CN110642848A - 新型可见光与近红外荧光染料的合成与其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了新型可见光与近红外荧光染料的合成与其应用，其制备方法是：制备中间体，与费歇尔吲哚醛反应，即得到前四种该荧光染料，继而，把后两种荧光染料作为中间体，使之甲基化，继续生成另两种荧光染料；本发明的荧光染料光稳定性强、水溶性好、背景干扰弱、高量子产率、灵敏度高、低毒甚至无毒；根据不同的修饰基团，其波长可根据需求得到改变；荧光探针分子波长可以高于700nm，穿透力强，对细胞伤害低，自发荧光干扰小，可实时、定量分析。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物或医用荧光染料及其应用。
背景技术
荧光染料被广泛用于标记、检测、定量样品中的组分，将荧光染料共轭于配体比如蛋白质、抗体、酶、核苷酸、核酸、以及其他生物学和非生物学分子来制备被染料标记的配体，被染料标记的配体是重要的可赋予特异性用于随后的生物化学反应的试剂，在生物化学反应中，荧光染料可提供一种用于检测和/或定量该反应的方法。现有常规的荧光染料为罗丹明类染料以及吲哚菁绿类染料，但是现有染料存在波长范围较窄、荧光量子效率偏低、光稳定性弱、水溶性差等问题。
发明内容
为了克服现有荧光染料各自的缺陷，现提供一种方案，即本发明公开了一种荧光染料及其应用；得到的荧光探针的发射波长高于700nm，甚至高于800nm，高于常规罗丹明探针（500至600 nm）、常规吲哚菁绿类探针（600至650 nm）。
本发明采用如下技术方案：
一种荧光染料，为如下化学结构式中的一种：
其中R1、R2、R3独立的选自氢、烷基或者环烷基；R4选自CH3、(CH2)xCH3、（CH2）xSO3、或（CH2）xCO2；R5、R6、R7独立的选自氢、羧基（-COOH）或者磺酸基（-SO3 -）；n为1～5；x为1～5。
本发明的荧光染料为内盐结构或者为阴离子配位结构，满足电荷平衡，阴离子Y可以为卤素离子，比如氯离子、溴离子、碘离子或者为磺酸根离子。
优选的，烷基或者环烷基中，碳原子数量小于6，比如乙基、丙基、异丙基等。
本发明公开了上述荧光染料的制备方法，包括以下步骤：
（1）将三羟基苯胺化合物、咪唑甲醛化合物、环己酮反应，制备中间体甲；
（2）将中间体甲、费歇尔吲哚醛反应，制备所述荧光染料；
或者
（3）将中间体甲、费歇尔吲哚醛反应制备中间体乙；然后将中间体乙甲基化，制备所述荧光染料。
本发明中，三羟基苯胺化合物的化学结构式如下：
咪唑甲醛化合物的化学结构式如下结构式中的一种：
中间体甲的化学结构式如下结构式中的一种：
中间体乙为步骤（2）的产物，也是本发明公开的荧光染料中的一种，具体为以下化学结构式中的一种：
费歇尔吲哚醛为以下化学结构式中的一种：
上述技术方案中，步骤（1）中，将浓硫酸加入三羟基苯胺化合物与水的混合物中，然后加入咪唑甲醛化合物，再加入环己酮，然后第二次加入浓硫酸，然后搅拌反应，搅拌反应结束后用浓氨水中和，得到中间体甲；优选的，于0℃～-40℃下将浓硫酸加入三羟基苯胺化合物与水的混合物中，然后于0℃下加入咪唑甲醛化合物，然后于室温搅拌后再加入环己酮，然后再次室温搅拌后于0℃～-40℃下第二次加入浓硫酸；搅拌反应结束后将反应物加入冰水中，然后用浓氨水中和，再经过浓缩、柱分离，得到中间体甲。浓硫酸为常规浓硫酸，质量浓度为98%；浓氨水为常规浓氨水，质量浓度为28%。浓硫酸加入三羟基苯胺化合物与水的混合物中时，浓硫酸、三羟基苯胺化合物、水的用量比为0.54mL∶10mol∶17mL；三羟基苯胺化合物、咪唑甲醛化合物、环己酮的摩尔比为1∶1∶1；第二次加入浓硫酸时，浓硫酸的用量与三羟基苯胺化合物的用量比为22mL∶10mol。室温搅拌的时间为12小时，再次室温搅拌的时间为12小时，搅拌反应为室温搅拌反应0.5小时后120℃时搅拌12小时。
上述技术方案中，步骤（2）中，将中间体甲、费歇尔吲哚醛加入乙酸酸酐中，搅拌反应，得到荧光染料；优选的，搅拌反应的温度为1~100℃，搅拌反应结束后，于室温下加入水，然后浓缩、分离，得到荧光染料。中间体甲、费歇尔吲哚醛的摩尔比为1∶1。
上述技术方案中，步骤（3）中，将中间体甲、费歇尔吲哚醛加入乙酸酸酐中，搅拌反应，得到中间体乙，将中间体乙与对甲苯磺酸甲酯先反应后加入乙酸乙酯，继续反应，得到荧光染料；优选的，搅拌反应的温度为1~100℃，搅拌反应结束后，于室温下加入水，然后浓缩、分离，得到中间体乙；先反应为在40~200℃条件下回流2分钟~24小时，继续反应为回流反应2分钟~24小时。中间体甲、费歇尔吲哚醛的摩尔比为1∶1；中间体乙、对甲苯磺酸甲酯、乙酸乙酯的用量比为1mol∶10mL∶100mL。继续反应结束后，除去乙酸乙酯，剩余的固体用乙腈洗涤、过滤，得到荧光染料。
本发明中，步骤（1）可表示如下：
步骤（2）可表示如下：
步骤（3）中的甲基化可表示如下：
本发明技术方案的有益效果是：
本发明公开了新型荧光探针；经实验发现，其光稳定性强、水溶性高、背景干扰弱、高量子产率、灵敏度高、低毒甚至无毒。而咪唑环的应用有别于传统的苯环，其益处很显然：施加以不同的修饰基团，那么该荧光物质的波长就可以根据需求得到改变。因此，该荧光染料的探针分子波长可达到高于800nm，穿透力得以增强，对细胞伤害降低；同时，背景干扰少（自发荧光干扰小）；还可以实现实时、定量观测与分析。
附图说明
图1为本发明内盐产物的质谱图；
图2为本发明甲基化产物的质谱图；
图3为实施例二染料的溶液照片；
图4为本发明染料与现有染料的蛋白质免疫印迹图。
具体实施方式
下面以实例来进一步说明权利要求书和发明内容。
实施例一
当R1、R2为乙基，R3为氢，n = 5时，具体的反应如下：
该化学式最左端是3-羟基-N, N-二乙基苯胺，往右依次是1-（6-乙酸乙脂）-1H-咪唑-2-甲醛和环己酮，箭头右侧产物即为中间体甲的一种具体形式，具体步骤如下：
a. 把10摩尔3-羟基-N, N-二乙基苯胺与17毫升水混合，搅拌均匀后，整个混合物被冷凝至-20℃；
b. 加入0.54毫升浓硫酸（98wt%），整个混合物在1分钟内被逐渐升至0℃；
c.按照与3-羟基-N, N-二乙基苯胺1：1的摩尔比加入1 -（6-乙酸乙脂）-1H-咪唑-2-甲醛，整个混合物5分钟内被逐渐升至室温，搅拌12小时；
d.按照与3-羟基-N, N-二乙基苯胺1：1摩尔比加入环己酮，在室温下搅拌12小时；
e. 于-20℃下加入22毫升浓硫酸（98wt%），2分钟内逐渐升至室温；
f. 整个混合物在室温下搅拌30分钟，然后在120℃时搅拌12小时；
g. 整个混合物冷却至室温，倒在100毫升冰水中，然后用浓氨水（浓度为28wt%）中和至中性；
h. 把中和后的冰水混合物浓缩，然后用氧化铝柱子常规分离，得到中间体甲。
以上a至h依次进行。
当R1、R2为乙基，R3为氢，R4为甲基，R6、R7为磺酸基，n = 5时，反应如下：
其中箭头最左侧属于中间体甲，紧靠其右是费歇尔吲哚醛，箭头右侧属于中间体乙，它也是本发明产物荧光染料的一种具体表现形式，具体步骤如下：
把等摩尔量的中间体甲与费歇尔吲哚醛溶解在10毫升的乙酸酸酐中；然后50℃搅拌反应1小时；反应结束混合物被冷却至室温后，加入10毫升的水，然后浓缩混合物；再通过常规制备液相色谱的方法，分离出中间体乙，为荧光染料，激发光谱为763 nm,发射光谱为798nm。
箭头上方为对甲苯磺酸甲酯，箭头左侧属于中间体乙，为内盐结构，也属于本发明最终产物，箭头右侧属于最终产物的另一种具体形式，以磺酸根离子达到电荷平衡，为常识，负离子磺酸根对产物以及性能应用没影响，为了简洁，本发明未标注，其激发光谱为790nm,发射光谱为827 nm，制备的步骤为：
在250毫升圆底烧瓶中，加入1摩尔中间体乙、10毫升对甲苯磺酸甲酯，然后在90℃条件下回流2小时；然后加入100毫升乙酸乙酯，继续回流2小时，然后冷凝至室温；再倾倒出乙酸乙酯，剩余的固体用乙腈洗涤、搅拌，重复3次，过滤，得到产物荧光染料。
实施例二
将实施例一中的费歇尔吲哚醛替换为式①化合物，将实施例一中的3-羟基-N, N-二乙基苯胺替换为3-羟基-N, N-二甲基苯胺；其余与实施例一致，得到产物荧光染料，结构式如下：
式①化合物结构式如下：
本实施例产物未甲基化荧光染料的激发光谱为753 nm,发射光谱为782 nm，质谱图见图1；甲基化荧光染料的激发光谱为780 nm,发射光谱为813 nm。
实施例三
将实施例一中的费歇尔吲哚醛替换为式②化合物；其余与实施例一致，得到产物荧光染料，结构式如下：
式②化合物结构式如下：
本实施例产物未甲基化荧光染料的激发光谱为728 nm,发射光谱为757 nm；甲基化荧光染料的激发光谱为755 nm,发射光谱为786 nm。
.实施例四
将实施例一中的1-（6-乙酸乙脂）-1H-咪唑-2-甲醛替换为式③化合物或者式④的化合物；其余与实施例一致，得到产物荧光染料，结构式如下：
本实施例产物未甲基化荧光染料的激发光谱为721 nm,发射光谱为750 nm；甲基化荧光染料的激发光谱为752 nm,发射光谱为781 nm。
本实施例产物未甲基化荧光染料的激发光谱为720 nm,发射光谱为751nm；甲基化荧光染料的激发光谱为753nm,发射光谱为784nm。
式③化合物结构式如下：
式④化合物结构式如下：
实施例五
将实施例三中的1-（6-乙酸乙脂）-1H-咪唑-2-甲醛替换为式③化合物或者式④的化合物（实施例四）；其余与实施例一致，得到产物荧光染料，结构式如下：
本实施例产物未甲基化荧光染料的激发光谱为701 nm,发射光谱为732 nm；甲基化荧光染料的激发光谱为728nm,发射光谱为761 nm。
本实施例产物未甲基化荧光染料的激发光谱为699 nm,发射光谱为730 nm；甲基化荧光染料的激发光谱为731 nm,发射光谱为765 nm。
根据上述方法，通过原料取代基的更换，本发明制备的最终产物的分子式如下：
其中R1、R2、R3独立的选自氢、烷基或者环烷基；R4选自CH3、(CH2)xCH3、（CH2）xSO3、或（CH2）xCO2；R5、R6、R7独立的选自氢、羧基或者磺酸基；n为1～5；x为1～5；Y为阴离子，包括卤素离子或者磺酸根离子，负离子对产物以及性能应用没影响，为了简洁，本发明在具体实施例未标注。
本发明公开的荧光染料经实验发现，其光稳定性强、水溶性高、背景干扰弱、高量子产率、灵敏度高、低毒甚至无毒，采用常规MTT法（参见CN107418557A）实验发现细胞存活率超过99%（0～50微克/毫升）；而且发射波长范围较长、荧光量子效率高，可以进入近红外区，尤其是咪唑环的应用有别于传统的苯环，施加以不同的修饰基团，荧光物质的波长就可以得到改变，适用检测范围更广。
实施例六
以如下化合物为染料进行蛋白染色：
以磺酸根为阴离子，为常规阴离子平衡，对技术效果没有影响，质谱图见图2；图3为实施例二中未甲基化荧光染料的水溶液，其浓度可以达到880毫克每毫升。
首先常规提取hela cell （海拉宫颈癌细胞）的蛋白，然后依据标准WB实验步骤（west blot）进行实验。WB 标准操作实验步骤如下：提取蛋白，然后蛋白定量，接着制备蛋白胶并准备电泳和转膜，转膜之后分别进行一抗与二抗的孵育，孵育结束之后，进行显影（激发光源为cy7通道）。在做WB实验过程中，所用的一抗为1:5000 Mouse tubulin（鼠一抗），使用的二抗则是用本发明上述染料标记做成的羊抗鼠（GAM），所得到的WB效果图如附图4，其中最左列表示常规蛋白分子量指示剂，中间列、最右列都是本发明染料的结果，左边数值表示分子量Kb，说明本发明染料检测结果准确、稳定。
Claims (10)
1.一种荧光染料，为如下化学结构式中的一种：
其中R1、R2、R3独立的选自氢、烷基或者环烷基；R4选自CH3、(CH2)xCH3、（CH2）xSO3、或（CH2）xCO2；R5、R6、R7独立的选自氢、羧基或者磺酸基；n为1～8的整数；x为1～8的整数；Y为阴离子。
2.根据权利要求1所述荧光染料，其特征在于，所述烷基或者环烷基中，碳原子数量小于8；阴离子Y包括卤素离子或者磺酸根离子。
3.根据权利要求1所述荧光染料，其特征在于，所述荧光染料的制备方法包括以下步骤：
（1）将三羟基苯胺化合物、咪唑甲醛化合物、环己酮反应，制备中间体甲；
（2）将中间体甲、费歇尔吲哚醛反应，制备所述荧光染料；
或者
（3）将中间体甲、费歇尔吲哚醛反应制备中间体乙；然后将中间体乙甲基化，制备所述荧光染料。
4.根据权利要求1所述荧光染料，其特征在于，三羟基苯胺化合物的化学结构式如下：
咪唑甲醛化合物的化学结构式如下结构式中的一种：
中间体甲的化学结构式如下结构式中的一种：
费歇尔吲哚醛为以下化学结构式中的一种：
5.根据权利要求1所述荧光染料，其特征在于，步骤（1）中，将浓硫酸加入三羟基苯胺化合物与水的混合物中，然后加入咪唑甲醛化合物，再加入环己酮，然后第二次加入浓硫酸，然后搅拌反应，搅拌反应结束后用浓氨水中和，得到中间体甲；步骤（2）中，将中间体甲、费歇尔吲哚醛加入乙酸酸酐中，搅拌反应，得到荧光染料；步骤（3）中，将中间体甲、费歇尔吲哚醛加入乙酸酸酐中，搅拌反应，得到中间体乙，将中间体乙与对甲苯磺酸甲酯先反应后加入乙酸乙酯，继续反应，得到荧光染料。
6.根据权利要求1所述荧光染料，其特征在于，步骤（1）中，于0℃～-40℃下将浓硫酸加入三羟基苯胺化合物与水的混合物中，然后于0℃下加入咪唑甲醛化合物，然后于室温搅拌后再加入环己酮，然后再次室温搅拌后于0℃～-40℃下第二次加入浓硫酸；搅拌反应结束后将反应物加入冰水中，然后用浓氨水中和，再经过浓缩、柱分离，得到中间体甲；步骤（2）中，搅拌反应的温度为1~100℃，搅拌反应结束后，于室温下加入水，然后浓缩、分离，得到荧光染料；步骤（3）中，搅拌反应的温度为1~100℃，搅拌反应结束后，于室温下加入水，然后浓缩、分离，得到中间体乙；先反应为在40~200℃条件下回流2分钟~24小时，继续反应为回流反应2分钟~24小时，继续反应结束后，除去乙酸乙酯，剩余的固体用乙腈洗涤、过滤，得到荧光染料。
7.根据权利要求1所述荧光染料，其特征在于，步骤（1）中，浓硫酸加入三羟基苯胺化合物与水的混合物中时，浓硫酸、三羟基苯胺化合物、水的用量比为0.54mL∶10mol∶17mL；三羟基苯胺化合物、咪唑甲醛化合物、环己酮的摩尔比为1∶1∶1；第二次加入浓硫酸时，浓硫酸的用量与三羟基苯胺化合物的用量比为22mL∶10mol；步骤（2）中，中间体甲、费歇尔吲哚醛的摩尔比为1∶1；步骤（3）中，中间体甲、费歇尔吲哚醛的摩尔比为1∶1；中间体乙、对甲苯磺酸甲酯、乙酸乙酯的用量比为1mol∶10mL∶100mL。
8.权利要求1所述荧光染料作为荧光探针或者在制备荧光探针中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述荧光探针为蛋白质荧光探针或者核酸荧光探针。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述荧光探针的发射波长高于700nm。
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