KR20220104310A - 미세유체 디바이스에서의 t 림프구들의 선택 및 클로닝 - Google Patents

미세유체 디바이스에서의 t 림프구들의 선택 및 클로닝 Download PDF

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알렉산더 제이 마스트로얀니
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Abstract

미세유체 디바이스에서 T 림프구들을 증식시키는 방법이 제공된다. 방법들은 미세유체 디바이스 내로 하나 이상의 T 림프구들을 도입하는 단계; 하나 이상의 T 림프구들을 활성화 작용제와 접촉시키는 단계; 및 하나 이상의 T 림프구들이 적어도 1 라운드의 유사분열을 겪는 것을 허용하기에 충분한 시간 주기 동안 미세유체 디바이스를 통해 배양 매질을 관류시키는 단계를 포함할 수 있다. 증식은 비특정이거나 항원-특정적일 수 있다. 개시된 방법들에 따라 생성된 T 림프구들은 또한 환자 내의 암을 치료하는 방법들과 함께 제공된다. 암을 치료하는 방법들은 환자로부터 획득된 조직 샘플로부터 T 림프구들을 분리시키는 단계; 미세유체 디바이스 내에서 분리된 상기 T 림프구들을 증식시키는 단계; 미세유체 디바이스로부터 증식된 T 림프구들을 익스포트하는 단계; 및 환자 내로 증식된 T 림프구들을 재도입하는 단계를 포함할 수 있다.

Description

미세유체 디바이스에서의 T 림프구들의 선택 및 클로닝{SELECTION AND CLONING OF T LYMPHOCYTES IN A MICROFLUIDIC DEVICE}
본 출원은 2016년 3월 17일자로 출원된 미국 특허출원 제 62/309,454 호, 2016년 4월 22일자로 출원된 미국 특허출원 제 62/326,667 호, 2016년 10월 24일자로 출원된 미국 특허출원 제 62/412,212 호, 및 2017년 3월 13일자로 출원된 미국 특허출원 제 62/470,744 호의 35 U.S.C. 119 하의 이익을 주장하며, 이들 각각의 전체 개시는 여기에 참조에 의해 포함된다.
분야는 일반적으로 미세유체 환경 내에서 T 림프구들을 선택 및 증식하기 위한 방법들, 시스템들 및 디바이스들에 관한 것이다.
면역 치료는 질병과 싸우는 것을 돕기 위해 환자의 면역 체계를 사용하는 급성장하는 분야이다. 암 세포들을 공격하기 위해 환자 자신의 면역 체계를 자극하는 것 및 외부 소스로부터의 면역 체계 컴포넌트들을 관리하는 것을 포함하는 다양한 면역 치료 전략들이 암과 싸우기 위해 평가되었다. 예를 들어, 생체 내에서 암 세포들을 공격하도록 설계된 모노클론 항체들을 단독으로 또는 유전자 공학에 의해 생성된 구조물들 (constructs) 내에서 관리되었다. 또한, 여러 T 세포 치료들이 조사되었다. 자가 T 세포 치료들은 환자로부터 T 세포들을 획득하는 것, 생체 외에서 T 세포들을 증식시키는 것, 및 증식된 T 세포들을 환자에게 재도입시키는 것을 수반한다. 키메라 항원 수용체 T 세포 (Chimeric antigen receptor T cell: CAR-T) 치료들은 문제의 암을 타겟팅하는, 표면상에 키메라 항체-함유 융합 단백질들을 발현시키는 T 세포들을 유전자 공학에 의해 생성하는 것을 수반하고 그 T 세포들이 암세포들을 죽이는 것을 허용한다. T 세포 치료들의 양 타입들은 이점들을 제공한다. 그러나, 그 치료들은 여전히 추가의 정제를 요구한다.
자가 T 세포 치료들 및 CAR-T 치료들 양자 모두에서의 중요한 문제들 중 하나는 가장 높은 종양 살상 잠재력을 갖는 T 세포들을 선택적으로 증식시키는 방식으로 생내 외에서 T 세포들을 증식시키기 위한 방법들의 결핍이다. 본 개시는 생체 외에서 T 세포들의 선택적 증식을 위한 솔루션들을 제공한다. 본 개시는 또한 여기에 개시된 방법들에 따라 생체 외에서 증식된 T 세포들을 사용하여 암으로부터 고통받고 있는 환자들을 치료하기 위한 개선된 방법들을 제공한다.
미세유체 디바이스 (또는 "칩") 에서 T 림프구들을 증식시키는 방법들이 개시된다. 미세유체 디바이스는 미세유체 채널 및 그 채널에 유체 흐름 가능하게 연결된 격리 펜 (sequestration pen) 을 포함할 수 있으며, 격리 펜은 T 림프구들의 배양 및 증식을 지원하도록 구성된다. 소정의 실시형태들에서, 미세유체 디바이스는 나노유체 디바이스일 수 있다. 격리 펜은 예를 들어 약 0.5x106 내지 약 5.0x106 세제곱 마이크론, 또는 약 0.5x106 내지 약 2.0x106 세제곱 마이크론의 체적을 가질 수 있다. 또한, 미세유체 디바이스는 2 이상의 미세유체 채널 및 각각의 미세유체 채널에 유체 흐름 가능하게 연결된 복수의 격리 펜들을 가질 수 있으며, 복수의 격리 펜들 중 각각의 격리 펜은 T 림프구들의 배양 및 증식을 지원하도록 구성된다. 격리 펜(들) 의 하나 이상의 표면들은 컨디셔닝될 수 있다.
T 림프구들을 증식시키는 방법들은, 미세유체 디바이스에서의 격리 펜으로 하나 이상의 T 림프구들을 도입하는 단계; 및 그 하나 이상의 T 림프구들을 활성화 작용제와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시형태들에서, 20 개 이하, 10 개 이하, 6 내지 10 개, 5 개 이하, 약 5 개, 약 4 개, 약 3 개, 약 2 개 또는 1 개의 T 림프구(들) 이 격리 펜으로 도입된다. 미세유체 디바이스가 복수의 격리 펜들을 포함하는 경우, 하나 이상의 T 림프구들 (예를 들어, 20 개 이하, 10 개 이하, 6 내지 10 개, 5 개 이하, 약 5 개, 약 4 개, 약 3 개, 약 2 개 또는 1 개의 T 림프구(들)) 이 하나 이상의 격리 펜들 각각 내로 도입될 수 있다. T 림프구들을 증식시키는 방법들은 미세유체 디바이스의 미세유체 채널을 통해 배양 매질을 관류시키는 것 (perfusing) 을 더 포함할 수 있다. 관류는 연속적이거나 간헐적일 수 있고, 격리 펜 (또는 격리 펜들) 으로 도입된 하나 이상의 T 림프구들이 유사 분열의 적어도 1 라운드를 격는 것을 허용하기에 충분한 시간 주기 동안 지속될 수 있다.
소정의 실시형태들에서, 그 하나 이상의 T 림프구들은 환자의 말초 혈액으로부터 분리된 T 림프구들의 군집으로부터이다. 다른 실시형태들에서, 그 하나 이상의 T 림프구들은 환자의 고형 종양 샘플로부터 분리된 T 림프구들의 군집으로부터이다. 고형 종양 샘플은 세침 흡인물 (FNA) 또는 종양 바이옵시 (biopsy) (예를 들어, 코어 바이옵시) 일 수 있다. 고형 종양은 유방암, 비뇨기 암 (예를 들어, 신장 (예를 들어, 콩팥세포암종), 요관, 방광, 또는 요도에서와 같은 요로에서 발생하는 암; 웅성 생식 기관의 암 (예를 들어, 고환암, 전립선암, 또는 정낭들, 정관들 또는 음경의 암); 자성 생식 수관의 암 (예를 들어, 난소암, 자궁암, 자궁경부암, 질암, 또는 나팔관의 암)), 신경계의 암 (예를 들어, 신경모세포종, 망막모세포종), 장암 (예를 들어, 대장암), 폐암, 흑색종, 또는 다른 타입의 암일 수 있다. 특정의 실시형태들에서, 고형 종양은 수질 유방암, 중피종, 또는 흑색종일 수 있다.
일부 실시형태들에서, T 림프구들의 군집은 CD3+ T 림프구들에 대해 인리치 (enrich) 된다. 일부 실시형태들에서, T 림프구들의 군집은 CD3+CD4+ T 림프구들에 대해 인리치된다. 일부 실시형태들에서, T 림프구들의 군집은 CD3+CD8+ T 림프구들에 대해 인리치된다. 일부 실시형태들에서, T 림프구들의 군집은 CD45RA+ T 림프구들에 대해 인리치된다. 일부 실시형태들에서, T 림프구들의 군집은 CD45RO+ T 림프구들에 대해 인리치된다. 일부 실시형태들에서, T 림프구들의 군집은 CCR7+ T 림프구들에 대해 인리치된다. 일부 실시형태들에서, T 림프구들의 군집은 CD62L+ T 림프구들에 대해 인리치된다. 일부 실시형태들에서, T 림프구들의 군집은 CD45RA+/CD7+/CD62L+ T 림프구들에 대해 인리치된다. 일부 실시형태들에서, T 림프구들의 군집은 CD45RO+/CD7+/CD62L+ T 림프구들에 대해 인리치된다. 일부 실시형태들에서, T 림프구들의 군집은 PD-1+ T 림프구들에 대해 인리치된다. 일부 실시형태들에서, T 림프구들의 군집은 CD137+ T 림프구들에 대해 인리치된다. 일부 실시형태들에서, T 림프구들의 군집은 PD-1+/CD137+ T 림프구들에 대해 인리치된다.
일부 실시형태들에서, T 림프구들의 군집은 CD4+ T 림프구들이 고갈된다. 일부 실시형태들에서, T 림프구들의 군집은 CD8+ T 림프구들이 고갈된다. 일부 실시형태들에서, T 림프구들의 군집은 CD45RO+ T 림프구들이 고갈된다. 일부 실시형태들에서, T 림프구들의 군집은 CD45RA+ T 림프구들이 고갈된다. 일부 실시형태들에서, T 림프구들의 군집은 CCR7+ T 림프구들이 고갈된다. 일부 실시형태들에서, T 림프구들의 군집은 CD62L+ T 림프구들이 고갈된다. 일부 실시형태들에서, T 림프구들의 군집은 CD45RO+/CD7+/CD62L+ T 림프구들이 고갈된다. 일부 실시형태들에서, T 림프구들의 군집은 CD45RA+/CD7+/CD62L+ T 림프구들이 고갈된다. 일부 실시형태들에서, T 림프구들의 군집은 PD-1+ T 림프구들이 고갈된다. 일부 실시형태들에서, T 림프구들의 군집은 CD137+ T 림프구들이 고갈된다. 일부 실시형태들에서, T 림프구들의 군집은 PD-1+/CD137+ T 림프구들이 고갈된다.
일부 실시형태들에서, T 림프구들의 군집에서의 우세한 세포 타입은 나이브 T 세포
Figure pat00001
, 중앙 기억 T 세포 (TCM) 또는 효과기 기억 T 세포 (TEM) 과 같은 기억 T 세포, 또는 효과기 T 세포 (TEFF) 이다.
일부 실시형태들에서, 방법은 나이브 T 림프구들, 기억 T 림프구들 (예를 들어, TCM 세포들 및/또는 TEM 세포들), TEFF 림프구들, 또는 이들의 임의의 조합에 대해 인리치하기 위해 T 림프구들을 포함하는 샘플을 사전 프로세싱하는 단계를 포함한다. 프로세싱하는 단계는 샘플로부터 부스러기 및/또는 비림프구 세포 타입들을 제거하는 단계를 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 프로세싱하는 단계는 나이브 T 림프구들, 기억 T 림프구들 (예를 들어, TCM 및/또는 TEM 림프구들), TEFF 림프구들, 또는 이들의 임의의 조합의 샘플을 고갈시키는 단계를 포함할 수 있다.
샘플은 암 (예를 들어, 여기에 설명되거나 본 기술에서 알려져 있는 임의의 타입의 암) 으로부터 고통 받고 있는 환자와 같은 환자로부터 올 수 있다. 샘플은 말초 혈액 샘플 또는 그것의 유도체 (예를 들어, PBMC 들의 샘플) 일 수 있다. 대안적으로, 샘플은 고형 종양 바이옵시 또는 FNA 일 수 있다. 일부 실시형태들에서, 말초 혈액 샘플은 나이브 T 림프구들에 대해 인리치하기 위해 프로세싱된다. 다른 실시형태들에서, 종양 샘플은 기억 T 림프구들, 특히 TCM 림프구들에 대해 인리치하도록 프로세싱되지만, TEF 림프구들이 인리치될 수도 있다. 여전히 다른 실시형태들에서, 종양 샘플은 TEFF 림프구들에 대해 인리치하기 위해 프로세싱된다. 원하는 T 림프구 세포 타입(들) 에 대해 인리치하기 위해, 하나 이상의 세포 표면 항원들에 특정적으로 결합하는 결합제들 (예를 들어, 항체들 등) 이 채용될 수 있다. 결합제들에 의해 결합된 세포 표면 항원들은 CD4, CD8, CD45RO, CD45RA, CCR7, CD62L, PD-1, 및 CD137T, 또는 이들의 조합을 포함하는, 여기에 기술된 세포 표면 항원들 중 임의의 세포 표면 항원일 수 있다. 프로세싱하는 것은 샘플을 하나 이상의 형광성으로 라벨링된 결합제들과 접촉시키는 것 및 (예를 들어, 하나 이상의 결합제들에 의해 특정적으로 결합된 세포 표면 항원(들) 에 기초하여 인리치하는 경우) 라벨링된 세포들에 대해 선택하기 위해 또는 (예를 들어, 하나 이상의 결합제들에 의해 특정적으로 결합된 세포 표면 항원(들) 에 기초하여 고갈되는 경우) 라벨링된 세포들을 제거하기 위해 FACS 를 수행하는 것을 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 프로세싱하는 것은 샘플을 고형 서포트에 링크되는 하나 이상의 결합제들과 접촉시키는 것, 및 (예를 들어, 하나 이상의 결합제들에 의해 특정적으로 결합된 세포 표면 항원(들) 에 기초하여 고갈되는 경우) 고형 서포트에 결합된 세포들을 제거하는 것 또는 (예를 들어, 하나 이상의 결합제들에 의해 특정적으로 결합된 세포 표면 항원(들) 에 기초하여 인리치하는 경우) 고형 서포트에 결합되지 않은 세포들을 제거하는 것을 포함할 수 있다. 고형 서포트는, 예를 들어, 하나 이상의 비드들 (예를 들어, 자성일 수도 있는 비드들의 군집) 일 수 있다. 자성 비드들이 사용되는 경우, 자성 비드들이 펠릿을 형성하도록 샘플에 자기력이 인가되어, 결과의 수퍼네이턴트 (supernatant) 가 펠릿으로부터 분리되는 것을 허용할 수 있다.
소정의 실시형태들에서, 격리 펜으로 하나 이상의 T 림프구들을 도입하는 것은 미세유체 디바이스의 미세유체 채널 내로 하나 이상의 T 림프구들을 포함하는 유체를 흐르게 하는 것을 포함한다. 격리 펜으로 하나 이상의 T 림프구들을 도입하는 것은 격리 펜으로 미세유체 채널에 위치된 적어도 하나의 T 림프구를 선택 및 이동시키기 위해 유전영동 (DEP) 을 사용하는 것을 더 포함할 수 있다. 적어도 하나의 T 림프구들은 CD3, CD4, CD8, CD45RO, CD45RA, CCR7, CD62L, PD-1, CD137T, 또는 이들의 임의의 조합과 같은 마커의 세포-표면 발현에 기초하여 선택될 수 있다. 대안적으로, 격리 펜으로 하나 이상의 T 림프구들을 도입하는 것은 중력이 격리 펜 내로 적어도 하나이 T 림프구를 끌어당기도록 미세유체 칩을 틸팅하는 것을 더 포함할 수 있다. 다른 대안들에서, 격리 펜으로 하나 이상의 T 림프구들을 도입하는 것은 원심력이 격리 펜으로 적어도 하나의 T 림프구를 끌어당기도록 미세유체 디바이스에 원심력을 작용시키는 것을 더 포함할 수 있다.
일부 실시형태들에서, 적어도 하나의 선택된 T 림프구가, 그것의 세포 표면이 CD4+ 또는 CD3+CD4+ 이기 때문에, 적어도 부분적으로, 선택된다. 일부 실시형태들에서, 적어도 하나의 선택된 T 림프구가, 그것의 세포 표면이 CD8+ 또는 CD3+CD8+ 이기 때문에, 적어도 부분적으로, 선택된다. 일부 실시형태들에서, 적어도 하나의 선택된 T 림프구가, 그것의 세포 표면이 CD45RA+ (예를 들어, CD45RA+CD45RO-) 이기 때문에, 적어도 부분적으로, 선택된다. 일부 실시형태들에서, 적어도 하나의 선택된 T 림프구가, 그것의 세포 표면이 CD45RA- (예를 들어, CD45RA-CD45RO+) 이기 때문에, 적어도 부분적으로, 선택된다. 일부 실시형태들에서, 적어도 하나의 선택된 T 림프구가, 그것의 세포 표면이 CCR7+ 및/또는 CD62L+ 이기 때문에, 적어도 부분적으로, 선택된다. 일부 실시형태들에서, 적어도 하나의 선택된 T 림프구가, 그것의 세포 표면이 CCR7- 및/또는 CD62L- 이기 때문에, 적어도 부분적으로, 선택된다. 일부 실시형태들에서, 적어도 하나의 선택된 T 림프구가, 그것의 세포 표면이 CD45RA+, CD45RO-, CD45RA+CCR7+, CD45RO-CCR7+, CD45RA+CD45RO-CCR7+, CD45RA+CD62L+, CD45RO-CD62L+, CD45RA+CD45RO-CD62L+, CD45RA+CCR7+CD62L+, CD45RO-CCR7+CD62L+, 또는 CD45RA+CD45RO-CCR7+CD62L+ 이기 때문에, 적어도 부분적으로, 선택된다. 일부 실시형태들에서, 적어도 하나의 선택된 T 림프구가, 그것의 세포 표면이 CD45RO+, CD45RA-, CD45RO+CCR7+, CD45RA-CCR7+, CD45RO+CD45RA-CCR7+, CD45RO+CD62L+, CD45RA-CD62L+, CD45RO+CD45RA-CD62L+, CD45RO+CCR7+CD62L+, CD45RA-CCR7+CD62L+, 또는 CD45RO+CD45RA-CCR7+CD62L+ 이기 때문에, 적어도 부분적으로, 선택된다. 일부 실시형태들에서, 적어도 하나의 선택된 T 림프구가, 그것의 세포 표면이 CD45RO+CCR7-, CD45RA-CCR7-, CD45RO+CD45RA-CCR7-, CD45RO+CD62L-, CD45RA-CD62L-, CD45RO+CD45RA-CD62L-, CD45RO+CCR7-CD62L-, CD45RA-CCR7-CD62L-, CD45RO+CD45RA-CCR7-CD62L- 이기 때문에, 적어도 부분적으로, 선택된다. 일부 실시형태들에서, 적어도 하나의 선택된 T 림프구가, 그것의 세포 표면이 CD69- 이기 때문에, 적어도 부분적으로, 선택된다. 일부 실시형태들에서, 적어도 하나의 선택된 T 림프구가, 그것의 세포 표면이 PD-1+ 및/또는 CD137+ 이기 때문에, 적어도 부분적으로, 선택된다. 일부 실시형태들에서, 적어도 하나의 선택된 T 림프구가, 그것의 세포 표면이 PD-1- 및/또는 CD137- 이기 때문에, 적어도 부분적으로, 선택된다.
일부 실시형태들에서, 선택하는 단계는 적어도 하나의 T 림프구를 하나 이상의 결합제들 (예를 들어, 항체들, 펩티드-결합 MHC 착체들의 테트라머 등) 과 접촉시키는 것 및 하나 이상이 결합제들과 적어도 하나의 T 림프구 사이의 결합의 존재 (또는 부재) 에 기초하여 격리 펜으로 적어도 하나의 T 림프구를 이동시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 하나 이상의 결합제들 각각은 형광단과 같은 라벨을 포함한다.
소정의 실시형태들에서, 격리 펜으로 하나 이상의 T 림프구들을 도입하는 것은 격리 펜으로 활성화 작용제를 도입하는 것을 더 포함한다. 하나 이상의 T 림프구들은 격리 펜으로 도입되기 전에 활성화 작용제와 접촉될 수 있다. 예를 들어, T 림프구들은 미세유체 디바이스로 도입되기 전에 적어도 1 시간 (예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 또는 그 이상의 시간들) 의 주기 동안 활성화 작용제로 인큐베이팅될 수 있다. 대안적으로, 하나 이상의 T 림프구들은 격리 펜으로 도입된 후 활성화 작용제와 접촉될 수 있다.
소정의 실시형태들에서, 활성화 작용제는 CD3 및 CD28 작용제들을 포함할 수 있다. CD3 및/또는 CD28 작용제는 항체일 수 있다. 일부 실시형태들에서, 안티-CD3 작용제 (예를 들어, 항체) 가 고형 서포트에 컨쥬게이트 (conjugate) 된다. 일부 실시형태들에서, 안티-CD28 작용제 (예를 들어, 항체) 가 고형 서포트에 컨쥬게이트된다. 일부 실시형태들에서, 안티-CD28 작용제 (예를 들어, 항체) 는 수용액에서 용질이다. 따라서, 예를 들어, 활성화 작용제는 안티-CD3 및 안티-CD28 작용제 항체들에 컨쥬게이트된 하나 이상의 비드들을 포함할 수 있다. 대안적으로, 활성화 작용제는 안티-CD3 작용제 항체들에 컨쥬게이트된 하나 이상의 비드들 및 용해가능한 안티-28 작용제 항체의 용액을 포함할 수 있다. 여전히 다른 대안들에서, CD3 및/또는 CD28 작용제들은 격리 펜의 하나 이상의 표면들에 (공유결합으로 또는 비공유결합으로) 연결될 수 있다. 격리 펜의 표면(들) 은 그 표면(들) 에 대한 CD3 및/또는 CD28 작용제들의 연결을 용이하게 하는 방식으로 컨디셔닝될 수 있다.
소정의 실시형태들에서, 활성화 작용제는 수지상세포 (DC) 를 포함할 수 있다. 수지상세포는 하나 이상의 T 림프구들과 접촉하기 전에 관심의 항원 (예를 들어, 암-연관 항원, 전염성 질병-연관 항원, 또는 일부 다른 타입의 조건과 연관된 항원) 으로 펄싱될 수 있다. 잘 알려진 항원 또는 네오항원일 수 있는 암-연관 항원은 종양 바이옵시로부터 획득된 종양 세포들의 게놈 분석을 통해 식별될 수 있다.
소정의 실시형태들에서, 활성화 작용제는 펩티드 항원과 MHC 분자 사이의 착체를 포함할 수 있다. 그러한 착체들은 펩티드-MHC 테트라머 착체들의 경우에서와 같이 연결될 수 있다. 펩티드-MHC 착체들은 고형 서포트에 컨쥬게이트될 수 있다. 일부 실시형태들에서, 고형 서포트는 하나 이상의 비드들일 수 있다. 다른 실시형태들에서, 고형 서포트는 격리 펜의 하나 이상의 표면들일 수 있다. 따라서, 격리 펜의 표면(들) 은 그 표면(들) 에 대한 펩티드-MHC 착체들의 연결을 용이하게 하는 방식으로 컨디셔닝될 수 있다.
소정의 실시형태들에서, 배양 매질은 적어도 24 시간 (예를 들어, 적어도 48, 72, 96, 110, 또는 이상의 시간, 또는 그들 사이의 임의의 수) 의 주기 동안 미세유체 디바이스의 미세유체 채널을 통해 관류된다. 소정의 실시형태들에서, 배양 매질은 선택적으로 소혈청 (예를 들어, 소태아혈청 또는 송아지 혈청) 과 결합한 인간 혈청 (예를 들어, 휴먼 AB 혈청) 일 수 있는 포유류 혈청을 포함한다. 소정의 실시형태들에서, 배양 매질은 인터류킨 2 (IL2), 인터류킨 7 (IL7), 인터류킨 21 (IL21), 인터류킨 15 (IL15), 또는 이들의 임의의 조합을 더 포함한다. 일부 실시형태들에서, 배양 매질은 약 50 U/ml IL2 (예를 들어, 약 1 U/ml 내지 약 10 U/ml IL2) 를 포함한다. 일부 실시형태들에서, 배양 매질은 약 5 ng/ml IL7 (예를 들어, 약 1 ng/ml 내지 약 10 ng/ml IL7) 를 포함한다. 일부 실시형태들에서, 배양 매질은 약 30 ng/ml IL21 (예를 들어, 약 10 ng/ml 내지 약 50 mg/ml IL21) 를 포함한다.
일부 실시형태들에서, 방법은 하나 이상의 T 림프구들의 펜 내 (in-pen) 증식 속도를 분석하는 것을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 방법은 격리 펜 내의 하나 이상의 T 림프구들에 의한, 하나 이상의 시토킨들, 예를 들어, INFgamma, TNFalpha, IL2, 또는 이들의 조합의 발현을 분석하는 것을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 방법은 격리 펜 내의 하나 이상의 T 림프구들에 의한, CTLA4 와 같은 하나 이상의 조절 T 세포 마커들의 발현을 분석하는 것을 포함한다.
일부 실시형태들에서, T 림프구들은 예를 들어 증식 후에 미세유체 디바이스로부터 익스포트된다. 익스포트 (export) 는 예를 들어 증식 속도, 시토킨 발현, 조절 T 세포 마커(들) 의 발현, 또는 이들의 조합에 적어도 부분적으로 기초하여 선택적일 수 있다. 일부 실시형태들에서, 익스포트된 T 림프구들의 샘플은 게놈적으로 프로파일링 (genomically profiling) 된다.
소정의 실시형태들에서, 환자 내의 암을 치료하는 방법들이 개시된다. 환자는 인간과 같은 포유 동물일 수 있다. 암은 유방암, 비뇨기 암 (예를 들어, 신장 (예를 들어, 콩팥세포암종), 요관, 방광, 또는 요도에서와 같은 요로에서 발생하는 암; 웅성 생식 기관의 암 (예를 들어, 고환암, 전립선암, 또는 정낭들, 정관들 또는 음경의 암); 자성 생식 수관의 암 (예를 들어, 난소암, 자궁암, 자궁경부암, 질암, 또는 나팔관의 암)), 신경계의 암 (예를 들어, 신경모세포종), 장암 (예를 들어, 대장암), 폐암, 흑색종, 또는 다른 타입의 암일 수 있다. 특정의 실시형태들에서, 암은 수질 유방암, 중피종, 또는 흑색종일 수 있다.
암을 치료하는 방법들은, 환자로부터 획득된 조직 샘플로부터 T 림프구들을 분리시키는 단계; 여기에 개시된 방법들 중 임의의 것에 따라 미세유체 디바이스 내에서 그 분리된 T 림프구들을 증식시키는 단계; 미세유체 디바이스로부터 그 증식된 T 림프구들을 익스포트하는 단계; 및 환자 내로 그 증식된 T 림프구들을 재도입하는 단계를 포함할 수 있다.
소정의 실시형태들에서, 조직 샘플은 말초 혈액의 샘플이다. 소정의 실시형태들에서, 조직 샘플은 고형 종양으로부터이다. 조직 샘플은, 예를 들어, 고형 종양으로부터의 FNA 또는 바이옵시 (예를 들어, 코어 바이옵시) 일 수 있다. 고형 종양 샘플은 상술된 암들 중 임의의 암으로부터일 수 있다.
소정의 실시형태들에서, 조직 샘플로부터 T 림프구들을 분리시키는 것은 조직 샘플 내의 CD3+ 세포들에 대한 선택을 수행하는 것을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 선택은 위에서 그리고 본 명세서의 다른 곳에서 기술된 바와 같이, 마커들 CD3, CD4, CD8, CD45RO, CD45RA, CCR7, CD62L, PD-1, PD-L1, 및 CD137 중 하나 이상에 기초할 수 있다. 선택은 그것에 부착되는 CD3-결합제 (또는 다른 마커-결합제) 를 갖는, 자성 비드들과 같은 비드들을 사용하는 것을 포함할 수 있다. 소정의 실시형태들에서, 조직 샘플로부터 T 림프구들을 분리시키는 것은 종양 샘플 내의 CD3+ (또는 다른 마커-포지티브) 세포들에 대한 선택을 수행하기 전에 조직 샘플을 해리하는 것을 더 포함한다.
소정의 실시형태들에서, 분리된 T 림프구들은 미세유체 디바이스로 도입된다. 미세유체 디바이스는 나노유체 디바이스일 수 있다. 소정의 실시형태들에서, 분리된 T 림프구들을 증식시키는 것은 미세유체 (또는 나노유체) 디바이스의 격리 펜으로 하나 이상의 분리된 T 림프구들을 도입하는 것을 포함한다. 격리 펜은, 예를 들어, 약 0.5x106 내지 약 5x106 세제곱 마이크론, 또는 약 0.5x106 내지 약 2.0x106 세제곱 마이크론의 체적을 가질 수 있다.
소정의 실시형태들에서, 분리된 T 림프구들을 증식시키는 것은 분리된 T 림프구들을 활성화 작용제와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 활성화 작용제는 CD3 및/또는 CD28 작용제들을 포함한다. CD3 및/또는 CD28 작용제는 항체일 수 있다. 일부 실시형태들에서, 안티-CD3 작용제는 고형 서포트에 컨쥬게이트된다. 일부 실시형태들에서, 안티-CD28 작용제는 고형 서포트에 컨쥬게이트된다. 따라서, 활성화 작용제는, 예를 들어, 하나 이상의 고형 서포트들 (예를 들어, 하나 이상의 비드들) 을 포함할 수 있으며, 이들 각각은 안티-CD3 및/또는 안티-CD28 작용제 항체들에 컨쥬게이트될 수 있다. 일부 실시형태들에서, 안티-CD28 작용제 (예를 들어, 항체) 는 수용액에서 용질로서 제공된다. 다른 실시형태들에서, 활성화 작용제는 수지상세포들 (DCs) 을 포함한다. DC 들은 치료받고 있는 환자로부터 획득될 수 있고 및/또는 분리된 T 림프구들과 접촉하기 전에 종양 항원으로 펄싱될 수 있다. 종양 항원은 환자로부터 획득된 암 세포들로부터 핵산 분자들 (예를 들어, gDNA, mRNA 등) 의 시퀀싱을 통해 식별될 수 있다. 여전히 다른 실시형태들에서, 활성화 작용제는 하나 이상의 비드들 또는 격리 펜의 하나 이상의 표면들 (예를 들어, 컨디셔닝된 표면들) 과 같은 고형 서포트에 연결될 수도 있는 펩티드-MHC 착체 또는 (펩티드-MHC 테트라머 착체와 같은) 착체들의 클러스터일 수 있다.
소정의 실시형태들에서, T 림프구들은 미세유체 디바이스로 도입되기 전에 적어도 1 시간 (예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 또는 그 이상의 시간들) 의 주기 동안 활성화 작용제로 인큐베이팅된다. 소정의 실시형태들에서, 격리 펜으로 분리된 T 림프구들을 도입시키는 것은 격리 펜으로 활성화 작용제를 도입시키는 것을 더 포함한다.
소정의 실시형태들에서, 활성화 작용제에 의해 접촉되는 것에 응답하여 증식을 겪는 분리된 T 림프구들은 적어도 100-배 (예를 들어, 적어도 200-배, 적어도 500-배, 적어도 1000-배 등) 증식을 나타낸다. 소정의 실시형태들에서, 증식된 T 림프구들은 미세유체 디바이스로부터 익스포트된 후 그러나 환자 내로 재도입되기 전에 "오프 칩 (off chip)" 으로 추가로 증식된다.
여기에 기술된 방법들 중 임의의 방법은 미세유체 디바이스와 그 안에서 성장된 T 세포들 사이의 일차적 인터페이스를 제공하는 유기 및/또는 친수성 분자들의 층을 제공하도록 컨디셔닝되거나 코팅된 하나 이상의 내부 표면들 (예를 들어, 기질 표면, 커버 표면, 및/또는 회로 재료의 표면들) 을 갖는 미세유체 디바이스를 사용하여 수행될 수도 있다. 예를 들어, 흐름 경로 및 격리 펜(들) 은 하나 이상의 내부 표면들에 유기 및/또는 친수성 분자층을 결합시키고 제공하는 코팅 용액으로 처리될 수 있다. 따라서, 코팅 용액은 혈청, 혈청 알부민 (예를 들어, BSA), 폴리머, 계면활성제, 엔자임들, 또는 이들의 임의의 조합과 같은, 하나 이상의 내부 표면들에 결합되는 코팅제를 포함할 수 있다.
소정의 실시형태들에서, 미세유체 디바이스는 코팅 재료를 포함하는 내부 기질 표면 (및/또는 내부 커버 표면 및/또는 회로 재료의 내부 표면들) 을 포함할 수 있다. 일부 실시형태들에서, 코팅 재료는 연결기 및 알킬 모이어티를 갖는 분자들을 포함한다. 연결기는 내부 기질 표면에 공유결합으로 결합될 수 있고, 예를 들어, 실록시 연결기일 수 있다. 알킬 모이어티는, 예를 들어, 플루오로알킬 모이어티 또는 퍼플루오로알킬 모이어티와 같은 비치환 알킬 모이어티 또는 치환 알킬 모이어티일 수 있다. 알킬 모이어티는 적어도 10 개의 탄소 원자들 (예를 들어, 적어도 12, 14, 16, 18, 20, 22, 또는 더 많은 탄소 원자들) 을 포함하는 탄소들의 선형 사슬을 포함할 수 있다. 코팅 재료의 분자들은 내부 기질 표면 (및/또는 내부 커버 표면 및/또는 회로 재료의 내부 표면들) 에 공유결합된 밀집 패킹된 (densely-packed) 단층 구조를 형성할 수 있다.
일부 실시형태들에서, 코팅 재료는 연결기 및 양이온성 모이어티 및/또는 음이온성 모이어티를 갖는 분자들을 포함하며, 여기서 연결기는 내부 기질 표면 (및/또는 내부 커버 표면 및/또는 회로 재료의 내부 표면들) 에 공유결합된다. 양이온성 모이어티는 쿼터너리 (quaternary) 암모늄기를 포함할 수 있다. 음이온성 모이어티는 포스포닉 애시드, 카르복실 애시드, 또는 술포닉 애시드를 포함할 수 있다. 일부 관련된 실시형태들에서, 코팅 재료는 연결기 및 양성이온 모이어티를 갖는 분자들을 포함할 수 있으며, 여기서 연결기는 내부 기질 표면 (및/또는 내부 커버 표면 및/또는 회로 재료의 내부 표면들) 에 공유결합된다. 양성이온 모이어티는 카르복시베타인들, 술포베타인들, 술파믹 애시드들, 및 아미노 애시드들로부터 선택된다. 일부 실시형태들에서, 양이온성, 음이온성, 또는 양성이온 모이어티들은 차단제와 이온 결합할 수 있다.
일부 실시형태들에서, 코팅 재료는 알킬렌 에테르 모이어티들, 사카라이드 모이어티들, 또는 아미노 애시드 모이어티들을 포함하는 폴리머를 포함한다. 예를 들어, 코팅 재료는 덱스트란 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 을 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 코팅 재료는 단백질 폴리머들 (예를 들어, T 세포 활성화를 증진시키는 단백질들) 을 포함할 수 있다.
여기에 개시된 방법에 따라 생성된 T 림프구가 또한 제공된다. 예를 들어, 미세유체 디바이스의 하나 이상의 격리 펜들에, 여기에 개시된 방법에 따라 생성된 하나 이상의, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 개, 또는 그 이상의 T 림프구들을 포함하는 미세유체 디바이스가 또한 제공된다. 여기에 개시된 방법에 따라 생성된 T 림프구를 포함하는 약학 조성물 및, 선택적으로, 약학적으로 수용가능한 캐리어가 또한 제공된다.
추가의 목적들 및 이점들은 다음의 설명에 부분적으로 진술될 것이고, 부분적으로는 상세한 설명으로부터 명백할 것이거나, 실시에 의해 학습될 수도 있다. 목적들 및 이점들은 첨부된 청구범위에 특별히 지적된 엘리먼트들 및 조합들에 의해 실현 및 달성될 것이다.
상술된 일반 설명 및 다음의 상세한 설명은 양자 모두가 예시적이고 설명적일 뿐이고 청구범위를 제한하지 않는다는 것이 이해되어야 한다.
본 명세서에 포함되고 본 명세성의 부분을 구성하는 첨부하는 도면들은 하나 (수개) 의 실시형태(들) 을 도시하고, 상세한 설명과 함게, 여기에 기술된 원리들을 설명하는 작용을 한다.
도 1a 는 본 개시의 일부 실시형태들에 따른 미세유체 디바이스 및 연관된 제어 장비와 함께 사용하기 위한 시스템의 예를 도시한다.
도 1b 및 도 1c 는 본 개시의 일부 실시형태들에 따른 미세유체 디바이스를 도시한다.
도 2a 및 도 2b 는 본 개시의 일부 실시형태들에 따른 격리 펜들을 도시한다.
도 2c 는 본 개시의 일부 실시형태들에 따른 상세화된 격리 펜을 도시한다.
도 2d 는 본 개시의 일부 다른 실시형태들에 따른 격리 펜들을 도시한다.
도 2g 는 본 개시의 일 실시형태에 따른 미세유체 디바이스를 도시한다.
도 2h 는 본 개시의 일 실시형태에 따른 미세유체 디바이스의 코팅된 표면을 도시한다.
도 3a 는 본 개시의 일부 실시형태들에 따른 미세유체 디바이스 및 연관된 제어 장비와 함께 사용하기 위한 시스템의 특정의 예를 도시한다.
도 3b 는 본 개시의 일부 실시형태들에 따른 이미징 디바이스를 도시한다.
도 4 는 안티-CD3/안티-CD28 T 세포-활성화 비드들로 배양된 인간 T 림프구들을 포함하는 나노유체 칩 내의 단일 나노웰 (nanowell) 의 시간-경과 이미지들의 시리즈를 제공한다. 이미지들은 배양의 0, 24, 48, 72, 및 96 시간들에서의 나노웰을 보여준다.
도 5a 는 동종이계 수지상 세포들 (DCs) 로 배양된 인간 T 림프구들을 포함하는 나노유체 칩 내의 단일 나노웰의 시간-경과 이미지들의 시리즈를 제공한다. 이미지들은 배양의 0, 24, 48, 72, 및 96 시간들에서의 나노웰을 보여준다.
도 5b 는 파상풍 독소 및 엡스타인 (Epstein) 바 바이러스 항원들로 펄싱된 수지상세포들 (DCs) 로 배양된 인간 T 림프구들을 포함하는 나노유체 칩 내의 단일 나노웰의 시간-경과 이미지들의 시리즈를 제공한다. 이미지들은 배양의 0, 24, 48, 72, 96 및 110 시간들에서의 나노웰을 보여준다.
도 6a 는 도 6a 의 나노웰 내의 T 세포들에의 EdU (형광 신호) 의 통합을 보여주는 이미지를 제공한다. EdU 통합이 96-시간 배양 시간 포인트에 대해 (적색으로) 도시되고 선택적으로 증식된 T 세포들의 명시야 이미지상에 오버레이된다.
도 6b 는 도 6b 의 나노웰 내의 T 세포들에의 EdU (형광 신호) 의 통합을 보여주는 이미지를 제공한다. EdU 통합이 110-시간 배양 시간 포인트에 대해 (적색으로) 도시되고 선택적으로 증식된 T 세포들의 명시야 이미지상에 오버레이된다.
도 7a 및 도 7b 는 적어도 하나의 커디셔닝된 표면을 갖는 미세유체 디바이스에서 T 세포들을 배양하는 실시형태의 사진 표현들이다.
도 8a 는 샘플로부터 T 림프구들을 획득하는 것 및 그것들을 미세유체 디바이스 내의 격리 펜들로 도입시켜, 페닝된 (penned) 세포들을 제공하는 것에 대한 예시적인 작업흐름을 도시한다.
도 8b 는 도 8a 에 도시된 작업흐름에 따라 페닝된 T 림프구들과 같은 페닝된 T 림프구들을 증식시키기 위한 예시적인 작업흐름을 도시한다.
도 8c 는 도 8b 에 도시된 작업흐름에 따라 증식된 T 림프구들과 같은 증식된 T 림프구들을 익스포트시키기 위한 예시적인 작업흐름을 도시한다.
본 상세한 설명은 본 개시의 예시적인 실시형태들 및 애플리케이션들을 설명한다. 그러나, 본 개시는 이들 예시적인 실시형태들 및 애플리케이션들에 또는 예시적인 실시형태들 및 애플리케이션들이 동작하거나 본원에 설명되는 방식에 제한되지 않는다. 더욱이, 도면들은 단순화된 또는 부분 뷰들을 나타낼 수도 있고, 도면들에서 엘리먼트들의 치수들은 과장되거나 또는 다르게는 비례적이지 않을 수도 있다. 또한, 용어들 "~ 상에 (on)", "~ 에 부착된 (attached to)", "~ 에 접속된 (connected to)", "~ 에 결합된 (coupled to)" 또는 유사한 단어들이 본원에서 사용되는 바와 같이, 하나의 엘리먼트가 다른 엘리먼트 바로 위에 있고, 그것에 부착되거나, 그것에 접속되고 또는 그것에 결합되는지, 또는 하나의 엘리먼트와 다른 엘리먼트 사이에 하나 이상의 중간 엘리먼트들이 있는지 여부에 관계 없이, 하나의 엘리먼트 (예를 들어, 재료, 층, 기판 등) 는 다른 엘리먼트 "상에" 있을 수 있고, 그것에 "부착될" 수 있고, 그것에 "접속될" 수 있고, 또는 그것에 "결합될" 수 있다. 또한, 콘텍스트가 다르게 기술하지 않으면, 방향들 (예를 들어, 위 (above), 아래 (below), 상단 (top), 하단 (bottom), 측면 (side), 상 (up), 하 (down), 상부에서 (over), 상부 (upper), 하부 (lower), 수평, 수직, "x", "y", "z" 등) 은 제공된다면 상대적이고, 제한이 아니라, 전적으로 예로서 그리고 예시 및 논의의 용이함을 위해 제공된다. 또한, 엘리먼트들 (예를 들어, 엘리먼트들 a, b, c) 의 리스트에 대해 참조가 이루어지는 경우, 이러한 참조는 열거된 엘리먼트들 자체, 전부보다 적은 열거된 엘리먼트들의 임의의 조합, 및/또는 열거된 엘리먼트들의 전부의 조합 중의 임의의 하나를 포함하도록 의도된다. 상세한 설명에서 섹션 분할들은 단지 리뷰의 용이함을 위한 것이고 논의된 엘리먼트들의 임의의 조합을 제한하지 않는다.
미세유체 피쳐들 (features) 의 치수들이 너비 또는 면적을 갖는 것으로서 기술되는 경우, 치수는 통상적으로 x-축 및/또는 y-축 치수에 대해 기술되며, 이들 양자는 미세유체 디바이스의 기질 및/또는 커버에 평행한 평면 내에 있다. 미세유체 피쳐의 높이는 미세유체 디바이스의 기질 및/또는 커버에 평행한 평면에 수직인 z-축 치수에 대해 기술될 수도 있다. 일부 경우들에서, 채널 또는 통로와 같은, 미세유체 피쳐의 단면적은 x-축/z-축, y-축/z-축, 또는 x-축/y-축 면적을 참조할 수도 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "실질적으로" 는 의도된 목적을 위해 작동하기에 충분하다는 것을 의미한다. 용어 "실질적으로" 는 따라서, 당업자에 의해 예상될 것이지만, 전체적인 성능에 인식가능하게 영향을 주지 않는 바와 같은, 절대적인 또는 완전한 상태, 치수, 측정, 결과 등으로부터의 소수의 중요하지 않은 변형들을 허용한다. 수치 값들 또는 수치 값들로서 표현될 수 있는 파라미터들 또는 특징들에 대하여 사용될 때, "실질적으로" 는 10 퍼센트 이내를 의미한다.
용어 "것들" 은 하나보다 많은 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "복수" 는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 그 이상일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "배치된" 은 그 의미 내에 "위치된" 을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "미세유체 디바이스" 또는 "미세유체 장치" 는 유체를 보유하도록 구성된 하나 이상의 별개의 미세유체 회로들을 포함하는 디바이스이고, 각각의 미세유체 회로는, 영역(들), 흐름 경로(들), 채널(들), 챔버(들), 및/또는 펜(들), 및 유체 (및, 선택적으로는 유체에서 부유된 마이크로-객체들) 가 미세유체 디바이스의 안 및/또는 밖으로 유동하는 것을 허용하도록 구성된 적어도 하나의 포트를 포함하지만 이에 제한되지는 않는, 유동적으로 서로접속된 회로 엘리먼트들로 이루어진다. 통상적으로, 미세유체 디바이스의 미세유체 회로는 미세유체 채널을 포함할 수도 있는 흐름 경로, 및 적어도 하나의 챔버를 포함할 것이고, 약 1 mL 미만, 예를 들어 약 750, 500, 250, 200, 150, 100, 75, 50, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 또는 2 μL 미만의 유체의 볼륨을 보유할 것이다. 소정 실시형태들에서, 미세유체 회로는 약 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 2-5, 2-8, 2-10, 2-12, 2-15, 2-20, 5-20, 5-30, 5-40, 5-50, 10-50, 10-75, 10-100, 20-100, 20-150, 20-200, 50-200, 50-250, 또는 50-300 μL 를 보유한다. 미세유체 회로는 미세유체 디바이스에서의 제 1 포트 (예를 들어, 입구) 와 유동적으로 접속된 제 1 단부 및 미세유체 디바이스에서의 제 2 포트 (예를 들어, 출구) 와 유동적으로 접속된 제 2 단부를 갖도록 구성될 수도 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "나노유체 디바이스" 또는 "나노유체 장치" 는 약 1 μL 미만, 예를 들어 약 750, 500, 250, 200, 150, 100, 75, 50, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 nL 미만의 유체의 볼륨을 보유하도록 구성된 적어도 하나의 회로 엘리먼트를 포함하는 미세유체 회로를 갖는 미세유체 디바이스의 유형이다. 나노유체 디바이스는 복수의 회로 엘리먼트들 (예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000, 또는 그 이상) 을 포함할 수도 있다. 소정의 실시형태들에서, 적어도 하나의 회로 엘리먼트들 중 하나 이상 (예를 들어, 전부) 은 약 100 pL 내지 1 nL, 100 pL 내지 2 nL, 100 pL 내지 5 nL, 250 pL 내지 2 nL, 250 pL 내지 5 nL, 250 pL 내지 10 nL, 500 pL 내지 5 nL, 500 pL 내지 10 nL, 500 pL 내지 15 nL, 750 pL 내지 10 nL, 750 pL 내지 15 nL, 750 pL 내지 20 nL, 1 내지 10 nL, 1 내지 15 nL, 1 내지 20 nL, 1 내지 25 nL, 또는 1 내지 50 nL 의 유체의 볼륨을 보유하도록 구성된다. 다른 실시형태들에서, 적어도 하나의 회로 엘리먼트들 중 하나 이상 (예를 들어, 전부) 은 약 20 nL 내지 200 nL, 100 내지 200 nL, 100 내지 300 nL, 100 내지 400 nL, 100 내지 500 nL, 200 내지 300 nL, 200 내지 400 nL, 200 내지 500 nL, 200 내지 600 nL, 200 내지 700 nL, 250 내지 400 nL, 250 내지 500 nL, 250 내지 600 nL, 또는 250 내지 750 nL 의 유체의 볼륨을 보유하도록 구성된다.
본원에 사용된 바와 같은 "미세유체 채널" 또는 "흐름 채널" 은 수평 및 수직 치수들 양자 모두보다 상당히 더 긴 길이를 갖는 미세유체 디바이스의 흐름 경로를 지칭한다. 예를 들어, 흐름 채널은 수평 또는 수직 치수 중 어느 하나의 길이의 적어도 5 배, 예를 들어 적어도 10 배 길이, 적어도 25 배 길이, 적어도 100 배 길이, 적어도 200 배 길이, 적어도 500 배 길이, 적어도 1,000 배 길이, 적어도 5,000 배 길이, 또는 더 길 수 있다. 일부 실시형태들에서, 흐름 채널의 길이는 그 사이의 임의의 범위를 포함하는, 약 100,000 마이크론 내지 약 500,000 마이크론의 범위에 있다. 일부 실시형태들에서, 수평 치수는 약 100 마이크론 내지 약 1000 마이크론 (예를 들어, 약 150 내지 500 마이크론) 의 범위에 있고, 수직 치수는 약 25 마이크론 내지 약 200 마이크론, 예를 들어 약 40 내지 약 150 마이크론의 범위에 있다. 흐름 채널은 미세유체 디바이스에서 다양한 상이한 공간적 구성들을 가질 수도 있고, 따라서 완벽히 선형 엘리먼트에 제한되지 않는다는 것이 주목된다. 예를 들어, 흐름 채널은 다음의 구성들: 커브, 벤드, 나선형, 경사, 쇠퇴, 포크 (예를 들어, 다수의 상이한 유동 경로들), 및 이들의 임의의 조합을 갖는 하나 이상의 섹션들이거나, 그것들을 포함할 수도 있다. 또한, 흐름 채널은, 원하는 유체 흐름을 그 안에 제공하기 위해 넓히고 수축시키는, 그 경로를 따른 상이한 단면 영역들을 가질 수도 있다. 흐름 채널은 밸브들을 포함할 수도 있고, 밸브들은 미세유체공학의 기술에서 알려져 있는 임의의 타입일 수도 있다. 밸브들을 포함하는 미세유체 채널들의 예들은 미국 특허들 제 6,408,878 호 및 제 9,227,200 호에 개시되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 참조에 의해 여기에 병합된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "장애물"은 일반적으로 미세유체 디바이스 내의 2 개의 상이한 영역들 또는 회로 엘리먼트들 사이의 타겟 마이크로-객체들의 이동을 부분적으로 (그러나 완전히는 아님) 방해하기에 충분히 큰 범프 또는 유사한 유형의 구조를 지칭한다 . 2 개의 상이한 영역들/회로 엘리먼트들은, 예를 들어 미세유체 격리 펜의 접속 영역 및 고립 영역일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "수축 (constriction)" 은 일반적으로 미세유체 디바이스에서 회로 엘리먼트 (또는 2 개의 회로 엘리먼트들 사이의 인터페이스) 의 폭을 좁히는 것을 지칭한다. 수축은, 예를 들어 본 개시의 미세유체 격리 펜의 고립 영역과 접속 영역 사이의 인터페이스에 위치될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "투명한" 은 가시 광이 통과될 때 가시 광이 광을 실질적으로 바꾸지 않고 통과하는 것을 허용하는 재료를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "마이크로-객체" 는 일반적으로, 본 개시에 따라 고립 및/또는 조작될 수도 있는 임의의 미세한 객체를 지칭한다. 마이크로-객체들의 비-제한적 예들은: 미세입자들; 미세비드들 (예를 들어, 폴리스티렌 비드들, Luminex™ 비드들 등); 자기 비드들; 미세로드들; 미세와이어들; 양자 점들 등과 같은 무생물의 마이크로-객체들; 세포들; 생물학적 세포기관들; 소낭들, 또는 착물들; 합성 소낭들; (예를 들어, 막 표본들로부터 유래된 또는 합성의) 리포솜들; 지질 나노래프트 (lipid nanoraft) 들 등과 같은 생물학적 마이크로-객체들; 또는 무생물의 마이크로-객체들 및 생물학적 마이크로-객체들의 조합 (예를 들어, 세포들에 부착된 미세비드들, 리포좀-코팅된 미세-비드들, 리포솜-코팅된 자기 비드들, 등) 을 포함한다. 비드들은 또한, 공유결합으로 또는 비-공유결합으로 부착된 모이어티들/분자들, 예컨대 형광성 라벨들, 단백질들, 탄수화물들, 항원들, 소분자 시그널링 모이어티들, 또는 분석에서 사용할 수 있는 다른 화학적/생물학적 종들을 가질 수도 있다. 지질 나노래프트들은 예를 들어 Ritchie 등의, (2009) "Reconstitution of Membrane Proteins in Phospholipid Bilayer Nanodiscs," Methods Enzymol., 464:211-231 에 기술되어 있다.
여기서 사용되는 바와 같이, 용어 "세포" 는 용어 "생물학적 세포" 와 교환가능하게 사용된다. 생물학적 세포들의 비제한적 예들은 진핵세포들, 식물 세포들, 포유류 세포들, 파충류 세포들, 조류 세포들, 어류 세포들 등과 같은 동물 세포들, 원핵세포들, 박테리아 세포들, 균류 세포들, 원생 동물 세포들 등, 근육, 연골, 지방, 피부, 간, 폐, 신경 조직 등과 같은 조직으로부터 분리된 세포들, T 세포들, B 세포들, 내추럴 킬러 세포들, 대식세포들 등과 같은 면역학적 세포들, 배아들 (예를 들어, 접합자들), 난모세포들, 난자들, 정자 세포들, 하이브리도마들, 배양 세포들, 세포주로부터의 세포들, 암 세포들, 감염된 세포들, 세포 감염된 및/또는 형질전환된 세포들, 리포터 세포들 등을 포함한다. 포유류 세포는 예를 들어 인간, 생쥐, 쥐, 말, 염소, 양, 소, 영장류 등으로부터일 수 있다.
생물학적 세포들의 콜로니 (colony) 는 재생할 수 있는 콜로니에서의 모든 살아 있는 세포들이 단일의 친세포로부터 도출된 딸 세포들인 경우 "클론"이다. 소정의 실시형태들에서, 클론 콜로니에서의 모든 딸 세포들은 10 회 이하의 분할들에 의해 단일의 친세포로부터 도출된다. 다른 실시형태들에서, 클론 콜로니에서의 모든 딸 세포들은 14 회 이하의 분할들에 의해 단일의 친세포로부터 도출된다. 다른 실시형태들에서, 클론 콜로니에서의 모든 딸 세포들은 17 회 이하의 분할들에 의해 단일의 친세포로부터 도출된다. 다른 실시형태들에서, 클론 콜로니에서의 모든 딸 세포들은 20 회 이하의 분할들에 의해 단일의 친세포로부터 도출된다. 용어 "클론 세포들" 은 동일한 클론 콜로니의 세포들을 지칭한다.
여기서 사용되는 바와 같이, 생물학적 세포들의 "콜로니" 는 2 이상의 세포들 (예를 들어, 약 2 내지 약 20, 약 4 내지 약 40, 약 6 내지 약 60, 약 8 내지 약 80, 약 10 내지 약 100, 약 20 내지 약 200, 약 40 내지 약 400, 약 60 내지 약 600, 약 80 내지 약 800, 약 100 내지 약 1000, 또는 1000 초과 세포들) 을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "세포(들)을 유지하는" 은 세포들의 생존 및/또는 증식을 유지하는데 필요한 컨디션들을 제공하는 유체 및 기체 성분들 양자 모두, 및 선택적으로는 표면을 포함하는 환경을 제공하는 것을 지칭한다.
여기서 사용된 바와 같이, 세포들을 지칭할 때의 용어 "증식" 은 세포 수에서의 증가를 지칭한다.
유체 매질의 "성분" 은, 용매 분자들, 이온들, 소분자들, 항생물질들, 뉴클레오티드들 및 뉴클레오시드들, 핵산들, 아미노산들, 펩티드들, 단백질들, 설탕들, 탄수화물들, 지질들, 지방산들, 콜레스테롤, 대사물들 등을 포함하는, 매질에 존재하는 임의의 화학적 또는 생물학적 분자이다.
여기서 사용된 바와 같이, "캡쳐 모이어티" 는 마이크로-객체에 대한 인식 사이트 (site) 를 제공하는 화학적 또는 생물학적 종, 기능성, 또는 모티프 (motif) 이다. 마이크로-객체들의 선택된 클래스는 인 시츄 생성 캡쳐 모이어티를 인식할 수도 있고 인 시츄 생성 캡쳐 모이어티를 결합하거나 그것에 대한 친화력을 가질 수도 있다. 비제한적 예들은 항원들, 항체들, 및 세포 표면 결합 모티프들을 포함한다.
여기서 사용된 바와 같이, "유동가능 폴리머" 는 유체 매질 (예를 들어, 프리폴리머 용액) 내에 용해가능하거나 분산가능한 폴리머 모노머 또는 매크로머이다. 유동가능한 폴리머는 미세유체 흐름 경로로 투입될 수도 있으며, 거기서 그것은 그 안의 유체 매질의 다른 성분들과 함께 흐를 수 있다.
여기서 사용된 바와 같이 "광개시 폴리머" 는 광에 노출 시에 공유결합적으로 가교, 특정의 공유결합들을 형성, 고화된 케미컬 모티프 주위의 리지오케미스트리 (regiochemistry) 를 변경, 또는 물리적 상태에서의 변경을 야기하는 이온 쌍들을 형성할 수 있고, 및 이것에 의해 폴리머 네트워크를 형성할 수 있는 폴리머 (또는 그 폴리머를 생성하기 위해 사용될 수 있는 모노머 분자) 를 지칭한다. 일부 예들에서, 광개시 폴리머는 공유결합적으로 가교, 특정의 공유결합들을 형성, 고화된 화학적 모티프 주위의 리지오케미스트리를 변경, 또는 물리적 상태에서의 변경을 야기하는 이온 쌍들을 형성할 수 있는 하나 이상의 화학적 모이어티들에 결합된 폴리머 세그먼트를 포함할 수도 있다. 일부 예들에서, 광개시 폴리머는 (예를 들어, 폴리머의 중합을 통해) 폴리머 네트워크의 형성을 개시하기 위해 광활성화가능 라디컬 개시제를 요구할 수도 있다.
여기서 사용된 바와 같이, "항체" 는 면역글로불린 (Ig) 을 지칭하고 다클론성 및 단클론성 항체들 양자 모두; 영장류화된 (예를 들어, 인간화된); 쥣과의; 쥐-인간 (mouse-human); 쥐-영장류 (mouse-primate); 및 키메라를 포함하고, 순수한 (intact) 분자, 그것의 프래그먼트 (예를 들어, scFv, Fv, Fd, Fab, Fab' 및 F(ab)'2 프래그먼트들), 또는 순수한 분자들 및/또는 프래그먼트들의 멀티머들 또는 애그리케이트들일 수도 있고; 자연적으로 발생하거나 예를 들어 면역화, 합성 또는 유전공학에 의해 생성될 수도 있다. 여기서 사용된 바와 같은 "항체 프래그먼트" 는 항체로부터 도출되거나 항체와 관련된, 항원을 결합시키는, 및 일부 실시형태들에서 예를 들어 갈락토스 레지듀들의 병합에 의해 클리어런스 및 활용을 용이하게 하는 구조적 피쳐들을 나타내도록 유도될 수도 있는 프래그먼트들을 지칭한다. 이것은 예를 들어 F(ab), F(ab)'2, scFv, 경쇄 가변 영역 (VL), 중쇄 가변 영역 (VH), 및 이들의 조합을 포함한다.
유체 매질을 참조하여 본원에 사용된 바와 같이, "확산하다" 및 "확산" 은 농도 구배 아래의 유체 매질 성분의 열역학 운동을 지칭한다.
문구 "매질의 흐름" 은 주로 확산 이외의 임의의 메커니즘으로 인한 유체 매질의 벌크 이동을 의미한다. 예를 들어, 매질의 흐름은 포인트들 사이의 압력 차이로 인한 유체 매질의 한 포인트에서 다른 포인트로의 이동을 수반할 수 있다. 이러한 흐름은 액체의 연속적인, 펄싱된, 주기적인, 랜덤한, 간헐적인, 또는 왕복 흐름, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 하나의 유체 매질이 다른 유체 매질로 유동하는 경우, 매질의 터뷸런스 및 혼합이 초래될 수 있다.
문구 "실질적으로 유동하지 않음" 은, 시간 경과에 따라 평균화될 때, 유체 매질 안으로 또는 유체 매질 내에서 재료 (예를 들어, 관심 있는 분석물) 의 성분들의 확산 속도보다 작은 유체 매질의 흐름 속도를 지칭한다. 이러한 재료의 성분들의 확산 속도는, 예를 들어 온도, 성분들의 크기, 및 성분들과 유체 매질 간의 상호작용들의 강도에 의존할 수 있다.
미세유체 디바이스 내의 상이한 영역들을 참조하여 본원에 사용된 바와 같이, 문구 "유동적으로 접속된" 은, 상이한 영역들이 유체 매질과 같은 유체로 실질적으로 채워지는 경우, 유체의 단일 바디를 형성하도록 영역들 각각에서의 유체가 접속되는 것을 의미한다. 이것은, 상이한 영역들에서의 유체들 (또는 유체 매질) 이 반드시 조성이 동일한 것을 의미하지 않는다. 차라리, 미세유체 디바이스의 상이한 유동적으로 접속된 영역들에서의 유체들은, 용질들이 그들 각각의 농도 구배들을 하강시키고/시키거나 유체들이 미세유체 디바이스를 통해 유동할 때 유입되는 상이한 조성들 (예를 들어, 단백질들, 탄수화물들, 이온들, 또는 다른 분자들과 같은 용질들의 상이한 농도들) 을 가질 수 있다.
여기서 사용된 바와 같이, "흐름 경로" 또는 "흐름 영역" 은 매질의 흐름의 궤적을 정의하고, 그것에 종속되는 하나 이상의 유동적으로 접속된 회로 엘리먼트들 (예를 들어, 채널(들), 영역(들), 챔버(들) 등) 을 지칭한다. 흐름 경로는 따라서 미세유체 디바이스의 스윕 영역의 예이다. 다른 회로 엘리먼트들 (예를 들어, 비스윕 영역들) 은 흐름 경로 내의 매질의 흐름에 종속됨 없이 흐름 경로를 포함하는 회로 엘리먼트들과 유동적으로 접속될 수도 있다.
여기서 사용된 바와 같이, "마이크로-객체를 고립시키는 것" 은 미세유체 디바이스 내의 정의된 영역에 마이크로-객체를 한정한다. 마이크로-객체는 여전히 인 시츄 생성 캡쳐 구조 내에서 모션이 가능할 수도 있다.
미세유체 (또는 나노유체) 디바이스는 "스윕" 영역들 및 "비스윕" 영역들을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "스윕" 영역은, 미세유체 회로의 하나 이상의 유동적으로 상호접속된 회로 엘리먼트들로 이루어지고, 엘리먼트들 각각은 유체가 미세유체 회로를 통해 유동되고 있을 때 매질의 흐름을 경험한다. 스윕 영역의 회로 엘리먼트들은, 예를 들어 영역들, 채널들, 및 챔버들의 전부 또는 부분들을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "비스윕" 영역은 미세유체 회로의 하나 이상의 유동적으로 상호접속된 회로 엘리먼트로 이루어지고, 엘리먼트 각각은 유체가 미세유체 회로를 통해 유동되고 있을 때 유체의 플럭스를 실질적으로 경험하지 않는다. 비스윕 영역은, 유체 접속들이 확산을 가능하게 하도록 구조화되지만 스윕 영역과 비스윕 영역 사이의 매질의 흐름이 실질적으로 없다면, 스윕 영역에 유동적으로 접속될 수 있다. 미세유체 디바이스는 따라서, 스윕 영역에서의 매질의 흐름으로부터 비스윕 영역을 실질적으로 격리시키면서, 스윕 영역과 비스윕 영역 사이에서 단지 확산성 유체 연통만이 실질적으로 가능하도록 구조화될 수 있다. 예를 들어, 미세유체 디바이스의 흐름 채널은 스윕 영역의 예인 한편, 미세유체 디바이스의 고립 영역 (이하에서 더 상세히 설명됨) 은 비스윕 영역의 예이다.
여기서 사용되는 바와 같이, "인리치하다 (enrich)" 는 다른 세포 타입들과 같은 다른 성분들에 비해 조성물 또는 군집에서, 관심의 세포 타입과 같은, 성분의 농도를 증가시키는 것을 의미한다. 인리치먼트 (enrichment) 는 조성물 또는 군집에서 다른 성분들 (예를 들어, 다른 세포 타입들) 의 농도를 감소시키는 것의 결과일 수 있다. 예를 들어, 여기서 사용되는 바와 같이, 샘플 내의 T 림프구들의 소정의 서브 군집에 대해 "인리치하는 것 (enriching) " 은 샘플 내의 세포들의 총수에 비해 그 서브 군집의 비율을 증가시키는 것을 의미한다.
여기서 사용되는 바와 같이, "고갈시키다 (deplete)" 는 하나 이상의 원하는 세포 타입들과 같은 다른 성분들에 비해 조성물 또는 군집에서, 원하지 않는 세포 타입과 같은, 성분의 농도를 감소시키는 것을 의미한다. 고갈은 다른 성분들 중 하나 이상의 농도를 증가시키는 것의 결과일 수 있다. 예를 들어, 여기서 사용된 바와 같이, T 림프구들의 소정의 서브 군집의 샘플을 "고갈시키는 것" 은 샘플 내의 세포들의 총수에 비해 그 서브 군집의 비율을 감소시키는 것을 의미한다.
특정의 생물학적 물질들 (예를 들어, 항체들과 같은 단백질들) 을 생성하는 생물학적 마이크로-객체들 (예를 들어, 생물학적 세포들) 의 능력이 그러한 미세유체 디바이스에서 분석될 수 있다. 분석의 특정의 실시형태에서, 관심의 분석물의 생성을 위해 분석될 생물학적 마이크로-객체들 (예를 들어, 세포들) 을 포함하는 샘플 물질이 미세유체 디바이스의 스윕 (swept) 영역으로 로딩될 수 있다. 생물학적 마이크로-객체들 (예를 들어, 인간 세포들과 같은 포유류 세포들) 의 마이크로-객체들은 특정의 특징들을 위해 선택되고 비스윕 (unswept) 영역들에 배치될 수 있다. 나머지 샘플 재료는 그 후 스윕 영역 밖으로 유출되고 분석 물질이 스윕 영역으로 유입될 수 있다. 선택된 생물학적 마이크로-객체들이 비스윕 영역들에 있기 때문에, 선택된 생물학적 마이크로-객체들은 나머지 샘플 물질의 유출 또는 분석 물질의 유입에 의해 실질적으로 영향을 받지 않는다. 선택된 생물학적 마이크로-객체들은 비스윕 영역으로부터 스윕 영역으로 확산할 수 있는 관심의 분석물을 생성하도록 허용될 수 있으며, 여기서 관심의 분석물은 각각이 특정의 비스윕 영역과 상관될 수 있는 국부화된 검출가능 반응들을 생성하기 위해 분석 물질과 반응할 수 있다. 검출된 반응과 연관된 임의의 비스윕 영역은, 존재하는 경우, 비스윕 영역 내의 생물학적 마이크로-객체들 중 어는 것이 관심의 분석물의 충분한 생산자들인지를 결정하기 위해 분석될 수 있다.
미세유체/나노유체 디바이스들에서의 T 림프구들의 배양, 선택 및 증식. T 림프구들은 여기서 기술된 미세유체 및 나노유체 디바이스들에서 배양, 선택 및 증식될 수 있다. 본 섹션에서의 논의에 더하여, 배양, 선택 및 증식의 방법들이 발명의 요약 (위) 에서, 실시예들 (아래) 에서, 및 여기에 첨부되는 청구범위에서 기술된다. 예시적인 작업흐름들이 도 8a 내지 도 8c 에 도시된다. 현재 개시된 미세유체 디바이스들 내에서, T 세포들을 포함하는 생물학적 세포들을 증식하는 방법들은 또한 2016년 4월 22일자로 출원된 미국 특허출원 제 15/135,707 호에 기술되었고, 이것의 전체 내용들이 여기에 참조에 의해 포함된다.
T 림프구들의 군집은 기지의 방법들을 통해 획득될 수 있다. 일부 실시형태들에서, T 림프구들을 포함하는 말초 혈액 단핵 세포들 (PBMCs) 은 전체 혈액 샘플과 같은 혈액 샘플로부터 분리된다. 일부 실시형태들에서, T 림프구들은 고형 종양 샘플, 예를 들어, 세침 흡인물 또는 바이옵시로부터 분리된다. 분리된 T 림프구들의 군집은 원하는 세포 타입들에 대해 인리치되거나 원하지 않는 세포 타입들이 고갈될 수 있다. 인리치먼트 및 고갈은 예를 들어 유세포분석, T 세포 인리치먼트 칼럼들, 항체-컨쥬게이티드 비드들 (예를 들어, 자성 비드들) 등을 사용하여 수행될 수 있고, 각각 군집으로부터 원하는 세포들을 분리시키는 것 또는 군집으로부터 원하지 않는 세포들을 제거하는 것과 같은 적극적이거나 소극적인 선택들을 사용할 수도 있다. 예를 들어, CD45RO 에 대한 항체들에 컨쥬게이트된 자성 비드들은 군집으로부터 CD45RO+ 세포들을 고갈시키기 위해 사용될 수 있다. 다른 예로서, CD45RA 에 대한 항체들에 컨쥬게이트된 자성 비드들은 군집으로부터 CD45RA+ 세포들을 고갈시키기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시형태들에서, T 림프구들은 CD3+ T 림프구들에 대해 인리치된다. 일부 실시형태들에서, 하나 이상의 T 림프구들은 말초 혈액 샘플 또는 고형 종양 샘플로부터 분리된 CD3+ T 림프구들의 군집으로부터이다. 일부 실시형태들에서, T 림프구들은 CD3+CD4+ 세포들 (예를 들어, 헬퍼 T 세포들) 에 대해 인리치된다. 일부 실시형태들에서, T 림프구들은 CD3+CD8+ 세포들 (예를 들어, 세포독성 T 세포들) 에 대해 인리치된다. 일부 실시형태들에서, T 림프구들은 CD3+CD4+ 및 CD3+CD8+ 세포들 양자 모두에 대해 인리치된다. 일부 실시형태들에서, T 림프구들은 CCR7+ 세포들, 예를 들어, CD3+CCR7+, CD3+CD4+CCR7+, 또는 CD3+CD8+CCR7+ 세포들에 대해 인리치된다. 일부 실시형태들에서, T 림프구들은 CD45RA+ 세포들, 예를 들어, CD3+CD45RA+, CD3+CD4+CD45RA+, 또는 CD3+CD8+CD45RA+ 세포들에 대해 인리치된다. 일부 실시형태들에서, T 림프구들은 CD45RO+ 세포들, 예를 들어, CD3+CD45RO+, CD3+CD4+CD45RO+, 또는 CD3+CD8+CD45RO+ 세포들에 대해 인리치된다.
일부 실시형태들에서, T 림프구들은 CD45RO+, CD45RO+CCR7+, CD45RO+CD62L+, 또는 CD45RO+CCR7+CD62L+ 세포들이 고갈된다. 일부 실시형태들에서, T 림프구들은 CD45RA+, CD45RA+CCR7+, CD45RA+CD62L+, 또는 CD45RA+CCR7+CD62L+ 세포들이 고갈된다.
미세유체 디바이스 내의 T 림프구들은 또한 상술된 바와 같은 인리치먼트 또는 고갈에 대안적이거나 또는 그것에 더하여 원하거나 원하지 않는 마커들의 존재 또는 부재에 기초하여 선택될 수 있다. 유전영동이 격리 펜 내로 미세유체 채널에 위치된 T 림프구를 이동시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, T 림프구는 세포 표면이 CD3+, CD4+, CD8+, 또는 이들의 임의의 조합, 예를 들어, CD3+CD4+, 또는 CD3+CD8+ 이기 때문에 미세유체 디바이스의 격리 펜 내의 배치를 위해, 적어도 부분적으로, 선택될 수 있다. 선택은 항체 (예를 들어, 형광성 항체) 로 라벨링하는 것 및 격리 펜으로 그 항체와 연관된 T 림프구를 이동시키는 것을 포함할 수 있다.
일부 실시형태들에서, T 림프구는 세포 표면이 CD45RA+, CCR7+, 및/또는 CD62L+, 또는 양자 모두이기 때문에 미세유체 디바이스의 격리 펜 내의 배치를 위해, 적어도 부분적으로, 선택될 수 있다. CD45RA+ 는 나이브 T 림프구들
Figure pat00002
의 마커로 고려되지만, CCR7+ 및 CD62L+ 은 (CD45RA+ 이 또한 존재하는지 여부에 따라)
Figure pat00003
상태와 일관된 마커들로 고려된다. 일부 실시형태들에서, T 림프구는 세포 표면이
Figure pat00004
상태와 일관되지 않는 적어도 하나의 마커가 결핍되기 때문에 미세유체 디바이스의 격리 펜 내의 배치를 위해, 적어도 부분적으로, 선택된다. 예를 들어, T 림프구는 CD45RO+, PD-1+, PD-L1+, CD137+, 또는 CD69+ 세포 표면, 또는 이들의 임의의 조합이 결핍되기 때문에 선택될 수 있다. 일부 실시형태들에서, T 림프구는 또한 CD4+ 세포 표면을 갖기 때문에 선택된다. 일부 실시형태들에서, T 림프구는 또한 CD8+ 세포 표면을 갖기 때문에 선택된다.
일부 실시형태들에서, T 림프구는 세포 표면이 CD45RO+, CCR7+, 및/또는 CD62L+, 또는 양자 모두이기 때문에 미세유체 디바이스의 격리 펜 내의 배치를 위해, 적어도 부분적으로, 선택될 수 있다. CCR7+ 및/또는 CD62L+ 마커들과의 CD45RO+ 의 결합은 기억 T 림프구들 (예를 들어, TCM 세포들) 과 일관된 것으로 고려된다. 일부 실시형태들에서, T 림프구는 세포 표면이 기억 T 림프구 상태와 일관되지 않는 적어도 하나의 마커를 결핍하고 있기 때문에 미세유체 디바이스의 격리 펜 내의 배치를 위해, 적어도 부분적으로, 선택된다. 예를 들어, T 림프구는 CD45RA+, PD-1+, PD-L1+, CD137+, 또는 CD69+ 세포 표면, 또는 이들의 임의의 조합이 결핍되기 때문에 선택될 수 있다. 일부 실시형태들에서, T 림프구는 또한 CD4+ 세포 표면을 갖기 때문에 선택된다. 일부 실시형태들에서, T 림프구는 또한 CD8+ 세포 표면을 갖기 때문에 선택된다.
일부 실시형태들에서, T 림프구는 세포 표면이 CD45RO+, PD-1+ 및/또는 PD-L1+, CD137+, 또는 이들의 조합이기 때문에 미세유체 디바이스의 격리 펜 내의 배치를 위해, 적어도 부분적으로, 선택될 수 있다. PD-1, PD-L1, 및/또는 CD137 마커들과 결합된 CD45RO 의 존재는 효과기 T 림프구들 (TEFF 세포들) 과 일관된 것으로 고려된다. 일부 실시형태들에서, T 림프구는 세포 표면이 TEFF 상태와 일관되지 않는 적어도 하나의 마커를 결핍하기 때문에 미세유체 디바이스의 격리 펜 내의 배치를 위해, 적어도 부분적으로, 선택된다. 예를 들어, T 림프구들은 CD45RA, CCR7, CD62L, 또는 이들의 임의의 조합에 대한 항체들로 라벨링될 수 있고, CD45RA, CCR7, CD62L, 또는 이들의 조합에 대한 항체와 연관되지 않은 T 림프구는 (예를 들어, 미세유체 채널로부터) 미세유체 디바이스의 격리 펜 내로 (예를 들어, 유전영동을 사용하여) 이동될 수 있다.
일부 실시형태들에서, T 림프구는 세포 표면이
Figure pat00005
와 일관되지 않는 적어도 하나의, 적어도 두개의, 또는 적어도 세개의 마커들을 결핍하기 때문에 미세유체 디바이스의 격리 펜 내의 배치를 위해, 적어도 부분적으로, 선택된다. 일부 실시형태들에서, T 림프구는 세포 표면이 기억 T 림프구 (예를 들어, TCM 또는 TEM) 상태와 일관되지 않는 적어도 하나의, 적어도 두개의, 또는 적어도 세개의 마커들을 결핍하기 때문에 미세유체 디바이스의 격리 펜 내의 배치를 위해, 적어도 부분적으로, 선택된다. 일부 실시형태들에서, T 림프구는 세포 표면이 TEFF 상태와 일관되지 않는 적어도 하나의, 적어도 두개의, 또는 적어도 세개의 마커들을 결핍하기 때문에 미세유체 디바이스의 격리 펜 내의 배치를 위해, 적어도 부분적으로, 선택된다.
이에 따라, 여기에 개시된 방법들은 CD3+ CD45RA+ CCR7+ CD62L+ CD45RO- 중 적어도 하나, 적어도 두 개, 적어도 세 개, 적어도 네 개, 또는 모두, 예를 들어, CD3+ CD45RA+ CCR7+ CD62L+; CD3+ CD45RA+ CCR7+ CD45RO-; CD3+ CD45RA+ CD62L+ CD45RO-; CD45RA+ CCR7+ CD62L+ CD45RO-; CD3+ CCR7+ CD62L+ CD45RO-; CD3+ CD45RA+ CCR7+; CD3+ CD45RA+ CD62L+; CD45RA+ CCR7+ CD62L+; CD3+ CCR7+ CD45RO-; CD3+ CD62L+ CD45RO-; CCR7+ CD62L+ CD45RO-; CD45RA+ CCR7+; CD45RA+ CD62L+; CCR7+ CD45RO-; CD62L+ CD45RO- 인 T 림프구를 격리 펜으로 이동시키는 것을 포함할 수 있다. 상기 타입들의 T 림프구들 중 임의의 것은 추가적으로 CD4+ 또는 CD8+ 및/또는 CD69- PD-1- PD-L1- CD137- 중 적어도 하나, 두 개, 세 개, 또는 모두, 예를 들어, CD69- PD-L1- PD-1-, CD69- PD-1- CD137-, CD69- PD-L1- CD137-, PD-1- PD-L1- CD137-, CD69- PD-1-, CD69- PD-L1-, CD69- CD137-, PD-1- PD-L1-, PD-1- CD137-, PD-L1- CD137-, CD69-, PD-1-, PD-L1-, or CD137- 일 수도 있다.
여기에 개시된 방법들은 CD3+ CD45RA- CCR7+ CD62L+ CD45RO+ 중 적어도 하나, 적어도 두 개, 적어도 세 개, 적어도 네 개, 또는 모두, 예를 들어, CD3+ CD45RA- CCR7+ CD62L+; CD3+ CD45RA- CCR7+ CD45RO+; CD3+ CD45RA- CD62L+ CD45RO+; CD3+ CCR7+ CD62L+ CD45RO+; CD45RA- CCR7+ CD62L+ CD45RO+; CD3+ CD45RA- CCR7+; CD3+ CD45RA- CD62L+; CD45RA- CCR7+ CD62L+; CD3+ CCR7+ CD45RO+, CD3+ CD62L+ CD45RO+, CCR7+ CD62L+ CD45RO+, CD45RA- CCR7+; CD45RA- CD62L+; CCR7+ CD45RO+; CD62L+ CD45RO+ 인 T 림프구를 격리 펜으로 이동시키는 것을 포함할 수 있다. 상기 타입들의 T 림프구들 중 임의의 것은 추가적으로 CD4+ 또는 CD8+ 및/또는 CD69- PD-1- PD-L1- CD137- 중 적어도 하나, 두 개, 세 개, 또는 모두, 예를 들어, CD69- PD-L1- PD-1-, CD69- PD-1- CD137-, CD69- PD-L1- CD137-, PD-1- PD-L1- CD137-, CD69- PD-1-, CD69- PD-L1-, CD69- CD137-, PD-1- PD-L1-, PD-1- CD137- , PD-L1- CD137-, CD69-, PD-1-, PD-L1-, 또는 CD137- 일 수도 있다.
여기에 개시된 방법들은 CD3+ CD45RA- PD-1+ CD137+ CD45RO+ 중 적어도 하나, 적어도 두 개, 적어도 세 개, 적어도 네 개, 또는 모두, 예를 들어, CD3+ CD45RA- PD-1+ CD137+; CD3+ CD45RA- PD-1+ CD45RO+; CD3+ CD45RA- CD137+ CD45RO+; CD3+ PD-1+ CD137+ CD45RO+; CD45RA- PD-1+ CD137+ CD45RO+; CD3+ CD45RA- PD-1+; CD3+ CD45RA- CD137+; CD3+ PD-1+ CD137+; CD45RA- PD-1+ CD137+; CD3+ CD45RA- CD45RO+; CD3+ PD-1+ CD45RO+; CD45RA- PD-1+ CD45RO+; CD3+ CD137+ CD45RO+; CD45RA- CD137+ CD45RO+; PD-1+ CD137+ CD45RO+; CD45RA- PD-1+; CD45RA- CD137+; CD137+ CD45RO+; 또는 PD-1+ CD45RO+ 인 T 림프구를 격리 펜으로 이동시키는 것을 포함할 수 있다. 상기 타입들의 T 림프구들 중 임의의 것은 추가적으로 CD4+ 또는 CD8+ 및/또는 CD69+ PD-L1+ CCR7- CD62L- 중 적어도 하나, 두 개, 세 개, 또는 모두, 예를 들어, CD69+ PD-L1+ CCR7-; CD69+ PD-L1+ CD62L-; CD69+ CCR7- CD62L-; PD-L1+ CCR7- CD62L-; CD69+ PD-L1+; CD69+ CCR7-; PD-L1+ CCR7-; CD69+ CD62L-; PD-L1+ CD62L-; CCR7- CD62L-; CD69+; PD-L1+; CCR7-; 또는 CD62L- 일 수도 있다.
여기에 개시된 방법들은 예를 들어 유전영동에 의해, (중력이 격리 펜 내로 하나 이상의 T 림프구를 끌어당기도록 미세유체 디바이스를 틸팅하는 것과 같은) 중력에 의해, 원심력에 의해, 또는 국소화된 흐름에 의해 미세유체 디바이스의 격리 펜으로 T 림프구를 도입하는 것을 포함할 수 있다.
일부 실시형태들에서, 방법들은 하나 이상의 T 림프구들을 활성화 작용제와 접촉시키는 것을 포함한다. 그러한 접촉시키는 것은, 예를 들어 T 림프구들이 미세유체 디바이스로 도입되기 전에, 예를 들어, 디바이스로의 도입 전에 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 시간 동안, 또는 0.5 내지 2, 2 내지 4, 4 내지 6, 6 내지 8, or 8 내지 10 시간들의 주기 동안 발생할 수 있다. 활성화 작용제는 T 림프구들과 함께 격리 펜으로 도입될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 접촉시키는 것 (예를 들어, 활성화 작용제의 첨가) 은 T 림프구들이 격리 펜 내에 있을 때 발생할 수 있다. 일부 실시형태들에서, 안티-CD3 항체 또는 작용제가 림프구들과 접촉하기 위해 사용된다. 일부 실시형태들에서, 안티-CD28 항체 또는 작용제가, 예를 들어, 안티-CD3 항체 또는 작용제와 결합하여, 림프구들과 접촉하기 위해 사용된다. 활성화 작용제들은 용해가능한 형태로 제공되거나 비드들에 부착될 수 있다. 예를 들어, 부착된 안티-CD3 항체 또는 작용제를 갖는 비드들은 용해가능한 안티-CD28 항체 또는 작용제와 결합하여 사용될 수 있다. 대안적으로, 안티-CD3 항체 또는 작용제 및 안티-CD28 항체 또는 작용제가 사용될 수 있으며, 여기서 양자 모두는 비드들에 부착된다 (예를 들어, 양 항체들이 동일한 비드들에 부착될 수 있거나 일부 비드들은 안티-CD3 항체들에 부착될 수 있고 다른 비드들은 안티-CD28 항체들에 부착될 수 있다). 일부 실시형태들에서, 적어도 하나의 활성화 작용제 (예를 들어, 항체), 예를 들어, 안티-CD3 항체가 T 림프구가 펜 내에 있을 때 자극이 발생하도록 격리 펜의 표면에 부착된다. 일부 실시형태들에서, 안티-CD3 항체 및 안티-CD28 항체 양자 모두가 격리 펜의 표면에 부착된다. 일부 실시형태들에서, 안티-CD3 항체는 격리 펜의 표면에 부착되고 적어도 하나의 T 림프구는 또한 격리 펜에 있는 동안 용해가능한 안티-CD28 항체와 접촉된다. 통상적으로, 활성화 작용제들로서 사용될 때 안티-CD3 및 안티-CD28 항체들은 작용제 항체들일 것이다.
일부 실시형태들에서, 활성화 작용제에 의해 접촉되는 것에 응답하여 증식을 겪는 분리된 T 림프구들은 적어도 100 배, 200 배, 300 배, 400 배, 500 배, 600 배, 700 배, 800 배, 900 배, 1000 배 증식, 또는 그 이상을 나타낸다.
일부 실시형태들에서, T 림프구들은 수지상세포들, 예를 들어, 자가 수지상세포들로 자극된다. 일부 실시형태들에서, 수지상세포들은 T 림프구들과 자가인 (autologous) 암 세포들로부터 분리된 항원들 또는 펩티드들과 같은 하나 이상의 항원들, 예를 들어, 암-도출 (cancer-derived) 펩티드들로 로딩 (예를 들어, 펄싱) 된다. 예를 들어, 아래의 실시예 3 을 참조하라. 수지상세포들은 또한 T 림프구들과 자가일 수 있다. 대안적으로, 수지상세포들은 합성 항원으로 로딩 (예를 들어, 펄싱) 될 수 있다.
일부 실시형태들에서, T 림프구들은 펩티드-MHC 착체를 형성하기 위해 MHC 분자에 결합될 수도 있는 항원으로 자극된다. 펩티드-MHC 착체들은 MHC 테트라머 구조의 방식으로, 함께 결합될 수도 있다. 항원 (또는 항원 착체) 은 하나 이상의 비드들과 같은 고형 서포트에 부착될 수 있다. 대안적으로, 고형 서포트는 격리 펜의 적어도 하나의 표면일 수 있고, 항원은 적어도 하나의 표면에 공유결합되거나 (예를 들어, 비오틴-스트렙타비딘 결합 상호작용을 통해) 비공유결합될 수 있다.
일부 실시형태들에서, 배양 매질은 미세유체 디바이스의 미세유체 채널을 통해 관류된다. 관류는 예를 들어 상이한 관류 속도들에서의 2 또는 3 개의 페이즈들을 포함하는 사이클들로 간헐적일 수 있다. 일부 실시형태들에서, 관류는 약 0.002-0.1 ㎕/sec 의 관류 속도를 갖는 제 1 페이즈 및 약 0.5-10 ㎕/sec 의 관류의 제 2 페이즈의 하나 이상의 사이클들을 포함한다. 사이크들은 예를 들어 관류가 약 0.01 ㎕/sec 보다 작은 속도에 있는, 예를 들어, 실질적으로 정지되는 제 3 페이즈를 더 포함할 수 있다. 높은 관류 속도의 페이즈의 길이는 예를 들어 약 1-10 분, 예를 들어, 1-2 분일 수 있다. 낮은 관류 속도의 페이즈(들) 의 길이는 예를 들어 약 0.5 분 내지 약 3 시간, 예를 들어, 약 1 분 내지 약 2 시간일 수 있다. 존재하는 경우, 관류가 약 0.01 ㎕/sec 보다 작은 속도에 있는 페이즈의 길이는 예를 들어 약 2-30 또는 2-20 분, 또는 약 5-10 분일 수 있다. 배양 매질은 적어도 24, 48, 72, 96, 120, 또는 그 이상의 시간들의 주기 동안, 또는 0.5 내지 10 일, 예를 들어, 0.5 내지 1, 1 내지 2, 2 내지 3, 3 내지 4, 4 내지 5, 5 내지 7, 6 내지 8, 7 내지 9, 또는 8 내지 10 일의 길이 동안 미세유체 디바이스의 흐름 경로를 통해 관류될 수 있다.
일부 실시형태들에서, 배양 매질은 시토킨, 예를 들어, IL7, IL15, IL21, 또는 이들의 조합, 예를 들어, IL15 및 IL21 로 보충된다. 일부 실시형태들에서, 배양 매질은 IL2 를 포함한다. (매질이 격리 펜들로 도입되는 능동 관류에 후속하는 인큐베이션 주기를 포함할 수 있는) 관류는 하나 이상의 T 림프구들이 증식, 예를 들어, 적어도 하나의, 두 개의, 세개의, 또는 그 이상의 라운드들의 유사분열을 겪기에 충분한 시간의 주기 동안일 수 있다. 일부 실시형태들에서, 배양 매질은 선택적으로 FBS 또는 송아지혈청과 결합한 인간 AB 혈청과 같은 혈청을 포함한다.
일부 실시형태들에서, 20 개 이하, 10 개 이하, 6 내지 10 개, 5 개 이하, 약 5 개, 약 4 개, 약 3 개, 약 2 개 또는 1 개의 T 림프구(들) 이 미세유체 디바이스 내의 격리 펜으로 도입된다. 일부 실시형태들에서, 20 개 이하, 10 개 이하, 6 내지 10 개, 5 개 이하, 약 5 개, 약 4 개, 약 3 개, 약 2 개 또는 1 개의 T 림프구(들) 이 미세유체 디바이스 내의 복수의 격리 펜으로 도입된다.
격리 펜은 예를 들어 격리 펜 내의 T 림프구가 단단한 표면과 직접 접촉하지 않도록 코팅을 포함할 수 있다. 일부 실시형태들에서, 펜 표면은 덱스트란 또는 폴리에틸렌 글리콜로 코팅된다. 일부 실시형태들에서, 격리 펜은 약 5x105 내지 약 5x106 세제곱 마이크론의 체적을 갖는다.
일부 실시형태들에서, 하나 이상의 T 림프구들의 증식 속도가 모니터링된다. 예를 들어, 이것은 주어진 격리 펜 내의 세포 분할의 빈도를 관찰함으로써, 예를 들어, 펜 내의 세포들의 수를 주기적으로 관찰함으로써 관류 동안 행해질 수 있다.
일부 실시형태들에서, T 림프구에 의한 하나 이상의 시토킨들 (예를 들어, INFgamma, TNFalpha, IL2, 또는 이들의 조합) 의 발현이 모니터링된다. 일부 실시형태들에서, 하나 이상의 조절 T 세포 마커들, 예를 들어, CTLA4 의 발현이 모니터링된다.
상술된 모니터링은 예를 들어 격리 펜들 내의 T 림프구들의 증식에 후속하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 증식된 T 림프구들의 샘플은 온-칩 발현 분석들을 사용하여 조절 T 세포 마커들 및/또는 시토킨들의 발현에 대해 특징지워 질 수 있으며, 이것은 예를 들어 미국 특허 출원 공개 제 2015/0151298 호 및 제 2015/0165436 호 및 미국 특허 출원 제 15/372,094 호 (2016년 12월 7일자로 출원) 에 기술되어 있으며, 이들 각각의 내용들은 참조로 여기에 포함된다.
일부 실시형태들에서, 증식에 후속하여, T 림프구들은 미세유체 디바이스로부터 익스포트된다. 일부 실시형태들에서, 증식된 T 림프구들의 샘플은 게놈 프로파일링, 예를 들어, 게놈 시퀀스 분석 및/또는 발현 분석 (예를 들어, RNA-Seq) 을 위해 미세유체 디바이스로부터 익스포트된다. 일부 실시형태들에서, T 림프구들은 게놈 프로파일링 결과들, 예를 들어, 기능 소실 돌연변이들의 부재, 시토킨 발현 등에 기초하여 암 치료와 같은 다운스트림 사용을 위해 선택된다. 일부 실시형태들에서, T 림프구들은 예를 들어 약 1 주 이하의 주기에서 적어도 100 배 증식을 격는 것과 같은 적어도 증식의 임계 레벨을 보여준 미리 결정된 임계값 이상의 증속 속도를 갖는 것에 적어도 부분적으로 기초하여 선택적으로 익스포트된다. 선택적 익스포트는 대안적으로 또는 추가로 INFgamma, TNFalpha, IL2, 또는 이들의 조합과 같은 하나 이상의 시토킨들의 발현에 적어도 부분적으로 기초할 수 있다. 선택적 익스포트는 대안적으로 또는 추가로 CTLA4 등과 같은 하나 이상의 조절 T 세포 마커들의 발현에 적어도 부분적으로 기초할 수 있다.
일부 실시형태들에서, 미세유체 디바이스로부터 익스포트된 T 림프구들은 예를 들어 그 T 림프구들이 획득된 환자와 같은 환자 내로 그들을 도입함으로써 암을 치료하기 위해 사용된다. 환자는 포유 동물, 예를 들어, 인간 또는 비인간 포유 동물일 수 있다.
미세유체 디바이스들 및 이러한 디바이스들을 동작 및 관측하기 위한 시스템들.
도 1a 는 T 림프구들을 선택, 활성화, 증식, 및/또는 클로닝하기 위해 사용될 수 있는 미세유체 디바이스 (100) 및 시스템 (150) 의 예를 예시한다. 미세유체 디바이스 (100) 의 사시도는 미세유체 디바이스 (100) 안의 부분 뷰를 제공하도록 그 커버 (110) 의 부분 컷-어웨이를 갖고 도시된다. 미세유체 디바이스 (100) 는 일반적으로, 흐름 경로 (106) 를 포함하는 미세유체 회로 (120) 를 포함하고, 이 흐름 경로를 통해 유체 매질 (180) 이 유동하여 선택적으로, 하나 이상의 마이크로-객체들 (미도시) 을 미세유체 회로 (120) 안으로 운반하고/하거나 통과시킬 수 있다. 단일의 미세유체 회로 (120) 가 도 1a 에 예시되지만, 적합한 미세유체 디바이스들은 복수 (예를 들어, 2 또는 3) 의 이러한 미세유체 회로들을 포함할 수 있다. 관계없이, 미세유체 디바이스 (100) 는 나노유체 디바이스이도록 구성될 수 있다. 도 1a 에 예시된 바와 같이, 미세유체 회로 (120) 는 복수의 미세유체 격리 펜들 (124, 126, 128, 및 130) 을 포함할 수도 있고, 여기서 각각의 격리 펜들은 흐름 경로 (106) 와 유체 연통하는 하나 이상의 개구들을 가질 수도 있다. 도 1a 의 디바이스의 일부 실시형태들에서, 격리 펜들은 흐름 경로 (106) 와 유체 연통하는 단지 단일의 개구만을 가질 수도 있다. 이하에서 추가로 논의되는 바와 같이, 미세유체 격리 펜들은, 매질 (180) 이 흐름 경로 (106) 를 통해 유동하고 있을 때에도, 미세유체 디바이스 (100) 와 같은 미세유체 디바이스 내에 마이크로-객체들을 보유하기 위해 최적화되어 있는 다양한 피처들 및 구조들을 포함한다. 그러나, 전술한 것을 시작하기 전에, 미세유체 디바이스 (100) 및 시스템 (150) 의 간단한 설명이 제공된다.
일반적으로 도 1a 에 예시된 바와 같이, 미세유체 회로 (120) 는 인클로저 (102) 에 의해 정의된다. 인클로저 (102) 는 상이한 구성들로 물리적으로 구조화될 수 있지만, 도 1a 에 도시된 예에서 인클로저 (102) 는 지지 구조 (104)(예를 들어, 베이스), 미세유체 회로 구조 (108), 및 커버 (110) 를 포함하는 것으로 도시된다. 지지 구조 (104), 미세유체 회로 구조 (108), 및 커버 (110) 는 서로 부착될 수 있다. 예를 들어, 미세유체 회로 구조 (108) 는 지지 구조 (104) 의 내측 면 (109) 상에 배치될 수 있고, 커버 (110) 는 미세유체 회로 구조 (108) 위에 배치될 수 있다. 지지 구조 (104) 및 커버 (110) 와 함께, 미세유체 회로 구조 (108) 는 미세유체 회로 (120) 의 엘리먼트들을 정의할 수 있다.
지지 구조 (104) 는 도 1a 에 예시된 바와 같이 미세유체 회로 (120) 의 하단에 있고 커버 (110) 는 상단에 있을 수 있다. 대안으로, 지지 구조 (104) 및 커버 (110) 는 다른 배향들에서 구성될 수 있다. 예를 들어, 지지 구조 (104) 는 미세유체 회로 (120) 의 상단에 있을 수 있고 커버 (110) 는 하단에 있을 수 있다. 관계없이, 인클로저 (102) 안 또는 밖으로의 통로를 각각 포함하는 하나 이상의 포트들 (107) 이 존재할 수 있다. 통로의 예들은 밸브, 게이트, 관통 홀 (pass-through hole) 등을 포함한다. 예시된 바와 같이, 포트 (107) 는 미세유체 회로 구조 (108) 에서 갭에 의해 생성된 관통 홀이다. 그러나, 포트 (107) 는 커버 (110) 와 같은, 인클로저 (102) 의 다른 컴포넌트들에 놓일 수 있다. 단지 하나의 포트 (107) 가 도 1a 에 예시되지만, 미세유체 회로 (120) 는 2 이상의 포트들 (107) 을 가질 수 있다. 예를 들어, 미세유체 회로 (120) 로 진입하는 유체에 대한 인렛로서 기능하는 제 1 포트 (107) 가 존재할 수 있고, 미세유체 회로 (120) 를 나가는 유체에 대한 아웃렛으로서 기능하는 제 2 포트 (107) 가 존재할 수 있다. 포트 (107) 가 인렛 또는 아웃렛으로서 기능하는지 여부는 유체가 흐름 경로 (106) 를 통해 유동하는 방향에 의존할 수 있다.
지지 구조 (104) 는 하나 이상의 전극들 (미도시) 및 기판 또는 복수의 상호접속된 기판들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 지지 구조 (104) 는 하나 이상의 반도체 기판들을 포함할 수 있고, 이 기판들 각각은 전극에 전기적으로 접속된다 (예를 들어, 반도체 기판들의 전부 또는 서브세트는 단일 전극에 전기적으로 접속될 수 있다). 지지 구조 (104) 는 인쇄 회로 기판 어셈블리 ("PCBA") 를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 반도체 기판(들) 은 PCBA 상에 장착될 수 있다.
미세유체 회로 구조 (108) 는 미세유체 회로 (120) 의 회로 엘리먼트들을 정의할 수 있다. 이러한 회로 엘리먼트들은, 미세유체 회로 (120) 가 유체로 채워질 때 유동적으로 상호접속될 수 있는 공간들 또는 영역들을, 예컨대 (하나 이상의 흐름 채널들을 포함하거나 하나 이상의 흐름 채널들일 수도 있는) 흐름 경로들, 챔버들, 펜들, 트랩들 등을 포함할 수 있다. 도 1a 에 예시된 미세유체 회로 (120) 에서, 미세유체 회로 구조 (108) 는 프레임 (114) 및 미세유체 회로 재료 (116) 를 포함한다. 프레임 (114) 은 미세유체 회로 재료 (116) 를 부분적으로 또는 완전히 인클로징할 수 있다. 프레임 (114) 은, 예를 들어 미세유체 회로 재료 (116) 를 실질적으로 둘러싸는 상대적으로 강성 구조일 수 있다. 예를 들어, 프레임 (114) 은 금속 재료를 포함할 수 있다.
미세유체 회로 재료 (116) 는 미세유체 회로 (120) 의 상호접속들 및 회로 엘리먼트들을 정의하도록 캐비티들 등으로 패터닝될 수 있다. 미세유체 회로 재료 (116) 는, 기체 투과성일 수 있는 유연성 재료, 예컨대 유연성 폴리머 (예를 들어, 고무, 플라스틱, 엘라스토머, 실리콘, 폴리디메틸실록산 ("PDMS"), 등) 을 포함할 수 있다. 미세유체 회로 재료 (116) 를 구성할 수 있는 재료들의 다른 예들은 몰딩된 유리, 실리콘 (예를 들어, 포토-패턴 가능 실리콘 또는 "PPS") 과 같은 식각 가능 재료, 포토-레지스트 (예를 들어, SU8) 등을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 이러한 재료들 - 및 이에 따른 미세유체 회로 재료 (116) - 은 강성 및/또는 실질적으로 기체에 대해 불투과성일 수 있다. 관계없이, 미세유체 회로 재료 (116) 는 지지 구조 (104) 상에 그리고 프레임 (114) 안에 배치될 수 있다.
커버 (110) 는 미세유체 회로 재료 (116) 및/또는 프레임 (114) 의 일체형 부품일 수 있다. 대안으로, 커버 (110) 는 도 1a 에 예시된 바와 같이 구조적으로 별개의 엘리먼트일 수 있다. 커버 (110) 는 미세유체 회로 재료 (116) 및/또는 프레임 (114) 과 동일한 또는 상이한 재료들을 포함할 수 있다. 유사하게, 지지 구조 (104) 는 예시된 바와 같이 프레임 (114) 또는 미세유체 회로 재료 (116) 로부터 별개의 구조이거나, 또는 프레임 (114) 또는 미세유체 회로 재료 (116) 의 일체형 부품일 수 있다. 마찬가지로, 프레임 (114) 및 미세유체 회로 재료 (116) 는 도 1a 에 도시된 바와 같이 별개의 구조들이거나 또는 동일한 구조의 일체형 부분들일 수 있다.
일부 실시형태들에서, 커버 (110) 는 강성 재료를 포함할 수 있다. 강성 재료는 유리 또는 유사한 특성들을 갖는 재료일 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 커버 (110) 는 변형 가능한 재료를 포함할 수 있다. 변형 가능한 재료는 폴리머, 예컨대 PDMS 일 수 있다. 일부 실시형태들에서, 커버 (110) 는 강성 및 변형 가능한 재료들 양자 모두를 포함할 수 있다. 예를 들어, 커버 (110) 의 하나 이상의 부분들 (예를 들어, 격리 펜들 (124, 126, 128, 130) 위에 위치된 하나 이상의 부분들) 은 커버 (110) 의 강성 재료들과 인터페이스하는 변형 가능한 재료를 포함할 수 있다. 일부 실시형태들에서, 커버 (110) 는 하나 이상의 전극들을 더 포함할 수 있다. 하나 이상의 전극들은 유리 또는 유사한 절연 재료 상에 코팅될 수도 있는, 전도성 산화물, 예컨대 인듐-틴-옥사이드 (ITO) 를 포함할 수 있다. 대안으로, 하나 이상의 전극들은, 변형 가능한 재료, 예컨대 폴리머 (예를 들어, PDMS) 에 임베딩된, 유연성 전극들, 예컨대 단일-벽 나노튜브들, 멀티-벽 나노튜브들, 나노와이어들, 전기적으로 전도성 나노입자들의 클러스터들, 또는 이들의 조합들일 수 있다. 미세유체 디바이스들에서 사용될 수 있는 유연성 전극들은, 예를 들어 미국 2012/0325665 (Chiou 등) 에서 설명되어 있고, 이 내용들은 참조로서 본원에 통합된다. 일부 실시형태들에서, 커버 (110) 는 세포 부착, 생존성 및/또는 성장을 지원하도록 (예를 들어, 미세유체 회로 (120) 를 향해 내측으로 대면하는 표면의 전부 또는 부분을 컨디셔닝함으로써) 변경될 수 있다. 이 변경은 합성 또는 천연 폴리머의 코팅을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 커버 (110) 및/또는 지지 구조 (104) 는 광에 투명할 수 있다. 커버 (110) 는 기체 투과성인 적어도 하나의 재료 (예를 들어, PDMS 또는 PPS) 를 포함할 수도 있다.
도 1a 은 또한, 미세유체 디바이스들, 예컨대 미세유체 디바이스 (100) 를 동작 및 제어하는 시스템 (150) 을 나타낸다. 시스템 (150) 은 전기 전원 (192), 이미징 디바이스 (194) (이미징 모듈 (164) 내에 통합된, 여기서 디바이스 (194) 는 도 1a 자체에는 도시되지 않음), 및 틸팅 디바이스 (190) (틸팅 모듈 (166) 의 부분, 여기서 디바이스 (190) 는 도 1a 에 도시되지 않음) 를 포함한다.
전기 전원 (192) 은, 필요에 따라 바이어싱 전압들 또는 전류들을 제공하는, 미세유체 디바이스 (100) 및/또는 틸팅 디바이스 (190) 에 전기 전력을 제공할 수 있다. 전기 전원 (192) 은, 예를 들어 하나 이상의 교류 (AC) 및/또는 직류 (DC) 전압 또는 전류 소스들을 포함할 수 있다. 이미징 디바이스 (194) (이하에 논의되는 이미징 모듈 (164) 의 부분) 는 미세유체 회로 (120) 내의 이미지들을 캡처하기 위한 디바이스, 예컨대 디지털 카메라를 포함할 수 있다. 일부 경우들에서, 이미징 디바이스 (194) 는 (예를 들어, 낮은 광 애플리케이션들에 대해) 빠른 프레임 속도 및/또는 고 감도를 갖는 검출기를 더 포함한다. 이미징 디바이스 (194) 는 또한, 시뮬레이팅 방사 및/또는 광 빔들을 미세유체 회로 (120) 로 지향시키고 미세유체 회로 (120) (또는 그 안에 포함된 마이크로-객체들) 로부터 반사 또는 방출된 방사 및/또는 광 빔들을 수집하기 위한 메커니즘을 포함할 수 있다. 방출된 광 빔들은 가시적 스펙트럼에 있을 수도 있고, 예를 들어 형광 방출들을 포함할 수도 있다. 반사된 광 빔들은 LED 또는 넓은 스펙트럼 램프, 예컨대 수은등 (예를 들어, 고 압력 수은등) 또는 크세논 아크 등에서 비롯되는 반사된 방출들을 포함할 수도 있다. 도 3b 에 대하여 논의된 바와 같이, 이미징 디바이스 (194) 는 아이피스를 포함하거나 포함하지 않을 수도 있는 현미경 (또는 광학 트레인) 을 더 포함할 수도 있다.
시스템 (150) 은 하나 이상의 회전 축들을 중심으로 미세유체 디바이스 (100) 를 회전시키도록 구성된 틸팅 디바이스 (190) (이하에 논의되는 틸팅 모듈 (166) 의 부분) 를 더 포함한다. 일부 실시형태들에서, 틸팅 디바이스 (190) 는, 미세유체 디바이스 (100)(및 이에 따른 미세유체 회로 (120)) 가 레벨 배향 (즉, x 및 y 축에 대해 0°), 수직 배향 (즉, x 축 및/또는 y 축에 대해 90°), 또는 그 사이의 임의의 배향에서 홀딩될 수 있도록 적어도 하나의 축을 중심으로 미세유체 회로 (120) 를 포함하는 인클로저 (102) 를 지지 및/또는 홀딩하도록 구성된다. 축에 대한 미세유체 디바이스 (100)(및 미세유체 회로 (120)) 의 배향은 미세유체 디바이스 (100)(및 미세유체 회로 (120)) 의 "틸트" 로서 본원에서 지칭된다. 예를 들어, 틸팅 디바이스 (190) 는 미세유체 디바이스 (100) 를 x-축에 대하여 0.1°, 0.2°, 0.3°, 0.4°, 0.5°, 0.6°, 0.7°, 0.8°, 0.9°, 1°, 2°, 3°, 4°, 5°, 10°, 15°, 20°, 25°, 30°, 35°, 40°, 45°, 50°, 55°, 60°, 65°, 70°, 75°, 80°, 90°에서 또는 그 사이의 임의의 각도에서 틸팅할 수 있다. 레벨 배향 (및 이에 따른, x- 및 y-축) 은 중력에 의해 정의된 수직 축에 대해 법선으로서 정의된다. 틸팅 디바이스는 또한, x-축 및/또는 y-축에 대해 90°보다 큰 임의의 각도까지 미세유체 디바이스 (100)(및 미세유체 회로 (120)) 를 틸팅하거나, 또는 x-축 또는 y-축에 대해 180°로 미세유체 디바이스 (및 미세유체 회로 (120)) 를 틸팅하여 미세유체 디바이스 (100)(및 미세유체 회로 (120)) 를 완전히 인버팅할 수 있다. 유사하게, 일부 실시형태들에서, 틸팅 디바이스 (190) 는 미세유체 회로 (120) 의 일부 다른 부분 또는 흐름 경로 (106) 에 의해 정의된 회전 축을 중심으로 미세유체 디바이스 (100)(및 미세유체 회로 (120)) 를 틸팅한다.
일부 경우들에서, 미세유체 디바이스 (100) 는, 흐름 경로 (106) 가 하나 이상의 격리 펜들 위 또는 아래에 위치되도록 수직 배향으로 틸팅된다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "~위" 는, 흐름 경로 (106) 가 중력에 의해 정의된 수직 축 상에서 하나 이상의 격리 펜들보다 더 높이 위치된다 (즉, 흐름 경로 (106) 위의 격리 펜에서의 객체는 흐름 영역/채널에서의 객체보다 더 높은 중력 포텐셜 에너지를 가질 것이다) 는 것을 나타낸다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "~아래" 는, 흐름 경로 (106) 가 중력에 의해 정의된 수직 축 상에서 하나 이상의 격리 펜들보다 더 낮게 위치된다 (즉, 흐름 경로 (106) 아래의 격리 펜에서의 객체는 흐름 경로에서의 객체보다 더 낮은 중력 포텐셜 에너지를 가질 것이다) 는 것을 나타낸다.
일부 경우들에서, 틸팅 디바이스 (190) 는 흐름 경로 (106) 에 평행한 축을 중심으로 미세유체 디바이스 (100) 를 틸팅한다. 또한, 미세유체 디바이스 (100) 는, 흐름 경로 (106) 가 격리 펜들 바로 위 또는 아래에 위치되지 않고 하나 이상의 격리 펜들 위 또는 아래에 위치되도록 90°미만의 각도로 틸팅될 수 있다. 다른 경우들에서, 틸팅 디바이스 (190) 는 흐름 경로 (106) 에 수직한 축을 중심으로 미세유체 디바이스 (100) 를 틸팅한다. 또 다른 경우들에서, 틸팅 디바이스 (190) 는 흐름 경로 (106) 에 평행하지도 또는 수직하지도 않은 축을 중심으로 미세유체 디바이스 (100) 를 틸팅한다.
시스템 (150) 은 매질 소스 (178) 를 더 포함할 수 있다. 매질 소스 (178)(예를 들어, 콘테이너, 저장고 등) 는 상이한 유체 매질 (180) 을 각각 홀딩하기 위해 다수의 섹션들 또는 콘테이너들을 포함할 수 있다. 따라서, 매질 소스 (178) 는 도 1a 에 예시된 바와 같이, 미세유체 디바이스 (100) 밖에 있는 그리고 이로부터 별개인 디바이스일 수 있다. 대안으로, 매질 소스 (178) 는 미세유체 디바이스 (100) 의 인클로저 (102) 내에 전체적으로 또는 부분적으로 위치될 수 있다. 예를 들어, 매질 소스 (178) 는 미세유체 디바이스 (100) 의 부분인 저장고들을 포함할 수 있다.
도 1a 은 또한, 시스템 (150) 의 부분을 구성하고 미세유체 디바이스 (100) 와 함께 이용될 수 있는 제어 및 모니터링 장비 (152) 의 예들의 단순화된 블록도 도시들을 예시한다. 도시된 바와 같이, 이러한 제어 및 모니터링 장비 (152) 의 예들은 매질 소스 (178) 를 제어하기 위한 매질 모듈 (160), 미세유체 회로 (120) 내의 마이크로-객체들 (미도시) 및/또는 매질 (예를 들어, 매질의 액적들) 의 이동 및/또는 선택을 제어하기 위한 동기 모듈 (162), 이미지들 (예를 들어, 디지털 이미지들) 을 캡처하는 이미징 디바이스 (194)(예를 들어, 카메라, 현미경, 광원 또는 이들의 임의의 조합) 를 제어하기 위한 이미징 모듈 (164), 및 틸팅 디바이스 (190) 를 제어하기 위한 틸팅 모듈 (166) 을 포함하는 마스터 제어기 (154)를 포함한다. 제어 장비 (152) 는 또한, 미세유체 디바이스 (100) 에 대하여 제어, 모니터링, 또는 다른 기능들을 수행하기 위한 다른 모듈들 (168) 을 포함할 수 있다. 도시된 바와 같이, 장비 (152) 는 디스플레이 디바이스 (170) 및 입/출력 디바이스 (172) 를 더 포함할수 있다.
마스터 제어기 (154) 는 제어 모듈 (156) 및 디지털 메모리 (158) 를 포함할 수 있다. 제어 모듈 (156) 은, 예를 들어 메모리 (158) 내에 비-일시적 데이터 또는 신호들로서 저장된 머신 실행가능 명령들 (예를 들어, 소프트웨어, 펌웨어, 소스 코드, 등) 에 따라 동작하도록 구성된 디지털 프로세서를 포함할 수 있다. 대안으로, 또는 추가적으로, 제어 모듈 (156) 은 하드웨어 디지털 회로부 및/또는 아날로그 회로부를 포함할 수 있다. 매질 모듈 (160), 동기 모듈 (162), 이미징 모듈 (164), 틸팅 모듈 (166), 및/또는 다른 모듈들 (168) 은 유사하게 구성될 수 있다. 따라서, 미세유체 디바이스 (100) 또는 임의의 다른 미세유체 장치에 대하여 수행되는 것으로서 본원에 설명된 기능들, 프로세스들, 액트들, 액션들, 또는 프로세스의 단계들은 위에서 논의된 바와 같이 구성된 마스터 제어기 (154), 매질 모듈 (160), 동기 모듈 (162), 이미징 모듈 (164), 틸팅 모듈 (166), 및/또는 다른 모듈들 (168) 중 임의의 하나 이상에 의해 수행될 수 있다. 유사하게, 마스터 제어기 (154), 매질 모듈 (160), 동기 모듈 (162), 이미징 모듈 (164), 틸팅 모듈 (166), 및/또는 다른 모듈들 (168) 은 본원에 논의된 임의의 기능, 프로세스, 액트, 액션 또는 단계에서 사용된 데이터를 송신 및 수신하도록 통신 가능하게 커플링될 수도 있다.
매질 모듈 (160) 은 매질 소스 (178) 를 제어한다. 예를 들어, 매질 모듈 (160) 은 선택된 유체 매질 (180) 을 (예를 들어, 인렛 포트 (107) 를 통해) 인클로저 (102) 안으로 입력하도록 매질 소스 (178) 를 제어할 수 있다. 매질 모듈 (160) 은 또한, (예를 들어, 아웃렛 포트 (미도시) 를 통해) 인클로저 (102) 로부터 매질의 제거를 제어할 수 있다. 하나 이상의 매질은 따라서, 선택적으로 미세유체 회로 (120) 안으로 입력되고 이로부터 제거될 수 있다. 매질 모듈 (160) 은 또한, 미세유체 회로 (120) 내의 흐름 경로 (106) 에서의 유체 매질 (180) 의 흐름을 제어할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태들에서 매질 모듈 (160) 은 틸팅 모듈 (166) 이 틸팅 디바이스 (190) 로 하여금 원하는 각도의 기울기로 미세유체 디바이스 (100) 를 틸팅하게 하기 전에 인클로저 (120) 를 통해 그리고 흐름 경로 (106) 에서의 매질 (180) 의 흐름을 정지시킨다.
동기 모듈 (162) 은 미세유체 회로 (120) 에서 마이크로-객체들 (미도시) 의 선택, 트랩핑, 및 이동을 제어하도록 구성될 수 있다. 도 1b 및 도 1c 를 참조하여 이하에 논의된 바와 같이, 인클로저 (102) 는 유전영동 (DEP), 광전 트위저들 (optoelectronic tweezers; OET) 및/또는 광-전기습윤 (OEW) 구성 (도 1a 에 미도시) 을 포함할 수 있고, 동기 모듈 (162) 은 흐름 경로 (106) 및/또는 격리 펜들 (124, 126, 128, 130) 에서 매질 (미도시)의 액적 (droplet) 들 및/또는 마이크로-객체들 (미도시) 을 선택 및 이동시키도록 전극들 및/또는 트랜지스터들 (예를 들어, 포토트랜지스터들) 의 활성화를 제어할 수 있다.
이미징 모듈 (164) 은 이미징 디바이스 (194) 를 제어할 수 있다. 예를 들어, 이미징 모듈 (164) 은 이미징 디바이스 (194) 로부터 이미지 데이터를 수신 및 프로세싱할 수 있다. 이미징 디바이스 (194) 로부터의 이미지 데이터는 이미징 디바이스 (194) 에 의해 캡처된 정보의 임의의 유형 (예를 들어, 마이크로-객체들의 존재 또는 부재, 매질의 액적들, 형광 라벨과 같은 라벨의 축적 등) 을 포함할 수 있다. 이미징 디바이스 (194) 에 의해 캡처된 정보를 사용하여, 이미징 모듈 (164) 은 또한, 객체들 (예를 들어, 마이크로-객체들, 매질의 액적들) 의 포지션 및/또는 미세유체 디바이스 (100) 내에서의 이러한 객체들의 모션 속도를 계산할 수 있다.
틸팅 모듈 (166) 은 틸팅 디바이스 (190) 의 틸팅 모션들을 제어할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 틸팅 모듈 (166) 은 틸팅 속도 및 타이밍을 제어하여, 중력들을 통해 하나 이상의 격리 펜들로의 마이크로-객체들의 트랜스퍼를 최적화할 수 있다. 틸팅 모듈 (166) 은 미세유체 회로 (120) 에서 매질의 액적들 및/또는 마이크로-객체들의 모션을 설명하는 데이터를 수신하도록 이미징 모듈 (164) 과 통신 가능하게 커플링된다. 이 데이터를 사용하여, 틸팅 모듈 (166) 은, 마이크로-객체들 및/또는 매질의 액적들이 미세유체 회로 (120) 에서 이동하는 속도를 조정하기 위해 미세유체 회로 (120) 의 틸트를 조정할 수도 있다. 틸팅 모듈 (166) 은 또한, 이 데이터를 사용하여 미세유체 회로 (120) 에서 마이크로-객체 및/또는 매질의 액적의 포지션을 반복적으로 조정할 수도 있다.
도 1a 에 도시된 예들에서, 미세유체 회로 (120) 는 미세유체 채널 (122) 및 격리 펜들 (124, 126, 128, 130) 을 포함하는 것으로서 예시된다. 각각의 펜은 채널 (122) 에 대한 개구를 포함하지만, 다르게는 펜들이 펜 내부의 마이크로-객체들을 채널 (122) 의 흐름 경로 (106) 내 또는 다른 펜들 내의 마이크로-객체들 및/또는 유체 매질 (180) 로부터 실질적으로 격리할 수 있도록 인클로징된다. 격리 펜의 벽들은 베이스의 내부 표면 (109) 로부터 커버 (110) 의 내측 표면까지 연장되어 인클로저를 제공한다. 미세유체 채널 (122) 에 대한 펜의 개구는 흐름 (106) 이 펜들로 지향되지 않도록 유체 매질 (180) 의 흐름 (106) 에 대해 소정 각도로 배향된다. 그 흐름은 펜의 개구의 평면에 접하거나 직교할 수도 있다. 일부 경우들에서, 펜들 (124, 126, 128, 130) 은 미세유체 회로 (120) 내에 하나 이상의 마이크로-객체들을 물리적으로 몰아넣도록 구성된다. 본 개시에 따른 격리 펜들은, 이하에서 상세히 논의 및 도시되는 바와 같이, DEP, OET, OEW, 유체 흐름, 중력들 및/또는 원심력들과 함께 사용을 위해 최적화되는 다양한 형상들, 표면들 및 피처들을 포함할 수 있다.
미세유체 회로 (120) 는 임의의 수의 미세유체 격리 펜들을 포함할 수도 있다. 5 개의 격리 펜들이 도시되지만, 미세유체 회로 (120) 는 더 적은 또는 더 많은 격리 펜들을 가질 수도 있다. 도시된 바와 같이, 미세유체 회로 (120) 의 미세유체 격리 펜들 (124, 126, 128, 및 130) 은 각각 생물학적 마이크로-객체들을 유지, 분리, 분석, 자극 (예를 들어, 활성화), 또는 배양하기 위해 유용한 하나 이상의 이익들을 제공할 수도 있는 상이한 특징들 및 형상들을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 미세유체 회로 (120) 는 복수의 동일한 미세유체 격리 펜들을 포함한다.
도 1a 에 예시된 실시형태에서, 단일의 채널 (122) 및 흐름 경로 (106) 가 도시된다. 그러나, 다른 실시형태들은 다수의 채널들 (122) 을 포함할 수도 있고, 채널들 각각은 흐름 경로 (106) 를 포함하도록 구성된다. 미세유체 회로 (120) 는 흐름 경로 (106) 및 유체 매질 (180) 과 유체 연통하는 인렛 밸브 또는 포트 (107) 를 더 포함하고, 이로써 유체 매질 (180) 은 인렛 포트 (107) 를 통해 채널 (122) 에 접근할 수 있다. 일부 경우들에서, 흐름 경로 (106) 는 단일의 경로를 포함한다. 일부 경우들에서, 그 단일의 경로는 지그재그 패턴으로 배열되고, 이에 의해 흐름 경로 (106) 는 교번하는 방향들에서 2 회 이상 미세유체 디바이스 (100) 를 가로질러 이동한다.
일부 경우들에서, 미세유체 회로 (120) 는 복수의 병렬 채널들 (122) 및 흐름 경로들 (106) 을 포함하며, 여기서 각각의 흐름 경로 (106) 내의 유체 매질 (180) 은 동일한 방향으로 흐른다. 일부 경우들에서, 각각의 흐름 경로 (106) 내의 유체 매질은 순방향 또는 역방향 중 적어도 하나로 유동한다. 일부 경우들에서, 복수의 격리 펜들은, 격리 펜들이 타겟 마이크로-객체들과 병렬로 로딩될 수 있도록 (예를 들어, 채널 (122) 에 대해) 구성된다.
일부 실시형태들에서, 미세유체 회로 (120) 는 하나 이상의 마이크로-객체 트랩들 (132) 을 더 포함한다. 트랩들 (132) 은 일반적으로, 채널 (122) 의 경계를 형성하는 벽에 형성되고, 미세유체 격리 펜들 (124, 126, 128, 130) 중 하나 이상의 개구 반대편에 위치될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 트랩들 (132) 은 흐름 경로 (106) 로부터 단일의 마이크로-객체를 수신 또는 캡처하도록 구성된다. 일부 실시형태들에서, 트랩들 (132) 은 흐름 경로 (106) 로부터 복수의 마이크로-객체들을 수신 또는 캡처하도록 구성된다. 일부 경우들에서, 트랩들 (132) 은 단일의 타겟 마이크로-객체의 체적과 거의 동일한 체적을 포함한다.
트랩들 (132) 은 타겟이되는 마이크로-객체들의 트랩들 (132) 안으로의 흐름을 돕도록 구성되는 개구를 더 포함할 수도 있다. 일부 경우들에서, 트랩들 (132) 은 단일의 타겟 마이크로-객체의 치수들과 대략 동일한 높이 및 폭을 갖는 개구를 포함하고, 이에 의해 더 큰 마이크로-객체들이 마이크로-객체 트랩 안으로 진입하는 것이 방지된다. 트랩들 (132) 은 트랩 (132) 내에 타겟이되는 마이크로-객체들의 보유를 돕도록 구성된 다른 피처들을 더 포함할 수도 있다. 일부 경우들에서, 트랩 (132) 은, 미세유체 채널 (122) 에 평행한 축을 중심으로 미세유체 디바이스 (100) 를 틸팅할 때, 트랩된 마이크로-객체가, 마이크로-객체로 하여금 격리 펜의 개구 안으로 들어가게 하는 궤적에서 트랩 (132) 을 나가도록, 미세유체 격리 펜의 개구에 대해 채널 (122) 의 반대 측에 놓이고 이와 정렬된다. 일부 경우들에서, 트랩 (132) 은, 트랩 (132) 을 통한 흐름을 용이하게 하고 이에 의해 트랩 (132) 에서 마이크로-객체를 캡처하는 가능성을 증가시키기 위해 타겟 마이크로-객체보다 더 작은 사이드 통로 (134) 를 포함한다.
일부 실시형태들에서, 유전영동 (DEP) 힘들이 하나 이상의 전극들 (미도시) 을 통해 (예를 들어, 흐름 경로에서 및/또는 격리 펜들에서) 유체 매질 (180) 을 가로질러 인가되어 그 안에 위치된 마이크로-객체들을 조작, 이송, 분리 및 소팅한다. 예를 들어, 일부 실시형태들에서, 단일의 마이크로-객체를 흐름 경로 (106) 로부터 원하는 미세유체 격리 펜 안으로 트랜스퍼하기 위해 미세유체 회로 (120) 의 하나 이상의 부분들에 DEP 힘들이 인가된다. 일부 실시형태들에서, DEP 힘들은 격리 펜 (예를 들어, 격리 펜 (124, 126, 128, 또는 130)) 내의 마이크로-객체가 챔버로부터 변위되는 것을 방지하는데 사용된다. 또한, 일부 실시형태들에서, DEP 힘들은 본 개시의 실시형태들에 따라 이전에 수집되었던 마이크로-객체를 격리 펜으로부터 선택적으로 제거하는데 사용된다. 일부 실시형태들에서, DEP 힘들은 광전 트위저 (OET) 힘들을 포함한다.
다른 실시형태들에서, 광전기습윤 (OEW) 력들은 미세유체 회로 (120) 내에 위치된 액적들을 조작, 수송, 분리 및 분류하기 위해 하나 이상의 전극들 (도시하지 않음) 을 통해 미세유체 디바이스 (100) 의 지지 구조 (104) (및/또는 커버 (110)) 에서의 하나 이상의 위치들 (예를 들어, 흐름 경로 및/또는 격리 펜들을 정의하는 것을 돕는 위치들) 에 인가된다. 예를 들어, 일부 실시형태들에서, OEW 력들은 흐름 경로 (106) 로부터 원하는 미세유체 격리 펜 내로 단일의 액적을 이송하기 위해 지지 구조 (104) (및/또는 커버 (110)) 에서의 하나 이상의 위치들에 인가된다. 일부 실시형태들에서, OEW 력들은 격리 펜 (예를 들어, 격리 펜 (124, 126, 128, 또는 130)) 내의 액적이 그것으로부터 변위되는 것을 방지하기 위해 사용된다. 또한, 일부 실시형태들에서, OEW 력들은 본 개시의 실시형태들에 따라 이전에 수집되었던 액적을 격리 펜으로부터 선택적으로 제거하기 위해 사용된다.
일부 실시형태들에서, DEP 및/또는 OEW 힘들은 미세유체 회로 (120) 내의 액적들 및/또는 마이크로-객체들을 조작, 이송, 분리 및 소팅하도록, 다른 힘들, 예컨대 흐름 및/또는 중력과 결합된다. 예를 들어, 인클로저 (102) 는 흐름 경로 (106)) 및 그 안에 위치된 마이크로-객체들을 미세유체 격리 펜들 위에 위치시키도록 (예를 들어, 틸팅 디바이스 (190) 에 의해) 틸팅될 수 있고, 중력의 힘은 마이크로-객체들 및/또는 액적들을 펜들 안으로 이송할 수 있다. 일부 실시형태들에서, DEP 및/또는 OEW 힘들은 다른 힘들 전에 인가될 수 있다. 다른 실시형태들에서, DEP 및/또는 OEW 힘들은 다른 힘들 후에 인가될 수 있다. 또 다른 경우들에서, DEP 및/또는 OEW 힘들은 다른 힘들과 동시에 또는 다른 힘들과 교번하는 방식으로 인가될 수 있다.
도 1b, 도 1c, 및 도 2a 내지 도 2h 는 본 개시의 실시형태들의 실시에서 사용될 수 있는 미세유체 디바이스들의 여러 실시형태들을 도시한다. 도 1b 는 미세유체 디바이스 (200) 가 광학적으로 작동되는 동전기적 디바이스로서 구성되는 실시형태를 묘사한다. 광전 트위저 (OET) 구성을 갖는 디바이스들 및 광전기습윤 (OEW) 구성을 갖는 디바이스들을 포함하는 여러 광학적으로 작동되는 동전기적 디바이스들이 본 기술에서 알려져 있다. 적합한 OET 구성들의 예들은 각각 그 전체가 참조에 의해 여기에 포함되는 다음의 미국 특허 문서들에 예시된다: 미국 특허 제 RE 44,711 호 (Wu 등) (US 특허 제 7,612,355 호로서 특허됨); 및 US 특허 제 7,956,339 호 (Ohta 등). OEW 구성들의 예들은 양자 모두가 전체가 참조에 의해 여기에 포함되는 미국 특허 제 6,958,132 (Chiou 등) 및 US 특허 출원 공개 제 2012/0024708 호 (Chiou 등) 에 예시되어 있다. 광학적으로 작동되는 동전기적 디바이스의 또 다른 예는 결합된 OET/OEW 구성을 포함하며, 이것의 예들은 미국 특허 공보들 제 20150306598 호 (Khandros 등) 및 제 20150306599 호 (Khandros 등) 및 그들의 대응하는 PCT 공보들 WO2015/164846 호 및 WO2015/164847 호에 도시되며, 이들 모두는 그 전체가 참조에 의해 여기에 포함된다.
생물학적 마이크로-객체들이 배치, 배양, 및/또는 모니터될 수 있는 펜들을 갖는 미세유체 디바이스들의 예들은 예를 들어 US 2014/0116881 (2013년 10월 22일자로 출원된 출원 번호 제 14/060,117 호), US 2015/0151298 (2014년 10월 22일자로 출원된 출원 번호 제 14/520,568 호), 및 US 2015/0165436 (2014년 10월 22일자로 출원된 출원 번호 제 14/521,447 호) 에 기재되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 참조에 의해 여기에 포함된다. 미국 출원 번호들 제 14/520,568 호 및 제 14/521,447 호는 또한 미세유체 디바이스에서 배양된 세포들의 분비물들을 분석하는 예시적인 방법들을 기술한다. 상기 출원들 각각은 광전 트위저들 (OET) 과 같은 유전영동 (DEP) 힘들을 생성하도록 구성되거나 광-전기습윤 (OEW) 을 제공하도록 구성된 미세유체 디바이스들을 더 기술한다. 예를 들어, US 2014/0116881 의 도 2 에 도시된 광전 트위저 디바이스는 개개의 생물학적 마이크로-객체 또는 생물학적 마이크로-객체들의 그룹을 선택하고 이동시키기 위해 본 개시의 실시형태들에서 이용될 수 있는 디바이스의 예이다.
미소유체 디바이스 동기 (motive) 구성들. 전술된 바와 같이, 시스템의 제어 및 모니터링은 미세유체 디바이스의 미세유체 회로에서, 마이크로-객체들 또는 액적들과 같은 객체들을 선택 및 이동시키기 위한 동기 모듈을 포함할 수 있다. 미세유체 디바이스는, 이동되고 있는 객체의 유형 및 다른 고려사항들에 따라, 다양한 동기 구성들을 가질 수 있다. 예를 들어, 유전영동 (DEP) 구성은 미세유체 회로에서 마이크로-객체들을 선택하고 이동시키기 위해 이용될 수 있다. 따라서, 미세유체 디바이스 (100) 의 지지 구조 (104) 및/또는 커버 (110) 는 미세유체 회로 (120) 내의 유체 매질 (180) 내의 마이크로-객체들상에 DEP 힘들을 선택적으로 유도하기 위한 DEP 구성을 포함할 수 있고, 이것에 의해 개개의 마이크로-객체들 또는 마이크로-객체들의 그룹들을 선택, 캡쳐, 및/또는 이동시킬 수 있다. 대안적으로, 미세유체 디바이스 (100) 의 지지 구조 (104) 및/또는 커버 (110) 는 미세유체 회로 (120) 에서의 유체 매질 (180) 내의 액적들상에 EW 힘들을 선택적으로 유도하기 위한 전기습윤 (EW) 구성을 포함할 수 있고, 이것에 의해 개개의 액적들 또는 액적들의 그룹들을 선택, 캡쳐, 및/또는 이동시킬 수 있다.
DEP 구성을 포함하는 미세유체 디바이스 (200) 의 하나의 예가 도 1b 및 도 1c 에 도시된다. 간단성의 목적으로, 도 1b 및 도 1c 는 영역/챔버 (202) 를 갖는 미세유체 디바이스 (200) 의 인클로저 (102) 의 부분의, 각각, 측단면도 및 평면 단면도를 도시하지만, 그 영역/챔버 (202) 는 성장 챔버, 격리 펜, 흐름 경로, 또는 흐름 채널과 같은 더 상세한 구조를 갖는 유체 회로 엘리먼트의 부분일 수도 있다는 것이 이해되어야 한다. 더욱이, 미세유체 디바이스 (200) 는 다른 유체 회로 엘리먼트들을 포함할 수도 있다. 예를 들어, 미세유체 디바이스 (200) 는, 미세유체 디바이스 (100) 에 대하여 본원에 설명된 바와 같은, 복수의 성장 챔버들 또는 격리 펜들 및/또는 하나 이상의 흐름 영역들 또는 흐름 채널들을 포함할 수 있다. DEP 구성은 미세유체 디바이스 (200) 의 임의의 이러한 유체 회로 엘리먼트들 안에 통합되거나, 또는 그 부분들을 선택할 수도 있다. 위 또는 아래에 설명된 미세유체 디바이스 컴포넌트들 및 시스템 컴포넌트들 중 어느 하나는 미세유체 디바이스 (200) 에 통합되고/되거나 이와 결합되어 사용될 수도 있다는 것이 또한 인식되어야 한다. 예를 들어, 전술된 제어 및 모니터링 장비 (152) 를 포함하는 시스템 (150) 은, 매질 모듈 (160), 동기 모듈 (162), 이미징 모듈 (164), 틸팅 모듈 (166), 및 다른 모듈들 (168) 중 하나 이상을 포함하는 미세유체 디바이스 (200) 와 함께 사용될 수도 있다.
도 1b 에서 알 수 있는 바와 같이, 미세유체 디바이스 (200) 는 하단 전극 (204) 및 하단 전극 (204) 위에 있는 전극 활성화 기판 (206) 을 갖는 지지 구조 (104), 및 하단 전극 (204) 으로부터 떨어져 이격된 상단 전극 (210) 을 갖는 커버 (110) 를 포함한다. 상단 전극 (210) 및 전극 활성화 기판 (206) 은 영역/챔버 (202) 의 반대 표면들을 정의한다. 영역/챔버 (202) 에 포함된 매질 (180) 은 따라서, 상단 전극 (210) 과 전극 활성화 기판 (206) 간의 저항성 접속을 제공한다. 하단 전극 (204) 및 상단 전극 (210) 에 접속되고 영역/챔버 (202) 에서 DEP 힘들의 생성에 필요한 바와 같은 전극들 간의 바이어싱 전압을 생성하도록 구성된 전원 (212) 이 또한 도시된다. 전원 (212) 은, 예를 들어 교류 (AC) 전원일 수 있다.
소정 실시형태들에서, 도 1b 및 도 1c 에 예시된 미세유체 디바이스 (200) 는 광학적으로-작동된 DEP 구성을 가질 수 있다. 따라서, 동기 모듈 (162) 에 의해 제어될 수도 있는 광원 (216) 으로부터의 광 (218) 의 패턴들을 변경하는 것은 전극 활성화 기판 (206) 의 내측 면 (208) 의 영역들 (214) 에서 DEP 전극들의 패턴들을 변경하는 것을 선택적으로 활성화 및 비활성화할 수 있다. (이하에서, DEP 구성을 갖는 미세유체 디바이스의 영역들 (214) 은 "DEP 전극 영역들" 로서 지칭된다). 도 1c 에 예시된 바와 같이, 전극 활성화 기판 (206) 의 내측 면 (208) 위로 지향된 광 패턴 (218) 은 정사각형과 같은 패턴으로 DEP 전극 영역들 (214a)(화이트로 도시됨) 을 선택적으로 조명할 수 있다. 비-조명된 DEP 전극 영역들 (214)(십자-해칭됨) 은 "어두운" DEP 전극 영역들 (214) 로서 이하에서 지칭된다. DEP 전극 활성화 기판 (206) 을 통한 (즉, 하부 전극 (204) 으로부터 흐름 경로 (106) 에서 매질 (180) 과 인터페이스하는 전극 활성화 기판 (206) 의 내측 면 (208) 까지의) 상대적인 전기적 임피던스는 각각의 어두운 DEP 전극 영역 (214) 에서 영역/챔버 (202) 내의 매질 (180) 을 통한 (즉, 전극 활성화 기판 (206) 의 내측 면 (208) 으로부터 커버 (110) 의 상단 전극 (210) 까지의) 상대적 전기적 임피던스보다 더 크다. 그러나, 조명된 DEP 전극 영역 (214a) 은, 각각의 조명된 DEP 전극 영역 (214a) 에서 영역/챔버 (202) 내의 매질 (180) 을 통한 상대적 임피던스보다 작은 전극 활성화 기판 (206) 을 통한 감소된 상대적 임피던스를 보인다.
전원 (212) 이 활성화됨에 따라, 상기 DEP 구성은 조명된 DEP 전극 영역들 (214a) 과 인접한 어두운 DEP 전극 영역들 (214) 사이의 유체 매질 (180) 에서 전계 구배를 생성하고, 이것은 이어서 유체 매질 (180) 에서 부근의 마이크로-객체들 (미도시) 을 끌어당기거나 밀어내는 로컬 DEP 힘들을 생성한다. 유체 매질 (180) 내의 마이크로-객체들을 끌어당기거나 밀어내는 DEP 전극들은 따라서, 광원 (216) 으로부터 미세유체 디바이스 (200) 로 프로젝팅된 광 패턴들 (218) 을 변경함으로써 영역/챔버 (202) 의 내측 면 (208) 에서 많은 상이한 이러한 DEP 전극 영역들 (214) 에서 선택적으로 활성화 및 비활성화될 수 있다. DEP 힘들이 부근의 마이크로-객체들을 끌어당기거나 밀어내는지 여부는, 매질 (180) 및/또는 마이크로-객체들 (미도시) 의 유전 특성들 및 전원 (212) 의 주파수와 같은 이러한 파라미터들에 의존할 수 있다.
도 1c 에 예시된 조명된 DEP 전극 영역들 (214a) 의 정사각형 패턴 (220) 은 단지 일 예이다. DEP 전극 영역들 (214) 의 임의의 패턴이 미세유체 디바이스 (200) 로 프로젝팅된 광의 패턴 (218) 에 의해 조명 (및 이에 의해 활성화) 될 수 있고, 조명된/활성화된 DEP 전극 영역들 (214) 의 패턴은 광 패턴 (218) 을 변경 또는 이동시킴으로써 반복적으로 변경될 수 있다.
일부 실시형태들에서, 전극 활성화 기판 (206) 은 광전도 재료를 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다. 이러한 실시형태들에서, 전극 활성화 기판 (206) 의 내측 면 (208) 은 특색이 없을 수 있다. 예를 들어, 전극 활성화 기판 (206) 은 수소화 비정질 실리콘 (a-Si:H) 을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. a-Si:H 는, 예를 들어 (100 * 수소 원자들의 수/수소 및 규소 원자들의 총 수로서 계산된) 약 8% 내지 40% 수소를 포함할 수 있다. a-Si:H 의 층은 약 500 nm 내지 약 2.0 ㎛의 두께를 가질 수 있다. 이러한 실시형태들에서, DEP 전극 영역들 (214) 은 광 패턴 (218) 에 따라, 전극 활성화 기판 (206) 의 내측 면 (208) 상에 임의의 패턴으로 그리고 어디든 생성될 수 있다. 따라서, DEP 전극 영역들 (214) 의 패턴 및 수는 고정될 필요가 없고, 광 패턴 (218) 에 대응할 수 있다. 위에서 논의된 바와 같은 광전도성 층을 포함하는 DEP 구성을 갖는 미세유체 디바이스들의 예들은, 예를 들어 미국특허 제 RE 44,711 (Wu 등)(미국특허 제 7,612,355 호로서 최초로 발행됨) 에서 설명되어 있고, 이 전체 내용들은 참조로서 본원에 포함된다.
다른 실시형태들에서, 전극 활성화 기판 (206) 은 복수의 도핑된 층들, 전기적으로 절연 층들 (또는 영역들), 및 반도체 분야들에서 알려진 바와 같은 반도체 집적 회로들을 형성하는 전기적으로 전도성 층들을 포함하는 기판을 포함할 수 있다. 예를 들어, 전극 활성화 기판 (206) 은 예를 들어, 측방 바이폴러 포토트랜지스터들을 포함하는 복수의 포토트랜지스터들을 포함할 수 있고, 포토트랜지스터들 각각은 DEP 전극 영역 (214) 에 대응한다. 대안으로, 전극 활성화 기판 (206) 은 포토트랜지스터 스위치들에 의해 제어된 전극들 (예를 들어, 전도성 금속 전극들) 을 포함할 수 있고, 각각의 이러한 전극은 DEP 전극 영역 (214) 에 대응한다. 전극 활성화 기판 (206) 은 이러한 포토트랜지스터들 또는 포토트랜지스터-제어된 전극들의 패턴을 포함할 수 있다. 패턴은, 예를 들어 도 2b 에 도시된 바와 같이 행들 및 열들로 배열된 실질적으로 정사각형의 포토트랜지스터들 또는 포토트랜지스터-제어된 전극들의 어레이일 수 있다. 대안으로, 패턴은 육각형 격자를 형성하는 실질적으로 육각의 포토트랜지스터들 또는 포토트랜지스터-제어된 전극들의 어레이일 수 있다. 패턴에 관계없이, 전기 회로 엘리먼트들은 하단 전극 (210) 과 전극 활성화 기판 (206) 의 내측 면 (208) 에서의 DEP 전극 영역들 (214) 간의 전기적 접속들을 형성할 수 있고, 이들 전기적 접속들 (즉, 포토트랜지스터들 또는 전극들) 은 광 패턴 (218) 에 의해 선택적으로 활성화 및 비활성화될 수 있다. 활성화되지 않은 경우, 각각의 전기적 접속은, 전극 활성화 기판 (206) 을 통한 (즉, 하단 전극 (204) 으로부터 영역/챔버 (202) 에서 매질 (180) 과 인터페이스하는 전극 활성화 기판 (206) 의 내측 면 (208) 까지의) 상대적 임피던스가 대응하는 DEP 전극 영역 (214) 에서 매질 (180) 을 통한 (즉, 전극 활성화 기판 (206) 의 내측 면 (208) 으로부터 커버 (110) 의 상단 전극 (210) 까지의) 상대적 임피던스보다 더 크도록 높은 임피던스를 가질 수 있다. 그러나 광 패턴 (218) 에서 광에 의해 활성화되는 경우, 전극 활성화 기판 (206) 을 통한 상대적 임피던스는 각각의 조명된 DEP 전극 영역 (214) 에서 매질 (180) 을 통한 상대적 임피던스보다 더 작고, 이에 의해 위에서 논의된 바와 같이 대응하는 DEP 전극 영역 (214) 에서 DEP 전극을 활성화시킨다. 매질 (180) 내의 마이크로-객체들 (미도시) 을 끌어당기거나 밀어내는 DEP 전극들은 따라서, 광 패턴 (218) 에 의해 결정된 방식으로 영역/챔버 (202) 의 전극 활성화 기판 (206) 의 내측 면 (208) 에서 많은 상이한 DEP 전극 영역들 (214) 에서 선택적으로 활성화 및 비활성화될 수 있다.
포토트랜지스터들을 포함하는 전극 활성화 기판들을 갖는 미세유체 디바이스들의 예들은, 예를 들어 미국특허 제 7,956,339 (Ohta 등) (예를 들어, 도 21 및 도 22 에 예시된 디바이스 (300), 및 그 설명들을 참조), 및 미국 특허 공개 제 2016/0184821 (Hobbs 등) (예를 들어, 도면들 및 그것의 설명 전체에 걸쳐 예시된 디바이스들 (200, 502, 504, 600, 및 700) 을 참조) 에서 설명되어 있고, 이들의 각각의 전체 내용들은 참조로서 본원에 포함된다. 포토트랜지스터 스위치들에 의해 제어된 전극들을 포함하는 전극 활성화 기판들을 갖는 미세유체 디바이스들의 예들은, 예를 들어 미국 특허공개 제 2014/0124370 (Short 등) (예를 들어, 도면들 전체에 예시된 디바이스들 (200, 400, 500, 600, 및 900) 및 그 설명들을 참조) 에서 설명되어 있고, 그 전체 내용들은 참조로서 본원에 포함된다.
DEP 구성된 미세유체 디바이스의 일부 실시형태들에서, 상단 전극 (210) 은 인클로저 (102) 의 제 1 벽 (또는 커버 (110)) 의 부분이고, 전극 활성화 기판 (206) 및 하단 전극 (204) 은 인클로저 (102) 의 제 2 벽 (또는 지지 구조 (104)) 의 부분이다. 영역/챔버 (202) 는 제 1 벽과 제 2 벽 사이에 있을 수 있다. 다른 실시형태들에서, 전극 (210) 은 제 2 벽 (또는 지지 구조 (104)) 의 부분이고, 하나 또는 양자 모두의 전극 활성화 기판 (206) 및/또는 전극 (210) 은 제 1 벽 (또는 커버 (110)) 의 부분이다. 또한, 광원 (216) 은 대안으로 아래로부터 인클로저 (102) 를 조명하도록 사용될 수 있다.
DEP 구성을 갖는 도 1b 및 도 1c 의 미세유체 디바이스 (200) 로, 동기 모듈 (162) 은, 마이크로-객체를 둘러싸고 캡처하는 패턴 (예를 들어, 정사각형 패턴 (220)) 에서 전극 활성화 기판 (206) 의 내측 면 (208) 의 DEP 전극 영역들 (214a) 에서 하나 이상의 DEP 전극들의 제 1 세트를 활성화시키도록 광 패턴 (218) 을 미세유체 디바이스 (200) 로 프로젝팅함으로써 영역/챔버 (202) 내의 매질 (180) 에서 마이크로-객체 (미도시) 를 선택할 수 있다. 동기 모듈 (162) 은 그 후, DEP 전극 영역들 (214) 에서 하나 이상의 DEP 전극들의 제 2 세트를 활성화시키도록 미세유체 디바이스 (200) 에 대해 광 패턴 (218) 을 이동시킴으로써 인 시츄 생성된 캡처된 마이크로-객체를 이동시킬 수 있다. 대안으로, 미세유체 디바이스 (200) 는 광 패턴 (218) 에 대해 이동될 수 있다.
다른 실시형태들에서, 미세유체 디바이스 (200) 는 전극 활성화 기판 (206) 의 내측 면 (208) 에서 DEP 전극들의 광 활성화에 의존하지 않는 DEP 구성을 가질 수 있다. 예를 들어, 전극 활성화 기판 (206) 은 적어도 하나의 전극을 포함하는 표면 (예를 들어, 커버 (110)) 의 반대편에 위치된 선택적으로 어드레싱 가능 및 에너자이징 가능한 전극들을 포함할 수 있다. 스위치들 (예를 들어, 반도체 기판에서의 트랜지스터 스위치들) 은 DEP 전극 영역들 (214) 에서 DEP 전극들을 활성화 또는 비활성화시키도록 선택적으로 개방 및 폐쇄될 수도 있고, 이에 의해 활성화된 DEP 전극들 근처에서 영역/챔버 (202) 내의 마이크로-객체 (미도시) 상에 순 (net) DEP 힘을 생성한다. 영역/챔버 (202) 에서 마이크로-객체들 및/또는 매질 (미도시) 의 유전 특성들 및 전원 (212) 의 주파수와 같은 이러한 특징들에 따라, DEP 힘은 부근의 마이크로-객체를 끌어당기거나 밀어낼 수 있다. (예를 들어, 정사각형 패턴 (220) 을 형성하는 DEP 전극 영역들 (214) 의 세트에서) DEP 전극들의 세트를 선택적으로 활성화 및 비활성화시킴으로써, 영역/챔버 (202) 내의 하나 이상의 마이크로-객체들은 영역/챔버 (202) 내에서 트랩 및 이동될 수 있다. 도 1a 에서의 동기 모듈 (162) 은 이러한 스위치들을 제어하고, 따라서 영역/챔버 (202) 주변의 특정한 마이크로-객체들 (미도시) 을 선택, 트랩, 및 이동시키도록 DEP 전극들 중 개별의 전극들을 활성화 및 비활성화시킬 수 있다. 선택적으로 어드레싱 가능 및 에너자이징 가능한 전극들을 포함하는 DEP 구성을 갖는 미세유체 디바이스들은 당해 분야에 알려져 있고, 예를 들어 미국특허 제 6,294,063 (Becker 등) 및 6,942,776 (Medoro) 에서 설명되어 있고, 그 전체 내용들은 참조로서 본원에 포함된다.
또 다른 예로서, 미세유체 디바이스 (200) 는 전기습윤 (EW) 구성을 가질 수 있으며, 이것은 DEP 구성 대신일 수 있거나 DEP 구성을 갖는 부분으로부터 분리된 미세유체 디바이스 (200) 의 부분에 위치될 수 있다. EW 구성은 광-전기습윤 구성 또는 유전체상의 전기습윤 (EWOD) 구성일 수도 있으며, 이들 양자는 본 기술에서 알려져 있다. 일부 EW 구성들에서, 지지 구조 (104) 는 유전체층 (미도시) 과 하부 전극 (204) 사이에 샌드위치된 전극 활성화 기판 (206) 을 갖는다. 유전체층은 이하에 기술되는 바와 같이 소수성 재료를 포함할 수 있고 및/또는 소수성 재료로 코팅될 수 있다. EW 구성을 갖는 미세유체 디바이스들 (200) 의 경우, 지지 구조 (104) 의 내부 표면 (208) 은 유전체층의 내부 표면 또는 그것의 소수성 코팅이다.
유전체층 (미도시) 은 하나 이상의 산화물 층들을 포함할 수 있고, 약 50 nm 내지 약 250 nm (예를 들어, 약 125 nm 내지 약 175 nm) 의 두께를 가질 수 있다. 소정의 실시형태들에서, 유전체층은 금속 산화물 (예를 들어, 알루미늄 산화물 또는 하프늄 산화물) 과 같은 산화물의 층을 포함할 수도 있다. 소정의 실시형태들에서, 유전체층은 실리콘 산화물 또는 질화물과 같은, 금속 산화물 이외의 유전체 재료를 포함할 수 있다. 정확한 조성 및 두께에 관계 없이, 유전체층은 약 10 kOhms 내지 약 50 kOhms 의 임피던스를 가질 수 있다.
일부 실시형태들에서, 영역/채널 (202) 를 향해 내부로 마주하는 유전체층의 표면은 소수성 재료로 코팅된다. 소수성 재료는 예를 들어 플루오리네이티드 카본 분자들을 포함할 수 있다. 플루오리네이티드 카본 분자들의 예들은 폴리테트라플루오로에틸렌 (예를 들어, TEFLON®) 또는 폴리(2,3-디플루오로메틸렌일-퍼플루오로테트라하이드로퓨란) (예를 들어, CYTOPTM) 과 같은 퍼플루오로-폴리머들을 포함한다. 소수서 재료를 구성하는 분자들은 유전체층의 표면에 공유결합될 수 있다. 예를 들어, 소수성 재료의 분자들은 실록산 기, 포스포닉 애시드 기, 또는 티올 기와 같은 연결자에 의해 유전체층의 표면에 공유결합될 수 있다. 따라서, 일부 실시형태들에서, 소수성 재료는 알킬-말단 실록산, 알킬-말단 포스포닉 애시드, 또는 알킬-말단 티올을 포함할 수 있다. 일킬 기는 (예를 들어, 적어도 10 개의 탄소들, 또는 적어도 16, 18, 20, 22 개 또는 그 이상의 탄소들의 사슬을 갖는) 긴-사슬 탄화수소들일 수 있다. 대안적으로, 플루오리네이티드 (또는, 퍼플루오리네이티드) 카본 사슬들이 알킬 기들을 대신하여 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 소수성 재료는 플루오로알킬-말단 실록산, 플루오로알킬-말단 포스포닉 애시드, 또는 플루오로알킬-말단 티올을 포함할 수 있다. 일부 실시형태들에서, 소수성 코팅은 약 10 nm 내지 약 50 nm 의 두께를 갖는다. 다른 실시형태들에서, 소수성 코팅은 10 nm 미만 (예를 들어, 5 nm 미만, 또는 약 1.5 내지 3.0 nm) 의 두께를 갖는다.
일부 실시형태들에서, 전기습윤 구성을 갖는 미세유체 디바이스 (200) 의 커버 (110) 는 마찬가지로 소수성 재료 (미도시) 로 코팅된다. 소수성 재료는 지지 구조 (104) 의 유전체층을 코팅하기 위해 사용되는 동일한 소수성 재료일 수 있고, 소수성 코팅은 지지 구조 (104) 의 유전체층상의 소수성 코팅의 두께와 실질적으로 동일한 두께를 가질 수 있다. 게다가, 커버 (110) 는 지지 구조 (104) 의 방식으로, 유전체층과 상부 전극 (210) 사이에 샌드위치된 전극 활성화 기판 (206) 을 포함할 수 있다. 커버 (110) 의 전극 활성화 기판 (206) 및 유전체층은 지지 구조 (104) 의 전극 활성화 기판 (206) 및 유전체층과 동일한 조성 및/또는 치수들을 가질 수 있다. 따라서, 미세유체 디바이스 (200) 는 2 개의 전기습윤 표면들을 가질 수 있다.
일부 실시형태들에서, 전극 활성화 기판 (206) 은 상술된 바와 같은 광도전 재료를 포함할 수 있다. 이에 따라, 소정의 실시형태들에서, 전극 활성화 기판 (206) 은 수소화 비정질 실리콘 (a-Si:H) 의 층을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. a-Si:H 는, 예를 들어 (100 * 수소 원자들의 수/수소 및 규소 원자들의 총 수로서 계산된) 약 8% 내지 40% 수소를 포함할 수 있다. a-Si:H 의 층은 약 500 nm 내지 약 2.0 ㎛의 두께를 가질 수 있다. 대안적으로, 전극 활성화 기판 (206) 은 상술된 바와 같이 포토트랜지스터 스위치들에 의해 제어되는 전극들 (예를 들어, 도전성 금속 전극들) 을 포함할 수 있다. 광-전기습윤 구성을 갖는 미세유체 디바이스들은 본 기술에서 알려져 있고 및/또는 본 기술에서 알려져 있는 전극 활성화 기판들로 구성될 수 있다. 예를 들어, 그 전체 내용들이 참조로 여기에 포힘되는 미국 특허 제 6,958,132 호 (Chiou 등) 는 a-Si:H 와 같은 광도전성 재료를 갖는 광-전기습윤 구성들을 개시하는 반면, 상술된 미국 특허 공보 제 2014/0124370 호 (Short 등) 는 포토트랜지스터 스위치들에 의해 제어되는 전극들을 갖는 전극 활성화 기판들을 개시한다.
미세유체 디바이스 (200) 는 따라서 광-전기습윤 구성을 가질 수 있고, 광 패턴들 (218) 은 전극 활성화 기판 (206) 에서의 광도전성 EW 영역들 또는 광응답성 EW 전극들을 활성화하기 위해 사용될 수 있다. 전극 활성화 기판 (206) 의 그러한 활성화된 EW 영역들 또는 EW 전극들은 지지 구조 (104) 의 내부 표면 (208) (즉, 오버레이잉 유전체층 또는 그것의 소수성 코팅의 내부 표면) 에서 전기습윤력을 생성할 수 있다. 전극 활성화 기판 (206) 상에 입사하는 광 패턴들 (218) 을 변경함으로써 (또는 광원 (216) 에 대해 미세유체 디바이스 (200) 를 이동시킴으로써), 지지 구조 (104) 의 내부 표면 (208) 과 접촉하는 (예를 들어, 수성 매질, 용액, 또는 용매를 포함하는) 액적들이 영역/챔버 (202) 에 존재하는 비혼성 유체 (예를 들어, 오일 매질) 를 통해 이동될 수 있다.
다른 실시형태들에서, 미세유체 디바이스들 (200) 은 EWOD 구성을 가질 수 있고, 전극 활성화 기판 (206) 은 활성화를 위해 광에 의존하지 않는 선택적으로 어드레싱가능한 및 에너자이징가능한 전극들을 포함할 수 있다. 전극 활성화 기판 (206) 은 따라서 그러한 전기습윤 (EW) 전극들의 패턴을 포함할 수 있다. 그 패턴은 예를 들어 도 2b 에 도시된 바와 같은 열들 및 행들로 배열된 실질적으로 정사각형 EW 전극들의 어레이일 수 있다. 대안적으로, 패턴은 육각형 격자를 형성하는 실질적으로 육각형 EW 전극들의 어레이일 수 있다. 패턴에 관계없이, EW 전극들은 전기 스위치들 (예를 들어, 반도체 기판 내의 트랜지스터 스위치들) 에 의해 선택적으로 활성화 (또는 활성화해제) 될 수 있다. 전극 활성화 기판 (206) 내의 EW 전극들을 선택적으로 활성화 및 활성화해제함으로써, 오버레이잉 유전체층 또는 그것의 소수성 코팅의 내부 표면 (208) 과 접촉하는 액적들 (미도시) 은 영역/챔버 (202) 내에서 이동될 수 있다. 도 1a 에서의 동기 모듈 (162) 은 그러한 스위치들을 제어할 수 있고 따라서 영역/챔버 (202) 주위의 특정의 액적들을 선택하고 이동시키기 위해 개개의 EW 전극들을 활성화 및 활성화해제할 수 있다. 선택적으로 어드레싱가능한 및 에너자이징가능한 전극들을 갖는 EWOD 구성을 갖는 미세유체 디바이스들은 본 기술에서 알려져 있고 예를 들어 미국 특허 제 8,685,344 호 (Sundarsan 등) 에 기술되었으며, 이것의 전체 내용들은 참조에 의해 여기에 포함된다.
미세유체 디바이스 (200) 의 구성에 관계없이, 전원 (212) 은 미세유체 디바이스 (200) 의 전기 회로들에 전력을 공급하는 전위 (예를 들어, AC 전압 전위) 를 제공하기 위해 사용될 수 있다. 전원 (212) 은 도 1 에서 참조되는 전원 (192) 과 동일하거나, 그 전원의 컴포넌트일 수 있다. 전원 (212) 은 상부 전극 (210) 및 하부 전극 (204) 에 AC 전압 및/또는 전류를 제공하도록 구성될 수 있다. AC 전압의 경우, 전원 (212) 은 상술된 바와 같이 영역/챔버 (202) 내에서 개개의 마이크로-객체들 (미도시) 을 트랩하고 이동시키며, 및/또는 또한 상술된 바와 같이 영역/챔버 (202) 에서 지지 구조 (104) (예를 들어, 유전체층 및/또는 유전체층상의 소수성 코팅) 의 내부 표면 (208) 의 습윤 특성들을 변경하기에 충분히 강한 네트 DEP 힘들 (또는 습윤력들) 을 발생시키기에 충부난 주파수 범위 및 평균 또는 피크 전력 (예를 들어, 전압 또는 전류) 범위를 제공할 수 있다. 그러한 주파수 범위들 및 평균 또는 피크 전력 범위들은 본 기술에서 알려져 있다. 예를 들어, 미국 특허 제 6,958,132 호 (Chiou 등), 미국 특허 제 RE44,711 (Wu 등) (미국특허 제 7,612,355 호로서 이슈됨), 및 미국 특허 출원 공개 제 US2014/0124370 호 (Short 등), 제 US2015/0306598 호 (Khandros 등) 및 제 US2015/0306599 호 (Khandros 등) 참조.
격리 펜들. 일반적인 격리 펜들 (224, 226, 및 228) 의 비-제한 예들은 도 2a 내지 도 2c 에 도시된 미세유체 디바이스 (230) 내에 도시된다. 각각의 격리 펜 (224, 226, 및 228) 는 고립 영역 (240) 및 고립 영역 (240) 을 미세유체 채널 (122) 에 유동성으로 접속시키는 접속 영역 (236) 을 정의하는 고립 구조 (232) 를 포함할 수 있다. 접속 영역 (236) 은 미세유체 채널 (122) 로의 근위 (proximal) 개구 (234) 및 고립 영역 (240) 로의 원위 (distal) 개구 (238) 를 포함할 수 있다. 접속 영역 (236) 은, 채널 (122) 로부터 격리 펜 (224, 226, 228) 안으로 유동하는 유체 매질 (미도시) 의 흐름의 최대 침투 깊이가 고립 영역 (240) 안으로 확장하지 않도록 구성될 수 있다. 따라서, 접속 영역 (236) 으로 인해, 격리 펜 (224, 226, 228) 의 고립 영역 (240) 에 배치된 마이크로-객체 (미도시) 또는 다른 재료 (미도시) 는 미세유체 채널 (122) 에서의 매질 (180) 의 흐름으로부터 고립될 수 있고, 실질적으로 이에 의해 영향을 받지 않는다.
도 2a 내지 도 2c 의 격리 펜들 (224, 226, 및 228) 은 각각 미세유체 채널 (122) 에 대해 직접 개방하는 단일 개구를 갖는다. 격리 펜의 개구는 미세유체 채널 (122) 로부터 측면방향으로 개방된다. 전극 활성화 기판 (206) 은 미세유체 채널 (122) 및 격리 펜들 (224, 226, 및 228) 양자의 아래에 놓인다. 격리 펜의 바닥을 형성하는, 격리 펜의 인클로저 내의 전극 활성화 기판 (206) 의 상부 표면은 미세유체 디바이스의 흐름 채널 (또는 각각, 흐름 경로) 의 바닥을 형성하는, 미세유체 채널 (122) (또는 채널이 존재하지 않는 경우 흐름 경로) 내의 전극 활성화 기판 (206) 의 상부 표면의 동일한 레벨 또는 실질적으로 동일한 레벨에 배치된다. 전극 활성화 기판 (206) 은 피쳐리스 (featureless) 일 수도 있거나 그것의 최고 고도로부터 그것의 최저 함몰부까지 약 3 미크론 이하만큼, 2.5 미크론, 2 미크론, 1.5 미크론, 1 미크론, 0.9 미크론, 0.5 미크론, 0.4 미크론, 0.2 미크론, 0.1 미크론 이하만큼 변화하는 불규칙적이거나 패터닝된 표면을 가질 수도 있다. 미세유체 채널 (122) (또는 흐름 경로) 및 격리 펜들 양자에 걸친 기판의 상부 표면에서의 고도의 변동은 격리 펜의 벽들 또는 미세유체 디바이스의 벽들의 높이의 약 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.5%, 0.3% 또는 0.1% 보다 작을 수도 있다. 미세유체 디바이스 (200) 에 대해 상세히 설명되지만, 이것은 또한 여기에 기술된 미세유체 디바이스들 (100, 230, 250, 280, 290, 320, 400, 450, 500, 700) 중 임의의 것에 적용된다.
미세유체 채널 (122) 은 따라서, 스윕 영역의 일 예일 수 있고, 격리 펜들 (224, 226, 228) 의 고립 영역들 (240) 은 스윕되지 않은 영역들의 예들일 수 있다. 주목된 바와 같이, 미세유체 채널 (122) 및 격리 펜들 (224, 226, 228) 은 하나 이상의 유체 매질 (180) 을 포함하도록 구성될 수 있다. 도 2a 및 도 2b 에 도시된 예에서, 포트들 (222) 은 미세유체 채널 (122) 에 접속되고 유체 매질 (180) 이 미세유체 디바이스 (230) 안으로 도입되거나 이로부터 제거되는 것을 허용한다. 유체 매질 (180) 의 도입 전에, 미세유체 디바이스는 이산화탄소 기체와 같은 기체로 프라이밍될 수도 있다. 일단, 미세유체 디바이스 (230) 가 유체 매질 (180) 을 포함하면, 미세유체 채널 (122) 에서 유체 매질 (180) 의 흐름 (242) 은 선택적으로 생성 및 정지될 수 있다. 예를 들어, 도시된 바와 같이 포트들 (222) 은 미세유체 채널 (122) 의 상이한 로케이션들 (예를 들어, 반대편 단부들) 에 배치될 수 있고, 매질의 흐름 (242) 은 인렛로서 기능하는 하나의 포트 (222) 로부터 아웃렛으로서 기능하는 다른 포트 (222) 로 생성될 수 있다.
도 2c 는 본 개시에 따른 격리 펜 (224) 의 일 예의 상세 뷰를 예시한다. 마이크로-객체들 (246) 의 예들이 또한, 도시된다.
알려진 바와 같이, 격리 펜 (224) 의 근위 개구 (234) 를 지나 미세유체 채널 (122) 에서 유체 매질 (180) 의 흐름 (242) 은 격리 펜 (224) 의 안 및/또는 밖으로의 매질 (180) 의 세컨더리 흐름 (244) 을 야기할 수 있다. 격리 펜 (224) 의 고립 영역 (240) 에서 마이크로-객체들 (246) 을 세컨더리 흐름 (244) 으로부터 고립시키기 위해, (즉, 근위 개구 (234) 로부터 원위 개구 (238) 로의) 격리 펜 (224) 의 접속 영역 (236) 의 길이 (Lcon) 는 세컨더리 흐름 (244) 의 접속 영역 (236) 안으로의 침투 깊이 (Dp) 보다 커야 한다. 세컨더리 흐름 (244) 의 침투 깊이 (Dp) 는 미세유체 채널 (122) 에서 유동하는 유체 매질 (180) 의 속도 및 미세유체 채널 (122) 및 미세유체 채널 (122) 에 대한 접속 영역 (236) 의 근위 개구 (234) 의 구성에 관련한 다양한 파라미터들에 의존한다. 소정의 미세유체 디바이스에 대해, 미세유체 채널 (122) 및 개구 (234) 의 구성들은 고정될 것이지만 반면에, 미세유체 채널 (122) 에서 유체 매질 (180) 의 흐름 (242) 의 속도는 가변적일 것이다. 따라서, 각각의 격리 펜 (224) 에 대해, 미세유체 채널 (122) 에서 유체 매질 (180) 의 흐름 (242) 에 대한 최대 속도 (Vmax) 는, 세컨더리 흐름 (244) 의 침투 깊이 (Dp) 가 접속 영역 (236) 의 길이 (Lcon) 를 초과하지 않는 것을 보장하도록 식별될 수 있다. 미세유체 채널 (122) 에서 유체 매질 (180) 의 흐름 (242) 의 속도가 최대 속도 (Vmax) 를 초과하지 않는 한, 결과의 세컨더리 흐름 (244) 은 미세유체 채널 (122) 및 접속 영역 (236) 에 제한되고 고립 영역 (240) 밖에서 유지될 수 있다. 미세유체 채널 (122) 에서 매질 (180) 의 흐름 (242) 은 따라서, 마이크로-객체들 (246) 을 고립 영역 (240) 밖으로 인출하지 않을 것이다. 차라리, 고립 영역 (240) 에 위치된 마이크로-객체들 (246) 은 미세유체 채널 (122) 에서 유체 매질 (180) 의 흐름 (242) 에 관계없이 고립 영역 (240) 에 머무를 것이다.
또한, 미세유체 채널 (122) 에서의 매질 (180) 의 흐름 (242) 의 속도가 Vmax 를 초과하지 않는 한, 미세유체 채널 (122) 에서의 유체 매질 (180) 의 흐름 (242) 은 미세유체 채널 (122) 로부터 격리 펜 (224) 의 고립 영역 (240) 으로 잡다한 입자들 (예를 들어, 마이크로입자들 및/또는 나노입자들) 을 이동시키지 않을 것이다. 접속 영역 (236) 의 길이 (Lcon) 가 세컨더리 흐름 (244) 의 최대 침투 깊이 (Dp) 보다 더 큰 것은 따라서, 미세유체 채널 (122) 또는 다른 격리 펜 (예를 들어, 도 2d 에서 격리 펜들 (226, 228)) 로부터의 잡다한 입자들로 하나의 격리 펜 (224) 의 오염을 방지할 수 있다.
격리 펜들 (224, 226, 228) 의 접속 영역들 (236) 및 미세유체 채널 (122) 이 미세유체 채널 (122) 에서의 매질 (180) 의 흐름 (242) 에 의해 영향을 받을 수 있기 때문에, 미세유체 채널 (122) 및 접속 영역들 (236) 은 미세유체 디바이스 (230) 의 스윕 (또는 흐름) 영역들로 간주될 수 있다. 한편, 격리 펜들 (224, 226, 228) 의 고립 영역들 (240) 은, 스윕되지 않은 (또는 비-흐름) 영역들로 간주될 수 있다. 예를 들어, 미세유체 채널 (122) 에서의 제 1 유체 매질 (180) 내의 성분들 (미도시) 은 미세유체 채널 (122) 로부터 접속 영역 (236) 을 통해 그리고 고립 영역 (240) 내의 제 2 유체 매질 (248) 로의 제 1 매질 (180) 의 성분들의 확산에 의해서만 실질적으로, 고립 영역 (240) 에서 제 2 유체 매질 (280) 와 혼합할 수 있다. 유사하게, 고립 영역 (240) 에서의 제 2 매질 (248) 의 성분들 (미도시) 은 고립 영역 (240) 으로부터 접속 영역 (236) 을 통해 그리고 미세유체 채널 (122) 의 제 1 매질 (180) 안으로 제 2 매질 (248) 의 성분들의 확산에 의해서만 실질적으로, 미세유체 채널 (122) 에서 제 1 매질 (180) 과 혼합할 수 있다. 일부 실시형태들에서, 확산에 의한 격리 펜의 고립 영역과 흐름 경로 사이의 유체 매질 교환의 정도는 유체 교환의 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 보다 더 크거나 약 99% 보다 더 크다. 제 1 매질 (180) 은 제 2 매질 (248) 와 동일한 매질이거나 상이한 매질일 수 있다. 또한, 제 1 매질 (180) 및 제 2 매질 (248) 는 동일하게 시작하고, 그 후 (예를 들어, 고립 영역 (240) 에서 하나 이상의 세포들에 의해 제 2 매질 (248) 의 컨디셔닝을 통해, 또는 미세유체 채널 (122) 을 통해 유동하는 매질 (180) 을 변경함으로써) 상이하게 될 수 있다.
미세유체 채널 (122) 에서 유체 매질 (180) 의 흐름 (242) 에 의해 야기된 세컨더리 흐름 (244) 의 최대 침투 깊이 (Dp) 는, 위에서 언급된 바와 같이 다수의 파라미터들에 의존할 수 있다. 이러한 파라미터들의 예들은: 미세유체 채널 (122) 의 형상 (예를 들어, 미세유체 채널은 접속 영역 (236) 안으로 매질을 지향시키고, 접속 영역 (236) 으로부터 멀리 매질을 전환시키고, 또는 접속 영역 (236) 의 근위 개구 (234) 에 실질적으로 수직한 방향에서 매질을 미세유체 채널 (122) 로 지향시킬 수 있음); 근위 개구 (234) 에서 미세유체 채널 (122) 의 폭 (Wch)(또는 단면적); 및 근위 개구 (234) 에서 접속 영역 (236) 의 폭 (Wcon)(또는 단면적); 미세유체 채널 (122) 에서 유체 매질 (180) 의 흐름 (242) 의 속도 (V); 제 1 매질 (180) 및/또는 제 2 매질 (248) 의 속도 등을 포함한다.
일부 실시형태들에서, 미세유체 채널 (122) 및 격리 펜들 (224, 226, 228) 의 치수들은 미세유체 채널 (122) 에서 유체 매질 (180) 의 흐름 (242) 의 벡터에 대하여 다음과 같이 배향될 수 있다: 미세유체 채널 폭 (Wch)(또는 미세유체 채널 (122) 의 단면적) 은 매질 (180) 의 흐름 (242) 에 실질적으로 수직할 수 있다; 개구 (234) 에서 접속 영역 (236) 의 폭 (Wcon)(또는 단면적) 은 미세유체 채널 (122) 에서의 매질 (180) 의 흐름 (242) 에 실질적으로 평행할 수 있다; 및/또는 접속 영역의 길이 (Lcon) 는 미세유체 채널 (122) 에서 매질 (180) 의 흐름 (242) 에 실질적으로 수직할 수 있다. 상기는 단지 예들이며, 미세유체 채널 (122) 및 격리 펜들 (224, 226, 228) 의 상대적 포지션은 서로에 대하여 다른 배향들에 있을 수 있다.
도 2c 에 예시된 바와 같이, 접속 영역 (236) 의 폭 (Wcon) 은 근위 개구 (234) 로부터 원위 개구 (238) 까지 균일할 수 있다. 따라서, 원위 개구 (238) 에서 접속 영역 (236) 의 폭 (Wcon) 은 근위 개구 (234) 에서 접속 영역 (236) 의 폭 (Wcon) 에 대해 본원에 식별된 범위들 중 어느 하나에 있을 수 있다. 대안으로, 원위 개구 (238) 에서 접속 영역 (236) 의 폭 (Wcon) 은 근위 개구 (234) 에서 접속 영역 (236) 의 폭 (Wcon) 보다 더 클 수 있다.
도 2c 에 예시된 바와 같이, 원위 개구 (238) 에서 고립 영역 (240) 의 폭은 근위 개구 (234) 에서 접속 영역 (236) 의 폭 (Wcon) 과 실질적으로 동일할 수 있다. 원위 개구 (238) 에서 고립 영역 (240) 의 폭은 따라서, 근위 개구 (234) 에서 접속 영역 (236) 의 폭 (Wcon) 에 대해 본원에 식별된 범위들 중 어느 하나에 있을 수 있다. 대안으로, 원위 개구 (238) 에서 고립 영역 (240) 의 폭은 근위 개구 (234) 에서 접속 영역 (236) 의 폭 (Wcon) 보다 더 크거나 또는 더 작을 수 있다. 또한, 원위 개구 (238) 는 근위 개구 (234) 보다 더 작을 수도 있고, 접속 영역 (236) 의 폭 (Wcon) 은 근위 개구 (234) 와 원위 개구 (238) 사이에서 좁아질 수도 있다. 예를 들어, 접속 영역 (236) 은 다양한 상이한 지오메트리들을 사용하여 (예를 들어, 접속 영역을 챔퍼링, 접속 영역을 베벨링), 근위 개구와 원위 개구 사이에서 좁아질 수도 있다. 또한, 접속 영역 (236) 의 임의의 부분 또는 하위부분 (예를 들어, 근위 개구 (234) 에 인접한 접속 영역의 부분) 이 좁아질 수도 있다.
도 2d 내지 도 2f 는 도 1a 의 각각의 미세유체 디바이스 (100), 회로 (132) 및 채널 (134) 의 변형들인, 미세유체 회로 (262) 및 흐름 채널들 (264) 을 포함하는 미세유체 디바이스 (400) 의 다른 예시적인 실시형태를 도시한다. 미세유체 디바이스 (250) 는 또한, 전술된 격리 펜들 (124, 126, 128, 130, 224, 226 또는 228) 의 추가적인 변형들인 복수의 격리 펜들 (266) 을 갖는다. 특히, 도 2d 내지 도 2f 에 도시된 디바이스 (250) 의 격리 펜들 (266) 은 전술된 디바이스들 (100, 200, 230, 280, 290, 300) 내의 격리 펜들 (124, 126, 128, 130, 224, 226 또는 228) 중 어느 하나를 대체할 수 있다. 마찬가지로, 미세유체 디바이스 (400) 는 미세유체 디바이스 (100) 의 다른 변형이고, 또한 전술된 미세유체 디바이스 (100, 200, 230, 280, 290, 300), 뿐만 아니라 본원에 설명된 다른 미세유체 시스템 컴포넌트들 중 어느 하나와 동일한 또는 상이한 DEP 구성을 가질 수도 있다.
도 2d 내지 도 2f 의 미세유체 디바이스 (250) 는 지지 구조 (도 2d 내지 도 2f 에서 보이지 않지만, 도 1a 에 도시된 디바이스 (100) 의 지지 구조 (104) 와 동일하거나 일반적으로 유사할 수 있음), 미세유체 회로 구조 (256), 및 커버 (도 2d 내지 도 2f 에서 보이지 않지만, 도 1a 에 도시된 디바이스 (100) 의 커버 (122) 와 동일하거나 일반적으로 유사할 수도 있음) 를 포함한다. 미세유체 회로 구조 (256) 는, 도 1a 에 도시된 디바이스 (100) 의 프레임 (252) 및 미세유체 회로 재료 (260) 와 동일하거나 또는 일반적으로 유사할 수 있는 프레임 (252) 및 미세유체 회로 재료 (260) 를 포함한다. 도 2d 에 나타낸 바와 같이, 미세유체 회로 재료 (260) 에 의해 정의된 미세유체 회로 (262) 는 다수의 격리 펜들 (266) 이 유동적으로 접속되는 다수의 채널들 (264)(2 개가 도시되지만 더 많이 존재할 수 있음) 을 포함할 수 있다.
각각의 격리 펜 (266) 는 고립 구조 (272), 고립 구조 (272) 내의 고립 영역 (270), 및 접속 영역 (268) 을 포함할 수 있다. 미세유체 채널 (264) 에서의 근위 개구 (274) 로부터 고립 구조 (272) 에서의 원위 개구 (276) 까지, 접속 영역 (268) 은 미세유체 채널 (264) 을 고립 영역 (270) 에 유동적으로 접속시킨다. 일반적으로, 도 2b 및 도 2c 의 상기 논의에 따르면, 미세유체 채널 (264) 에서 제 1 유체 매질 (254) 의 흐름 (278) 은 미세유체 채널 (264) 로부터 격리 펜들 (266) 의 각각의 접속 영역들 (268) 안으로 및/또는 밖으로 제 1 매질 (254) 의 세컨더리 흐름들 (282) 을 생성할 수 있다.
도 2e 에 예시된 바와 같이, 각각의 격리 펜 (266) 의 접속 영역 (268) 은 일반적으로, 미세유체 채널 (264) 로의 근위 개구 (274) 와 고립 구조 (272) 로의 원위 개구 (276) 사이에서 확장하는 영역을 포함한다. 접속 영역 (268) 의 길이 (Lcon) 는 세컨더리 흐름 (282) 의 최대 침투 깊이 (Dp) 보다 더 클 수 있고, 이 경우에서 세컨더리 흐름 (282) 은 (도 2d 에 도시된 바와 같이) 고립 영역 (270) 을 향해 재지향되지 않고 접속 영역 (268) 으로 확장할 것이다. 대안으로, 도 2f 에 예시된 바와 같이, 접속 영역 (268) 은 최대 침투 깊이 (Dp) 보다 작은 길이 (Lcon) 를 가질 수 있고, 이 경우에서 세컨더리 흐름 (282) 은 접속 영역 (268) 을 통해 확장하고 고립 영역 (270) 을 향해 재지향될 것이다. 이 후자의 상황에서, 접속 영역 (268) 의 길이들 (LC1 및 LC2) 의 합은 최대 침투 깊이 (Dp) 보다 커서, 세컨더리 흐름 (282) 이 고립 영역 (270) 안으로 확장하지 않을 것이다. 접속 영역 (268) 의 길이 (Lcon) 가 침투 깊이 (Dp) 보다 크든 아니든, 또는 접속 영역 (268) 의 길이들 (LC1 및 LC2) 의 합이 최대 침투 깊이 (Dp) 보다 크든 아니든, 최대 속도 (Vmax) 를 초과하지 않는 미세유체 채널 (264) 에서의 제 1 매질 (254) 의 흐름 (278) 은 침투 깊이 (Dp) 를 갖는 세컨더리 흐름을 생성할 것이고, 격리 펜 (266) 의 고립 영역 (270) 에서 마이크로-객체들 (도시되지 않지만, 도 2e 에 도시된 마이크로-객체들 (246) 과 동일하거나 또는 일반적으로 유사할 수 있음) 은 미세유체 채널 (264) 에서 제 1 매질 (254) 의 흐름 (278) 에 의해 고립 영역 (270) 밖으로 인출되지 않을 것이다. 또한, 미세유체 채널 (264) 에서의 흐름 (278) 은 미세유체 채널 (264) 로부터 격리 펜 (266) 의 고립 영역 (270) 안으로 잡다한 재료들 (미도시) 을 인출하지도 않을 것이다. 이와 같이, 확산은, 미세유체 채널 (264) 에서 제 1 매질 (254) 내의 성분들이 미세유체 채널 (264) 로부터 격리 펜 (266) 의 고립 영역 (270) 내의 제 2 매질 (258) 로 이동할 수 있는 유일한 메커니즘이다. 마찬가지로, 확산은, 격리 펜 (266) 의 고립 영역 (270) 에서의 제 2 매질 (258) 내의 성분들이 고립 영역 (270) 으로부터 미세유체 채널 (264) 내의 제 1 매질 (254) 로 이동할 수 있는 유일한 메커니즘이다. 제 1 매질 (254) 은 제 2 매질 (258) 과 동일한 매질일 수 있고, 또는 제 1 매질 (254) 은 제 2 매질 (258) 과 상이한 매질일 수 있다. 대안으로, 제 1 매질 (254) 및 제 2 매질 (258) 는 동일하게 시작할 수 있고, 그 후 예를 들어 고립 영역 (270) 내의 하나 이상의 세포들에 의한 제 2 매질의 컨디셔닝을 통해, 또는 미세유체 채널 (264) 을 통해 유동하는 매질을 변경함으로써 상이하게 될 수 있다.
도 2e 에 예시된 바와 같이, 미세유체 채널 (264) 내의 (즉, 도 2d 에서 화살표들 (482) 에 의해 표시된 미세유체 채널을 통한 유체 매질 흐름의 방향을 가로질러 취해진) 미세유체 채널들 (264) 의 폭 (Wch) 은 근위 개구 (274) 의 폭 (Wcon1) 에 실질적으로 수직하고 따라서 원위 개구 (276) 의 폭 (Wcon2) 에 실질적으로 평행할 수 있다. 근위 개구 (274) 의 폭 (Wcon1) 및 원위 개구 (276) 의 폭 (Wcon2) 은 그러나, 서로 실질적으로 수직할 필요는 없다. 예를 들어, 근위 개구 (274) 의 폭 (Wcon1) 이 배향되는 축 (미도시) 과 원위 개구 (276) 의 폭 (Wcon2) 이 배향되는 다른 축 간의 각도는 수직 외 및 따라서 90°이외일 수 있다. 다르게 배향된 각도들의 예들은 다음의 범위들 중 어느 하나의 각도들을 포함한다: 약 30°내지 약 90°, 약 45°내지 약 90°, 약 60°내지 약 90°등.
격리 펜들 (예를 들어, 124, 126, 128, 130, 224, 226, 228, 또는 266) 의 다양한 실시형태들에서, 고립 영역 (예를 들어, 240 또는 270) 은 복수의 마이크로-객체들을 포함하도록 구성된다. 다른 실시형태들에서, 고립 영역은 단지 1, 2, 3, 4, 5, 또는 유사한 상대적으로 작은 수의 마이크로-객체들 만을 포함하도록 구성될 수 있다. 따라서, 고립 영역의 체적은, 예를 들어 적어도 2x105, 4x105, 8x105, 1x106, 2x106, 4x106, 8x106 세제곱 마이크론, 또는 그 이상일 수 있다.
격리 펜들의 다양한 실시형태들에서, 근위 개구 (예를 들어, 234) 에서 미세유체 채널 (예를 들어, 122) 의 폭 (Wch) 은 다음의 범위들 중 어느 하나 내에 있을 수 있다: 약 50-1000 마이크론, 50-500 마이크론, 50-400 마이크론, 50-300 마이크론, 50-250 마이크론, 50-200 마이크론, 50-150 마이크론, 50-100 마이크론, 70-500 마이크론, 70-400 마이크론, 70-300 마이크론, 70-250 마이크론, 70-200 마이크론, 70-150 마이크론, 90-400 마이크론, 90-300 마이크론, 90-250 마이크론, 90-200 마이크론, 90-150 마이크론, 100-300 마이크론, 100-250 마이크론, 100-200 마이크론, 100-150 마이크론, 및 100-120 마이크론. 일부 다른 실시형태들에서, 근위 개구 (예를 들어, 234) 에서 미세유체 채널 (예를 들어, 122) 의 폭 (Wch) 은 약 200-800 마이크론, 200-700 마이크론, 또는 200-600 마이크론의 범위에 있을 수 있다. 상기의 것은 단지 예들이며, 미세유체 채널 (122) 의 폭 (Wch) 은 다른 범위들 (예를 들어, 위에 열거된 엔드포인트들 중 어느 하나에 의해 정의된 범위) 에 있을 수 있다. 또한, 미세유체 채널 (122) 의 폭 (Wch) 은 격리 펜의 근위 개구 외의 미세유체 채널의 영역들에서 이들 범위들 중 어느 하나에 있도록 선택될 수 있다.
일부 실시형태들에서, 격리 펜은 약 30 내지 약 200 마이크론, 또는 약 50 내지 약 150 마이크론의 높이를 갖는다. 일부 실시형태들에서, 격리 펜은 약 1x104 내지 3x106 제곱 마이크론, 2x104 내지 2x106 제곱 마이크론, 4x104 내지 1x106 제곱 마이크론, 2x104 내지 5x105 제곱 마이크론, 2x104 내지 1x105 제곱 마이크론 또는 약 2x105 내지 2x106 제곱 마이크론의 단면적을 갖는다.
격리 펜들의 다양한 실시형태들에서, 근위 개구 (예를 들어, 234) 에서 미세유체 채널 (예를 들어, 122) 의 높이 (Hch) 는 다음의 범위들 중 어느 하나 내에 있을 수 있다: 20-100 마이크론, 20-90 마이크론, 20-80 마이크론, 20-70 마이크론, 20-60 마이크론, 20-50 마이크론, 30-100 마이크론, 30-90 마이크론, 30-80 마이크론, 30-70 마이크론, 30-60 마이크론, 30-50 마이크론, 40-100 마이크론, 40-90 마이크론, 40-80 마이크론, 40-70 마이크론, 40-60 마이크론, 또는 40-50 마이크론. 상기의 것은 단지 예들이며, 미세유체 채널 (예를 들어, 122) 의 높이 (Hch) 는 다른 범위들 (예를 들어, 위에서 열거된 엔드포인트들 중 어느 하나에 의해 정의된 범위) 에 있을 수 있다. 미세유체 채널 (122) 의 높이 (Hch) 는 격리 펜의 근위 개구 이외의 미세유체 채널의 영역들에서 이들 범위들 중 어느 하나에 있도록 선택될 수 있다.
격리 펜들의 다양한 실시형태들에서, 근위 개구 (예를 들어, 234) 에서 미세유체 채널 (예를 들어, 122) 의 단면적은 다음의 범위들 중 어느 하나 내에 있을 수 있다: 500-50,000 제곱 마이크론, 500-40,000 제곱 마이크론, 500-30,000 제곱 마이크론, 500-25,000 제곱 마이크론, 500-20,000 제곱 마이크론, 500-15,000 제곱 마이크론, 500-10,000 제곱 마이크론, 500-7,500 제곱 마이크론, 500-5,000 제곱 마이크론, 1,000-25,000 제곱 마이크론, 1,000-20,000 제곱 마이크론, 1,000-15,000 제곱 마이크론, 1,000-10,000 제곱 마이크론, 1,000-7,500 제곱 마이크론, 1,000-5,000 제곱 마이크론, 2,000-20,000 제곱 마이크론, 2,000-15,000 제곱 마이크론, 2,000-10,000 제곱 마이크론, 2,000-7,500 제곱 마이크론, 2,000-6,000 제곱 마이크론, 3,000-20,000 제곱 마이크론, 3,000-15,000 제곱 마이크론, 3,000-10,000 제곱 마이크론, 3,000-7,500 제곱 마이크론, 또는 3,000 내지 6,000 제곱 마이크론. 상기의 것은 단지 예들이며, 근위 개구 (예를 들어, 234) 에서 미세유체 채널 (예를 들어, 122) 의 단면적은 다른 범위들 (예를 들어, 위에서 열거된 엔드포인트들 중 어느 하나에 의해 정의된 범위) 에 있을 수 있다.
격리 펜들의 다양한 실시형태들에서, 접속 영역 (예를 들어, 236) 의 길이 (Lcon) 는 다음의 범위들 중 어느 하나에 있을 수 있다: 약 1-600 마이크론, 5-550 마이크론, 10-500 마이크론, 15-400 마이크론, 20-300 마이크론, 20-500 마이크론, 40-400 마이크론, 60-300 마이크론, 80-200 마이크론, 또는 약 100-150 마이크론. 상기의 것은 단지 예들이며, 접속 영역 (예를 들어, 236) 의 길이 (Lcon) 는 상기 예들과 상이한 범위 (예를 들어, 위에서 열거된 엔드포인트들 중 어느 하나에 의해 정의된 범위) 에 있을 수 있다.
격리 펜들의 다양한 실시형태들에서, 근위 개구 (예를 들어, 234) 에서 접속 영역 (예를 들어, 236) 의 폭 (Wcon) 은 다음의 범위들 중 어느 하나에 있을 수 있다: 20-500 마이크론, 20-400 마이크론, 20-300 마이크론, 20-200 마이크론, 20-150 마이크론, 20-100 마이크론, 20-80 마이크론, 20-60 마이크론, 30-400 마이크론, 30-300 마이크론, 30-200 마이크론, 30-150 마이크론, 30-100 마이크론, 30-80 마이크론, 30-60 마이크론, 40-300 마이크론, 40-200 마이크론, 40-150 마이크론, 40-100 마이크론, 40-80 마이크론, 40-60 마이크론, 50-250 마이크론, 50-200 마이크론, 50-150 마이크론, 50-100 마이크론, 50-80 마이크론, 60-200 마이크론, 60-150 마이크론, 60-100 마이크론, 60-80 마이크론, 70-150 마이크론, 70-100 마이크론, 및 80-100 마이크론. 상기의 것은 단지 예들이며, 근위 개구 (예를 들어, 234) 에서 접속 영역 (예를 들어, 236) 의 폭 (Wcon) 은 상기 예들과 상이 (예를 들어, 위에서 열거된 엔드포인트들 중 어느 하나에 의해 정의된 범위) 할 수 있다.
격리 펜들의 다양한 실시형태들에서, 근위 개구 (예를 들어, 234) 에서 접속 영역 (예를 들어, 236) 의 폭 (Wcon) 은 적어도 격리 펜이 그에 대해 의도되는 마이크로-객체 (예를 들어, 활성화된 T 세포와 같은 생물학적 세포) 의 최대 치수만큼 클 수 있다. 상기의 것은 단지 예들이며, 근위 개구 (예를 들어, 234) 에서 접속 영역 (예를 들어, 236) 의 폭 (Wcon) 은 상기 예들과 상이 (예를 들어, 위에서 열거된 엔드포인트들 중 어느 하나에 의해 정의된 범위) 할 수 있다.
격리 펜들의 다양한 실시형태들에서, 근위 개구 (예를 들어, 234) 에서 접속 영역 (예를 들어, 236) 의 길이 (Lcon) 대 접속 영역 (예를 들어, 236) 의 폭 (Wcon) 의 비율은 다음의 비율들 중 어느 하나 이상일 수 있다: 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0, 또는 그 이상. 상기의 것은 단지 예들이며, 근위 개구 (예를 들어, 234) 에서 접속 영역 (236) 의 길이 (Lcon) 대 접속 영역 (예를 들어, 236) 의 폭 (Wcon) 의 비율은 상기 예들과 상이할 수 있다.
미세유체 디바이스들 (100, 200, 230, 250, 280, 290, 300) 의 다양한 실시형태들에서, Vmax 는 대략 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 10, 11, 12, 13, 14, 15 마이크로리터/초, 또는 그 이상으로 설정될 수 있다.
격리 펜들을 갖는 미세유체 디바이스들의 다양한 실시형태들에서, 격리 펜의 고립 영역 (예를 들어, 240) 의 체적은, 예를 들어 적어도 1x105, 2x105, 4x105, 8x105, 1x106, 2x106, 4x106, 6x106, 8x106, 1x107, 5x107, 1x108, 5x108, 또는 8x108 세제곱 마이크론, 또는 그 이상일 수 있다. 격리 펜들을 갖는 미세유체 디바이스들의 다양한 실시형태들에서, 격리 펜의 체적은 약 2x105, 5x105, 8x105, 1x106, 2x106, 4x106, 8x106, 1x107, 3x107, 5x107, 또는 약 8x107 세제곱 마이크론, 또는 그 이상일 수 있다. 일부 다른 실시형태들에서, 격리 펜의 체적은 약 0.1 나노미터 내지 약 50 나노미터, 0.2 나노미터 내지 약 25 나노미터, 0.5 나노미터 내지 약 20 나노미터, 약 0.8 나노미터 내지 약 15 나노미터, 또는 약 1 나노미터 내지 약 10 나노미터일 수도 있다.
다양한 실시형태에서, 미세유체 디바이스는, 본원에 논의된 실시형태들 중 어느 하나로서 구성된 격리 펜들을 갖고, 여기서 미세유체 디바이스는 약 5 내지 약 10 개의 격리 펜들, 약 10 내지 약 50 개의 격리 펜들, 약 100 내지 약 500 개의 격리 펜들; 약 200 내지 약 1000 개의 격리 펜들, 약 500 내지 약 1500 개의 격리 펜들, 약 1000 내지 약 2000 개의 격리 펜들, 약 1500 내지 약 3000 개의 격리 펜들, 약 2000 내지 약 4000 개의 격리 펜들, 약 2500 내지 약 5000 개의 격리 펜들, 약 3000 내지 약 6000 개의 격리 펜들, 약 3500 내지 약 7000 개의 격리 펜들, 약 4000 내지 약 8000 개의 격리 펜들, 약 4500 내지 약 9000 개의 격리 펜들, 또는 약 5000 내지 약 10,000 개의 격리 펜들을 갖는다. 격리 펜들은 모두 동일한 사이즈일 필요는 없고 다양한 구성들 (예를 들어, 격리 펜 내의 상이한 폭들, 상이한 특징들) 을 포함할 수도 있다.
도 2g 는 일 실시형태에 따른 미세유체 디바이스 (280) 를 예시한다. 도 2g 에 예시된 미세유체 디바이스 (280) 는 미세유체 디바이스 (100) 의 양식화된 다이어그램이다. 실제로, 미세유체 디바이스 (280) 및 그 구성 회로 엘리먼트들 (예를 들어, 채널들 (122) 및 격리 펜들 (128)) 은 본원에 논의된 치수들을 가질 것이다. 도 2g 에 예시된 미세유체 회로 (120) 는 2 개의 포트들 (107), 4 개의 별개의 채널들 (122) 및 4 개의 별개의 흐름 영역들 (106) 을 갖는다. 미세유체 디바이스 (280) 는 각각의 미세유체 채널 (122) 에서 개방된 복수의 격리 펜들을 더 포함한다. 도 2g 에 예시된 미세유체 디바이스에서, 격리 펜들은 도 2c 에 예시된 펜들과 유사한 지오메트리를 갖고, 따라서 양자의 접속 영역들 및 고립 영역들을 갖는다. 따라서, 미세유체 회로 (120) 는 스윕 영역들 (예를 들어, 세컨더리 흐름 (244) 의 최대 침투 깊이 (Dp) 내의 접속 영역들 (236) 의 부분들 및 채널들 (122)) 및 비-스윕 영역들 (예를 들어, 세컨더리 흐름 (244) 의 최대 침투 깊이 (Dp) 내에 있지 않은 접속 영역들 (236) 의 부분들 및 고립 영역들 (240)) 양자 모두를 포함한다.
도 3a 및 도 3b 는 본 개시에 따른 미세유체 디바이스들 (예를 들어, 100, 200, 230, 250, 280, 290, 300) 을 동작 및 관측하는데 사용될 수 있는 시스템 (150) 의 다양한 실시형태들을 나타낸다. 도 3a 에 예시된 바와 같이, 시스템 (150) 은 미세유체 디바이스 (100)(미도시), 또는 본원에 설명된 임의의 다른 미세유체 디바이스를 홀딩하도록 구성된 구조 ("네스트 (nest)")(300) 를 포함할 수 있다. 네스트 (300) 는 미세유체 디바이스 (320) (예를 들어, 광학적으로-작동된 동전기 디바이스 (100)) 와 인터페이스하고 전원 (192) 으로부터 미세유체 디바이스 (320) 로 전기적 접속들을 제공할 수 있는 소켓 (302) 을 포함할 수 있다. 네스트 (300) 는 집적된 전기적 신호 생성 서브시스템 (304) 을 더 포함할 수 있다. 전기적 신호 생성 서브시스템 (304) 은, 바이어싱 전압이, 미세유체 디바이스가 소켓 (302) 에 의해 홀딩되는 경우 미세유체 디바이스 (320) 내의 전극들의 쌍 양단에 인가되도록 바이어싱 전압을 소켓 (302) 에 공급하도록 구성될 수 있다. 따라서, 전기적 신호 생성 서브시스템 (304) 은 전원 (192) 의 부분일 수 있다. 미세유체 디바이스 (320) 에 바이어싱 전압을 인가하는 능력은, 바이어싱 전압이, 미세유체 디바이스 (320) 가 소켓 (302) 에 의해 홀딩되는 경우 항상 인가될 것이라는 것을 의미하지는 않는다. 차라리, 대부분의 경우들에서, 바이어싱 전압은 간헐적으로, 예를 들어 미세유체 디바이스 (320) 에서 유전영동 또는 전기습윤과 같은 동전기적 힘들의 생성을 용이하게 하도록 필요할 때에만, 인가될 것이다.
도 3a 에 예시된 바와 같이, 네스트 (300) 는 인쇄 회로 기판 어셈블리 (PCBA)(322) 를 포함할 수 있다. 전기적 신호 생성 서브시스템 (304) 은 PCBA (322) 상에 장착되고 이 안에 전기적으로 집적될 수 있다. 예시적인 지지체는 PCBA (322) 상에 또한 장착된 소켓 (302) 을 포함한다.
통상적으로, 전기적 신호 생성 서브시스템 (304) 은 파형 생성기 (미도시) 를 포함할 것이다. 전기적 신호 생성 서브시스템 (304) 은 파형 생성기로부터 수신된 파형을 증폭시키도록 구성된 파형 증폭 회로 (미도시) 및/또는 오실로스코프 (미도시) 를 더 포함할 수 있다. 오실로스코프는, 존재하는 경우, 소켓 (302) 에 의해 홀딩된 미세유체 디바이스 (320) 에 인가된 파형을 측정하도록 구성될 수 있다. 소정 실시형태들에서, 오실로스코프는 미세유체 디바이스 (320) 에 근접한 (및 파형 생성기에 대해 먼) 로케이션에서 파형을 측정하고, 따라서 디바이스에 실제로 인가된 파형을 측정하는데 있어서 더 큰 정확도를 보장한다. 오실로스코프 측정으로부터 획득된 데이터는, 예를 들어 파형 생성기에 피드백으로서 제공될 수 있고, 파형 생성기는 이러한 피드백에 기초하여 그 출력을 조정하도록 구성될 수 있다. 적합한 결합형 파형 생성기 및 오실로스코프의 예는 Red Pitaya™ 이다.
소정의 실시형태들에서, 네스트 (300) 는 제어기 (308), 예컨대 전기적 신호 생성 서브시스템 (304) 을 감지 및/또는 제어하는데 사용된 마이크로프로세서를 더 포함한다. 적합한 마이크로프로세서들의 예들은 Arduino™ 마이크로프로세서들, 예컨대 Arduino Nano™ 을 포함한다. 제어기 (308) 는 기능들 및 분석을 수행하는데 사용될 수도 있고, 또는 기능들 및 분석을 수행하도록 (도 1a 에 도시된) 외부 마스터 제어기 (154) 와 통신할 수도 있다. 도 3a 에 예시된 실시형태에서, 제어기 (308) 는 인터페이스 (310)(예를 들어, 플러그 또는 커넥터) 를 통해 마스터 제어기 (154) 와 통신한다.
일부 실시형태들에서, 네스트 (300) 는 Red Pitaya™ 파형 생성기/오실로스코프 유닛 ("Red Pitaya 유닛") 및 Red Pitaya 유닛에 의해 생성된 파형을 증폭시키고 증폭된 전압을 미세유체 디바이스 (100) 로 패스하는 파형 증폭 회로를 포함하는 전기적 신호 생성 서브시스템 (304) 을 포함할 수 있다. 일부 실시형태들에서, Red Pitaya 유닛은 미세유체 디바이스 (320) 에서 증폭된 전압을 측정하고, 그 후, 미세유체 디바이스 (320) 에서 측정된 전압이 원하는 값이도록 필요에 따라 그 자신의 출력 전압을 조정하도록 구성된다. 일부 실시형태들에서, 파형 증폭 회로는, 미세유체 디바이스 (100) 에서 최대 13 Vpp 의 신호를 초래하는, PCBA (322) 상에 장착된 DC-DC 컨버터들의 쌍에 의해 생성된 +6.5V 내지 -6.5V 전력 공급을 가질 수 있다.
도 3a 에 예시된 바와 같이, 지지 구조 (300) (예를 들어, 네스트 (nest)) 는 열 제어 서브시스템 (306) 을 더 포함할 수 있다. 열 제어 서브시스템 (306) 은 지지 구조 (300) 에 의해 홀딩된 미세유체 디바이스 (320) 의 온도를 조절하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 열 제어 서브시스템 (306) 은 펠티어 열전기 디바이스 (미도시) 및 냉각 유닛 (미도시) 을 포함할 수 있다. 펠티어 열전기 디바이스는 미세유체 디바이스 (320) 의 적어도 하나의 표면과 인터페이스하도록 구성된 제 1 표면을 가질 수 있다. 냉각 유닛은, 예를 들어 냉각 블록 (미도시), 예컨대 수냉식 (liquid-cooled) 알루미늄 블록일 수 있다. 펠티어 열전기 디바이스의 제 2 표면 (예를 들어, 제 1 표면의 반대 표면) 은 이러한 냉각 블록의 표면과 인터페이스하도록 구성될 수 있다. 냉각 블록은 냉각 블록을 통해 냉각된 유체를 순환시키도록 구성된 유체 경로 (314) 에 접속될 수 있다. 도 3a 에 예시된 실시형태에서, 지지 구조 (300) 는 인렛 (316) 및 아웃렛 (318) 를 포함하여, 외부 저장소 (미도시) 로부터 냉각된 유체를 수신하고, 냉각된 유체를 유체 경로 (314) 안으로 그리고 냉각 블록을 통해 도입하며, 그 후 냉각된 유체를 외부 저장소로 리턴한다. 일부 실시형태들에서, 펠티어 열전기 디바이스, 냉각 유닛, 및/또는 유체 경로 (314) 는 지지 구조 (300) 의 케이싱 (312) 상에 장착될 수 있다. 일부 실시형태들에서, 열 제어 서브시스템 (306) 은 미세유체 디바이스 (320) 에 대한 목표 온도를 달성하도록 펠티어 열전기 디바이스의 온도를 조절하도록 구성된다. 펠티어 열전기 디바이스의 온도 조절은, 예를 들어 Pololu™ 열전기 전력 공급기 (Pololu Robotics and Electronics Corp.) 와 같은 열전기 전력 공급기에 의해 달성될 수 있다. 열 제어 서브시스템 (306) 은 아날로그 회로에 의해 제공된 온도 값과 같은 피드백 회로를 포함할 수 있다. 대안으로, 피드백 회로는 디지털 회로에 의해 제공될 수 있다.
일부 실시형태들에서, 네스트 (300) 는 (예를 들어, 저항 1 kOhm+/-0.1 %, 온도 계수 +/-0.02 ppm/CO 를 갖는) 저항기 및 (예를 들어, 공칭 저항 1 kOhm+/-0.01 % 를 갖는) NTC 서미스터를 포함하는 아날로그 분압기 회로 (미도시) 인 피드백 회로를 갖는 열 제어 서브시스템 (306) 을 포함할 수 있다. 일부 경우들에서, 열 제어 서브시스템 (306) 은 피드백 회로로부터의 전압을 측정하고, 그 후 온-보드 PID 제어 루프 알고리즘에 대한 입력으로서 계산된 온도 값을 사용한다. PID 제어 루프 알고리즘으로부터의 출력은, 예를 들어 Pololu™ 모터 드라이브 (미도시) 상에서 방향성 및 펄스-폭-변조 신호 핀 양자 모두를 구동하여 열전기 전력 공급기를 작동시키고, 이에 의해 펠티어 열전기 디바이스를 제어할 수 있다.
네스트 (300) 는, 제어기 (308) 의 마이크로프로세서가 인터페이스 (310) (미도시) 를 통해 외부 마스터 제어기 (154) 와 통신하는 것을 허용하는 직렬 포트 (324) 를 포함할 수 있다. 또한, 제어기 (308) 의 마이크로프로세서는 전기적 신호 생성 서브시스템 (304) 및 열 제어 서브시스템 (306) 과 (예를 들어, Plink 툴 (미도시) 을 통해) 통신할 수 있다. 따라서, 제어기 (308), 인터페이스 (310), 및 직렬 포트 (324) 의 조합을 통해, 전기적 신호 생성 서브시스템 (304) 및 열 제어 서브시스템 (306) 은 외부 마스터 제어기 (154) 와 통신할 수 있다. 이 방식으로, 마스터 제어기 (154) 는, 다른 것들 중에서, 출력 전압 조정들을 위한 스케일링 계산들을 수행함으로써 전기적 신호 생성 서브시스템 (308) 을 도울 수 있다. 외부 마스터 제어기 (154) 에 커플링된 디스플레이 디바이스 (170) 를 통해 제공된, 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI)(미도시) 는 열 제어 서브시스템 (306) 및 전기적 신호 생성 서브시스템 (304) 각각으로부터 획득된 온도 및 파형 데이터를 플롯 (p10t) 하도록 구성될 수 있다. 대안으로, 또는 추가적으로, GUI 는 제어기 (308), 열 제어 서브시스템 (306), 및 전기적 신호 생성 서브시스템 (304) 에 대한 업데이트들을 허용할 수 있다.
위에서 논의된 바와 같이, 시스템 (150) 은 이미징 디바이스 (194) 를 포함할 수 있다. 일부 실시형태들에서, 이미징 디바이스 (194) 는 광 조절 서브시스템 (330) (도 3b 참조) 을 포함한다. 광 조절 서브시스템 (330) 은 디지털 미러 디바이스 (DMD) 또는 마이크로셔터 어레이 시스템 (MSA) 을 포함할 수 있고, 이들 중 어느 하나는 광원 (332) 으로부터 광을 수신하고 수신된 광의 서브세트를 현미경 (450) 의 광학 트레인으로 송신하도록 구성될 수 있다. 대안으로, 광 조절 서브시스템 (330) 은 그 자신의 광을 생성하고 (따라서 광원 (332) 에 대한 필요성을 없애는) 디바이스, 예컨대 유기 발광 다이오드 디스플레이 (OLED), 액정 온 실리콘 (LCOS) 디바이스, 강유전성 액정 온 실리콘 디바이스 (FLCOS), 또는 투과형 액정 디스플레이 (LCD) 를 포함할 수 있다. 광 조절 서브시스템 (330) 은, 예를 들어 프로젝터일 수 있다. 따라서, 광 조절 서브시스템 (330) 은 구조화된 및 구조화되지 않은 광 양자 모두를 방출할 수 있다. 소정의 실시형태들에서, 시스템 (150) 의 이미징 모듈 (164) 및/또는 동기 모듈 (162) 은 광 조절 서브시스템 (330) 을 제어할 수 있다.
소정의 실시형태들에서, 이미징 디바이스 (194) 는 현미경 (350) 을 더 포함한다. 이러한 실시형태들에서, 네스트 (300) 및 광 조절 서브시스템 (330) 은 현미경 (350) 상에 장착되도록 개별적으로 구성될 수 있다. 현미경 (350) 은, 예를 들어 표준 연구-등급 광 현미경 또는 형광 현미경일 수 있다. 따라서, 네스트 (300) 는 현미경 (350) 의 스테이지 (344) 상에 장착되도록 구성될 수도 있고/있거나 광 조절 서브시스템 (330) 은 현미경 (350) 의 부분 상에 장착하도록 구성될 수 있다. 다른 실시형태들에서, 본원에 설명된 네스트 (300) 및 광 조절 서브시스템 (330) 은 현미경 (350) 의 일체형 컴포넌트들일 수 있다.
소정의 실시형태들에서, 현미경 (450) 은 하나 이상의 검출기들 (348) 을 더 포함할 수 있다. 일부 실시형태들에서, 검출기 (348) 는 이미징 모듈 (164) 에 의해 제어된다. 검출기 (348) 는 아이 피스 (eye piece), 전하-결합 디바이스 (CCD), 카메라 (예를 들어, 디지털 카메라), 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 적어도 2 개의 검출기들 (348) 이 존재하면, 하나의 검출기는 예를 들어, 고속-프레임율 (fast-frame-rate) 카메라일 수 있는 한편, 다른 검출기는 고 감도 카메라일 수 있다. 또한, 현미경 (350) 은 미세유체 디바이스 (320) 로부터 반사 및/또는 방출된 광을 수신하고, 반사 및/또는 방출된 광의 적어도 일부분을 하나 이상의 검출기들 (348) 상에 포커싱하도록 구성된 광학 트레인을 포함할 수 있다. 현미경의 광학 트레인은 또한, 각각의 검출기 상의 최종 배율이 상이할 수 있도록, 상이한 검출기들에 대한 상이한 튜브 렌즈들 (미도시) 을 포함할 수 있다.
소정 실시형태들에서, 이미징 디바이스 (194) 는 적어도 2 개의 광원들을 사용하도록 구성된다. 예를 들어, 제 1 광원 (332) 은 (예를 들어, 광 조절 서브시스템 (330) 을 통해) 구조화된 광을 생성하도록 사용될 수 있고, 제 2 광원 (334) 은 비구조화된 광을 제공하도록 사용될 수 있다. 제 1 광원 (332) 은 광학적으로-작동된 전기역학 및/또는 형광성 여기를 위해 구조화된 광을 생성할 수 있고, 제 2 광원 (334) 은 밝은 필드 조명을 제공하도록 사용될 수 있다. 이들 실시형태들에서, 동기 모듈 (164) 은 제 1 광원 (332) 을 제어하도록 사용될 수 있고, 이미징 모듈 (164) 은 제 2 광원 (334) 을 제어하도록 사용될 수 있다. 현미경 (350) 의 광학 트레인은 (1) 디바이스가 네스트 (300) 에 의해 홀딩되는 경우, 광 조절 서브시스템 (330) 으로부터 구조화된 광을 수신하고, 이 구조화된 광을 광학적으로-작동된 전기역학 디바이스와 같은 미세유체 디바이스에서의 적어도 제 1 영역에 포커싱하고, (2) 미세유체 디바이스로부터 반사 및/또는 방출된 광을 수신하고 이러한 반사 및/또는 방출된 광의 적어도 일부를 검출기 (348) 로 포커싱하도록 구성될 수 있다. 광학 트레인은 또한, 디바이스가 네스트 (300) 에 의해 홀딩되는 경우, 제 2 광원으로부터 비구조화된 광을 수신하고, 이 비구조화된 광을 미세유체 디바이스의 적어도 제 2 영역 상에 포커싱하도록 구성될 수 있다. 소정 실시형태들에서, 미세유체 디바이스의 제 1 및 제 2 영역들은 오버랩하는 영역들일 수 있다. 예를 들어, 제 1 영역은 제 2 영역의 서브세트일 수 있다. 다른 실시형태들에서, 제 2 광원 (334) 은 대안적으로 또는 추가로 광의 임의의 적합한 파장을 가질 수도 있는 레이저를 포함할 수도 있다. 도 3b 에 도시된 광학 시스템의 표현은 단지 개략적 표현이고, 그 광학 시스템은 추가적인 필터들, 노치 필터들, 렌즈들 등을 포함할 수도 있다. 제 2 광원 (334) 이 브라잇필드 (brightfield) 및/또는 형광 여기를 위해 하나 이상의 광원(들), 뿐아니라 레이저 조명을 포함하는 경우, 광원(들) 의 물리적 배열은 도 3b 에 도시된 것으로부터 변화할 수도 있고, 레이저 조명이 광학 시스템 내의 임의의 적합한 물리적 로케이션에 도입될 수도 있다. 광원 (432) 및 광원 (402)/광 조절 서브시스템 (404) 의 개략적인 로케이션들은 마찬가지로 교환될 수도 있다.
도 3b 에서, 제 1 광원 (332) 은, 시스템 (355)(미도시) 의 현미경 (350) 의 광학 트레인에 구조화된 광을 제공하는, 광 조절 서브시스템 (330) 에 광을 공급하는 것으로 도시된다. 제 2 광원 (334) 은 비구조화된 광을 빔 스플리터 (336) 를 통해 광학 트레인에 제공하는 것으로 도시된다. 광 조절 서브시스템 (330) 으로부터의 구조화된 광 및 제 2 광원 (334) 으로부터의 비구조화된 광은 빔 스플리터 (336) 로부터 광학 트레인을 통해 함께 이동하여 제 2 빔 스플리터 (또는 광 조절 서브시스템 (330) 에 의해 제공된 광에 따라, 이색성 필터 (338)) 에 도달하며, 여기서 광은 대물렌즈 (336) 를 통해 샘플 평면 (342) 으로 아래로 반사된다. 샘플 평면 (342) 으로부터 반사 및/또는 방출된 광은 그 후, 대물렌즈 (340) 를 통해, 빔 스플리터 및/또는 이색성 필터 (338) 를 통해, 이색성 필터 (346) 로 위로 다시 이동한다. 이색성 필터 (346) 에 도달하는 광의 일부 만이 통과하여 검출기 (348) 에 도달한다.
일부 실시형태들에서, 제 2 광원 (334) 은 블루 광을 방출한다. 적합한 이색성 필터 (346) 로, 샘플 평면 (342) 으로부터 반사된 블루 광은 이색성 필터 (346) 를 통과하고 검출기 (348) 에 도달할 수 있다. 반대로, 광 조절 서브시스템 (330) 으로부터 오는 구조화된 광은 샘플 평면 (342) 으로부터 반사되지만, 이색성 필터 (346) 를 통과하지 않는다. 이 예에서, 이색성 필터 (346) 는 495 nm 보다 긴 파장을 갖는 가시 광을 필터링한다. 광 조절 서브시스템 (330) 으로부터의 광의 이러한 필터링은 단지, 광 조절 서브시스템으로부터 방출된 광이 495 nm 보다 짧은 임의의 파장을 포함하지 않는다면 (도시된 바와 같이) 완료될 것이다. 실제로, 광 조절 서브시스템 (330) 으로부터 오는 광이 495 nm 보다 짧은 파장들 (예를 들어, 블루 파장들) 을 포함하면, 광 조절 서브시스템으로부터의 광의 일부는 필터 (346) 를 통과하여 검출기 (348) 에 도달한다. 이러한 실시형태에서, 필터 (346) 는 제 1 광원 (332) 및 제 2 광원 (334) 으로부터 검출기 (348) 에 도달하는 광의 양 간의 균형을 변화시키도록 작용한다. 이것은, 제 1 광원 (332) 이 제 2 광원 (334) 보다 상당히 더 강한 경우 유리할 수 있다. 다른 실시형태들에서, 제 2 광원 (334) 은 레드 광을 방출할 수 있고, 이색성 필터 (346) 는 레드 광 외의 가시 광 (예를 들어, 650 nm 보다 짧은 파장을 갖는 가시 광) 을 필터링할 수 있다.
코팅 용액들 및 코팅제들. 이론에 의헤 제한되도록 의도하지 않고, 미세유체 디바이스 (예를 들어, DEP-구성된 및/또는 EW-구성된 미세유체 디바이스) 내에서의 생물학적 마이크로-객체 (예를 들어, 생물학적 세포) 의 유지보수는, 미세유체 디바이스와 그 안에 유지되는 생물학적 마이크로-객체(들) 사이의 일차 인터페이스를 제공하는 생체 분자 및/또는 친수성 분자의 층을 제공하도록 미세유체 디바이스의 적어도 하나 이상의 내부 표면들이 컨디셔닝 또는 코팅된 경우, 용이하게 될 수도 있다 (즉, 생물학적 마이크로-객체는 미세유체 디바이스 내에서 증가된 생존 능력, 더 큰 증식 및/또는 더 큰 운반가능성을 나타낸다). 일부 실시형태들에서, 미세유체 디바이스의 내부 표면들 중 하나 이상 (예를 들어, DEP-구성된 미세유체 디바이스의 전극 활성화 기판의 내부표면, 미세유체 디바이스의 커버, 및/또는 회로 재료의 표면들) 은 생체 분자 및/또는 친수성 분자들의 원하는 층을 생성하기 우해 코팅 용액 및/또는 코팅제에 의해 처리 또는 개질될 수도 있다.
코팅은 생물학적 마이크로-객체(들) 의 도입 전 또는 후에 도포될 수도 있거나, 생물학적 마이크로-객체(들) 과 동시에 도입될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 생물학적 마이크로-객체(들) 은 하나 이상의 코팅제들을 포함하는 유체 매질에서 미세유체 디바이스 내로 들여와 질 수도 있다. 다른 실시형태들에서, 미세유체 디바이스 (예를 들어, DEP-구성된 미세유체 디바이스) 의 내부 표면(들) 은 미세유체 디바이스 내로 생물학적 마이크로-객체(들) 의 도입 이전에 코팅제를 포함하는 코팅 용액으로 처리 또는 "프라이밍" 된다.
일부 실시형태들에서, 미세유체 디바이스의 적어도 하나의 표면은 생물학적 마이크로-객체(들) 의 유지 및/또는 증식에 적합한 생체 분자 및/또는 친수성 분자들의 층을 제공하는 (예를 들어, 이하에 기술된 바와 같이 컨디셔닝된 표면을 제공하는) 코팅 재료를 포함한다. 일부 실시형태들에서, 미세유체 디바이스의 실질적으로 모든 내부 표면들은 코팅 재료를 포함한다. 코팅된 내부 표면(들) 은 흐름 경로 (예를 들어, 채널), 챔버, 또는 격리 펜, 또는 이들의 조합의 표면을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 복수의 격리 펜들 각각은 코팅 재료들로 코팅된 적어도 하나의 내부 표면을 갖는다. 다른 실시형태들에서, 복수의 흐름 경로들 또는 채널들 각각은 코팅 재료들로 코팅된 적어도 하나의 내부 표면을 갖는다. 일부 실시형태들에서, 복수의 격리 펜들 각각 및 복수의 채널들 각각의 적어도 하나의 내부 표면은 코팅 재료들로 코팅된다.
코팅제/용액. 혈청 또는 혈청 인자들, 소 혈청 알부민 (BSA), 폴리머들, 계면활성제들, 효소들, 및 이들의 임의의 조합을 포함하지만 이들에 제한되지 않는 임의의 편리한 코팅제/코팅 용액이 사용될 수 있다.
폴리머-기반 코팅 재료들. 적어도 하나의 내부 표면은 폴리머를 포함하는 코팅 재료를 포함할 수도 있다. 폴리머는 적어도 하나의 표면에 공유결합 또는 비공유결합될 수도 있다 (또는 비특정적으로 부착될 수도 있다). 폴리머는 예를 들어 블록 폴리머들 (및 코폴리머들), 성형 폴리머들 (성형 코폴리머들), 및 그래프트 또는 빗살모양 폴리머들 (그래프트 코폴리머들) 에서 발견되는 다양한 구조성 모티프들을 가질 수도 있으며, 이들 모두는 여기에 개시된 방법들에 적합할 수도 있다.
폴리머는 알킬렌 에테르 모이어티들을 포함하는 폴리머를 포함할 수도 있다. 매우 다양한 알킬렌 에테르 함유 폴리머들이 여기에 기술된 미세유체 디바이스들에서의 사용을 위해 적합할 수도 있다. 알킬렌 에테르 함유 폴리머들의 하나의 비제한적인 예시의 클래스는 폴리머 사술 내에 상이한 비율들로 및 상이한 위치들에서 폴리에틸렌 옥사이드 (PEO) 및 폴리프로필렌 옥사이드 (PPO) 서브유닛들의 블록들을 포함하는 양쪽 친매성 비이온 블록 코폴리머들이다. Pluronic® 폴리머들 (BASF) 은 이러한 타입의 블록 코폴리머들이고, 살아있는 세포들과 접촉할 때 사용하기에 적합한 것으로 본 기술에서 알려져 있다. 폴리머들은 평균 분자 질량 (MW) 에서 약 2000Da 로부터 약 20KDa 까지의 범위에 있을 수도 있다. 일부 실시형태들에서, PEO-PPO 블록 코폴리머는 약 10 (예를 들어, 12-18) 보다 큰 친수성-친유성 밸런스 (HLB) 를 가질 수 있다. 코팅된 표면을 산출하기 위해 유용한 특정의 Pluronic® 폴리머들은 Pluronic® L44, L64, P85, 및 F127 (F127NF 를 포함) 을 포함한다. 알킬렌 에테르 함유 폴리머들의 다른 클래스는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG MW < 100,000Da) 또는 대안적으로 폴리에티렌 옥사이드 (PEO, MW > 100,000) 이다. 일부 실시형태들에서, PEG 는 약 1000Da, 5000Da, 10,000Da 또는 20,000Da 의 MW 를 가질 수도 있다.
다른 실시형태들에서, 코팅 재료는 카르복실릭 애시드 모이어티들을 포함하는 폴리머를 포함할 수도 있다. 카르복실릭 애시드 서브유닛은 알킬, 알케닐 또는 방향족 모이어티 포함 서브유닛일 수도 있다. 하나의 비제한적인 예는 폴리락틱 애시드 (PLA) 이다. 다른 실시형태들에서, 코팅 재료는 폴리머 백본의 말단 또는 폴리머의 백본으로부터의 펜던트 (pendant) 에서 포스페이트 모이어티들을 포함하는 폴리머를 포함할 수도 있다. 또 다른 실시형태들에서, 코팅 재료는 술포닉 애시드 모이어티들을 포함하는 폴리머를 포함할 수도 있다. 술포닉 애시드 서브유닛은 알킬, 알케닐 또는 방향족 모이어티 포함 서브유닛일 수도 있다. 하나의 비제한적인 예는 폴리스티렌 술포닉 애시드 (PSSA) 또는 폴리아네톨 술포닉 애시드이다. 추가의 실시형태들에서, 코팅 재료는 아민 모이어티들을 포함하는 폴리머를 포함할 수도 있다. 폴리아미노 폴리머는 천연 폴리아민 폴리머 또는 합성 폴리아민 폴리머를 포함할 수도 있다. 천연 폴리아민들의 예들은 스페르민, 스페르미딘, 및 푸트레신을 포함한다.
다른 실시형태들에서, 코팅 재료는 당류 모이어티들을 포함하는 폴리머를 포함할 수도 있다. 비제한적인 예에서, 크산탄 검 또는 덱스트란과 같은 다당류들은 미세유체 디바이스에서 세포 스티킹 (sticking) 을 감소시키거나 방지할 수 있는 재료를 형성하는데 적합할 수도 있다. 예를 들어, 약 3kDa 의 사이즈를 갖는 덱스트란 폴리머는 미세유체 디바이스 내의 표면을 위한 코팅 재료를 제공하기 위해 사용될 수도 있다.
다른 실시형태들에서, 코팅 재료는 뉴클레오티드 모이어티들을 포함하는 폴리머, 즉 핵산을 포함할 수도 있으며, 이것은 리보뉴클레오티드 모이어티들 또는 데옥시리보뉴클레오티드 모이어티들을 가져서 고분자전해질 표면을 제공할 수도 있다. 핵산은 천연 뉴클레오티드 모이어티들만을 포함할 수도 있거나 제한 없이 7-디아자아데닌, 펜토오스, 메틸 포스포네이트 또는 포스포로티오에이트 모이어티들과 같은 핵염기, 리보오스 또는 포스페이트 모이어티 유사체들을 포함하는 비천연 뉴클레오티브 모이어티들을 포함할 수도 있다.
또 다른 실시형태들에서, 코팅 재료는 아미노 애시드 모이어티들을 포함하는 폴리머를 포함할 수도 있다. 아미노 애시드 모이어티들을 포함하는 폴리머는 천연 아미노 액시드 포함 폴리머 또는 비천연 아미노 액시드 포함 폴리머를 포함할 수도 있으며, 이들 중 어느 것은 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 포함할 수도 있다. 하나의 비제한적인 예에서, 단백질은 코팅제들로서 알부민 및/또는 하나 이상의 다른 유사한 단백질들을 포함하는 소 혈청 알부민 (BSA) 및/또는 혈청 (또는 다수의 상이한 형청들의 조합) 일 수도 있다. 혈청은 신생 우아 혈청, 양 혈청, 염소 혈청, 말 혈청 등을 포함하지만 이들에 제한되지 않는 임의의 편리한 소스로부터일 수 있다. 소정의 실시형태들에서, 코팅 용액 내의 BSA 는 5 mg/mL, 10 mg/mL, 20 mg/mL, 30 mg/mL, 40 mg/mL, 50 mg/mL, 60 mg/mL, 70 mg/mL, 80 mg/mL, 90 mg/mL, 또는 그 이상 또는 이들 사이의 임의의 값을 포함하는 약 1 mg/mL 로부터 약 100 mg/mL 까지의 범위에서 존재한다. 소정의 실시형태들에서, 코팅 용액 내의 혈청은 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 그 이상 또는 이들 사이의 임의의 값을 포함하는 약 20% (v/v) 로부터 약 50% v/v 까지의 범위에서 존재할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, BSA 는 5 mg/mL 로 코팅 용액 내에서 코팅제로서 존재할 수도 있지만, 다른 실시형태들에서, BSA 는 70 mg/mL 로 코팅 용액 내에서 코팅제로서 존재할 수도 있다. 소정의 실시형태들에서, 혈청은 30% 로 코팅 용액 내에서 코팅제로서 존재한다. 일부 실시형태들에서, 세포외 기질 (ECM) 단백질은 세포 성장을 조성하기 위해 최적화된 세포 부착을 위해 코팅 재료 내에 제공될 수도 있다. 코팅 재료에 포함될 수도 있는 세포 기질 단백질은 콜라겐, 엘라스틴, RGD-함유 펩티드 (예를 들어, 피브로넥틴), 또는 라미닌을 포함할 수 있지만, 이들에 제한되지 않는다. 또 다른 실시형태들에서, 성장 인자들, 사이토킨들, 호르몬들 또는 다른 세포 시그널링 종이 미세유체 디바이스의 코팅 재료 내에 제공될 수도 있다.
일부 실시형태들에서, 코팅 재료는 알킬렌 옥사이드 모이어티들, 카르복실릭 애시드 모이어티들, 술포닉 애시드 모이어티들, 포스페이트 모이어티들, 당류 모이어티들, 뉴클레오티드 모이어티들, 또는 아미노 애시드 모이어티들 중 2 이상을 함유하는 폴리머를 포함할 수도 있다. 다른 실시형태들에서, 폴리머 컨디셔닝된 표면은 각각 알킬렌 옥사이드 모이어티들, 카르복실릭 애시드 모이어티들, 술포닉 애시드 모이어티들, 포스페이트 모이어티들, 당류 모이어티들, 뉴클레오티드 모이어티들, 및/또는 아미노 애시드 모이어티들을 갖는 2 이상의 폴리머의 혼합물을 포함할 수도 있으며, 그것은 코팅 재료 내로 독립적으로 또는 동시에 통합될 수도 있다.
공유결합으로 연결된 코팅 재료들. 일부 실시형태들에서, 적어도 하나의 내부 표면은 미세유체 디바이스 내에서 생물학적 마이크로-객체(들) 의 유지보수/증식을 위해 적합한 생체 분자 및/또는 친수성 분자의 층을 제공하는 공유결합으로 연결된 분자들을 포함하여, 그러한 세포들에 대한 컨디셔닝된 표면을 제공한다.
공유결합으로 연결된 분자들은 연결기를 포함하며, 여기서 연결기는 이하에 기술된 바와 같이 미세유체 디바이스의 하나 이상의 표면들에 공유결합으로 연결된다. 연결기는 또한 생물학적 마이크로-객체(들) 의 유지보수/증식을 위해 적합한 생체 분자 및/또는 친수성 분자의 층을 제공하도록 구성된 모이어티에 공유결합으로 연결된다.
일부 실시형태들에서, 생물학적 마이크로-객체(들) 의 유지보수/증식을 위해 적합한 생체 분자 및/또는 친수성 분자의 층을 제공하도록 구성된 공유결합으로 연결된 모이어티는 알킬 또는 플루오로알킬 (퍼플루오로알킬을 포함함) 모이어티들; (덱스트란을 포함할 수도 있지만 이것에 제한되지 않는) 단당류 또는 다당류; (프로파르길 알콜을 포함하지만 이것에 제한되지 않는) 알콜류; 폴리비닐 알콜을 포함하지만 이것에 제한되지 않는 폴리알콜류; 폴리에틸렌 글리콜을 포함하지만 이것에 제한되지 않는 알킬렌 에테르류; (폴리아크릴릭 애시드 또는 폴리비닐 포스포닉 애시드를 포함하지만 이것에 제한되지 않는) 고분자 전해질류; 아미노기들 (알킬레이티드 아민류, 히드록시알킬레이티드 아미노기, 구아니디늄과 같은, 그러나 이들에 제한되지 않는 그것의 유도체들, 및 모르폴리닐 또는 피페라지닐과 같은, 그러나 이들에 제한되지 않는 비방향화된 질소 고리 원자를 함유하는 헤테로실릭 기들을 포함); (카르복실레이트 음이온성 표면을 제공할 수도 있는) 프로피올릭 애시드를 포함하지만 이것에 제한되지 않는 카르복실릭 애시드류; (포스포네이트 음이온성 표면을 제공할 수도 있는) 에티닐 포스포닉 애시드를 포함하지만 이것에 제한되지 않는 포스포닉 애시드류; 술포네이트 음이온들; 카르복시베타인류; 술포베타인류; 술파믹 애시드류; 또는 아미노 애시드류를 포함할 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 미세유체 디바이스 내의 생물학적 마이크로-객체(들) 의 유지보수/증식을 위해 적합한 생체 분자 및/또는 친수성 분자의 층을 제공하도록 구성된 공유결합으로 연결된 모이어티는 알킬 모이어티와 같은 비-폴리머 모이어티들, (퍼플루오로알킬 모이어티를 포함하지만 이에 제한되지 않는) 플루오로알킬 모이어티와 같은 치환된 알킬 모이어티, 아미노 애시드 모이어티, 알콜 모이어티, 아미노 모이어티, 카르복실릭 애시드 모이어티, 포스포닉 애시드 모이어티, 술포닉 애시드 모이어티, 술파믹 애시드 모이어티, 또는 당류 모이어티를 포함할 수도 있다. 대안적으로, 공유결합으로 연결된 모이어티는 상술된 모이어티들 중 임의의 것일 수도 있는 폴리머 모이어티들을 포함할 수도 있다.
일부 실시형태들에서, 공유결합으로 연결된 알킬 모이어티는 선형 체인 (예를 들어, 적어도 10 개의 탄소들, 또는 적어도 14, 16, 18, 20, 22 개, 또는 그 이상의 탄소들의 선형 체인) 을 형성하는 탄소 원자들을 포함할 수도 있고, 비분기형 알킬 모이어티일 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 알킬 기는 치환된 알킬 기 (예를 들어, 알킬 기에서의 탄소들의 일부는 플루오르화 또는 퍼플루오르화될 수 있음) 를 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 알킬 기는 비-치환된 알킬 기를 포함할 수도 있는 제 2 분절 (segment) 에 결합된, 퍼플루오로알킬 기를 포함할 수도 있는 제 1 분절을 포함할 수도 있고, 여기서 제 1 및 제 2 분절들은 직접적으로 또는 (예를 들어, 에테르 결합에 의해) 간접적으로 결합될 수도 있다. 알킬 기의 제 1 분절은 연결 기에서 멀리 위치될 수도 있고, 알킬 기의 제 2 분절은 연결기에 근접하여 위치될 수도 있다.
다른 실시형태들에서, 공유결합으로 연결된 모이어티는 2 이상의 타입의 아미노 애시드를 포함할 수도 있는 적어도 하나의 아미노 애시드를 포함할 수도 있다. 따라서, 공유결합으로 연결된 모이어티는 펩티드 또는 단백질을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 공유결합으로 연결된 모이어티는 세포 성장, 생존 능력, 운반가능성, 또는 이들의 임의의 조합을 지원하기 위해 양쪽성 이온 표면을 제공할 수도 있는 아미노 애시드를 포함할 수도 있다.
다른 실시형태들에서, 공유결합으로 연결된 모이어티는 적어도 하나의 알킬렌 옥사이드 모이어티를 포함할 수도 있고, 상술된 바와 같은 임의의 알킬렌 옥사이드 폴리머를 포함할 수도 있다. 알킬렌 에테르 함유 폴리머들의 하나의 유용한 클래스는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG MW < 100,000Da) 또는 대안적으로 폴리에틸렌 옥사이드 (PEO, MW > 100,000) 이다. 일부 실시형태들에서, PEG 는 약 1000Da, 5000Da, 10,000Da 또는 20,000Da 의 MW 를 가질 수도 있다.
공유결합으로 연결된 모이어티는 하나 이상의 당류를 포함할 수도 있다. 공유결합으로 연결된 당류는 단당류, 이당류, 또는 다당류일 수도 있다. 공유결합으로 연결된 당류는 표면에 대한 부착을 위해 커플링 또는 정교화 (elaboration) 를 허용하는 반응성 페어링 (pairing) 모이어티를 도입하기 위해 개질될 수도 있다. 예시적인 반응성 페어링 모이어티들은 알데히드, 알킨 또는 할로 모이어티들을 포함할 수도 있다. 다당류는 랜덤한 양식으로 개질될 수도 있으며, 여기서 당류 모노머들 각각이 개질될 수도 있거나 다당류 내의 당류 모노머들의 일부만이 표면에 직접 또는 간접으로 커플링될 수도 있는 반응성 페어링 모이어티를 제공하기 위해 개질된다. 하나의 예는 비분기형 연결자를 통해 표면에 간접적으로 커플링될 수도 있는 덱스트란 다당류를 포함할 수도 있다.
공유결합으로 연결된 모이어티는 하나 이상의 아미노기들을 포함할 수도 있다. 아미노기는 치환된 아민 모이어티, 구아니딘 모이어티, 질소 함유 헤테로시클릭 모이어티 또는 헤테로아릴 모이어티일 수도 있다. 아미노 함유 모이어티들은 미세유체 디바이스 내의, 및 선택적으로 격리 펜들 및/또는 흐름 경로들 (예를 들어, 채널들) 내의 환경의 pH 변경을 허용하는 구조들을 가질 수도 있다.
컨디셔닝된 표면을 제공하는 코팅 재료는 단지 한 종류의 공유결합으로 연결된 모이어티를 포함할 수도 있거나 2 이상의 상이한 종류의 공유결합으로 연결된 모이어티를 포함할 수도 있다. 예를 들어, (퍼플루오로알킬을 포함하는) 플루오로알킬 컨디셔닝된 표면들은 모두 동일한, 예를 들어, 표면에 대한 동일한 연결기 및 공유결합 부착, 동일한 전체 길이, 및 플루오로알킬 모이어티를 포함하는 동일한 수의 플루오로메틸렌 유닛들을 갖는 복수의 공유결합으로 연결된 모이어티들을 가질 수도 있다. 대안적으로, 코팅 재료는 표면에 부착된 2 이상의 종류의 공유결합으로 연결된 모이어티를 가질 수도 있다. 예를 들어, 코팅 재료는 특정의 수의 메틸렌 또는 플루오로메틸렌 유닛들을 가지는 공유결합으로 연결된 알킬 또는 플루오로알킬 모이어티들을 갖는 분자들을 포함할 수도 있고, 더 큰 수의 메틸렌 또는 플루오로메틸렌 유닛들을 갖는 알킬 또는 플루오로알킬 사슬에 공유결합으로 부착된 대전된 모이어티들을 갖는 분자들의 추가의 세트를 더 포함할 수도 있으며, 이것은 코팅된 표면에서 더 덩치가 큰 (bulkier) 모이어티들을 제공하는 용량을 제공할 수도 있다. 이러한 예에서, 상이한, 덜 입체구조로 요구하는 말단들 및 더 적은 백본 원자들을 갖는 분자들의 제 1 세트는 전체 기판 표면을 기능화하고, 이것에 의해 기판 자체를 구성하는 실리콘/실리콘 옥사이드, 하프늄 옥사이드 또는 알루미나와의 원하지 않는 부착 또는 접촉을 방지하는 것을 도울 수 있다. 다른 예에서, 공유결합으로 연결된 모이어티들은 표면상에서 랜덤한 양식으로 교번하는 전하들을 제시하는 양쪽성 이온 표면을 제공할 수도 있다.
컨디셔닝된 표면 특성들. 컨디셔닝된 표면의 조성은 별문제로 하고, 소수성 재료의 물리적 두께와 같은 다른 인자들은 DEP 힘에 영향을 줄 수 있다. 컨디셔닝된 표면이 기판상에 형성되는 방식 (예를 들어, 기상증착, 액상 증착, 스핀 코팅, 플러딩, 및 정전 코팅) 과 같은 여러 인자들이 컨디셔닝된 표면의 물리적 두께를 변경할 수 있다. 일부 실시형태들에서, 컨디셔닝된 표면은 약 1 nm 내지 약 10 nm; 약 1 nm 내지 약 7 nm; 약 1 nm 내지 약 5 nm 의 범위의 또는 이들 사이의 임의의 개개의 값의 두께를 갖는다. 다른 실시형태들에서, 공유결합으로 연결된 모이어티들에 의해 형성된 컨디셔닝된 표면은 약 10 nm 내지 약 50 nm 의 두께를 가질 수도 있다. 여러 실시형태들에서, 여기에 기술된 바와 같이 준비된 컨디셔닝된 표면은 10 nm 미만의 두께를 갖는다. 일부 실시형태들에서, 컨디셔닝된 표면의 공유결합으로 연결된 모이어티들은 미세유체 디바이스의 표면 (예를 들어, DEP 구성 기판 표면) 에 공유결합으로 연결될 때 단분자층을 형성할 수도 있고, 10 nm 미만 (예를 들어, 5 nm 미만, 또는 약 1.5 내지 3.0 nm) 의 두께를 가질 수도 있다. 이들 값들은 통상적으로 약 30 nm 의 범위에서의 두께를 가질 수도 있는, 예를 들어, 스핀 코팅에 의해 준비된 표면의 값과 대조적이다. 일부 실시형태들에서, 컨디셔닝된 표면은 완벽하게 형성된 단분자층이 DEP 구성 미세유체 디바이스 내에서의 동작을 위해 적합하게 기능적이도록 요구하지 않는다.
여러 실시형태들에서, 미세유체 디바이스의 컨디셔닝된 표면을 제공하는 코팅 재료는 바람직한 전기적 특성들을 제공할 수도 있다. 이론에 의해 제한되도록 의도하지 않고, 특정의 코팅 재료로 코팅된 표면의 강건성에 영향을 주는 하나의 인자는 본질적 (intrinsic) 전하 트랩핑이다. 상이한 코팅 재료들이 전자들을 트랩할 수도 있고, 이것은 코팅 재료의 고장을 야기할 수 있다. 코팅 재료에서의 결함들은 전하 트랩핑을 증가시킬 수도 있고 코팅 재료의 추가의 고장을 야기할 수도 있다. 유사하게, 상이한 코팅 재료들은 전하 트랩핑에 영향을 줄 수도 있는 상이한 절연 내력들 (즉, 절연 파괴를 야기하는 최소 인가 전계) 을 갖는다. 소정의 실시형태들에서, 코팅 재료는 전하 트랩핑의 양을 감소시키거나 제한하는 전체 구조 (예를 들어, 빽빽히 채워진 단분자층 구조) 를 가질 수 있다.
그것의 전기적 특성들에 더하여, 컨디셔닝된 표면은 또한 생물학적 분자들과 함께 사용하는데 유익한 특성들을 가질 수도 있다. 예를 들어, 플루오리네이티드 (또는 퍼플루오리네이티드) 탄소 사슬들을 함유하는 컨디셔닝된 표면은 표면 부착물의 양을 감소시킴에 있어서 알킬-말단 사슬들에 비해 이익을 제공할 수도 있다. 여기서 사용된 표면 부착물은 미세유체 디바이스의 표면상의 무분별한 재료 증착의 양을 지칭하며, 그것은 단백질 및 그것의 분해 생성물들, 핵산들 및 각각의 분해 생성물들 등과 같은 생체재료들의 영구적인 또는 반영구적인 증착을 포함할 수도 있다.
유니터리 (unitary) 또는 멀티-파트 컨디셔닝된 표면. 공유결합으로 연결된 코팅 재료는 이하에 기술되는 바와 같이, 미세유체 디바이스 내의 생물학적 마이크로-객체(들) 의 유지보수/증식에 적합한 생체 분자 및/또는 친수성 분자들의 층을 제공하도록 구성된 모이어티를 이미 함유하는 분자의 반응에 의해 형성될 수도 있다. 대안적으로, 공유결합으로 연결된 코팅 재료는 그자신이 표면에 공유결합으로 연결된 표면 개질 리간드에 생물학적 마이크로-객체(들) 의 유지보수/증식에 적합한 생체 분자 및/또는 친수성 분자의 층을 제공하도록 구성된 모이어티를 커플링함으로써 2-파트 시퀀스에서 형성될 수도 있다.
공유결합으로 연결된 코팅 재료를 준비하는 방법들. 일부 실시형태들에서, (예를 들어, 격리 펜들 및/또는 흐름 경로들의 적어도 하나의 표면을 포함하는) 미세유체 디바이스의 표면에 공유결합으로 연결되는 코팅 재료는 식 1 또는 식 2 의 구조를 갖는다. 코팅 재료가 하나의 단계에서 표면에 도입될 때, 그것은 식 1 의 구조를 갖는 반면, 코팅 재료가 다수의 단계 프로세스에서 도입되는 경우, 그것은 식 2 의 구조를 갖는다.
Figure pat00006
식 1 ,
또는,
Figure pat00007
식 2
코팅 재료는 DEP-구성 또는 EW-구성 기질의 표면의 산화물들에 공유결합으로 연결될 수도 있다. DEP- 또는 EW-구성 기질은 실리콘, 실리콘 옥사이드, 알루미나, 또는 하프늄 옥사이드를 포함할 수도 있다. 산화물들은 기질의 본래의 화학적 구조의 부분으로서 제공될 수도 있거나 이하에 논의된 바와 같이 도입될 수도 있다.
코팅 재료는 산화물들과 실록산 또는 포스포닉 애시드기의 반응으로부터 형성된 실록시 또는 포스포네이트 에스테르기일 수도 있는 연결기 ("LG") 를 통해 산화물들에 부착될 수도 있다. 미세유체 디바이스 내에서 생물학적 마이크로-객체(들) 의 유지보수/증식에 적합한 생체 분자 및/또는 친수성 분자의 층을 제공하도록 구성된 모이어티는 여기에 기술된 모이어티들 중 임의의 것일 수 있다. 연결기 (LG) 는 미세유체 디바이스 내에서 생물학적 마이크로-객체(들) 의 유지보수/증식에 적합한 생체 분자 및/또는 친수성 분자의 층을 제공하도록 구성된 모이어티에 직접 또는 간접으로 연결될 수도 있다. 연결기 (LG) 가 모이어티에 직접 연결되는 경우, 선택적 연결자 ("L") 는 존재하지 않고 n 은 0 이다. 연결기 (LG) 가 모이어티에 간접으로 연결되는 경우, 연결자 (L) 는 존재하고 n 은 1 이다. 연결자 (L) 는 선형 부분을 포함할 수도 있으며, 여기서 그 선형 부분의 백본은 본 기술에서 알려진 바와 같은 화학 결합 제한들을 받는, 규소, 탄소, 질소, 산소, 황 및 인 원자들의 임의의 조합으로부터 선택된 1 내지 200 개의 비수소 원자들을 포함할 수도 있다. 그것은 에테르, 아미노, 카르보닐, 아미도, 또는 포스포네이트 기들, 아릴렌, 헤테로아릴렌, 또는 헤테로시클릭 기들로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 모이어티들의 임의의 조합으로 차단될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 연결자 (L) 의 백본은 10 내지 20 개의 원자들을 포함할 수도 있다. 다른 실시형태들에서, 연결자 (L) 의 백본은 약 5 개의 원자들 내지 약 200 개의 원자들; 약 10 개의 원자들 내지 약 80 개의 원자들; 약 10 개의 원자들 내지 약 50 개의 원자들; 또는 약 10 개의 원자들 내지 약 40 개의 원자들을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 백본 원자들은 모두 탄소 원자들이다.
일부 실시형태들에서, 생물학적 마이크로-객체(들) 의 유지보수/증식에 적합한 생체 분자 및/또는 친수성 분자의 층을 제공하도록 구성된 모이어티는 다중-단계 프로세스에서 기질의 표면에 첨가될 수도 있고, 상술된 바와 같이 식 2 의 구조를 갖는다. 그 모이어티는 상술된 모이어티들 중 임의의 것일 수도 있다.
일부 실시형태들에서, 커플링기 (CG) 는 반응성 모이어티 (RX) 와 반응성 페어링 모이어티 (RPX) (즉, 반응성 모이어티 (RX) 와 반응하도록 구성된 모이어티) 의 반응으로부터의 결과의 기를 나타낸다. 예를 들어, 하나의 통상적인 커플링기 (CG) 는 활성화된 에스테르, 애시드 클로라이드 등과 같은 카르복실릭 애시드의 유도체와 아미노기의 반응의 결과인 카로복사미딜기를 포함할 수도 있다. 다른 CG 는 트리아졸릴렌기, 카르복사미딜, 티오아미딜, 옥심, 메르캅틸, 디술피드, 에테르, 또는 알케닐기, 또는 반응성 모이어티의 그의 각각의 반응성 페어링 모이어티와의 반응 시에 형성될 수도 있는 임의의 다른 적합한 기를 포함할 수도 있다. 커플링기 (CG) 는 상술된 바와 같은 원소들의 임의의 조합을 포함할 수도 있는 연결자 (L) 의 제 2 단부 (즉, 미세유체 디바이스 내에서 생물학적 마이크로-객체(들) 의 유지보수/증식에 적합한 생체 분자 및/또는 친수성 분자의 층을 제공하도록 구성된 모이어티에 근접한 단부) 에 위치될 수도 있다. 일부 다른 실시형태들에서, 커플링기 (CG) 는 연결자 (L) 의 백본을 차단할 수도 있다. 커플링기 (CG) 가 트리아졸릴렌인 경우, 그것은 클릭 커플링 반응으로부터 야기되는 생성물일 수도 있고 더 치환될 수도 있다 (예를 들어, 디벤조시클로옥테닐 용융 트리아졸릴렌기).
일부 실시형태들에서, 코팅 재료 (또는 표면 개질 리간드) 는 화학적 기상 증착을 사용하여 미세유체 디바이스의 내부 표면들에 증착된다. 기상 증착 프로세스는 예를 들어, 용매 배스, 음파처리, 또는 이들의 조합에 노출함으로써 커버 (110), 미세유체 회로 재료 (116), 및/또는 기질 (DEP-구성 기질의 전극 활성화 기질 (206) 의 내부 표면 (208), 또는 EW-구성 기질의 지지 구조 (104) 의 유전체층) 을 사전 세정함으로써 선택적으로 향상될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 그러한 사전 세정은 동시에 산화된 표면 (여기에 기술된 바와 같이 공유결합으로 개질될 수도 있는 표면에서의 산화물들) 을 도입하면서 여러 불순물들을 제거할 수 있는 산소 플라즈마 클리너에서 커버 (110), 미세유체 회로 재료 (116), 및/또는 기질을 처리하는 것을 포함할 수 있다. 대안적으로, 하이드로클로릭 애시드와 하이드로전 페록사이드의 혼합물 또는 설퓨릭 애시드와 하이드로전 페록사이드의 혼합물 (예를 들어, 약 3:1 내지 약 7:1 의 범위의 설퓨릭 애시드 대 하이드로전 페록사이드의 비를 가질 수도 있는 피라냐 용액) 과 같은 액상 처리들은 산소 플라즈마 클리너 대신에 사용될 수도 있다.
일부 실시형태들에서, 기상 증착은 미세유체 디바이스 (200) 가 미세유체 회로 (120) 를 정의하는 인클로저 (102) 를 형성하기 위해 조립된 후 미세유체 디바이스 (200) 의 내부 표면을 코팅하기 위해 사용된다. 이론에 의해 제한되도록 의도하지 않고, 완전히 조립된 미세유체 회로 (120) 상에 그러한 코팅 재료를 증착하는 것은 미세유체 회로 재료 (116) 와 전극 활성화 기판 (206) 유전체층 및/또는 커버 (110) 사이의 약해진 결합에 의해 야기되는 박리를 방지하는데 유익할 수도 있다. 2-단계 프로세스가 채용되는 실시형태들에서, 표면 개질 리간드는 생물학적 마이크로-객체(들) 의 유지보수/증식에 적합한 생체 분자 및/또는 친수성 분자의 층을 제공하도록 구성된 모이어티의 후속적인 도입으로, 상술된 바와 같은 기상 증착을 통해 도입될 수도 있다. 후속적인 반응은 용액 내의 적합한 커플링 시약에 표면 개질된 미세유체 디바이스를 노출시킴으로써 수행될 수도 있다. 도 2h 는 컨디셔닝된 표면을 제공하는 예시적인 공유결합으로 연결된 코팅 재료를 갖는 미세유체 디바이스 (290) 의 단면도를 도시한다. 도시된 바와 같이, (개략적으로 도시된) 코팅 재료들 (298) 은 DEP 기질일 수도 있는 베이스 (286) 의 내부 표면 (294), 및 미세유체 디바이스 (290) 의 커버 (288) 의 내부 표면 (292) 양자에 공유결합으로 결합된 빽빽하게 채워진 분자들의 단분자층을 포함할 수 있다. 코팅 재료 (298) 는 일부 실시형태들에서 그리고 상술된 바와 같이 미세유체 디바이스 (290) 내의 회로 소자들 및/또는 구조들을 정의하기 위해 사용되는 미세유체 회로 재료 (미도시) 의 표면들을 포함하는, 미세유체 디바이스 (290) 의 인클로저 (284) 에 근접하고, 그것을 향해 내부로 마주하는 실질적으로 모든 내부 표면들 (294, 292) 에 증착될 수 있다. 대안적인 실시형태들에서, 코팅 재료들 (298) 은 미세유체 디바이스 (290) 의 내부 표면들의 단지 하나 또는 일부에만 증착될 수 있다.
도 2h 에 도시된 실시형태에서, 코팅 재료 (298) 는 오르가노실록산 분자들의 단분자층을 포함할 수 있고, 각각의 분자는 실록시 연결자 (296) 를 통해 미세유체 디바이스 (290) 의 내부 표면들 (292, 294) 에 공유결합된다. 상술된 코팅 재료들 (298) 중 임의의 것이 사용될 수 있으며 (예를 들어, 알킬-말단, 플루오로알킬 말단 모이어티, PEG-말단 모이어티, 덱스트란 말단 모이어티, 또는 오르가노실록시 모이어티들에 대한 포지티브 또는 네거티브 전하들을 함유하는 말단 모이어티), 여기서 말단 모이어티는 그것의 인클로저 대향 말단 (즉, 내부 표면들 (292, 294) 에 결합되지 않고 인클로저 (284) 에 근접한 코팅 재료 (298) 의 단부자층의 부분) 에 배치된다.
다른 실시형태들에서, 미세유체 디바이스 (290) 의 내부 표면(들) (292, 294) 을 코팅하기 위해 사용되는 코팅 재료 (298) 는 음이온성, 양이온성, 또는 양쪽성 이온 모이어티들, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 이론에 의해 제한되도록 의도하지 않고, 미세유체 회로 (120) 의 인클로저 (284) 의 내부 표면들에 양이온성 모이어티들, 음이온성 모이어티들, 및/또는 양쪽성 이온 모이어티들을 제공함으로써, 코팅 재료 (298) 는 수화의 결과의 물이 비생물학적 분자들 (예를 들어, 기질의 실리콘 및/또는 실리콘 산화물) 과의 상호작용들로부터 생물학적 마이크로-객체들을 분리하는 층 (또는 "실드 (shield)") 으로서 작용하도록 물 분자들과 강한 수소 결합들을 형성할 수 있다. 또, 코팅 재료 (298) 가 코팅제들과 함께 사용되는 실시형태들에서, 코팅 재료 (298) 의 음이온들, 양이온들, 및/또는 양쪽성 이온들은 인클로저 (284) 내의 매질 (180) (예를 들어, 코팅 용액) 에 존재하는 비공유결합 코팅제들 (예를 들어, 용액 내의 단백질들) 의 대전된 부분들과 이온성 결합들을 형성할 수 있다.
또 다른 실시형태들에서, 코팅 재료는 친수성 코팅제를 그것의 인클로저-대향 말단에 포함하거나 제공하도록 화학적으로 개질될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 코팅 재료는 PEG 와 같은 알킬렌 에테르 함유 폴리머를 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 코팅 재료는 덱스트란과 같은 다당류를 포함할 수도 있다. 상술된 대전된 모이어티들 (예를 들어, 양이온성 모이어티들, 음이온성 모이어티들, 및/또는 양쪽성 이온 모이어티들) 처럼, 친수성 코팅제는 수화의 결과의 물이 비생물학적 분자들 (예를 들어, 기질의 실리콘 및/또는 실리콘 산화물) 과의 상호작용들로부터 생물학적 마이크로-객체들을 분리하는 층 (또는 "실드 (shield)") 으로서 작용하도록 물 분자들과 강한 수소 결합들을 형성할 수 있다.
적절한 코팅 처리들 및 개질들의 추가의 상세들이 미국 특허 출원 공개 번호 US2016/0312165 에서 발견될 수도 있으며, 그것은 그 전체가 참조에 의해 포함된다.
미세유체 디바이스의 격리 펜들 내의 세포들의 생존 능력의 유지보수를 위한 추가적인 시스템 성분들. 세포 개체수들의 성장 및/또는 증식을 증진시키기 위해, 기능성 세포들을 유지하게 하는 환경적 조건들은 시스템의 추가적인 성분들에 의해 제공될 수도 있다. 예를 들어, 그러한 추가적인 성분들은 영양분들, 세포 성장 시그널링 종, pH 조절, 가스 교환, 온도 제어, 및 세포들로부터의 쓰레기 산물들의 제거를 제공할 수 있다. 이들 타입들의 추가적인 성분들은 예를 들어 US 특허 출원 공개 번호 US2016/0312165 호에 기술되어 있다.
실시예들
실시예 1: OptoSelect TM 칩에서의 인간 T 세포 증식
T 세포 증식은 OptoSelect chip, 즉 버클리 라이츠사에 의해 제조되고, 또한 버클리 라이츠사에 의해 제조된 광학 기기에 의해 제어되는 미세유체 디바이스 내에서 달성되었다. 그 기구는 온도 제어기에 커플링된 칩에 대한 탑재 스테이지; 펌프 및 유체 매질 컨디셔닝 컴포넌트; 및 카메라 및 칩 내의 포토트랜지스터들을 활성화하기 위해 적합한 구조형 광원을 포함하는 광학 트레인을 포함했다. OptoSelectTM 칩은 포토트랜지스터-활성화 OET 힘을 제공하는 OptoElectroPositioning (OEPTM) 기술로 구성된 기판을 포함했다. 칩은 또한 복수의 미세유체 채널들을 포함했으며, 이들 각각은 그것에 유동적으로 연결된 복수의 NanoPenTM 챔버들 (또는 격리 펜들) 을 갖는다. 각각의 격리 펜의 체적은 약 1x106 세제곱 마이크론이었다.
말초 혈액으로부터 분리된 CD3+ 인간 T 림프구들은 1 비드/1 세포의 비율로 안티-CD3/안티-CD28 자성 비드들 (DYNABEADSTM, 서머 피셔 사이엔틱 사) 과 혼합되었다. 혼합물은 37℃ 에서 5% CO2 인큐베이터에서 5 시간 동안 인큐베이팅되었다. 인큐베이션에 후속하여, T 세포/비드 혼합물은 재부유되었고, 그 후 유체 입구를 통과해 칩 내의 미세유체 채널 내로 유입되었다. 유동이 정지되었고 T 세포/비드들은 칩을 틸팅하여 중력이 펜들 내로 T 세포/비드들을 끌어당기는 것을 허용함으로써 격리 펜들 내로 램덤으로 로딩되었다.
T 세포들 및 비드들을 격리 펜들로 로딩한 후, T 세포 배양 매질 (RPMI, 10%FBS, 2% 휴먼 AB 혈청, 50 U/ml IL2; R&D 시스템스) 이 4 일의 주기 동안 칩의 미세유체 채널들을 통해 관류되었다. 격리 펜들, 및 그 안에 포함된 임의의 T 세포들 및 비드들은 전체 4-일 배양 주기 동안 매 30 분마다 촬상되었다.
도 4 는 배양의 0, 24, 48, 72, 및 96 시간들에서 단일 펜의 시간-경과 이미지들의 시리즈이며, 여기서 CD3+ 인간 T 림프구들은 상술한 방법에 따라 칩상에서 성공적으로 증식되었다. 알 수 있듯이, 시간 t=0 에서의 작은 수의 T 세포들은 온-칩 배양의 96 시간 후에 T 세포들의 올리고-클론 군집을 야기했다.
대안 1: 상술된 실험은 동물성분-프리 (free) T 세포 배양 매질로 반복될 수 있을 것이다. 예를 들어, 상술한 T 세포 배양 매질 내의 FBS 는 제거될 수 있을 것이고, RPMI 는 진보된 RPMI (또는 높은 레벨들의 인산염을 갖고 인슐린 및 페리틴 보충제들을 포함하는 유사한 베이스 매질) 로 대체될 수 있을 것이고, 결과의 T 세포 증식은 실질적으로 동일할 것이다. 또, T 세포 배양 매질은 IL7 (예를 들어, 5 ng/ml 의 IL7) 로 보충될 수 있을 것이다.
대안 2: 상술된 실험은 T 세포들 및 비드들의 5 시간 오프-칩 사전 인큐베이션 없이 반복될 수 있을 것이다. 대신에, 하나 이상의 비드들은 T 세포들을 격리 펜들로 로딩하기 전 또는 후에 각각의 격리 펜에 배치될 수 있을 것이고, 결과의 T 세포 증식은 실질적으로 동일할 것이다.
실시예 2: OptoSelect TM 칩에서의 인간 T 세포들의 선택적 증식
T 세포 증식은 실시예 1 에서 기술된 바와 같이, 또한 버클리 라이츠사에 의해 제조된 광학 기기에 의해 제어된 OptoSelect chip (버클리 라이츠사) 내에서 달성되었다.
처음에, 말초 혈액으로부터 분리된 인간 CD14+ 단핵구들이 수지상세포들 (DCs) 의 분화를 증진시키기 위해 DC 배양 매질 (RPMI, 10%FBS, 2% 휴먼 AB 혈청, 100 ng/ml GM-CSF, 50 ng/ml IL-4; R&D 시스템스) 에서 7일 동안 배양되었다. 250 μg/ml LPS (R&D 시스템스) 가 DC 활성화를 증진시키기 위해 배양의 마지막 2 일 동안 배양 매질에 첨가되었다.
동종이계 도너 T 림프구들이 ~10 T 세포들/1 DC 의 비율로 상술한 배양으로부터 DC 들과 혼합되었고 37℃ 에서 5% CO2 인큐베이터에서 5 시간 동안 인큐베이팅되었다. 인큐베이션에 후속하여, T 세포들/DC 들 혼합물은 재부유되었고, 그 후 유체 입구를 통과해 칩 내의 미세유체 채널 내로 유입되었다. 유동이 정지되었고 T 세포들/DC 들은 칩을 틸팅하여 중력이 펜들 내로 T 세포들/DC 들을 끌어당기는 것을 허용함으로써 격리 펜들 내로 램덤으로 로딩되었다.
T 세포들/DC 들을 격리 펜들로 로딩한 후, T 세포 배양 매질 (RPMI, 10%FBS, 2% 휴먼 AB 혈청, 50 U/ml IL2; R&D 시스템스) 이 4 일의 주기 동안 칩의 미세유체 채널들을 통해 관류되었다. 격리 펜들, 및 그 안에 포함된 임의의 T 세포들 및 DC 들은 전체 4-일 배양 주기 동안 매 30 분마다 촬상되었다.
도 5a 는 배양의 0, 24, 48, 72, 및 96 시간들에서 단일 격리 펜의 시간-경과 이미지들의 시리즈이며, 여기서 CD3+ 인간 T 림프구들은 상술한 방법에 따라 칩상에서 선택적으로 증식되었다. 알 수 있듯이, DC 들은 온-칩 배양의 96 시간 후에 T 세포들의 상당한 증식을 자극했다. 그러나, 적어도 하나의 T 세포 및 적어도 하나의 DC 가 처음에 뿌려진 격리 펜들의 1%-2% 만이 T 세포 증식을 나타내어, 도 5a 에서 관찰된 증식이 선택적이었다는 것을 나타냈다.
4일 배양 주기의 마지막 16 시간들 동안, 칩을 관류하기 위해 사용된 배양 매질은 Click-It EdU 시약 (서모 피셔 사이엔틱 사) 으로 보충되어, T 세포들이 시약을 흡수하고 그것을 그들의 DNA 로 통합하는 것을 허용했다. 배양 주기에 후속하여, 세포들은 세척되고, 3.7% 포름알데히드로 고정되고, 0.1% 트리톤-X 로 침투가능하게 되었다. EdU 통합은 텍사스 레드 (Texas Red) 채널에서의 형광을 모니터링함으로써 검출되었다. 도 6a 는 선택적으로 증식된 T 세포들의 브라잇필드 이미지에 오버레이된 EdU 형광 신호를 보여주는 이미지를 제공한다. EdU 데이터는 펜 내의 T 세포들의 수에서의 증가가 세포 성장과 분할로부터 야기되었다는 것을 보여주며, 이는 원래-페닝된 T 세포들이 DC 들에 의해 활성화되었다는 결론과 일관된다.
대안: 상술된 실험은 동물성분-프리 (free) T 세포 배양 매질로 반복될 수 있을 것이다. 예를 들어, 상술한 T 세포 배양 매질 내의 FBS 는 제거될 수 있을 것이고, RPMI 는 진보된 RPMI (또는 높은 레벨들의 인산염을 갖고 인슐린 및 페리틴 보충제들을 포함하는 유사한 베이스 매질) 로 대체될 수 있을 것이고, 결과의 T 세포 증식은 실질적으로 동일할 것이다. 또, T 세포 배양 매질은 IL7 (예를 들어, 5 ng/ml 의 IL7) 로 보충될 수 있을 것이다.
실시예 3: OptoSelect TM 칩에서의 인간 T 세포들의 항원-특정적 증식
T 세포 증식은 실시예 1 에서 기술된 바와 같이, 또한 버클리 라이츠사에 의해 제조된 광학 기기에 의해 제어된 OptoSelect chip (버클리 라이츠사) 내에서 달성되었다.
처음에, 말초 혈액으로부터 분리된 인간 CD14+ 단핵구들이 수지상세포들 (DCs) 의 분화를 증진시키기 위해 DC 배양 매질 (RPMI, 10%FBS, 2% 휴먼 AB 혈청, 100 ng/ml GM-CSF, 50 ng/ml IL-4; R&D 시스템스) 에서 7일 동안 배양되었다. 250 μg/ml LPS (R&D 시스템스) 가 DC 활성화를 증진시키기 위해 배양의 마지막 2 일 동안 배양 매질에 첨가되었다. LPS 의 첨가와 동시에, DC 들은 또한 10 μΜ 파상풍 독소 (TT) 항원 (시그마-알드리치 사) 및 10 μΜ 엡스타인 바 바이러스 (EBV) 항원 (이스트코스트 바이오 사) 으로 펄싱되었다.
동종이계 도너 T 림프구들이 ~10 T 세포들/1 DC 의 비율로 상술한 배양으로부터 TT- 및 EBV-펄싱된 DC 들과 혼합되었고 37℃ 에서 5% CO2 인큐베이터에서 5 시간 동안 인큐베이팅되었다. 인큐베이션에 후속하여, T 세포들/DC 들 혼합물은 재부유되었고, 그 후 유체 입구를 통과해 칩 내의 미세유체 채널 내로 유입되었다. 유동이 정지되었고 T 세포들/DC 들은 칩을 틸팅하여 중력이 펜들 내로 T 세포들/DC 들을 끌어당기는 것을 허용함으로써 격리 펜들 내로 램덤으로 로딩되었다.
T 세포들/DC 들을 격리 펜들로 로딩한 후, T 세포 배양 매질 (RPMI, 10%FBS, 2% 휴먼 AB 혈청, 50 U/ml IL2; R&D 시스템스) 이 5 일의 주기 동안 칩의 미세유체 채널들을 통해 관류되었다. 격리 펜들, 및 그 안에 포함된 임의의 T 세포들 및 비드들은 전체 5-일 배양 주기 동안 매 30 분마다 촬상되었다.
도 5b 는 배양의 0, 24, 48, 72, 96, 및 110 시간들에서 단일 격리 펜의 시간-경과 이미지들의 시리즈이며, 여기서 CD3+ 인간 T 림프구들은 상술한 방법에 따라 칩상에서 선택적으로 증식되었다. 알 수 있듯이, DC 들은 온-칩 배양의 110 시간 후에 T 세포들의 상당한 증식을 자극했다. 그러나, 적어도 하나의 T 세포 및 적어도 하나의 DC 가 처음에 뿌려진 격리 펜들의 1%-2% 만이 T 세포 증식을 나타내어, 도 5b 에서 관찰된 증식이 항원 특정적이었다는 것을 나타냈다.
5-일 배양 주기의 마지막 16 시간들 동안, 칩을 관류하기 위해 사용된 배양 매질은 Click-It EdU 시약 (서모 피셔 사이엔틱 사) 으로 보충되어, T 세포들이 시약을 흡수하고 그것을 그들의 DNA 로 통합하는 것을 허용했다. 배양 주기에 후속하여, 세포들은 세척되고, 3.7% 포름알데히드로 고정되고, 0.1% 트리톤-X 로 침투가능하게 되었다. EdU 통합은 텍사스 레드 채널에서의 형광을 모니터링함으로써 검출되었다. 도 6b 는 선택적으로 증식된 T 세포들의 브라잇필드 이미지에 오버레이된 EdU 형광 신호를 보여주는 이미지를 제공한다. EdU 데이터는 펜 내의 T 세포들의 수에서의 증가가 세포 성장과 분할로부터 야기되었다는 것을 보여주며, 이는 원래-페닝된 T 세포들이 DC 들에 의해 활성화되었다는 결론과 일관된다.
대안: 상술된 실험은 동물성분-프리 T 세포 배양 매질로 반복될 수 있을 것이다. 예를 들어, 상술한 T 세포 배양 매질 내의 FBS 는 제거될 수 있을 것이고, RPMI 는 진보된 RPMI (또는 높은 레벨들의 인산염을 갖고 인슐린 및 페리틴 보충제들을 포함하는 유사한 베이스 매질) 로 대체될 수 있을 것이고, 결과의 T 세포 증식은 실질적으로 동일할 것이다. 또, T 세포 배양 매질은 IL7 (예를 들어, 5 ng/ml 의 IL7) 로 보충될 수 있을 것이다.
실시예 4: 컨디셔닝된 표면을 갖는 OptoSelect TM 칩에서의 T 림프구들의 배양 및 익스포트
재료들. CD3+ 세포들은 AllCells 사로부터였다. 안티-CD3/안티-CD28 항체들이 자성 비드들 (Dynabeads®, ThermoFisher Scientific, Cat. No. 11453D) 에 결합되었다. 배양 매질은 10% FBS, 2% 휴먼 AB 혈청, 및 50 U/ml IL2 (R&D 시스템스) 로 보충된 RPMI-1640 (GIBCO®, ThermoFisher Scientific, Cat. No. 11875-127) 이었다.
시스템 및 미세유체 디바이스. T 세포 증식은 실시예 1 에서 실질적으로 기술된 바와 같이, 또한 버클리 라이츠사에 의해 제조된 광학 기기에 의해 제어된 OptoSelect chip (버클리 라이츠사) 내에서 달성되었다. 이러한 예에서, 그러나, OptoSelect chip 의 내부 표면들은 공유결합으로-연결된 덱스트란으로 컨디셔닝되었다.
미세유체 디바이스 프라이밍 (priming). 250 마이크로리터의 100% 이산화탄소가 12 마이크로리터/초의 속도로 유입되었고, 후속하여 0.1% Pluronic® F27 (Life Technologies® Cat# P6866) 을 함유하는 250 마이크로리터의 PBS 가 12 마이크로리터/초의 속도로 유입되었고, 마지막으로 250 마이크로리터의 PBS 가 12 마이크로리터/초의 속도로 유입되었다. 배양 매질의 도입이 후속되었다.
매질 관류. 매질은 다음의 2 가지 방법들 중 하나에 따라 미세유체 디바이스를 통해 관류되었다.
1. 2h 동안 0.01 마이크로리터/초로 관류; 64 초 동안 2 마이크로리터/초로 관류; 및 반복.
2. 100초 동안 0.02 마이크로리터/초로 관류; 500 초 흐름 정지; 64 초 동안 2 마이크로리터/초로 관류; 및 반복.
실험: CD3+ 세포들이 1 비드/세포의 비율로 안티-CD3/안티-CD28 자성 비드들과 혼합되었다. 그 혼합물은 37℃ 에서 5% CO2 인큐베이터에서 5 시간 동안 배양 매질에서 인큐베이팅되었고, 그 후 T 세포/비드 혼합물은 사용을 위해 재부유되었다.
(안티-CD3/안티-CD28 비드들을 포함하는) T 세포 부유는 유체 입구를 통해 미세유체 채널 내로 그 재부유를 유입시킴으로써 미세유체 디바이스 내로 도입되었다. 유동이 정지되었고 T 세포들/비드들은 칩을 틸팅하여 중력이 챔버들 내로 T 세포들/비드들을 끌어당기는 것을 허용함으로써 격리 챔버들 내로 램덤으로 로딩되었다.
T 세포들/비드들을 격리 챔버들로 로딩한 후, 배양 매질이 4 일의 주기 동안 나노유체 칩의 미세유체 채널들을 통해 관류되었다. 도 7a 는 미세유체 디바이스의 격리 챔버들의 덱스트란 컨디셔닝된 표면상에서의 T 세포들의 성장을 보여주었다. 덱스트란 컨디셔닝된 표면상의 T 세포의 성장은 유사한 미세유체 디바이스의 컨디셔닝되지 않은 표면에 비해 향상되었다 (데이터 미도시).
T 세포들은 그 후 미세유체 디바이스를 틸팅하여 중력이 T 세포들을 챔버들로부터 끌어당기는 것을 허용함으로써 격리 챔버들로부터 제거되었다. 도 7b 는 20 분의 중력-언로딩에 후속하여 격리 챔버들로부터 제거된 T 세포들의 대표 이미지를 보여준다. 증식된 T 세포들은 덱스트란 컨디셔닝된 격리 펜들로부터 용이하게 익스포트되었고, 이것은 덱스트란 컨디셔닝된 표면이 결핍된 OptoSelect chip 을 사용하여 달성된 T 세포 익스포트의 정도에 비해 향상이었다 (데이터 미도시).
실시예 5: 컨디셔닝된 표면을 갖는 OptoSelect TM 칩에서의 T 림프구들의 활성화 및 증식
T 세포 증식은 실시예 1 에서 실질적으로 기술된 바와 같이, 또한 버클리 라이츠사에 의해 제조된 광학 기기에 의해 제어된 OptoSelect chip (버클리 라이츠사) 내에서 달성되었다. 실시예 4 와 유사하게, OptoSelect chip 은 컨디셔닝된 표면을 특색으로 삼았다. 이러한 예에서, 컨디셔닝된 표면은 비오티닐레이티드 (biotinylated) 안티-CD3 작용제 항체들에 결합되었던 스트렙타비딘-연결된 폴리에틸린 글리콜 (PEG, ~1kD)-함유 폴리머를 포함했다.
OptoSelect chip 은 프리 스트렙타비딘 (1 mg/mL, 출구 포트 내로 주입에 의해 로딩됨) 으로 플러싱되었고, 1 시간 동안 RT 에서 인큐베이팅되었고, 그 후 PBS (주입에 의함) x1 로 린싱되었다. 다음에, 비오티닐레이티드 안티-CD3 항체 (5 마이크로그램/mL, Miltenyi 130-093-377) 가 칩 내로 유입되었고, 유동이 정지되었고, 칩이 가습 (humidification) 과 함께 37℃ 에서 1 시간 동안 인큐베이팅되었다. 칩은 그 후 디바이스를 통해 배양 매질을 흐르게 함으로써 린싱되었다.
T 세포들은 T 세포들의 배양을 입구를 통해 칩 내의 미세유체 채널들로 유입시키고, 그 후 유동을 정지시킴으로써 (상술된 바와 같이 준비된) 칩 내로 로딩되었다. 칩은 칩 내의 격리 펜들 내로 T 세포들의 중력 로딩을 허용하기 위해 틸팅되었다. 중력 로딩에 후속하여, T 세포들은 3 내지 4 일 동안 칩의 격리 펜들 내에서 배양되었다. T 세포 배양을 위해 사용된 매질은 2 ug/mL 용융가능, 기능적 등급 안티-CD28 항체 (클론 15E8, Miltenyi 130-093-375) 를 포함했다.
상술된 바와 같은 미세유체 디바이스 내에서 배양된 T 세포들은 시간-경과 촬상에 의해 모니터링되었다. 결과의 이미지들은 T 세포들이 이동하고 분할되어, T 세포 활성화의 특성들을 증언한다는 것을 드러냈다.
상술한 실험의 변형들은, 결합된 안티-CD3 작용제 항체의 표면 밀도를 변경하는 것; PEG 폴리머의 길이를 변경하는 것; 컨디셔닝된 표면에 안티-CD28 항체를 결합하는 것; 안티-CD3 작용제 항체-대-안티-CD28 항체의 비를 변화시키는 것; 및/또는 안티-CD3 항체를 펩티드-MHC 착체로 대체하는 것을 포함할 수 있을 것이다. 이러한 후자의 개질은 T 세포들의 항원-특정적 활성화 및 증식을 달성하기 위해 사용될 수 있을 것이다.
실시예 6: 미세유체 디바이스 내의 T-세포 활성화 표면의 도입
베이스를 형성하는 제 1 실리콘 전극 활성화 기판, 커버를 형성하는 제 2 ITO 기판, 및 그 두 기판들을 분리하는 벽들을 형성하는 포토패터닝된 실리콘 미세유체 회로 재료를 포함한 OptoSelectTM 칩 (버클리 라이츠 사) 의 내부 표면들은 미국 특허 출원 공개 제 US20160312165 호에 기술된 바와 같이, 아지도 모이어티들을 포함하도록 공유결합으로 개질되었다. 기본적으로, OptoSelect 칩은 100W 전력, 240 mTorr 압력 및 440 sccm 산소 유동률을 사용하여 1 분 동안 산소 플라즈마 클리너 (Nordson Asymtek) 에서 처리되었다. 플라즈마 처리된 칩은 진공 리액터의 저부에서 별개의 호일 보트 (foil boat) 내의 물 반응물 소스로서 마그네슘 설페이트 헵타하이드레이트 (0.5g, Acros Cat. #10034-99-8) 의 존재하에, 진공 리액터의 저부에서 호일 보트에서 (소듐 아지드, 300 마이크로리터와의 반응에 의해 11-브로모운데실트리메톡시실란 (Gelest Cat. # SIB1908.0) 으로부터 합성된) 3-아지도운데실) 트리메톡시실란으로 진공 리액터에서 처리되었다. 챔버는 그 후 진공 펌프를 사용하여 750 mTorr 까지 펌핑되고 밀봉되었다. 진공 리액터는 24-48 시간 동안 110℃ 까지 가열된 오븐 내에 배치되었다. 이것은 개질된 표면들이 구조:
Figure pat00008
를 갖도록 칩의 내부 표면들의 개질을 야기했다. 실온까지 냉각하고 아르곤을 진공 챔버로 도입한 후, 미세유체 디바이스는 리액터로부터 제거되었고 추가의 반응을 위해 적합했다.
다음에, 스트렙타비딘으로 표면을 기능화하기 위해, OptoSelect 칩은 먼저 100% 이산화탄소로 반복적으로 플러싱되었고, 그 후 DBCO-스트렙타비딘 용액으로 로딩되었다. DBCO-스트렙타비딘 용액은 1X PBS (pH 7.4, Gibco) 에서 1.0 마이크로몰 농도로 DBCO 모이어티들 (NANOCS Cat # SV1-DB-1) 에 공유결합으로 부착되었던 스트렙타비딘의 동결건조된 분말을 재부유시킴으로써 제조되었다. DBCO 및 아지드 기들이 커플링했던 15-30 분 동안의 인큐베이션 후에, OptoSelect 칩은 비결합된 DBCO-스트렙타비딘을 플러싱하기 위해 1X PBS 로 반복적으로 세척되었다. DBCO 개질된 스트렙타비딘 용액이 1 마이크로몰 농도로 준비된 반면, 약 0.5 내지 약 2 마이크로몰의 범위에서의 농도가 아지도 모이어티들을 갖는 OptoSelect 칩의 내부 표면들을 개질하기 위해 효과적이다.
이러한 스트렙타비딘-기능화된 표면들은 비오티닐레이티드 안티-CD3 항체 (OKT3 클론, 기능성 등급, Miltenyi, Cat. #130-093-377) 및 비오티닐레이티드 안티-CD28 항체 (15E8 클론, 기능성 등급, Miltenyi, Cat. #130-093-386) 로 더욱 개질되었다. 이들 항체들은 1:1 비율로 약 1 - 10 마이크로그램/mL 의 농도들로 PBS + 2% 소혈청 알부민에 부유되었다. 이러한 항체 용액은 스트렙타비딘-기능화된 표면들을 갖는 OptoSelect 칩을 통해 관류되어, 비오틴-스트렙타비딘 결합 상호작용을 통해 칩의 내부 표면들에 대한 항체들의 컨쥬게이션을 용이하게 했다. 1 시간의 인큐베이션 후에, OptoSelect 칩은 PBS 로 및 그 후 세포 배양 매질로 플러싱되었고, 그 시점에서 칩은 세포 로딩을 위해 준비되었다.
상술한 예는 항체들로의 OptoSelect 칩의 내부 표면들의 기능화에 초점을 맞추지만, 관심의 다른 생체분자들은 동일한 방식으로 (즉, 생체분자들의 비오틴 개질 및 스트렙타비딘 기능화된 표면들에 대한 비오틴-스트렙타비딘 매개 결합을 통해) 컨쥬게이트될 수 있을 것이다. 게다가, 비오티닐레이티드 항체들 (또는 다른 생체분자들) 은 OptoSelect 칩의 아지도-개질된 표면들과의 반응 이전에 스트렙타비딘과 반응될 수 있을 것이다. DBCO-스트렙타비딘 및 비오티닐레이티드 생체분자는 이하에 기술된 바와 같이, 0.5 - 2 마이크로몰의 범위에서의 농도들에서 PBS 용액에서 별개로 준비되고, 그 후 임의의 원하는 비율로 혼합될 수 있다. 비오티닐레이티드 생체분자들이 적어도 15 분 동안 스트렙타비딘 대해 컨쥬게이트하는 것을 허용한 후, 결과의 착체들은 상술된 바와 같이 아지도-개질된 OptoSelect 칩의 표면을 개질하기 위해 사용될 수 있다.
2 가지 이상의 타입의 항체/생체분자가 OptoSelect 칩의 표면들을 개질하기 위해 사용되는 경우, 그 2 가지 (이상의) 타입들의 항체들/생체분자들의 혼합은 DBCO-스트렙타비딘으로의 컨쥬게이션 단계 이전에 발생할 수 있거나, 수개의 개개의 타입들의 생체분자들의 DBCO-스트렙타비딘 컨쥬게이트들은 표면 기능화 이전에 준비 및 혼합될 수 있다. 따라서, 상기 예에서의 생체분자 개질된 표면은 1:1 비율의 안티-CD3 및 안티-CD28 항체들이었지만, 그 비율은 약 1:5 내지 약 5:1 (예를 들어, 약 2:1 내지 약 1:2) 일 수 있을 것이다. 더욱 일반적으로, T-세포들을 활성화하기 위해 유용한 생체분자-개질된 표면들은 2 개의 T 세포-활성화 생체분자들을 포함할 수도 있으며, 이들 중 어느 것은 CD3 작용제, CD28 작용제, 또는 MHC 단백질 (예를 들어, MBL International, Catalog # MR01008) 일 수 있을 것이고, 그 2 개의 생체분자들은 서로에 대해 약 1:10 내지 약 10:1 의 범위에 존재할 수 있을 것이다. 게다가, 생체분자-개질된 표면들은 3, 4, 5, 또는 더 많은 T 세포-활성화 생체분자들의 혼합물들을 포함할 수 있을 것이다.
상술한 실험의 추가의 변형들은, 결합된 안티-CD3 작용제 항체 및/또는 결합된 안티-28 작용제 항체의 표면 밀도를 변경하는 것; 처음에 내부 칩 표면들을 기능화하기 위해 사용된 아지도 모이어티-함유 분자들에서의 하이드로카본 사슬의 길이를 변경하는 것; 안티-CD28 항체를 용해가능한 형태로 제공하는 것; 및/또는 안티-CD3 항체를 펩티드-MHC 착체로 대체하는 것을 포함할 수 있을 것이다. 이러한 후자의 개질은 T 세포들의 항원-특정적 활성화 및 증식을 달성하기 위해 사용될 수 있을 것이다.
실시예 7: 실시형태들
다음의 넘버링된 아이템들은 여기에 기술된 실시형태에 대한 추가의 비제한적인 상세들을 제공한다.
아이템 1. 흐름 경로 및 그 흐름 경로에 유체 흐름 가능하게 연결된 격리 펜을 갖는 미세유체 디바이스에서 T 림프구들을 증식시키는 방법으로서, 그 방법은, 미세유체 디바이스에서의 격리 펜으로 하나 이상의 T 림프구들을 도입하는 단계; 및 하나 이상의 T 림프구들을 활성화 작용제와 접촉시키는 단계; 및 격리 펜으로 도입된 하나 이상의 T 림프구들이 증식을 격는 것을 허용하기에 충분한 시간 주기 동안 미세유체 디바이스의 흐름 경로를 통해 배양 매질을 관류시키는 단계를 포함한다.
아이템 2. 아이템 1 의 방법으로서, 여기서 격리 펜은 약 5x105 내지 약 5x106 세제곱 마이크론의 체적을 갖는다.
아이템 3. 아이템 1 또는 2 의 방법으로서, 여기서 격리 펜의 적어도 하나의 내부 표면은 코팅 재료를 포함한다.
아이템 4. 아이템 3 의 방법으로서, 여기서 코팅 재료는 격리 펜의 적어도 하나의 내부 표면에 공유결합되고, 코팅 재료는 알킬렌 에테르 모이어티들, 사카라이드 모이어티들, 아미노 애시드 모이어티들, 또는 이들의 조합을 포함하는 폴리머를 포함한다.
아이템 5. 아이템 4 의 방법으로서, 코팅 재료는 덱스트란을 포함한다.
아이템 6. 아이템 4 의 방법으로서, 코팅 재료는 폴리에틸렌 글리콜 모이어티들을 포함한다.
아이템 7. 아이템들 4 내지 6 중 어느 하나의 방법으로서, 코팅 재료는 하나 이상의 단백질들을 포함한다.
아이템 8. 아이템 3 의 방법으로서, 코팅 재료는 각각이 연결기 및 알킬 모이어티를 포함하는 분자들을 포함하고, 연결기는 격리 펜의 적어도 하나의 내부 표면에 공유결합된다.
아이템 9. 아이템 8 의 방법으로서, 연결기는 실록시 연결기이다.
아이템 10. 아이템 8 또는 9 의 방법으로서, 알킬 모이어티는 적어도 10 개의 탄소 원자들을 포함하는 탄소들의 선형 사슬을 포함한다.
아이템 11. 아이템들 8 내지 10 중 어느 하나의 방법으로서, 알킬 모이어티는 플루오로알킬 모이어티이다.
아이템 12. 아이템들 8 내지 10 중 어느 하나의 방법으로서, 알킬 모이어티는 퍼플루오로알킬 모이어티이다.
아이템 13. 아이템들 8 내지 12 중 어느 하나의 방법으로서, 코팅 재료의 분자들은 내부 기질 표면에 공유결합된 밀집 패킹된 단층 구조를 형성한다.
아이템 14. 아이템 3 의 방법으로서, 코팅 재료는 연결기 및 양이온성 모이어티 및/또는 음이온성 모이어티를 갖는 분자들을 포함하고, 연결기는 내부 기질 표면에 공유결합된다.
아이템 15. 아이템 14 의 방법으로서, 양이온성 모이어티는 쿼터너리 암모늄기를 포함한다.
아이템 16. 아이템 14 또는 15 의 방법으로서, 음이온성 모이어티는 포스포닉 애시드, 카르복실릭 애시드, 또는 술포닉 애시드를 포함한다.
아이템 17. 아이템들 14 내지 16 중 어느 하나의 방법으로서, 코팅 재료는 연결기 및 양성이온 모이어티를 갖는 분자들을 포함한다.
아이템 18. 아이템 17 의 방법으로서, 양성이온 모이어티는 카르복시베타인들, 술포베타인들, 술파믹 애시드들, 및 아미노 애시드들로부터 선택된다.
아이템 19. 아이템들 3 내지 18 중 어느 하나의 방법으로서, 활성화 작용제는 코팅 재료에 공유결합으로 연결된다.
아이템 20. 아이템들 3 내지 18 중 어느 하나의 방법으로서, 활성화 작용제는 코팅 재료에 안정하게 결합된다.
아이템 21. 아이템 20 의 방법으로서, 활성화 작용제는 비오틴-스트렙타비딘 연결을 통해 코팅 재료에 안정하게 결합된다.
아이템 22. 아이템들 1 내지 21 중 어느 하나의 방법으로서, 하나 이상의 T 림프구들은 환자로부터 취해진 말초 혈액 샘플로부터 분리된다.
아이템 23. 아이템들 1 내지 21 중 어느 하나의 방법으로서, 하나 이상의 T 림프구들은 환자의 고형 종양 샘플로부터 분리된다.
아이템 24. 아이템 23 의 방법으로서, 고형 종양 샘플은 세침 흡인물 (FNA) 이다.
아이템 25. 아이템 23 의 방법으로서, 고형 종양 샘플은 바이옵시이다.
아이템 26. 아이템들 23 내지 25 중 어느 하나의 방법으로서, 고형 종양은 유방암, 요로, 요관, 방광, 또는 요도에서 기원하는 암, 콩팥세포암종, 고환암, 전립선암, 또는 정낭들, 정관들 또는 음경의 암, 난소암, 자궁암, 자궁경부암, 질암, 또는 나팔관의 암, 신경계의 암, 신경모세포종, 망막모세포종, 장암, 대장암, 폐암, 흑색종이다.
아이템 27. 아이템들 23 내지 25 중 어느 하나의 방법으로서, 고형 종양은 수질 유방암, 중피종, 또는 흑색종이다.
아이템 28. 아이템들 22 내지 27 중 어느 하나의 방법으로서, 하나 이상의 T 림프구들은 말초 혈액 샘플 또는 고형 종양 샘플로부터 분리된 T 림프구들의 군집으로부터이다.
아이템 29. 아이템 28 의 방법으로서, 군집은 CD3+ T 림프구들에 대해 인리치된다.
아이템 30. 아이템 28 의 방법으로서, 군집은 CD3+CD4+ T 림프구들에 대해 인리치된다.
아이템 31. 아이템 28 의 방법으로서, 군집은 CD3+CD8+ T 림프구들에 대해 인리치된다.
아이템 32. 아이템들 28 내지 31 중 어느 하나의 방법으로서, 군집은 CD45RA+CD45RO- T 림프구들에 대해 인리치된다.
아이템 33. 아이템들 28 내지 31 중 어느 하나의 방법으로서, 군집은 CD45RA-CD45RO+ T 림프구들에 대해 인리치된다.
아이템 34. 아이템들 28 내지 33 중 어느 하나의 방법으로서, 군집은 CCR7+ T 림프구들에 대해 인리치된다.
아이템 35. 아이템들 28 내지 34 중 어느 하나의 방법으로서, 군집은 CD62L+ T 림프구들에 대해 인리치된다.
아이템 36. 아이템들 28 내지 35 중 어느 하나의 방법으로서, 군집은 CD69+ T 림프구들이 결핍된다.
아이템 37. 아이템들 28 내지 36 중 어느 하나의 방법으로서, 군집은 PD 1+ 및/또는 PD-L1+ T 림프구들이 결핍된다.
아이템 38. 아이템들 28 내지 37 중 어느 하나의 방법으로서, 방법은 T 림프구들을 CD45RO, CD45RA, CD69, PD-1, 및/또는 PD-L1 에 대한 항체들과 접촉시키고 그 항체들에 결합된 T 림프구들을 군집으로부터 제거함으로써 CD45RO+ T 림프구들, CD45RA+ T 림프구들, CD69+ T 림프구들, PD-1+ T 림프구들, 및 PD-L1+ T 림프구들 중 하나, 둘, 셋, 또는 넷을 고갈시키는 단계를 포함한다.
아이템 39. 아이템 38 의 방법으로서, 항체들은 고형 서포트와 연관된다.
아이템 40. 아이템 39 의 방법으로서, 고형 서포트는 자성 비드들의 군집이다.
아이템 41. 아이템들 1 내지 40 중 어느 하나의 방법으로서, 격리 펜으로 하나 이상의 T 림프구들을 도입하는 단계는 미세유체 디바이스의 미세유체 채널로 하나 이상의 T 림프구들을 함유하는 유체를 흐르게 하는 단계를 포함하고, 미세유체 채널은 미세유체 디바이스의 흐름 경로의 부분이며, 격리 펜은 미세유체 채널로부터 개방한다.
아이템 42. 아이템 41 의 방법으로서, 격리 펜으로 하나 이상의 T 림프구들을 도입하는 단계는 미세유체 채널에 위치된 적어도 하나의 T 림프구를 선택하고 그것을 격리 펜 내로 이동시키기 위해 유전영동 (DEP) 을 사용하는 단계를 더 포함한다.
아이템 43. 아이템 42 의 방법으로서, 적어도 하나의 선택된 T 림프구는, 그것의 세포 표면이 마커 CD3+, CD4+, CD8+, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하기 때문에, 적어도 부분적으로, 선택된다.
아이템 44. 아이템 42 의 방법으로서, 적어도 하나의 선택된 T 림프구는, 그것의 세포 표면이 마커들 CD3+ 및 CD4+ 를 포함하기 때문에, 적어도 부분적으로, 선택된다.
아이템 45. 아이템 42 의 방법으로서, 적어도 하나의 선택된 T 림프구는, 그것의 세포 표면이 마커들 CD3+ 및 CD8+ 를 포함하기 때문에, 적어도 부분적으로, 선택된다.
아이템 46. 아이템들 42 내지 45 중 어느 하나의 방법으로서, 적어도 하나의 선택된 T 림프구는, 그것의 세포 표면이 마커(들) CD45RA+, CD45RO+, CCR7+, CD62L+, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하기 때문에, 적어도 부분적으로, 선택된다.
아이템 47. 아이템들 42 내지 46 중 어느 하나의 방법으로서, 적어도 하나의 T 림프구를 선택하는 단계는 CD3, CD4, CD8, CD45RA, CD45RO, CCR7, 또는 CD62L 에 특정적으로 결합하는 항체로 적어도 하나의 T 림프구를 포함하는 T 림프구의 군집을 라벨링하는 단계, 및 그 항체와의 그것의 연관에 기초하여 격리 펜으로 적어도 하나의 T 림프구를 이동시키는 단계를 포함한다.
아이템 48. 아이템 47 의 방법으로서, 항체는 형광단을 포함한다.
아이템 49. 아이템들 42 내지 48 중 어느 하나의 방법으로서, 적어도 하나의 선택된 T 림프구는, 그것의 세포 표면이 CD45RO+ 가 아니기 때문에, 적어도 부분적으로, 선택된다.
아이템 50. 아이템들 42 내지 48 중 어느 하나의 방법으로서, 격리 펜으로 하나 이상의 T 림프구들을 도입하는 단계는 CD45RO+ T 림프구들을 라벨링하는 단계 및 격리 펜으로 CD45RO 를 나타내는 라벨과 연관되지 않은 하나 이상의 T 림프구들을 도입하는 단계를 포함한다.
아이템 51. 아이템들 42 내지 48 중 어느 하나의 방법으로서, 적어도 하나의 선택된 T 림프구는, 그것의 세포 표면이 CD45RA+ 가 아니기 때문에, 적어도 부분적으로, 선택된다.
아이템 52. 아이템들 42 내지 48 중 어느 하나의 방법으로서, 격리 펜으로 하나 이상의 T 림프구들을 도입하는 단계는 CD45RA+ T 림프구들을 라벨링하는 단계 및 격리 펜으로 CD45RA 를 나타내는 라벨과 연관되지 않은 하나 이상의 T 림프구들을 도입하는 단계를 포함한다.
아이템 53. 아이템들 42 내지 52 중 어느 하나의 방법으로서, CCR7+ 및 CD62L+ T 림프구들을 라벨링하는 단계 및 격리 펜으로 CCR7 를 나타내는 라벨과 연관된 및/또는 CD62L 를 나타내는 라벨과 연관된 하나 이상의 T 림프구들을 이동시키는 단계를 포함한다.
아이템 54. 아이템들 42 내지 52 중 어느 하나의 방법으로서, CCR7+ 및 CD62L+ T 림프구들을 라벨링하는 단계 및 격리 펜으로 CCR7 를 나타내는 라벨과 연관되지 않은 및/또는 CD62L 를 나타내는 라벨과 연관되지 않은 하나 이상의 T 림프구들을 이동시키는 단계를 포함한다.
아이템 55. 아이템들 42 내지 54 중 어느 하나의 방법으로서, 적어도 하나의 선택된 T 림프구는, 그것의 세포 표면이 CD69+ 가 아니기 때문에, 적어도 부분적으로, 선택된다.
아이템 56. 아이템들 42 내지 55 중 어느 하나의 방법으로서, 적어도 하나의 선택된 T 림프구는, 그것의 세포 표면이 PD-1+ 가 아니기 때문에, 적어도 부분적으로, 선택된다.
아이템 57. 아이템들 42 내지 56 중 어느 하나의 방법으로서, 적어도 하나의 선택된 T 림프구는, 그것의 세포 표면이 PD-L1+ 가 아니기 때문에, 적어도 부분적으로, 선택된다.
아이템 58. 아이템들 42 내지 57 중 어느 하나의 방법으로서, 적어도 하나의 선택된 T 림프구는, 그것이 형광 라벨과 연관된 항원으로 라벨링되기 때문에, 적어도 부분적으로, 선택된다.
아이템 59. 아이템들 58 의 방법으로서, 항원은 MHC 단백질과 착체가 되는 펩티드를 포함한다.
아이템 60. 아이템들 42 내지 59 중 어느 하나의 방법으로서, 적어도 하나의 선택된 T 림프구는, 그것이 형광 라벨과 연관된 하나 이상의 항체들로 라벨링되기 때문에, 적어도 부분적으로, 선택된다.
아이템 61. 아이템 60 의 방법으로서, 하나 이상의 항체들은 CD45RA 또는 CD45RO 에 대한 항체, CCR7 에 대한 항체, CD62L 에 대한 항체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
아이템 62. 아이템 60 또는 61 의 방법으로서, 하나 이상의 항체들은 CD4 에 대한 항체를 포함한다.
아이템 63. 아이템 60 또는 61 의 방법으로서, 하나 이상의 항체들은 CD8 에 대한 항체를 포함한다.
아이템 64. 아이템 41 의 방법으로서, 격리 펜으로 하나 이상의 T 림프구들을 도입하는 단계는 중력이 하나 이상의 T 림프구들을 격리 펜으로 끌어당기도록 미세유체 디바이스를 틸팅하는 단계를 더 포함한다.
아이템 65. 아이템들 1 내지 64 중 어느 하나의 방법으로서, 하나 이상의 T 림프구들은 격리 펜으로 도입되기 전에 활성화 작용제와 접촉된다.
아이템 66. 아이템 65 의 방법으로서, 하나 이상의 T 림프구들은 미세유체 디바이스로 도입되기 전에 적어도 1 시간의 주기 동안 활성화 작용제로 인큐베이팅된다.
아이템 67. 아이템 65 의 방법으로서, 하나 이상의 T 림프구들은 미세유체 디바이스로 도입되기 전에 적어도 5 시간의 주기 동안 활성화 작용제로 인큐베이팅된다.
아이템 68. 아이템들 65 내지 67 중 어느 하나의 방법으로서, 격리 펜으로 하나 이상의 T 림프구들을 도입하는 단계는 격리 펜 내로 활성화 작용제를 도입하는 단계를 더 포함한다.
아이템 69. 아이템 70 또는 71 의 방법으로서, 활성화 작용제는 하나 이상의 T 림프구들은 격리 펜으로 도입된 후 활성화 작용제와 접촉된다.
아이템 70. 아이템들 1 내지 69 중 어느 하나의 방법으로서, 활성화 작용제는 안티-CD3 및/또는 안티-CD28 작용제 항체들을 포함한다.
아이템 71. 아이템 70 의 방법으로서, 활성화 작용제는 고형 서포트에 컨쥬게이트되는 안티-CD3 작용제 항체를 포함한다.
아이템 72. 아이템 70 또는 71 의 방법으로서, 활성화 작용제는 고형 서포트에 컨쥬게이트되는 안티-CD28 작용제 항체를 포함한다.
아이템 73. 아이템 70 또는 71 의 방법으로서, 활성화 작용제는 용해가능한 안티-CD28 작용제 항체들을 포함한다.
아이템 74. 아이템들 1 내지 69 중 어느 하나의 방법으로서, 활성화 작용제는 수지상세포 (DC) 를 포함한다.
아이템 75. 아이템 74 의 방법으로서, DC 는 하나 이상의 T 림프구들과 접촉하기 전에 종양 항원으로 펄싱된다.
아이템 76. 아이템 75 의 방법으로서, 종양 항원은 하나 이상의 T 림프구들로 자가이식한 종양 세포들로부터 분리된다.
아이템 77. 아이템 75 의 방법으로서, 종양 항원은 종양 세포들의 게놈 분석을 통해 식별된다.
아이템 78. 아이템 77 의 방법으로서, 분석된 종양 세포들은 하나 이상의 T 림프구들로 자가이식한다.
아이템 79. 아이템들 74 내지 78 중 어느 하나의 방법으로서, DC 및 하나 이상의 T 림프구들은 자가 세포들이다.
아이템 80. 아이템들 1 내지 79 중 어느 하나의 방법으로서, 배양 매질은 적어도 24 시간의 주기 동안 미세유체 디바이스의 흐름 경로를 통해 관류된다.
아이템 81. 아이템들 1 내지 79 중 어느 하나의 방법으로서, 배양 매질은 적어도 48 시간의 주기 동안 미세유체 디바이스의 흐름 경로를 통해 관류된다.
아이템 82. 아이템들 1 내지 79 중 어느 하나의 방법으로서, 배양 매질은 적어도 96 시간의 주기 동안 미세유체 디바이스의 흐름 경로를 통해 관류된다.
아이템 83. 아이템들 1 내지 66 중 어느 하나의 방법으로서, 배양 매질은 인간 혈청 및 IL2 를 포함한다.
아이템 84. 아이템들 1 내지 67 중 어느 하나의 방법으로서, 배양 매질은 IL7, IL15, IL21, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
아이템 85. 아이템들 1 내지 84 중 어느 하나의 방법으로서, 20 개 이하, 10 개 이하, 6 내지 10 개, 5 개 이하, 약 5 개, 약 4 개, 약 3 개, 약 2 개 또는 1 개의 T 림프구(들) 이 미세유체 디바이스에서의 격리 펜으로 도입된다.
아이템 86. 아이템들 1 내지 85 중 어느 하나의 방법으로서, 증식은 유사 분열의 적어도 3 라운드들을 포함한다.
아이템 87. 아이템들 1 내지 86 중 어느 하나의 방법으로서, 방법은 미세유체 디바이스로부터 증식된 T 림프구들을 익스포트하는 단계를 포함한다.
아이템 88. 아이템들 1 내지 87 중 어느 하나의 방법으로서, 미세유체 디바이스는 복수의 격리 펜들을 포함하고, 하나 이상의 T 림프구들이 복수의 격리 펜들 중 각각의 격리 펜으로 도입되고 활성화 작용제와 접촉된다.
아이템 89. 아이템 88 의 방법으로서, 20 개 이하, 10 개 이하, 6 내지 10 개, 5 개 이하, 약 5 개, 약 4 개, 약 3 개, 약 2 개 또는 1 개의 T 림프구(들) 이 미세유체 디바이스에서의 복수의 격리 펜들 각각으로 도입된다.
아이템 90. 아이템들 1 내지 89 중 어느 하나의 방법에 따라 생성된 T 림프구.
아이템 91. 아이템들 1 내지 89 중 어느 하나의 방법에 따라 생성된 T 림프구를 포함하는 미세유체 디바이스.
아이템 92. 아이템 91 의 미세유체 디바이스로서, 미세유체 디바이스는 격리 펜을 포함하고, T 림프구는 격리 펜에 위치된다.
아이템 93. 아이템들 1 내지 89 중 어느 하나의 방법에 따라 생성된 T 림프구 및 약학으로 허용가능한 캐리어를 포함하는 약학 조성물.
아이템 94. 환자 내의 암을 치료하는 방법으로서, 방법은 환자 내로 T 림프구들을 도입하는 단계를 포함하고, T 림프구들은 아이템들 1 내지 89 중 어느 하나의 방법에 의해 준비된다.
아이템 95. 환자 내의 암을 치료하는 방법으로서, 방법은 환자로부터 획득된 조직 샘플로부터 T 림프구들을 분리시키는 단계; 아이템들 1 내지 89 중 어느 하나의 방법에 따라 미세유체 디바이스 내에서 분리된 T 림프구들을 증식시키는 단계; 미세유체 디바이스로부터 증식된 T 림프구들을 익스포트하는 단계; 및 환자 내로 증식된 T 림프구들을 재도입하는 단계를 포함한다.
아이템 96. 아이템 94 또는 95 의 방법으로서, 환자는 포유 동물이다.
아이템 97. 아이템 96 의 방법으로서, 환자는 인간이다.
아이템 98. 아이템들 95 내지 97 중 어느 하나의 방법으로서, 조직 샘플은 말초 혈액의 샘플이다.
아이템 99. 아이템들 95 내지 97 중 어느 하나의 방법으로서, 조직 샘플은 고형 종양으로부터이다.
아이템 100. 아이템 99 의 방법으로서, 조직 샘플은 고형 종양으로부터의 FNA 또는 바이옵시이다.
아이템 101. 아이템 99 또는 100 의 방법으로서, 고형 종양은 유방암, 요로, 요관, 방광, 또는 요도에서 기원하는 암, 콩팥세포암종, 고환암, 전립선암, 또는 정낭들, 정관들 또는 음경의 암, 난소암, 자궁암, 자궁경부암, 질암, 또는 나팔관의 암, 신경계의 암, 신경모세포종, 망막모세포종, 장암, 대장암, 폐암, 또는 흑색종이다.
아이템 102. 아이템 99 또는 100 의 방법으로서, 고형 종양은 수질 유방암, 중피종, 또는 흑색종이다.
아이템 103. 아이템들 95 내지 102 중 어느 하나의 방법으로서, 조직 샘플로부터 T 림프구들을 분리시키는 단계는 조직 샘플 내의 CD3+ 세포들, CD4+ 세포들, CD8+ 세포들, 또는 이들의 임의의 조합에 대한 선택을 수행하는 단계를 포함한다.
아이템 104. 아이템 103 의 방법으로서, 조직 샘플로부터 T 림프구들을 분리시키는 단계는 조직 샘플 내의 CD3+ 세포들, CD4+ 세포들, CD8+ 세포들, 또는 이들의 임의의 조합에 대한 선택을 수행하기 전에 조직 샘플을 해리하는 단계를 더 포함한다.
아이템 105. 아이템들 95 내지 104 중 어느 하나의 방법으로서, 분리된 T 림프구들을 증식시키는 단계는 분리된 T 림프구들을 활성화 작용제와 접촉시키는 단계를 포함한다.
아이템 106. 아이템 105 의 방법으로서, 활성화 작용제는 CD3 작용제 및/또는 CD28 작용제를 포함한다.
아이템 107. 아이템 106 의 방법으로서, 활성화 작용제는 안티-CD3 작용제 항체를 포함한다.
아이템 108. 아이템 106 또는 107 의 방법으로서, 활성화 작용제는 안티-CD28 작용제 항체를 포함한다.
아이템 109. 아이템들 105 내지 108 중 어느 하나의 방법으로서, 활성화 작용제는 하나 이상의 비드들에 컨쥬게이트된다.
아이템 110. 아이템들 105 내지 108 중 어느 하나의 방법으로서, 미세유체 디바이스는 분리된 T 림프구들의 증식을 지원하도록 구성된 적어도 하나의 격리 펜을 포함하고, 적어도 하나의 격리 펜의 각각의 격리 펜의 적어도 하나의 표면은 코팅 재료를 포함하며, 활성화 작용제는 코팅 재료에 공유결합으로 연결된다.
아이템 111. 아이템 110 의 방법으로서, 활성화 작용제는 코팅 재료에 안정하게 결합된다.
아이템 112. 아이템 110 의 방법으로서, 활성화 작용제는 비오틴-스트렙타비딘 연결을 통해 코팅 재료에 안정하게 결합된다.
아이템 113. 아이템들 95 내지 112 중 어느 하나의 방법으로서, 활성화 작용제는 수지상세포들 (DCs) 을 포함한다.
아이템 114. 아이템 113 의 방법으로서, DC 들은 암에 대해 치료받는 환자로부터 획득된다.
아이템 115. 아이템 113 또는 114 의 방법으로서, DC 들은 분리된 T 림프구들을 활성화 작용제와 접촉시키기 전에 종양 항원으로 펄싱된다.
아이템 116. 아이템 115 의 방법으로서, 종양 항원은 환자로부터 획득된 암 세포들로부터 분리된다.
아이템 117. 아이템 115 의 방법으로서, 종양 항원은 합성물이다.
아이템 118. 아이템들 115 내지 117 중 어느 하나의 방법으로서, 종양 항원은 환자로부터 획득된 암 세포들로부터의 핵산 분자들의 시퀀싱을 통해, 적어도 부분적으로, 식별된다.
아이템 119. 아이템들 95 내지 118 중 어느 하나의 방법으로서, 활성화 작용제에 의해 접촉되는 것에 응답하여 증식을 겪는 분리된 T 림프구들은 적어도 100 배 증식을 나타낸다.
아이템 120. 아이템들 95 내지 118 중 어느 하나의 방법으로서, 활성화 작용제에 의해 접촉되는 것에 응답하여 증식을 겪는 분리된 T 림프구들은 적어도 1000 배 증식을 나타낸다.
아이템 121. 아이템들 95 내지 120 중 어느 하나의 방법으로서, 증식된 T 림프구들은 미세유체 디바이스로부터 선택적으로 익스포트된다.
아이템 122. 아이템 121 의 방법으로서, 방법은 하나 이상의 펜들에서의 하나 이상의 T 림프구들의 증식 속도를 분석하는 단계, 및 미리 결정된 임계값 이상인 증식 속도를 갖는 T 림프구들을 선택적으로 익스포트하는 단계를 포함한다.
아이템 123. 아이템 121 또는 122 의 방법으로서, 방법은 하나 이상의 펜들에서의 하나 이상의 T 림프구들에 의한 하나 이상의 시토킨들의 발현을 분석하는 단계, 및 하나 이상의 시토킨들을 발현하는 T 림프구들을 선택적으로 익스포트하는 단계를 포함한다.
아이템 124. 아이템 123 의 방법으로서, 하나 이상의 시토킨들은 INFgamma, TNFalpha, IL2, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
아이템 125. 아이템 121 의 방법으로서, 방법은 하나 이상의 펜들에서의 하나 이상의 T 림프구들에 의한 하나 이상의 조절 T 세포 마커들의 발현을 분석하는 단계, 및 하나 이상의 조절 T 세포 마커들을 발현하는 T 림프구들을 선택적으로 익스포트하는 단계를 포함한다.
아이템 126. 아이템 125 의 방법으로서, 하나 이상의 조절 T 세포 마커들은 CTLA4 를 포함한다.
아이템 127. 아이템들 95 내지 126 중 어느 하나의 방법으로서, 익스포트된 T 림프구들의 샘플을 게놈적으로 프로파일링하는 단계를 더 포함한다.
아이템 128. 아이템들 95 내지 127 중 어느 하나의 방법으로서, 증식된 T 림프구들은 미세유체 디바이스로부터 익스포트된 후 그러나 환자 내로 재도입되기 전에 추가로 증식된다.
아이템 129. 아이템들 95 내지 128 중 어느 하나의 방법으로서, 증식된 T 림프구들의 익스포트하는 단계는 유전영동 (DEP) 힘을 사용하여 그들의 대응하는 격리 펜으로부터 증식된 T 림프구들을 익스포트하는 단계를 포함한다.
등가물들
상술된 명세서는 통상의 기술자가 실시형태들을 실시하는 것을 가능하게 하기에 충분한 것으로 고려된다. 상기의 설명 및 실시예들은 소정의 실시형태들을 상세화하고 고려된 최선의 모드를 기술한다. 그러나, 상술한 것이 텍스트에서 얼마나 상세화되었는지에 관계없이, 실시형태는 다수의 방식으로 실시될 수도 있고, 첨부된 청구범위 및 그것의 임의의 등가물들에 따라 해석되어야 한다.

Claims (34)

  1. 흐름 경로 및 상기 흐름 경로에 유체 흐름 가능하게 연결된 격리 펜을 갖는 미세유체 디바이스에서 T 림프구들을 증식 (expansion) 시키는 방법으로서,
    상기 흐름 경로는 미세유체 채널을 포함하고, 상기 격리 펜은 고립 영역 및 상기 고립 영역을 상기 채널에 유체 흐름 가능하게 접속하는 접속 영역을 포함하며, 상기 격리 펜의 상기 고립 영역은 상기 미세유체 디바이스의 비스윕 영역이고,
    상기 방법은,
    상기 미세유체 디바이스에서의 상기 격리 펜으로 하나 이상의 T 림프구들을 도입하는 단계;
    상기 하나 이상의 T 림프구들을 활성화 작용제와 접촉시키는 단계;
    상기 격리 펜으로 도입된 상기 하나 이상의 T 림프구들이 증식을 겪는 것을 허용하기에 충분한 시간 주기 동안 상기 미세유체 디바이스의 상기 흐름 경로를 통해 배양 매질을 관류시키는 단계; 및
    증식된 T 림프구들을 미세유체 디바이스로부터 익스포트 (export) 하는 단계를 포함하고,
    여기서, 상기 격리 펜의 적어도 하나의 내부 표면은 코팅 재료를 포함하고,
    상기 코팅 재료는 상기 격리 펜의 적어도 하나의 내부 표면에 공유결합되고,
    상기 코팅 재료는 알킬렌 에테르 모이어티들, 사카라이드 모이어티들, 아미노 애시드 모이어티들, 또는 이들의 조합을 포함하는 폴리머를 포함하는, 미세유체 디바이스에서 T 림프구들을 증식시키는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 격리 펜은 약 5x105 내지 약 5x106 세제곱 마이크론의 체적을 갖고/갖거나,
    약 20 마이크론 내지 약 100 마이크론의 범위의 폭 (Wcon) 을 갖는 상기 미세유체 채널로의 근위 개구 및 상기 고립 영역으로의 원위 개구를 포함하고,
    근위 개구로부터 원위 개구로의 상기 접속 영역의 길이 (Lcon) 는 접속 영역의 근위 개구의 폭 (Wcon) 의 적어도 1.0 배인, 미세유체 디바이스에서 T 림프구들을 증식시키는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    근위 개구로부터 원위 개구로의 상기 접속 영역의 길이 (Lcon) 는 접속 영역의 근위 개구의 폭 (Wcon) 의 적어도 1.5 배 또는 2.0 배인, 미세유체 디바이스에서 T 림프구들을 증식시키는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 코팅 재료는 하나 이상의 단백질들을 포함하는, 미세유체 디바이스에서 T 림프구들을 증식시키는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 코팅 재료는, 각각이 연결기 및 알킬 모이어티를 포함하는 분자들을 포함하고,
    상기 연결기는 상기 격리 펜의 적어도 하나의 내부 표면에 공유결합되고,
    상기 코팅 재료의 분자들은 밀집 패킹된 (densely-packed) 단층 구조를 형성하는, 미세유체 디바이스에서 T 림프구들을 증식시키는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 연결기는 실록시 연결기인, 미세유체 디바이스에서 T 림프구들을 증식시키는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 코팅 재료는 연결기 및 양이온성 모이어티 및/또는 음이온성 모이어티를 갖는 분자들을 포함하고,
    상기 연결기는 내부 기질 표면에 공유결합되는, 미세유체 디바이스에서 T 림프구들을 증식시키는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 양이온성 모이어티는 쿼터너리 (quaternary) 암모늄기를 포함하거나, 상기 음이온성 모이어티는 포스포닉 애시드, 카르복실 애시드, 또는 술포닉 애시드를 포함하는, 미세유체 디바이스에서 T 림프구들을 증식시키는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 활성화 작용제는 코팅 재료에 공유결합으로 연결되거나 또는 안정하게 결합되는, 미세유체 디바이스에서 T 림프구들을 증식시키는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 활성화 작용제는 비오틴-스트렙타비딘 결합을 통해 코팅 재료에 안정하게 결합되는, 미세유체 디바이스에서 T 림프구들을 증식시키는 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 T 림프구들은 환자로부터 취해진 말초 혈액 샘플로부터 또는 환자의 고형 종양 샘플로부터 분리된 T 림프구들의 군집으로부터인, 미세유체 디바이스에서 T 림프구들을 증식시키는 방법.
  12. 제 11 항에 있어서,
    하나 이상의 T 림프구들은 환자의 고형 종양 샘플로부터 분리된 T 림프구들의 군집으로부터인, 미세유체 디바이스에서 T 림프구들을 증식시키는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서,
    고형 종양은 유방암, 요로, 요관, 방광, 또는 요도에서 기원하는 암, 콩팥세포암종, 고환암, 전립선암, 또는 정낭들, 정관들 또는 음경의 암, 난소암, 자궁암, 자궁경부암, 질암, 또는 나팔관의 암, 신경계의 암, 신경모세포종, 망막모세포종, 장암, 대장암, 폐암 또는 흑색종인, 미세유체 디바이스에서 T 림프구들을 증식시키는 방법.
  14. 제 11 항에 있어서,
    상기 군집은 CD3+ T 림프구들, CD3+CD4+ T 림프구들, 또는 CD3+CD8+ T 림프구들에 대해 인리치되는, 미세유체 디바이스에서 T 림프구들을 증식시키는 방법.
  15. 제 11 항에 있어서,
    방법이 하기 단계 중 하나 이상을 더 포함하는, 미세유체 디바이스에서 T 림프구들을 증식시키는 방법:
    군집을 CD45RA+CD45RO- T 림프구들 또는 CD45RA-CD45RO+ T 림프구들에 대해 인리치시키는 단계;
    군집을 CCR7+ T 림프구들에 대해 인리치시키는 단계;
    군집을 CD62L+ T 림프구들에 대해 인리치시키는 단계;
    CD69+ T 림프구들의 군집을 고갈시키는 단계;
    PD-1+ 및/또는 PD-L1+ T 림프구들의 군집을 고갈시키는 단계; 및
    CD45RO+ T 림프구들, CD45RA+ T 림프구들, CD69+ T 림프구들, PD-1+ T 림프구들, 및 PD-L1+ T 림프구들 중 하나, 둘, 셋, 또는 넷의 군집을 고갈시키는 단계, 여기서, 고갈시키는 단계는 T 림프구들을 CD45RO, CD45RA, CD69, PD-1, 및/또는 PD-L1 에 대한 항체들과 접촉시키고 그 항체들에 결합된 T 림프구들을 군집으로부터 제거하는 단계를 포함함.
  16. 제 1 항에 있어서,
    격리 펜으로 하나 이상의 T 림프구들을 도입하는 단계는 미세유체 디바이스의 미세유체 채널로 하나 이상의 T 림프구들을 함유하는 유체를 흐르게 하는 단계 및 미세유체 채널에 위치된 적어도 하나의 T 림프구를 선택하고 그것을 격리 펜 내로 이동시키기 위해 유전영동 (DEP) 을 사용하는 단계를 포함하는, 미세유체 디바이스에서 T 림프구들을 증식시키는 방법.
  17. 제 16 항에 있어서,
    적어도 하나의 선택된 T 림프구는, 그것의 세포 표면이:
    CD3+, CD4+, CD8+, 또는 이들의 임의의 조합일 때; 및/또는
    CD45RA+, CD45RO+, CCR7+, CD62L+, 또는 이들의 임의의 조합일 때,
    적어도 부분적으로 선택되는, 미세유체 디바이스에서 T 림프구들을 증식시키는 방법.
  18. 제 16 항에 있어서,
    적어도 하나의 선택된 T 림프구는, 그것의 세포 표면이 CD45RO+ 가 아니거나 CD45RA+ 가 아니기 때문에 적어도 부분적으로 선택되는, 미세유체 디바이스에서 T 림프구들을 증식시키는 방법.
  19. 제 16 항에 있어서,
    CCR7+ 및 CD62L+ T 림프구들을 라벨링하는 단계 및
    CCR7 를 나타내는 라벨과 연관된 및/또는 CD62L 를 나타내는 라벨과 연관된 하나 이상의 T 림프구들을 격리 펜으로 이동시키는 단계; 또는
    CCR7 를 나타내는 라벨과 연관되지 않은 및/또는 CD62L 를 나타내는 라벨과 연관되지 않은 하나 이상의 T 림프구들을 격리 펜으로 이동시키는 단계
    를 포함하는, 미세유체 디바이스에서 T 림프구들을 증식시키는 방법.
  20. 제 16 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 하나의 선택된 T 림프구는, 하기 중 적어도 하나일 때 적어도 부분적으로 선택되는, 미세유체 디바이스에서 T 림프구들을 증식시키는 방법:
    그것의 세포 표면이 CD69+ 가 아닌 것, PD-1+ 가 아닌 것 및 PD-L1+ 가 아닌 것 중 적어도 하나일 때; 및
    그것의 세포 표면이 형광 라벨과 연관된 항원으로 라벨링된 때.
  21. 제 1 항에 있어서,
    하나 이상의 T 림프구들이, 격리 펜으로 도입되기 전에 활성화 작용제와 접촉되는, 미세유체 디바이스에서 T 림프구들을 증식시키는 방법.
  22. 제 21 항에 있어서,
    하나 이상의 T 림프구들이, 미세유체 디바이스로 도입되기 전에 적어도 1 시간의 기간 동안 또는 미세유체 디바이스로 도입되기 전에 적어도 5 시간의 기간 동안 활성화 작용제와 인큐베이팅되는, 미세유체 디바이스에서 T 림프구들을 증식시키는 방법.
  23. 제 1 항에 있어서,
    하나 이상의 T 림프구들이, 격리 펜으로 도입된 후 활성화 작용제와 접촉되는, 미세유체 디바이스에서 T 림프구들을 증식시키는 방법.
  24. 제 1 항에 있어서,
    상기 활성화 작용제는, 고형 서포트에 컨쥬게이트되는 안티-CD3 작용제 (agonist) 항체, 및 고형 서포트에 컨쥬게이트되는 안티-CD28 작용제 항체 또는 용해가능한 안티-CD28 작용제 항체를 포함하는, 미세유체 디바이스에서 T 림프구들을 증식시키는 방법.
  25. 제 1 항에 있어서,
    상기 배양 매질은 적어도 24 시간, 적어도 48 시간, 또는 적어도 96 시간의 기간 동안 미세유체 디바이스의 흐름 경로를 통해 관류되는, 미세유체 디바이스에서 T 림프구들을 증식시키는 방법.
  26. 제 1 항에 있어서,
    상기 배양 매질은 인간 혈청 및 IL2 를 포함하고/하거나, 상기 배양 매질은 IL7, IL15, IL21 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 미세유체 디바이스에서 T 림프구들을 증식시키는 방법.
  27. 제 1 항에 있어서,
    20 개 이하, 10 개 이하, 6 내지 10 개, 5 개 이하, 약 5 개, 약 4 개, 약 3 개, 약 2 개 또는 1 개의 T 림프구(들) 이 미세유체 디바이스에서의 복수의 격리 펜들 각각으로 도입되는, 미세유체 디바이스에서 T 림프구들을 증식시키는 방법.
  28. 제 1 항에 있어서,
    미세유체 디바이스는 복수의 격리 펜들을 포함하고, 하나 이상의 T 림프구들은 복수의 격리 펜들 중 각각의 격리 펜으로 도입되어 활성화 작용제와 접촉되는, 미세유체 디바이스에서 T 림프구들을 증식시키는 방법.
  29. 제 13 항, 제 24 항 또는 제 27 항의 방법에 따라 생성된 T 림프구.
  30. 환자 내의 암 치료에 사용되는 약제로서,
    상기 약제는, 환자로부터 획득된 조직 샘플로부터 분리되어 제 13 항, 제 24 항 또는 제 27 항의 방법에 따라 미세유체 디바이스 내에서 증식된 T 림프구들을 포함하는, 약제.
  31. 제 30 항에 있어서, 환자는 포유 동물인, 약제.
  32. 제 31 항에 있어서, 환자는 인간인, 약제.
  33. 제 30 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서, 조직 샘플은 말초 혈액의 샘플 또는 고형 종양으로부터인, 약제.
  34. 제 33 항에 있어서, 조직 샘플은 고형 종양으로부터의 세침 흡인물 (FNA) 또는 바이옵시인, 약제.
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