經組態以支持該等經分離之T淋巴球之擴增之封存圈，其中該至少一個封存圈中之各者之至少一個表面包含塗佈材料，且其中該活化劑係共價連接至該塗佈材料。
  111. 如請求項110之方法，其中該活化劑係穩定結合至該塗佈材料。
  112. 如請求項110之方法，其中該活化劑係經由生物素-鏈黴親和素鍵聯穩定結合至該塗佈材料。
  113. 如請求項95至112中任一項之方法，其中該活化劑包含樹突狀細胞(DC)。
  114. 如請求項113之方法，其中該等DC係獲自待治療癌症之個體。
  115. 如請求項113或114之方法，其中該等DC係在使該等經分離之T淋巴球與該活化劑接觸前經腫瘤抗原脈衝。
  116. 如請求項115之方法，其中該腫瘤抗原係分離自獲自該個體之癌細胞。
  117. 如請求項115之方法，其中該腫瘤抗原係合成的。
  118. 如請求項115至117中任一項之方法，其中該腫瘤抗原係至少部分透過定序獲自該個體之癌細胞的核酸分子來識別。
  119. 如請求項95至118中任一項之方法，其中為回應與活化劑接觸而進行的擴增之經分離T淋巴球顯示至少100倍擴增。
  120. 如請求項95至118中任一項之方法，其中為回應與活化劑接觸而進行擴增之經分離之T淋巴球顯示至少1000倍擴增。
  121. 如請求項95至120中任一項之方法，其中經擴增之T淋巴球係自該微流裝置選擇性輸出。
  122. 如請求項121之方法，其中該方法包括分析一或更多個區中一或更多個T淋巴球之增殖速率，及以大於或等於既定臨限值之增殖速率選擇性輸出T淋巴球。
  123. 如請求項121或122之方法，其中該方法包括分析一或更多個區中一或更多個T淋巴球之一或更多種細胞介素之表現，及選擇性輸出表現該等一或更多種細胞介素之T淋巴球。
  124. 如請求項123之方法，其中該等一或更多種細胞介素包括INFγ、TNFα、IL2或其任何組合。
  125. 如請求項121之方法，其中該方法包括分析一或更多個區中一或更多個T淋巴球之一或更多個調節T細胞標記物之表現，及選擇性輸出表現該等一或更多個調節T細胞標記物之T淋巴球。
  126. 如請求項125之方法，其中該等一或更多個調節T細胞標記物包括CTLA4。
  127. 如請求項95至126中任一項之方法，其進一步包括基因體圖譜分析具有經輸出之T淋巴球之樣品。
  128. 如請求項95至127中任一項之方法，其中該等經擴增之T淋巴球係在自該微流裝置輸出後但在再引入至該個體內前經進一步擴增。
  129. 如請求項95至128中任一項之方法，其中經擴增之T淋巴球之該輸出包括使用介電泳(DEP)力從其等相應之封存圈中輸出經擴增之T淋巴球。
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