CN111198267B - 一种磁弛豫时间免疫传感器磁信号探针及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种磁弛豫时间免疫传感器磁信号探针,包括偶联有Gd3+螯合物、多聚赖氨酸和抗体的超顺纳米磁颗粒,本发明通过将多聚赖氨酸和抗体偶联到超顺纳米磁颗粒表面,得到具有多维空间网状树枝结构的抗体‑超顺纳米磁颗粒‑多聚赖氨酸偶联物,然后将具有螯合性能的琥珀酰亚胺‑四氮杂环十二烷四乙酸偶联在多聚赖氨酸的表面并加入顺磁Gd3+离子,通过DOTA捕获Gd3+,最终将大量的Gd3+离子螯合在超顺纳米磁颗粒表面,得到多重信号放大的磁弛豫时间免疫传感磁信号探针。本发明首次将集磁分离和磁传感于一体的纳米磁颗粒与顺磁性Gd3+离子可控组装成为多功能纳米磁探针,实现了传感信号的多重放大,极大提高了传感器的灵敏度和检测速度。
Description
技术领域
本发明属于食品安全检测和临床诊断分析领域。具体涉及一种以纳米磁颗粒为载体,并层层偶联Gd3+离子和抗体进行信号多重放大的磁弛豫时间免疫传感磁信号探针,本发明还涉及基于该磁探针构建的磁弛豫时间免疫传感器检测方法。
背景技术
食品安全是备受关注的热点问题。近年来,食品安全事件的频繁发生给国家和人民带来了巨大的困扰和损失。食品安全问题主要包括微生物污染、食品添加剂、农兽药残留超标、重金属污染等。虽然我国已制定了针对不同污染物的国家标准及相应的检测方法,但因食源性致病菌污染及非法添加剂引发的食品安全问题仍屡见不鲜,对人民群众的身心健康造成很大的伤害。因此,对食品中有害物的快速、准确的检测具有重要意义。
莱克多巴胺(Ractopamine,Rac)属于瘦肉精类物质,常被用作饲料添加剂,莱克多巴胺的残留容易聚集在动物组织,尤其是内脏中。莱克多巴胺能够通过食物链积聚在人体内,当累积的莱克多巴胺超过一定量时,易发生毒副反应,出现心动过速、恶心晕眩、肌肉疼痛等中毒症状,严重者甚至会危及生命。目前,针对食品中莱克多巴胺残留定性定量分析的主要手段是有:(1)仪器分析法,具有灵敏度高、准确性好等优势,但样品前处理复杂,需要大型精密仪器,检测成本高,需要较高水平的专业技术人员,不适合现场快速检测。(2)免疫分析法。ELISA具有操作相对简单、高通量等优势,但其灵敏度一般在ng/mL级别,线性范围较窄,且不适用于痕量检测。胶体金免疫层析试纸条具有操作简单、反应速度快、适合现场快速检测等优点。但其灵敏度比ELISA低,线性范围较窄,同样无法满足痕量小分子残留的分析。
单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,简称单增李斯特菌)是李斯特菌属中致病力最强的革兰氏阳性菌,除了大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌,单增李斯特菌于20世纪90年代被世界卫生组织(WHO)列为第四大食源性致病菌。单增李斯特菌在自然中广泛存在,能对水源、饲料及各类食品造成污染,尤其冷藏食品,这使得贮存食物和冷链运输受到巨大威胁。国家食品安全法规定食物中不得检出单增李斯特菌。目前检测食源性致病菌的主要检测方法有微生物培养法、免疫检测方法、PCR法等。微生物培养法准确性好,但其耗时长,不适合快速检测。免疫检测方法的灵敏度不足以满足痕量食源性致病菌检测的需要。PCR方法具有灵敏度高的优势,但其需要洁净的环境,容易受气溶胶的污染。因此,构建一种简便的方法实现对单增李斯特菌高灵敏、快速的检测具有重要的意义。
临床诊断中生物标志物的早期筛查和诊断能够有效地保障人体健康、减少经济损失。血清中的降钙素原是一种具有良好特异性的细菌感染生物标志物,正常的人体中降钙素原的含量很低,只有当人体被细菌感染之后其在血液中的浓度才会显著上升,因此其被广泛作为一种细菌感染的生物标志物,在临床诊断领域发挥着重要作用。对血清中痕量的降钙素原进行高灵敏检测,对及时诊断细菌性感染等疾病、维护人体健康具有重要意义。
基于纳米磁颗粒的磁弛豫时间免疫传感器是一种比较新颖的免疫分析方法,具有选择性好,抗干扰能力强,适合于浑浊样品检测等优点。其基本原理是将偶联有抗体的超顺纳米磁颗粒作为磁信号探针,通过抗体-抗原的识别作用,其状态由原来的分散状态变成聚集状态,导致其磁场均匀性的改变,进而引起周围水分子质子的横向弛豫时间(transverserelaxation time,T2)发生显著改变。该传感器的主要优势在于:(1)读出不依赖光信号,避免了复杂基质的干扰,减少了样品前处理等复杂步骤;(2)它是一种均相反应体系,减少了传统酶联免疫分析中多次洗板和显色等步骤,大大提高了检测效率。但目前磁弛豫时间免疫传感器最大的缺点是灵敏度偏低,稳定性不好,不能满足复杂样品中痕量有害物质的检测。
传统磁弛豫时间免疫传感器灵敏度差的主要原因是缺乏性能优异的磁信号探针。基于钆离子(Gd3+)的螯合物已被广泛用作核磁共振成像中的造影剂,用于调整磁弛豫时间信号。作为顺磁离子,Gd3+在d轨道中有多个未配对电子,可以产生强的波动磁场,进而导致周围水分子质子的T2显著缩短,因此其被用作磁信号增强剂。本项目中,我们拟将Gd3+的螯合物和传统的纳米磁颗粒有机结合起来,在纳米磁颗粒表面偶联大量的Gd3+离子。与纳米磁颗粒相比,顺磁离子Gd3+的尺寸要小得多,因此一个100nm左右的纳米磁颗粒表面可以偶联数以万计的Gd3+,纳米磁颗粒本身具有很强的T2磁信号,然后加上Gd3+的磁信号,可以实现T2信号的协同放大。更为重要的是,纳米磁颗粒同时可以作为免疫磁分离的载体,可以从复杂的样品基质中富集需要的目标物,实现免疫磁分离和磁信号检测一步完成。因此,本项目构建的方法,一方面可以提高方法的灵敏度,同时也可以简化操作,加快分析速度,提高检测效率。
发明内容
本发明的目的是以集磁分离与磁传感于一体的纳米磁颗粒作为载体,并在其表面生物偶联大量的顺磁性Gd3+离子,从而组装高性能的功能化纳米磁探针,实现信号的多重放大。在此基础上构建了高性能的磁弛豫时间免疫传感器,用于食品中有害物及临床诊断中生物标志物的快速、高灵敏检测。
上述目的是通过以下技术方案实现的:
一种磁弛豫时间免疫传感器磁信号探针,包括偶联有抗体的超顺纳米磁颗粒,还包括顺磁性Gd3+离子,首先通过氨基与羧基的缩合作用将富含氨基的多聚赖氨酸和抗体偶联到超顺纳米磁颗粒表面,得到具有多维空间网状树枝结构的抗体-超顺纳米磁颗粒-多聚赖氨酸偶联物,然后将对顺磁性Gd3+离子具有螯合性能的DOTA-NHS ester偶联在多聚赖氨酸的表面,最后加入顺磁性Gd3+离子,通过DOTA捕获Gd3+,从而将大量的Gd3+离子螯合在超顺纳米磁颗粒表面,得到抗体-超顺纳米磁颗粒-多聚赖氨酸-DOTA-Gd3+多重信号放大的磁弛豫时间免疫传感器磁信号探针。
优选地,所述超顺纳米磁颗粒是氨基修饰的粒径为50-500纳米的磁颗粒。
最佳地,所述磁颗粒的粒径为150纳米。
优选地,所述超顺纳米磁颗粒与多聚赖氨酸的质量比为5:1。
优选地,所述DOTA-NHS ester的浓度为20nM。
优选地,所述Gd3+的添加浓度为100nM,每个超顺纳米磁颗粒可偶联的Gd3+数量为1.84×107个。
所述的磁弛豫时间免疫传感器磁信号探针可用于检测食品中有害物残留和动物体内的生物标志物。
一种非诊断目的检测食品中有害物残留和动物体内生物标志物的磁弛豫时间免疫传感器方法,包括以下步骤:将以上所述的磁弛豫时间免疫传感器磁信号探针和待测样品反应,然后磁分离,将反应后的磁信号探针加入到包被有待测物完全抗原或者识别待测物抗体的ELISA板上,进行免疫反应,最后洗脱特异性吸附在ELISA板上的磁信号探针,并进行横向弛豫时间的测定。
优选地,所述有害物为莱克多巴胺或单增李斯特菌,所述生物标志物为降钙素原,当磁探针添加浓度为100μg/mL时,对莱克多巴胺的检测效果最好。
在本发明中,我们将磁饱和强度大,稳定性好的纳米磁颗粒作为免疫磁分离和磁信号传感的载体,同时在其表面同时偶联抗体和顺磁性稀土金属离子Gd3+,可控组装为高信号强度的纳米磁探针。该纳米磁探针以纳米磁颗粒为载体,将磁分离与磁传感集为一体,避免了传统的磁免疫传感分析中免疫磁富集和磁传感分别采用不同的纳米磁颗粒,造成免疫磁分离与磁信号读出分步进行的缺点,极大地简化了分析步骤,从而提高传感方法的检测效率与稳定性。
同时,在纳米磁颗粒载体上层层组装多聚赖氨酸、羟基琥珀酰亚胺-四氮杂环十二烷四乙酸酯(DOTA-NHS ester)、Gd3+。多聚赖氨酸含有大量的氨基,可偶联大量的DOTA-NHSester,进而通过DOTA与Gd3+配位作用将Gd3+组装到纳米磁颗粒上,最终得到偶联有大量Gd3+的多重磁信号的纳米磁探针。
在此基础上,结合免疫分析法,构建高灵敏、检测速度快的磁弛豫时间免疫传感器,进而用于痕量有害物质的检测。可控组装集磁分离与磁传感于一体的磁信号多重放大的纳米磁探针是本传感器的核心。具体如图1所示(以莱克多巴胺为例),通过氨基与羧基的缩合作用将富含氨基的多聚赖氨酸和莱克多巴胺单克隆抗体(antibody,Ab)可控地组装到纳米磁颗粒(MNP150)的表面,得到具有多维空间网状树枝结构的“Ab-MNP150-多聚赖氨酸”偶联物,然后将对Gd3+离子具有很好螯合性能的羟基琥珀酰亚胺-四氮杂环十二烷四乙酸酯(DOTA-NHS ester)偶联在多聚赖氨酸的表面,通过DOTA捕获Gd3+,最终将大量的Gd3+离子螯合在MNP150表面,得到“Ab-MNP150-多聚赖氨酸-DOTA-Gd3+”多重信号放大的纳米免疫磁探针。其中,通过多聚赖氨酸可增加Gd3+的偶联量为一重信号放大过程,磁颗粒与Gd3+磁信号的叠加为多重信号放大过程。将该多功能磁探针和待测物(莱克多巴胺)先混合反应,磁分离之后,将“多功能磁探针-莱克多巴胺”加入到包被有完全抗原(BSA-莱克多巴胺)的ELISA板上,进行竞争性免疫反应,部分被吸附探针的量与样品中莱克多巴胺的含量成反比。最后洗脱特异性吸附在ELISA板上的磁探针,并对其进行横向弛豫时间(T2)的测定。在整个反应过程中,基于Gd3+-纳米磁颗粒的磁探针既能够进行免疫磁分离又可以进行磁信号传感,有效地提高了传感器的灵敏度、检测速度及稳定性,从而实现莱克多巴胺的快速、高灵敏检测。该磁免疫传感器在食品安全检测、生物医学诊断、环境监测等领域具有广阔的应用前景。
本发明制备的多重信号放大的磁弛豫时间免疫传感器的优势在于:
1.首次将集磁分离和磁传感于一体的纳米磁颗粒与Gd3+可控组装成为多功能纳米磁探针,实现了传感信号的多重放大,极大提高了传感器的性能。
2.以纳米磁颗粒为载体,将磁分离与磁传感集为一体,避免了传统的磁免疫传感分析中免疫磁富集和磁传感分别采用不同的纳米磁颗粒,造成免疫磁分离与磁信号读出分步进行的缺点,极大地简化了分析步骤,从而提高传感方法的检测速度与稳定性。
3.本发明中构建的磁免疫传感器,灵敏度高,特异性强,操作简便,检测效率高,避免使用HPLC-MS等大型仪器,应用前景广阔。
附图说明
图1是本传感器检测莱克多巴胺的原理图,图中,a为磁探针的组装示意图;b为传感器的检测示意图。
图2不同粒径磁颗粒信号比较。
图3多聚赖氨酸与磁颗粒质量比的优化结果。
图4 DOTA-NHS ester的浓度优化结果。
图5 Gd3+磁信号测定结果,图中,A为不同浓度Gd3+的横向弛豫时间(T2)与纵向弛豫时间(T1),B为Gd3+的T2和T1与浓度的线性关系。
图6 Gd3+浓度优化结果。
图7磁颗粒偶联Gd3+前后的SEM及能谱对比图,图中,A、D、G分别是纳米磁颗粒,Ab-MNP150-多聚赖氨酸,Ab-MNP150-多聚赖氨酸-DOTA-Gd3+的SEM图,B、E、H分别是纳米磁颗粒,Ab-MNP150-多聚赖氨酸,Ab-MNP150-多聚赖氨酸-DOTA-Gd3+的能谱对比图,C、F、I分别是纳米磁颗粒,Ab-MNP150-多聚赖氨酸,Ab-MNP150-多聚赖氨酸-DOTA-Gd3+的元素百分比图。
图8磁颗粒偶联Gd3+前后性质变化对比图。图中,(A)磁颗粒偶联Gd3+前后磁弛豫率的变化;(B)磁颗粒偶联Gd3+前后粒径的改变;(C)磁颗粒偶联Gd3+前后电位的改变。
图9 BCA试剂盒检测多聚赖氨酸的标准曲线图。
图10本传感器多功能磁纳米探针的用量优化结果。
图11本磁弛豫免疫传感器检测莱克多巴胺的标准曲线及与传统方法灵敏度的对比图。图中,A是两种传感器检测到的T2值,B是两种传感器检测到的T2值与浓度的线性关系,C是ELISA方法检测结果,D是ELISA方法检测的LOD与浓度的线性关系。
图12本磁弛豫免疫传感器检测莱克多巴胺的特异性结果。
图13本磁弛豫免疫传感器检测实际样品中的莱克多巴胺的结果及与HPLC-MS及ELISA对比的结果。
图14本磁弛豫免疫传感器检测实际样品中的降钙素原的结果及与化学发光免疫方法及ELISA对比的结果。
图15本磁弛豫免疫传感器检测实际样品中的单增李斯特菌的结果及与PCR及ELISA对比的结果。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了,所述实施例仅是帮助理解本发明,不应视为对本发明的具体限制。
所用的试剂仪器设备来源:
1.多聚赖氨酸(MW:3-7W):上海源叶公司
2.氨基修饰的150nm磁颗粒(MNP150):Ocean NanoTech公司(美国)
3.羟基琥珀酰亚胺-四氮杂环十二烷四乙酸酯(DOTA-NHS ester):Macrocyclics公司(美国)
4.莱克多巴胺单克隆抗体、莱克多巴胺-BSA、莱克多巴胺ELISA试剂盒:北京勤邦生物科技有限公司
5.GdCl3水合物:ALORICH Chemistry公司(美国)
6.莱克多巴胺、降钙素原、克伦特罗、沙丁胺醇、氯霉素、新霉素、牛血清白蛋白:上海Sigma-Aldrich公司
7.磁分离架:上海万润纳米科技公司
8. 0.5T核磁共振仪(PQ 001):上海纽迈公司
9.猪尿样品:由华中农业大学动物科学技术学院提供
10.血清样品:由北京友谊医院提供
实施例1.本磁弛豫免疫传感器中多功能纳米磁探针的制备
(1)“Ab-MNP150-多聚赖氨酸”偶联物的制备
将20μL EDC(10mg/ml)与10μL NHS(10mg/ml)加入到100μL莱克多巴胺单克隆抗体(Ab)溶液(2.5mg/mL)中,室温下缓慢涡旋反应5-15min。在上述混合溶液中加入500μLMNP150(2mg/mL),并缓慢涡旋反应50-60min。通过磁分离除去未反应的抗体,并用500μL PBS(0.01M,pH=7.4)缓冲液重悬,得到Ab-MNP150偶联物。将20μL EDC(10mg/ml)与10μL NHS(10mg/ml)加入到100μL多聚赖氨酸(20mg/mL)溶液中,缓慢震荡反应10-20min后,加入到上述Ab-MNP150偶联物重悬液中,缓慢涡旋反应1-2h。通过磁分离除去未反应的多聚赖氨酸,最终用PBS(0.01M,pH=7.4)缓冲液洗涤并重悬,得到Ab-MNP150-多聚赖氨酸偶联物,4℃保存备用。
在本实施例中,我们首先通过测定不同粒径磁颗粒(MNP150,MNP250,MNP1000)的磁信号对纳米磁颗粒进行了优选。即测定了相同浓度下,三种磁颗粒信号的差异,其中△T2值为同等条件下超纯水的T2值减去磁颗粒的T2值。如图2所示,MNP150具有较强信号,特别是低浓度下,其磁信号比其他几种纳米颗粒的磁信号强,具有很大的优势。因此,选择MNP150用于后续实验。
在本实施例优化了多聚赖氨酸与磁颗粒的质量比,磁颗粒的质量为1mg,分别与不同质量的多聚赖氨酸进行偶联。结果如图3所示,当多聚赖氨酸质量为0.2mg时,T2值最小,磁信号最强,因此,将磁颗粒:多聚赖氨酸质量比5:1作为最终条件。
本实施例及后续实施例中,横向弛豫时间(T2)通过一台0.5T核磁共振仪对其进行测定。使用CPMG脉冲序列进行T2测量,参数如下(NMR频率:19MHz;TW(ms):18000;TE(ms):1;PRG:3;NECH:18000;SW:100)。
(2)“Ab-MNP150-多聚赖氨酸-DOTA”偶联物的制备
取160μL DOTA-NHS ester(20nM)加入到Ab-MNP150-多聚赖氨酸偶联物中,在PBS(0.01M,pH=7.4)缓冲液中室温缓慢震荡反应1-2h。磁分离并洗涤两次,最终用去离子水重悬,得到Ab-MNP150-多聚赖氨酸-DOTA偶联物,4℃保存备用。
在本实施例优化了DOTA-NHS ester的浓度。结果如图4所示,当DOTA-NHS ester的浓度为20nM时,T2值最小,磁信号最强,因此,将20nM的DOTA-NHS ester作为最终添加浓度。
(3)“Ab-MNP150-多聚赖氨酸-DOTA-Gd3+”磁探针的制备
将500μL Ab-MNP150-polylysine-DOTA偶联物与300μL Gd3+溶液(100nM)在去离子水中混匀并缓慢涡旋反应3-4h。反应完成后,磁分离洗涤2-4次,并用去离子水重悬,得到“Ab-MNP150-多聚赖氨酸-DOTA-Gd”磁探针,4℃保存备用。
本实施例测定了Gd3+的横向弛豫时间(T2)与纵向弛豫时间(T1)。结果如图5所示,Gd3+的T2和T1在0.01-10mM范围内均具有良好的线性关系,均具有良好的弛豫效率。
本实施例优化了Gd3+的添加浓度。结果如图6所示,当Gd3+的添加浓度为100nM时,T2值最小,磁信号最强,因此,将100nM的Gd3+作为最终添加浓度。
本实施例对构建的纳米磁探针进行了SEM及能谱表征,如图7所示,在Gd3+偶联前后,磁颗粒表面由粗糙变为光滑。
本实施例对比了磁颗粒偶联Gd3+前后磁弛豫率及粒径和电位的变化。结果如图8所示,磁颗粒在偶联Gd3+前后磁弛豫效率显著提高(图8A),粒径增大(图8B),电位变化显著(图8C)。
在本实施例中,我们计算了纳米磁颗粒上可偶联的Gd3+的数量。首先通过BCA试剂盒测定多聚赖氨酸偶联在磁颗粒上的质量(图9为标准曲线),经计算,1mg MNP150可以偶联195.9μg的多聚赖氨酸(MW=30~70KDa,以50KDa计),分子数为2.358×1015,1mg MNP150含有5×1010个磁颗粒,因此每个磁颗粒上可偶联多聚赖氨酸的分子数为4.72×104个,每个多聚赖氨酸约含有390个多余的氨基,这些氨基可与DOTA-NHS酯偶联,进而螯合Gd3+。因此,每个磁颗粒可偶联的Gd3+数量为390×4.72×104=1.84×107个。
实施例2.本磁弛豫免疫传感器的构建及与传统方法灵敏度的对比
将100μL莱克多巴胺完全抗原(50μg/mL)包被在ELISA板上,并在37℃下孵化1-2h,用PBST(0.05%Tween-20)缓冲液洗涤2-4次,备用。将100μL Ab-MNP150-多聚赖氨酸-DOTA-Gd3+磁探针加入到梯度浓度的莱克多巴胺(Rac)标准溶液中,37℃下反应15-20min。通过磁分离得到Rac-Ab-MNP150-多聚赖氨酸-DOTA-Gd3+偶联物和未反应的Ab-MNP150-多聚赖氨酸-DOTA-Gd3+磁探针,并将它们加入到上述ELISA板中,室温反应20-60min。用PBST缓冲液洗涤2-4次,除去未反应的Ab-MNP150-多聚赖氨酸-DOTA-Gd3+磁探针。然后加入200μL PBST(5%Tween-20)缓冲液,保持3min,收集洗脱液,并进行T2信号的测定。
本实施例优化了磁探针的添加浓度。具体为分别添加不同浓度的Ab-MNP150-多聚赖氨酸-DOTA-Gd3+磁探针对梯度浓度的莱克多巴胺进行检测。结果如图10所示,当磁探针添加浓度为100μg/mL时,对莱克多巴胺的检测效果最好。因此,将100μg/mL的磁探针作为最终添加浓度。
在本实施例中,我们将本传感器与传统的磁弛豫时间免疫传感器及ELISA进行了对比。传统的磁弛豫时间免疫传感器以“Ab-MNP150”代替本传感器中的“Ab-MNP150-多聚赖氨酸-DOTA-Gd3+”,其他与本传感器相同。ELISA使用商业化试剂盒进行测定。结果如图11所示,本传感器线性范围为0.1-100ng/mL(Y=761X+1123,R2=0.99),传统MRS线性范围为0.5-100ng/mL(Y=902X+622,R2=0.99),本传感器具有更宽的线性范围;ELISA的LOD为576pg/mL,本传感器的LOD为20pg/mL。因此,本传感器具有更高的灵敏度与线性检测范围。
实施例3.本磁弛豫免疫传感器特异性与回收率的测定
(1)在特异性试验中,使用克仑特罗、沙丁胺醇、氯霉素、新霉素来作为干扰物质,以检测本传感器的灵敏度。这些类似物的浓度为10ng/mL,莱克多巴胺的浓度为0.5ng/mL。如图12所示,只有莱克多巴胺能够导致T2值的显著变化,其他类似物对磁信号的影响可以忽略不计。
2)回收率采用标准加入法进行了研究,即在空白样品中加入不同浓度的莱克多巴胺(0,0.05,0.1,0.5,1,5,10,50,100ng/mL)。如表1所示,莱克多巴胺检测回收率(90%-110%)也表明了该方法的准确性。
表1.本传感器检测空白样品中莱克多巴胺的回收率
莱克多巴胺添加浓度(ng mL<sup>-1</sup>) | 莱克多巴胺检测浓度(ng mL<sup>-1</sup>) | 回收率(%) |
0.1 | 0.09 | 90 |
0.5 | 0.55 | 110 |
1 | 1.06 | 106 |
10 | 10.14 | 101.4 |
50 | 51.5 | 103 |
100 | 96.8 | 96.8 |
实施例4.本磁弛豫免疫传感器用于样品中莱克多巴胺的定量检测
将猪尿样品用5倍体积的PBS缓冲液进行稀释,将稀释液通过本磁弛豫时间免疫传感器进行分析莱克多巴胺的含量,并用HPLC-MS和ELISA进行方法学比对。如图13所示,本传感器的检测结果与HPLC-MS相似,证明本传感器具有良好的准确性。
实施例5.本磁弛豫免疫传感器用于降钙素原和单增李斯特菌的定量检测
为检验本传感器的通用性,本实施例对生物大分子进行了检测,所检测目标物为降钙素原或单增李斯特菌。具体流程与实施例1、2相似,不同之处在于将磁探针中的莱克多巴胺抗体替换为降钙素原或单增李斯特菌的捕获抗体,将包被在ELISA板上的完全抗原替换为降钙素原或单增李斯特菌的检测抗体,经过免疫反应所形成的结构为“双抗夹心”结构,并将其用于真实样品的检测。结果如图14、15所示,本传感器检测降钙素原的结果与化学发光免疫法相似,本传感器检测单增李斯特菌的结果与PCR相似,证明本传感器具有良好的准确性。
Claims (9)
1.一种磁弛豫时间免疫传感器磁信号探针,包括偶联有抗体的超顺纳米磁颗粒,其特征在于:还包括顺磁性Gd3+离子,首先通过氨基与羧基的缩合作用将多聚赖氨酸和抗体偶联到超顺纳米磁颗粒表面,得到具有多维空间网状树枝结构的抗体-超顺纳米磁颗粒-多聚赖氨酸偶联物,然后将对顺磁性Gd3+离子具有螯合性能的DOTA-NHS ester偶联在多聚赖氨酸的表面,最后加入顺磁性Gd3+离子,通过DOTA捕获Gd3+,从而将大量的Gd3+离子螯合在超顺纳米磁颗粒表面,得到抗体-超顺纳米磁颗粒-多聚赖氨酸-DOTA- Gd3+多重信号放大的磁弛豫时间免疫传感器磁信号探针。
2.如权利要求1所述的磁弛豫时间免疫传感器磁信号探针,其特征在于:所述超顺纳米磁颗粒是氨基修饰的粒径为50-500纳米的磁颗粒。
3.如权利要求2所述的磁弛豫时间免疫传感器磁信号探针,其特征在于:所述磁颗粒的粒径为150纳米。
4.如权利要求1所述的磁弛豫时间免疫传感器磁信号探针,其特征在于:所述超顺纳米磁颗粒与多聚赖氨酸的质量比为5:1。
5.如权利要求1所述的磁弛豫时间免疫传感器磁信号探针,其特征在于:所述DOTA-NHSester的浓度为20 nM。
6.如权利要求1所述的磁弛豫时间免疫传感器磁信号探针,其特征在于:所述Gd3+的添加浓度为100 nM,每个超顺纳米磁颗粒可偶联的Gd3+数量为1.84×107个。
7.权利要求1-6任何一项所述的磁弛豫时间免疫传感器磁信号探针在检测食品中有害物残留和动物体内生物标志物中的应用。
8.一种非诊断目的检测食品中有害物残留或动物体内生物标志物的磁弛豫时间免疫传感器方法,其特征在于包括以下步骤:将权利要求1-6任何一项所述的磁弛豫时间免疫传感器磁信号探针和待测样品反应,然后磁分离,将反应后的磁信号探针加入到包被有待测物完全抗原或者识别待测物抗体的ELISA板上,进行免疫反应,最后洗脱特异性吸附在ELISA板上的磁信号探针,并进行横向弛豫时间的测定。
9.如权利要求8所述的检测方法,其特征在于:所述有害物为莱克多巴胺或单增李斯特菌,所述生物标志物为降钙素原。
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