JP6327565B2 - クマリン誘導体が結合した蛍光標識糖誘導体を用いた細胞イメージング方法及びイメージング剤 - Google Patents
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Description
D−ガラクトースは、エネルギー源として利用される糖であり、乳、果実類、野菜類に豊富に含まれているほか、ヒトの体内でも一日2g程度が産生されている。たとえば牛乳の2-8%を占める二糖類ラクトースは、D-ガラクトースとD−グルコースがグリコシド結合したもので、小腸で吸収される際に両者がラクターゼにより分離されて、グルコーストランスポーターの一種であるSGLTを介して体内に吸収されることが知られている。D−ガラクトースが小腸上皮細胞から血管へ運ばれる際にはグルコーストランスポーターGLUT2を通過する。細胞内に取り込まれたガラクトースは、1位にリン酸化を受けた後、解糖系に入りエネルギーとして利用され、あるいは糖脂質や糖タンパクの生合成に利用される。一方、L−ガラクトースは、霊長類が生合成できない抗酸化物質ビタミンC(L−アスコルビン酸)が、植物内においてD−グルコースから生合成される際の経路の一つSmirnoff-Wheeler経路の中間代謝産物としての記載があるが、一般に生物学に登場することがまれな希少糖である。
D−ガラクトースを18Fで標識した2-deoxy-2[18F]fluoro-D-galactoseは、肝臓の代謝解析への適用例がある(非特許文献1)。2-deoxy-2[18F]fluoro-D-galactoseは、がんにおけるガラクトース代謝イメージングへの利用可能性が報告されたが一般化していない(非特許文献2)。
放射性標識体として1-deoxy-1-[18F]fluoro-D-fructoseが合成され、腫瘍への中程度の取り込みが報告されたが、本分子は細胞内で代謝を受けないとみられ、利用されていない。最近では細胞内代謝を受ける6-deoxy-6-[18F]fluoro-D-fructoseが合成され、乳がんにおけるGLUT5を介した取り込みを標的とするPETトレーサー候補として報告されている(非特許文献3)。
D−マンノースが特異的に結合するマンノース受容体は、炎症時に増加する高マンノース糖タンパクの除去に役立つ。例えば、日和見感染症の一種でエイズ患者の死因第一位を占めるカリニ肺炎の原因菌P.cariniの膜表面には高マンノース糖鎖部分があり、肺胞のマクロファージに発現するマンノース受容体がこれを認識して、マクロファージの移動を促進する。D−マンノースのみならず、L−ガラクトースにも、強力なマクロファージ刺激作用があるほか、D−マンノース、L−ガラクトースの両者とも植物におけるビタミンC生合成の前駆体として利用される。
[18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-mannoseが、がんのトレーサーとして利用可能であることが報告されているが一般化していない(非特許文献4、非特許文献5)。
従来、生物がD−グルコースをどのようにして細胞内に取り込んで利用するのかについての研究は、例えばラジオアイソトープで標識したD−グルコースやその誘導体(D−デオキシグルコースなど)を用いて細胞内のラジオアイソトープ量を測定することで行われてきた。しかしながら、この方法は定量性に優れるものの、感度が低いといった問題があることに加え、測定手法上、生きた細胞がD−グルコースを取り込む様子をリアルタイムで連続的に観察することができないという欠点を有していた。そこで、本発明者らのグループは、生きた細胞のD−グルコースの動的な取り込みプロセスの研究に使用することができる方法として、D−デオキシグルコースの2位に蛍光発色団としてN−(7−ニトロベンズ−2−オキサ−1,3−ジアゾール−4−イル)アミノ基を結合せしめた、緑色の蛍光を発する2−[N−(7−ニトロベンズ−2−オキサ−1,3−ジアゾール−4−イル)アミノ]−2−デオキシ−D−グルコース(2-NBDG)を用いる方法を提案し、その有用性を哺乳動物の各種の細胞を用いて実証した(非特許文献6)。
また、D−フルクトースの1位にNBDを結合した分子(1-NBDF)を乳がんに応用した報告がある(非特許文献8)。
このようにNBDを分子内に有する、グルコース誘導体やフルクトース誘導体が、生きた細胞を個々の細胞レベルでイメージングできる蛍光標識糖誘導体として知られている。
また、他のヘキソースについても、上記したようにその放射性標識体を用いてがんの検出やイメージングへの応用が試みられてきた。しかし、D−グルコースと同様に、D体であるためにその利用が制限される他、個々の単一細胞における違いをリアルタイムに精度よく検出できないといった問題がある。
1.蛍光分子団として3−カルボキシ−6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシクマリン又は3−カルボキシメチル−6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシ−4−メチルクマリンを分子内に有する蛍光標識糖誘導体を含む、標的細胞又は標的細胞内分子(標的細胞内分子とは、標的細胞の内側、すなわち細胞質又は核内に存在する分子、標的細胞の細胞膜中に存在する分子、標的細胞の細胞膜上に存在する分子を含む。)をイメージングするための組成物。
2.蛍光標識糖誘導体が、グルコース誘導体、フルクトース誘導体、ガラクトース誘導体又はマンノース誘導体である、上記1に記載の組成物。
3.前記蛍光分子団が、グルコース、フルクトース、ガラクトース又はマンノースに、−NH−結合を介して結合している、上記2に記載の組成物。
4.蛍光標識糖誘導体が、グルコースの1位、2位、3位、4位又は6位(好ましくは、2位、3位、4位又は6位、より好ましくは2位、4位又は6位)に、蛍光分子団として3−カルボキシ−6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシクマリン又は3−カルボキシメチル−6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシ−4−メチルクマリンを、−NH−結合を介して結合した分子である上記1に記載の組成物。
5.蛍光標識糖誘導体が、2−デオキシ−2−((6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシクマリン−3−イル)カルボキサミド)−D−グルコース、2−デオキシ−2−(2−(6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシ−4−メチルクマリン−3−イル)アセタミド)−D−グルコース、2−デオキシ−2−((6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシクマリン−3−イル)カルボキサミド)−L−グルコース、及び2−デオキシ−2−(2−(6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシ−4−メチルクマリン−3−イル)アセタミド)−L−グルコースからなる群より選ばれる分子である上記4に記載の組成物。
6.蛍光標識糖誘導体が、マンノースの1位、2位、3位、4位又は6位(好ましくは、2位、3位、4位又は6位、より好ましくは2位、4位又は6位)に、蛍光分子団として3−カルボキシ−6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシクマリン又は3−カルボキシメチル−6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシ−4−メチルクマリンを−NH−結合を介して結合した分子である上記1に記載の組成物。
7.蛍光標識糖誘導体が、2−デオキシ−2−((6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシクマリン−3−イル)カルボキサミド)−D−マンノース、2−デオキシ−2−((6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシクマリン−3−イル)カルボキサミド)−L−マンノース、2−デオキシ−2−(2−(6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシ−4−メチルクマリン−3−イル)アセタミド)−D−マンノース、及び2−デオキシ−2−(2−(6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシ−4−メチルクマリン−3−イル)アセタミド)−L−マンノースからなる群より選ばれる分子である上記6に記載の組成物。
a.標的細胞(標的細胞は、細胞そのもののほか、組織内に存在する細胞も含む)に、上記1〜7のいずれか一つに記載の組成物を接触させる工程、及び
b.該標的細胞内(標的細胞の内側、すなわち細胞質又は核内、標的細胞の細胞膜中、及び標的細胞の細胞膜上を含む。)に存在する該糖誘導体を検出する工程、
を含むイメージング方法。
9.グルコース、フルクトース、ガラクトース及びマンノースからなる群から選ばれる糖に、蛍光分子団として3−カルボキシ−6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシクマリン又は3−カルボキシメチル−6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシ−4−メチルクマリンを−NH−結合を介して結合した蛍光標識糖誘導体。
10.2−デオキシ−2−((6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシクマリン−3−イル)カルボキサミド)−D−グルコース、2−デオキシ−2−(2−(6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシ−4−メチルクマリン−3−イル)アセタミド)−D−グルコース、2−デオキシ−2−((6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシクマリン−3−イル)カルボキサミド)−L−グルコース、2−デオキシ−2−(2−(6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシ−4−メチルクマリン−3−イル)アセタミド)−L−グルコース、2−デオキシ−2−((6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシクマリン−3−イル)カルボキサミド)−D−マンノース、2−デオキシ−2−(2−(6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシ−4−メチルクマリン−3−イル)アセタミド)−D−マンノース、2−デオキシ−2−((6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシクマリン−3−イル)カルボキサミド)−L−マンノース、及び2−デオキシ−2−(2−(6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシ−4−メチルクマリン−3−イル)アセタミド)−L−マンノースからなる群より選ばれる蛍光標識糖誘導体。
12.がん又はがん細胞を検出するための方法であって、以下の工程、
a.標的細胞(標的細胞は、細胞そのもののほか、組織内に存在する細胞も含む)に、蛍光分子団として3−カルボキシ−6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシクマリン又は3−カルボキシメチル−6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシ−4−メチルクマリンを結合した蛍光標識L−グルコース誘導体を含有する組成物を接触させる工程、及び
b.該標的細胞内(標的細胞の内側、すなわち細胞質又は核内、標的細胞の細胞膜中、及び標的細胞の細胞膜上を含む。)に存在する該L−グルコース誘導体を検出する工程、
を含む検出方法。
13.前記蛍光標識L−グルコース誘導体が、L−グルコースの1位、2位、3位、4位又は6位(好ましくは、2位、3位、4位又は6位、より好ましくは2位、4位又は6位)に、蛍光分子団として3−カルボキシ−6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシクマリン又は3−カルボキシメチル−6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシ−4−メチルクマリンを−NH−結合を介して結合した分子である上記12に記載の検出方法。
14.前記蛍光標識L−グルコース誘導体が、2−デオキシ−2−((6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシクマリン−3−イル)カルボキサミド)−L−グルコース、又は2−デオキシ−2−(2−(6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシ−4−メチルクマリン−3−イル)アセタミド)−L−グルコースである上記12に記載の検出方法。
15.前記工程aにおける検出が標的細胞をイメージングすることにより行う上記12〜14のいずれか一つに記載の検出方法。
16.前記工程aにおける組成物が、2位にスルホローダミン(好ましくは、スルホーダミン101、スルホーダミンB)をスルホンアミド結合せしめた2−アミノ−2−デオキシ−L−グルコースをさらに含み、かつ前記工程bが、標的細胞内に存在する(いずれかまたは両方の)蛍光標識L−グルコース誘導体を検出する工程である、上記12〜15のいずれか一つに記載の検出方法
17.標的細胞が腫瘍細胞塊中の細胞である、上記12〜16のいずれか一つに記載の検出方法。
19.前記蛍光標識L−グルコース誘導体が、L−グルコースの1位、2位、3位、4位又は6位(好ましくは、2位、3位、4位又は6位、より好ましくは2位、4位又は6位)に、蛍光分子団として3−カルボキシ−6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシクマリン又は3−カルボキシメチル−6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシ−4−メチルクマリンを−NH−結合を介して結合した蛍光標識L−グルコース誘導体である上記18に記載のイメージング剤。
20.前記蛍光標識L−グルコース誘導体が、2−デオキシ−2−((6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシクマリン−3−イル)カルボキサミド)−L−グルコース、又は2−デオキシ−2−(2−(6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシ−4−メチルクマリン−3−イル)アセタミド)−L−グルコースである上記18に記載のイメージング剤。
21.前記イメージング剤がさらに、2位にスルホローダミン(好ましくは、スルホーダミン101又はスルホローダミンB)をスルホンアミド結合せしめた2−アミノ−2−デオキシ−L−グルコースを含む上記18〜20のいずれか一つに記載のイメージング剤。
22.2−デオキシ−2−((6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシクマリン−3−イル)カルボキサミド)−L−グルコース、又は2−デオキシ−2−(2−(6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシ−4−メチルクマリン−3−イル)アセタミド)−L−グルコースである蛍光標識L−グルコース誘導体。
23.上記17〜20のいずれか一つに記載のイメージング剤を含むがん細胞を検出するためのキット。
24.上記11〜16のいずれか一つに記載の検出方法を用いてがん細胞を検出することによって、標的細胞ががんであると診断する方法。
本発明の一つの態様は、上記イメージング剤に用いることができる特定のクマリン誘導体(パシフィックブルー又はマリーナブルー)を結合した蛍光標識糖誘導体である。
本発明の他の態様は、L−グルコースに特定のクマリン誘導体(パシフィックブルー又はマリーナブルー)を結合した蛍光標識L−グルコース誘導体を用いてがん細胞を検出するためのイメージング剤及び該イメージング剤を用いてがん細胞を検出する方法である。
本発明の他の一つの態様は、上記イメージング剤に用いることができるクマリン誘導体(パシフィックブルー又はマリーナブルー)を結合した蛍光標識L−グルコース誘導体である。
さらに、D型およびL型の立体配置に関係する糖の認識、輸送、代謝において哺乳動物細胞とは異なった性質をもつ微生物についても、D型又はL型の蛍光標識糖誘導体を用いて細胞レベルでイメージングすることにより、その機能の解明も可能である。
(I−1)蛍光標識糖誘導体
細胞又は細胞内分子のイメージングに用いることができる青色蛍光を発する本発明の蛍光標識糖誘導体は、糖、好ましくは、グルコース、フルクトース、ガラクトース又はマンノースに、蛍光分子団として3−カルボキシ−6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシクマリン(パシフィックブルー)又は3−カルボキシメチル−6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシ−4−メチルクマリン(マリーナブルー)を結合した蛍光標識糖誘導体である。
糖誘導体における蛍光分子団の結合部位は、本明細書に記載の方法又は常法により合成できれば特に制限されないが、グルコースの場合は、1位、2位、3位、4位又は6位(好ましくは、2位、3位、4位又は6位、より好ましくは2位、4位又は6位)、フルクトースの場合は、1位、3位、4位、5位又は6位(好ましくは、1位、5位又は6位、より好ましくは1位)、ガラクトース場合は、1位、2位、3位、4位又は6位(好ましくは、2位、3位、4位又は6位、より好ましくは2位、3位又は6位)、マンノース場合は、1位、2位、3位、4位又は6位(好ましくは、2位、3位、4位又は6位、より好ましくは2位、4位又は6位)をあげることができる。
以下、グルコースを参考に上記蛍光分子団の糖への結合を説明するが、他の糖においても同様である。
グルコサミンは、D−グルコサミン又はL−グルコサミンを用いることができる。D−グルコサミンは、合成したD−グルコサミン又は市販のD−グルコサミンを用いることができる。L―グルコサミンは、WO2010/16587号公報に記載の方法、又はPCT/JP2012/58439号出願明細書に記載の方法により合成することができる(これらの公報又は出願明細書の記載は引用することにより本明細書の一部である)。PCT/JP2012/58439号出願明細書に記載の方法は以下の通りである。
本発明の青色蛍光を発するグルコース誘導体は、任意の溶液、例えば、DMSO等の溶媒に溶解して用いることができ、また、細胞又は細胞内分子のイメージングにおいて用いる溶媒や溶液中でも安定であるので、イメージング剤として適している。
本発明の青色蛍光を発する糖誘導体を用いたイメージングの対象である標的細胞は、特に限定されず、哺乳動物由来の細胞、大腸菌や酵母などの微生物の細胞、植物の細胞、受精卵などを対象とすることができ、また、生体から単離した細胞、生体から単離した組織中に存在する細胞、生体の組織中に存在する細胞、生体から単離後の初代培養細胞、又は株化した細胞など、どのような形態の細胞であってもよい。さらには、対象とする細胞は、正常細胞であっても、異常細胞(例えば、がん細胞)であってもよい。
(II−1)
がん細胞の検出又はイメージングに用いることができる青色蛍光を発する本発明のL−グルコース誘導体は、蛍光分子団として3−カルボキシ−6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシクマリン(パシフィックブルー)又は3−カルボキシメチル−6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシ−4−メチルクマリン(マリーナブルー)をL−グルコースに結合した分子である。L−グルコースへの結合は、グルコースの1位、2位、3位、4位又は6位のいずれの位置に上記蛍光分子団を結合することができるが、好ましくは、2位、3位、4位又は6位、より好ましくは、2位、4位又は6位である。また結合は、例えば、2位においては、グルコサミンを用いて−NH−を介して行うことができる。
本発明の蛍光標識L−グルコース誘導体は、好ましくは下記式(2)で表される。
がんは際限なく増殖し続けることで生体にさまざまな不都合を与えるが、特にがんの内部に抗がん剤や放射線治療に対し抵抗性を示すがん細胞の存在することが近年指摘されており、こうした特殊ながん細胞は、正常細胞が生きられない低酸素、低栄養環境に適応するための分子機構を備えている(非特許文献19参照)。
本発明の蛍光標識L−グルコース誘導体は、特定クマリンの誘導体(パシフィックブルー又はマリーナブルー)を鍵分子とし、正常細胞には取り込まれない性質を有するL−グルコースをこれに結合した化合物である。クマリンおよびその誘導体は、低酸素、低栄養環境に存在するがん細胞に過剰に発現する炭酸脱水酵素に結合してその機能を阻害するため、がん細胞を含む細胞集団に投与することにより、上記の特殊ながん細胞を選択的に蛍光可視化するとともに、その機能を阻害し、かつ正常細胞への影響を最小限にとどめることができる。
本発明の蛍光標識L−グルコース誘導体(例えば、2-PBLG)に強陽性の細胞は、低酸素環境への対応力において優れた形質を獲得しているがん細胞と考えられ、こうしたがん細胞は、転移先で本来そのがん細胞が存在していた環境とは異なる環境にあっても生存し得る能力の一つを獲得した細胞である可能性があり、本発明の蛍光標識L−グルコース誘導体を用いて、そのような細胞を選択的に識別・可視化することができる。
(1)蛍光標識糖誘導体の合成
2−PBDG(2-Deoxy-2-((6,8-difluoro-7-hydroxycoumarin-3-yl)carboxamide)-D-glucose)の合成
下記式で表される2−PBDGは以下のようにして合成した。
収量:42.9 mg、収率:72 %
1H-NMR (400 MHz、重メタノール、ppm):
δ9.11 (d, 0.8H, J=9.2 Hz, NH), δ8.98 (d, 0.2H, J=9.2 Hz, NH), δ8.77 (s, 1H, H4’), δ7.43 (dd, 1H, J=10.3 Hz and J=2.1 Hz, H5’), δ5.18 (d, 0.8H, J=3.2 Hz, H-1α), δ4.77 (d, 0.2H, J=8.7 Hz, H-1β), δ3.35-δ4.10 (m, 6H, H-2, H-3, H-4, H-5, H-6, H-6).
ESI-MS:calcd for C16H16F2NO9 [M+H]+ 404.07, found 404.0
励起極大波長:403 nm
蛍光極大波長:453 nm
下記式で表される2−PBLGは以下のようにして合成した。
収量:9.2 mg、収率:77 %
1H-NMR (400 MHz、重メタノール、ppm):
δ9.11 (d, 0.8H, J=9.2 Hz, NH), δ8.98 (d, 0.2H, J=9.2 Hz, NH), δ8.77 (s, 1H, H4’), δ7.43 (dd, 1H, J=10.3 Hz and J=2.1 Hz, H5’), δ5.18 (d, 0.8H, J=3.2 Hz, H-1α), δ4.77 (d, 0.2H, J=8.7 Hz, H-1β), δ3.35-δ4.10 (m, 6H, H-2, H-3, H-4, H-5, H-6, H-6).
ESI-MS:calcd for C16H16F2NO9 [M+H]+ 404.07, found 404.0
励起極大波長:403 nm
蛍光極大波長:453 nm
D−グルコースの3位、4位又は6位に蛍光分子団が結合したパシフィックブルー標識D−グルコース誘導体は、それぞれ、3−アミノ−3−デオキシ−D−グルコース、4−アミノ−4−デオキシ−D−グルコース、あるいは6−アミノ−6−デオキシ−D−グルコースを原料に用いて常法に基づきパシフィックブルーをD−グルコースの3位、4位又は6位に導入することにより合成できる。また、1位への蛍光分子団の導入は、中間体として1−アジド体を合成し、還元後即座に蛍光化することで可能である。
パシフィックブルー標識L−グルコース誘導体は、原料としてアミノデオキシ−L−グルコースを用いることにより、同様にして合成できる。
下記式で表される2−PBDMは以下のようにして合成した。
収量:10.5 mg、収率:88 %
1H-NMR (400 MHz、重メタノール、ppm):
δ9.14 (m, 0.5H, NH), δ8.74 (m, 1H, Ar), δ7.87 (s, 0.5H, NH), δ7.40 (m, 1H, Ar), δ5.14 (d, 0.5H, J=1.8 Hz, H-1), δ4.93 (d, 0.5H, J=1.4 Hz, H-1), δ3.43-δ4.57 (m, 6H, H-2, H-3, H-4, H-5, H-6, H-6).
ESI-MS:calcd for C16H16F2NO9 [M+H]+ 404.07, found 404.0
励起極大波長:404 nm
蛍光極大波長:453 nm
下記式で表される2−PBLMは、その鏡像異性体である上述の2−PBDMと同様の手法により合成することが可能である。
D−マンノースの3位、4位又は6位に蛍光分子団が結合したパシフィックブルー標識D−マンノース誘導体は、それぞれ、3−アミノ−3−デオキシ−D−マンノース、4−アミノ−4−デオキシ−D−マンノース、あるいは6−アミノ−6−デオキシ−D−マンノースを原料に用いて常法に基づきパシフィックブルーをD−マンノースの3位、4位又は6位に導入することにより合成できる。また、1位への蛍光分子団の導入は、中間体として1−アジド体を合成し、還元後即座に蛍光化することで可能である。
パシフィックブルー標識L−マンノース誘導体は、原料としてアミノデオキシ−L−マンノースを用いることにより、同様にして合成できる。
下記式で表される2−MBDGは以下のようにして合成した。
収量:11.4 mg、収率:97 %
1H-NMR (400 MHz、重メタノール、ppm):
δ7.89 (d, 0.4H, J=10.1 Hz, NH), δ7.37 (dd, 1H, J=11.9 Hz and J=2.3 Hz, H5’), δ5.11 (d, 0.7H, J=3.2 Hz, H-1α), δ4.61 (d, 0.3H, J=7.8 Hz, H-1β), δ3.34-δ3.87 (m, 8H, H-2, H-3, H-4, H-5, H-6, H-6, C3’-CH2), δ2.41 (s, 3H, C4’-CH3)
ESI-MS:calcd for C18H20F2NO9 [M+H]+ 432.10, found 432.1
励起極大波長:364 nm
蛍光極大波長:458 nm
下記式で表される2−MBLGは以下のようにして合成した。
収量:10.0 mg、収率:85 %
1H-NMR (400 MHz、重メタノール、ppm):
δ7.86 (d, 0.2H, J=9.2 Hz, NH), δ7.36 (dd, 1H, J=11.9 Hz and J=2.3 Hz, H5’), δ5.10 (d, 0.7H, J=3.2 Hz, H-1α), δ4.61 (d, 0.3H, J=8.2 Hz, H-1β), δ3.35-δ3.86 (m, 8H, H-2, H-3, H-4, H-5, H-6, H-6, C3’-CH2), δ2.40 (s, 3H, C4’-CH3)
ESI-MS:calcd for C18H20F2NO9 [M+H]+ 432.10, found 432.1
励起極大波長:365 nm
蛍光極大波長:458 nm
1位、3位、4位又は6位にマリーナブルーを有する他のMBDG及びMBLGは、PBDG及びPBLGと同様にして合成できる。
2−MBDGの合成方法と同様にして、2−MBDGの合成に用いるD−グルコサミン塩酸塩の代わりにD−マンノサミン塩酸塩を用いて、2−MBDMを合成できる。
2−MBLGの合成方法と同様にして、2−MBLGの合成に用いるL−グルコサミン塩酸塩の代わりにL−マンノサミン塩酸塩を用いて、2−MBLMを合成できる。
2−HCDG(2-Deoxy-2-((7-hydroxycoumarin-3-yl)carboxamide)-D-glucose)の合成
下記式で表される2−HCDGは以下のようにして合成した。
収量:10.6 mg、収率:44 %
1H-NMR (400 MHz、重水、ppm):
δ8.58 (s x 2, 1H, Ar), δ7.53-δ7.56 (m, 1H, Ar), δ6.79 (m, 1H, Ar), δ6.67 (m, 1H, Ar), δ5.24 (d, 0.7H, J=3.7 Hz, H-1α), δ4.84 (d, 0.3H, J=8.2 Hz, H-1β), δ3.41-δ4.06 (m, 6H, H-2, H-3, H-4, H-5, H-6, H-6).
ESI-MS:calcd for C16H18NO9 [M+H]+ 368.10, found 368.1
励起極大波長:402 nm
蛍光極大波長:447 nm
下記式で表される2−MCDGは以下のようにして合成した。
収量:69.6 mg、収率:18 %
1H-NMR (400 MHz、重メタノール、ppm):
δ7.66 (m, 1H, Ar), δ6.85 (m, 2H, Ar), δ6.23 (s x 2, 1H, Ar),δ5.03 (d, 0.6H, J=3.2 Hz, H-1α), δ4.54 (d, 0.4H, J=7.3 Hz, H-1β), δ3.26-δ3.81 (m, 9H, H-2, H-3, H-4, H-5, H-6, H-6, OMe).
ESI-MS:calcd for C18H22NO9 [M+H]+ 396.13, found 396.1
励起極大波長:325 nm
蛍光極大波長:392 nm
WO2010/16587に記載の方法に従って行った。結果を図1に示す。
マウス中脳の黒質網様部から生きた神経細胞を急性単離した上、これに 2-PBDG を100μM、 2-TRLGを20μM含む混合液を37度で5分間投与した。その直前の共焦点顕微鏡画像を図1A〜Cに示す。Aは、青色波長領域における蛍光像(Blue channel、波長範囲415-580 nm)である。自家蛍光により細胞位置がわかる。蛍光シグナル強度は疑似カラー表示してある。Bは、赤色波長領域における蛍光像(Red channel、580-740 nm)。AとBは共に405nm Blue diode laserを60%の強度で用いて同時に励起し、それぞれphotomultiplier(PMT)1と2を用いて、2-TRLGの侵入の有無を鋭敏に検出できるようPMT2の検出感度をPMT1よりも高めて取得したものである。Cは、明視野像(Bright field image)をA, Bの蛍光像に重ねた図である。
蛍光混合液の投与が終了して投与液の洗い流しを開始してから4分後の映像を図1D〜Fに示す。画像取得条件は、A〜Cと同様である。DのBlue channelでは、投与前(A)に比較して、核以外の細胞内蛍光強度が増加している様子が確認できた。中央部の暗い部分が細胞の核を示す。これに対してEにみられるようにRed channelの蛍光強度は増加していなかった(緑色の点は、細胞表面に一過性に認められた蛍光信号を疑似カラーで示したものである)。2-TRLGは比較的大型の蛍光基を分子内に有する赤色蛍光L-グルコース誘導体で、2-TRLGが細胞内に侵入していないことは、Blue channelでみられた蛍光強度の増加が2-TRLGの通過を許すような細胞膜破綻により生じたものではないことを示している。
それぞれ洗い流し開始後8分後、20分後の映像を図1G〜I、及び図1J〜Lに示す。いったん細胞内に取り込まれた2-PBDGが容易に減衰しない様子が確認できた。
実施例2と同様にして実験を行った。結果を図2に示す。
マウス中脳黒質網様部神経細胞を急性単離し、2-PBLG を100μM、 2-TRLGを20μM含む混合液を37度で5分間投与する投与直前の共焦点顕微鏡画像を図2A〜Cに示す。
蛍光混合液の投与が終了し、投与液の洗い流しを開始してから4分後の映像を図2D〜Fに示す。画像取得条件はA〜Cと同様である。DのBlue channelを見ると、投与前(A)に比較して細胞内蛍光強度はほとんど増加していなかった。EのRed channelの蛍光強度もほとんど増加しておらず、2-TRLGの侵入を許すような細胞膜の破綻は見られなかった。図2G〜I、及び図2J〜Lは、それぞれ洗い流し開始後8分後、20分後の映像である。Dでわずかに細胞内に認められた蛍光強度の増加は洗い流し開始後20分のJでは自家蛍光レベルに戻っていた。このようにL型グルコース誘導体である2-PBLGは、 D型グルコース誘導体である2-PBDGを投与した結果(図1)に比較して、細胞内にほとんどとりこまれないことがわかる。
実施例2と同様にして実験を行った。結果を図3に示す。
マウス中脳黒質網様部から急性単離した神経細胞に2-HCDGを100μM、2-TRLGを20μM含む混合液を37℃にて3分間投与した前後の共焦点顕微鏡画像を図3に示す。A, BはそれぞれBlue channel (415-580 nm)およびRed channel (580-740 nm)で取得した投与前蛍光画像。 励起波長は405 nm。Cは、微分干渉(Differential Interference contrast, DIC)画像。Dは以上の重ね合わせである。E〜HはA〜Dと同様だが、 2-HCDG+2-TRLG 蛍光トレーサー液を37℃にて3分間投与した後、蛍光トレーサーの洗い流しを開始、洗い流し開始から4分後に取得した画像である。E, Fを見ると、細胞の破片(debris)については投与後、青色の蛍光強度が増加しているのに対して、神経細胞のある位置においては投与前後で蛍光強度の増加は全く検知できない。 また2-TRLGが細胞内に侵入していないことから、神経細胞の細胞膜は健全に保たれていると考えられる。
マウス中脳黒質網様部から急性単離した神経細胞に2-MCDGを100μM、2-TRLGを20μM含む混合液を比較例1と同様に投与したが、投与前後で神経細胞における蛍光強度の増加を認めなかった。
なお本実験においては最適励起波長が320nmと非常に低いため、Nikon Ti-Eリアルタイムデコンボリューション顕微鏡を用い、キセノンランプで励起フィルター320nm (半値幅40nm)、蛍光フィルター435nm(半値幅40nm)、ダイクロイックミラー409nmの構成の特注フィルターを介して画像をQ-imaging社Retiga-2000R CCDカメラで取得した。
(実験方法)
(1−1)細胞の培養
凍結保存していたMIN6細胞(大阪大学の宮崎純一教授より供与を受けて5-8回継代した細胞)を常法に従って培養に移し、7-9回継代したものを実験に供した。
(1−2)MIN6細胞の培養に用いた培養液の組成
高グルコース含有Dulbecco's modified Eagle's Medium(DMEM-HG)(SIGMA #D5648) 13.4 g, NaHCO3(Wako, No.191-01305) 3.4 g, 2-Mercaptoethanol(Wako, No.135-14352) 5 μLを1 Lの超純水(Mili Q)に溶解し、37℃のCO2インキュベーター中でpH 7.3 - 7.35となるようpHを調整した。Hyclone Fetal Bovine Serum(Cat# SH30070.03)を終濃度10 %となるように、またペニシリン-ストレプトマイシン(Gibco #15140)を終濃度0.5 %となるよう添加した。
(1−3)KRB溶液
計測には下記の組成のKRB溶液を用いた。
NaCl 129.0 mM, KCl 4.75 mM, KH2PO4 1.19 mM MgSO4・7H2O 1.19 mM, CaCl2・2H2O 1.0 mM, NaHCO3 5.02 mM, D−Glucose 5.6 mM, HEPES 10 mM (1M NaOHにてpH 7.35に調整)。なおgap junction/hemichannelを経由する蛍光標識グルコースの出入りを阻害する目的で0.1 mM Carbenoxolone(SIGMA #C4790)を加えた。なお本KRB溶液は、2-PBLG溶液を作成するための溶液として使用した。
2-PBLG溶液の調製
0.5 mg 2-PBLGバイアル全量を合計30 μL dimethyl sulfoxide(DMSO) を用いて回収、3.1 mLのKRB溶液にYamada K. et al., Nat. Protoc. 2, 753-762, 2007に準じた方法で加えることで溶解した。
2-PBDG溶液の調製
2-PBDGの代わりに2-PBLGを用いて、同様にして行った。
PB-NH2溶液の調製
0.3 mg PB-NH2バイアル一本全量を、同様にして3.1 mLのKRB溶液に溶解することで、終濃度 200 μMのPB-NH2溶液とした。
2-NBDLG溶液の調製
0.5 mg 2-NBDLGバイアル一本全量をKRB溶液7.3 mLに溶解することで、終濃度 200 μMの2-NBDLG溶液とした。
2-PBDM溶液の調製
0.5 mg 2-PBDMバイアル一本全量を、2-PBLG溶液の調整に準じて3.1 mLのKRB溶液に溶解することで、終濃度 100 μMの2-PBDM溶液とした。
2-PBDGおよび2-PBLGは、8連ピペットを用いて、それぞれ3列目および5列目のウエルに投与した。投与前には、あらかじめ各ウェルの自家蛍光を蛍光マイクロプレートリーダー(Flex Station, Molecular Device社)で計測した。測定条件は、Bottom Readで、Ex 401 nm, Em 453 nm, Cut off 420 nm, Averaging 3 、Photomultiplier感度 highにておこなった。測定方法には、Well Scan Modeを用いた。Well Scan Modeは、一つのウェル中を9つの観察領域(直径1.5 mm)に分割して、それぞれ独立に計測する。
次いで、グルコース輸送阻害剤フロレチンの効果を計測するウェル(3C, 3E, 3G)には、2-PBDG投与の5分前からフロレチン(final 150 μM)を前投与し、その他のウェル(3B, 3D, 3F) にはKRBを加えた。2-PBLGを投与する予定の5列目にも同様の操作を行った。2-PBDGおよび2-PBLGの投与は、37℃で10分間おこなった。
投与終了後は、300 μL のKRB溶液を用いてウェル中の蛍光溶液を希釈する操作を30秒づつ、決められた回数繰り返した。繰り返し回数は、対照群として設定したA行およびH行のウェルの示す蛍光強度が、細胞のないブランクのウェルの蛍光強度と同レベルになることを基準として決定し、完全に洗い流されていることを毎回の実験で確認した。2-PBDGおよび2-PBLGの場合にはこの洗い流し過程に8分を要したため、投与後の蛍光計測は9分後に実施した。
なお、この方法によれば、細胞膜状態の破綻を来たした細胞が2-PBDGおよび2-PBLGに接触後、これらの化合物をいったん細胞内に取り込んだとしても、計測時点では既に細胞外に流出し洗い流されているために、観察エリア全体の蛍光強度の増加に対する寄与は無視しうる程度と判断された。このことは別途薬理学的阻害実験で、阻害剤存在下に蛍光強度の増加がほぼ消失することにより裏付けられた。上記の方法は、他の阻害剤たとえばサイトカラシンB (10μM)を投与する場合にも同様に実施した。
結果を図4に示す。
クマリン誘導体であるパシフィックブルーをD-グルコサミンに結合した2-PBDG 、ならびにL-グルコサミンに結合した2-PBLGを、いずれも100μMの濃度で培養開始後10日目の多数のMIN6マウスインスリノーマ細胞に対して投与した結果を図4に示す。グルコース輸送阻害剤であるフロレチン(PHT) 150 μM による阻害効果も併せて示している。図4Aは、投与前後の蛍光強度を蛍光マイクロプレートリーダーで計測した結果である。括弧内の数字は、観察領域数である。投与前の蛍光は、細胞の自家蛍光を示す。蛍光強度はいずれの場合にも投与前に比較して有意に増加している(ANOVA, Bonferroni-Dunn post hoc test)。励起および蛍光波長はそれぞれ401 nmおよび453 nmとした。図4Bは、Aにおける投与前後の蛍光強度の差を示したものである。フロレチン非存在下で2-PBDGを投与した際の蛍光強度の変化を100%として表示している。2-PBDGと2-PBLGの蛍光強度の間には有意の差が認められなかった。またフロレチン存在下では、非存在下に比較して2-PBDG、2-PBLGいずれの場合にも蛍光強度の低下を認めたが、蛍光の大部分はフロレチンにより阻害されなかった。独立に実施した二回の実験のいずれにおいても同様の結果が得られ、2-PBDG、2-PBLGのフロレチンによる減少分はそれぞれ平均 22.4%および 20.0%にとどまった。
培養10日目のMIN6細胞に対するD−グルコース誘導体(2−PBDG)、L−グルコース誘導体(2−PBLG)、及びパシフィックブルー(PB)発色団をアミド化したPB-NH2投与による蛍光強度の変化とグルコース輸送阻害剤による効果を実施例4と同様にして確認した。PB−NH2は以下の構造である(Ex max.402nm, Em max. 451nm)。結果を図5に示す。
図5Aから判るように、2-PBDG (100μM)投与による蛍光強度の増加に対し、 GLUT選択的阻害剤サイトカラシンB (CB, 10μM)は有意な阻害効果を示さなかった。本例では平均蛍光強度がCB存在下で非存在下に比較して減弱しているが、独立に3回実施した結果では増加したものも認められ、一定しなかった。図5Bは、2-PBLG (100μM)あるいはPB-NH2 (100μM)投与による蛍光強度の増加に対するグルコース輸送阻害剤フロレチン(PHT, 150μM)の効果を示している。フロレチンは、2-PBLGによる蛍光強度の増加を図4と同様わずかに阻害したが、逆にPB-NH2による蛍光強度の増加を著しく促進した。Bの縦軸の単位は、A、Cと異なることに注意されたい。 2-PBLGおよびPB-NH2への投与実験は同一培養プレート上で同時に実施し、独立に実施した3回の実験のいずれにおいてもPB-NH2応答へのフロレチンによる著しい増強効果が確認され、蛍光増加はPB-NH2のみ投与した場合の平均384.1 ± 24.2%に達した(n = 3)。また糖骨格を有しないPB-NH2は、糖骨格を有するL-グルコース誘導体2-PBLGより有意に大きな蛍光強度の増加を示した。
実施例4と同様にして実験を行った。結果を図6に示す。
培養10日目(10DIV)のMIN6細胞(20000 cells/well)に対し、2-PBDM(100μM)を投与して、投与前後の蛍光強度の増加に対するフロレチン (150μM, PHT)による阻害効果をフレックスステーションで計測したところ、2-PBDMはフロレチンによりわずかながら有意な阻害効果が確認された。実験は独立に3回実施し、すべて同様の結果が得られた。2-PBDM投与実験では極大励起光波長404nmで励起し、極大蛍光波長453nmで蛍光取得した。
(実験方法)
(1)マウスインスリノーマ細胞(MIN6)の調製
MIN6細胞を10 x 104 cells/mLの割合で懸濁させた培養液をガラスカバースリップ上に10μL滴下した後、ガラス面に付着させ、培養液を 3 mL加えて培養した。培養液は3日に一回半量を交換した。
(1−1)MIN6細胞の培養
凍結保存していたMIN6細胞(大阪大学の宮崎純一教授より供与を受けて5-8回継代した細胞)を常法に従って培養に移し、7-9回継代したものを実験に供した。培養液は2日に一回半量を交換した。
(1−2)MIN6細胞の培養に用いた培養液の組成
高グルコース含有Dulbecco's modified Eagle's Medium(DMEM-HG)(SIGMA #D5648) 13.4 g, NaHCO3(Wako, No.191-01305) 3.4 g, 2-Mercaptoethanol(Wako, No.135-14352) 5 μLを1 Lの超純水(Mili Q)に溶解し、37℃のCO2インキュベーター中でpH 7.3 - 7.35となるようpHを調整した。Hyclone Fetal Bovine Serum(Cat# SH30070.03)を終濃度10 %となるように、またペニシリン-ストレプトマイシン(Gibco #15140)を終濃度0.5 %となるよう添加した。
(1−3)MIN6細胞を10 x 104 cells/mLの割合で懸濁させた培養液
MIN6細胞を、細胞数が10 x 104 cells/mLになるよう培養液を用いて調製した。
2-PBLG溶液の調製
0.5 mg 2-PBLGバイアル全量を合計30 μL dimethyl sulfoxide(DMSO) を用いて回収、6.25mLの画像取得用HEPES溶液にYamada K. et al., Nat. Protoc. 2, 753-762, 2007に準じた方法で加えることで溶解した。
2-PBDG溶液の調製
2-PBDGの代わりに2-PBLGを用いて、同様にして行った。
2-NBDLG溶液の調製
0.5 mg 2-NBDLGバイアル一本全量を画像取得用HEPES溶液14.6 mLに溶解することで、終濃度 100 μMの2-NBDLG溶液とした。
2-TRLG溶液の調製
0.2 mg 2-TRLGバイアル全量を合計100μLのDMSOを用いて回収。6.5mLのKRB溶液に加えることで溶解した。
2-PBLG + 2-TRLG混合溶液の調製
上記の2-PBLG溶液ならびに2-TRLG溶液を1:1で混合して目的の蛍光誘導体混合液を作成した。
(2−1)画像取得用HEPES溶液
フレックスステーション実験で用いたKRB溶液と同一の下記の組成の溶液を用いた。
NaCl 129.0 mM, KCl 4.75 mM, KH2PO4 1.19 mM MgSO4・7H2O 1.19 mM, CaCl2・2H2O 1.0 mM, NaHCO3 5.02 mM, D−Glucose 5.6 mM, HEPES 10 mM (1M NaOHにてpH 7.35に調整)。なおgap junction/hemichannelを経由する蛍光標識グルコースの出入りを阻害する目的で0.1 mM Carbenoxolone(SIGMA #C4790)を加えた。なお本画像取得用HEPES溶液は、2-PBLG溶液を作成するための溶液として、また、2-PBLG/2-TRLG溶液及び2−PBLG/2-NBDLG/2-TRLG溶液を作成するための溶液として使用した。
MIN6細胞を付着させ10-13日間培養したガラスカバースリップを、35 mmディッシュに満たしたD−グルコース5.6 mMを含有するDAPI溶液中に移し、37℃で加温しながら45分から1時間静置して細胞にDAPIを取り込ませた。別実験で、共焦点顕微鏡上で継時的に観察しながらDAPIを投与する実験を行い、実験時間内にDAPI投与および405 nmのレーザー光照射による細胞の形態変化は認められないことを確認した。
DAPI溶液の調製:4',6-Diamidino-2-phenylindole DAPI(No. 049-18801, Wako Pure Chemical Industries, Osaka)を画像取得用HEPES溶液に終濃度1μg/mL の割合で溶解して用いた。
レーザースキャン共焦点顕微鏡(ライカ社TCS SP5)上のユニバーサルステージ(Leica 11600234)上にセットされた灌流チャンバー内の画像取得用HEPES溶液中に、MIN6細胞を培養したガラスカバースリップを移し、チャンバー底部のガラス面上に軽く密着させた。静置後、カバースリップの両側を左右からカバースリップの長軸に平行に2枚の長方形の金属ガイド(長さ10 mm、幅2 mm、厚み0.7 mm、銀製)を用いて押さえ、慎重に押し当てることで、流れの中でもカバースリップが動かないようにした。またこの2枚の金属ガイドに挟まれた空間内では、灌流液が層流となってスムーズに流れ、すみやかな液交換が可能となるという優れた効果がある。
(4−1)レーザースキャン共焦点顕微鏡ステージ上の蛍光測定用灌流チャンバー
底部に対物レンズ用の丸穴(直径18 mm)のあいたアルミ製加温制御プラットフォーム(PH1、Warner Instruments, USA、温度制御装置TC-324により37℃に加温, Warner Instruments)上に、シリコングリース(HIVAC-G, Shin-Etsu Silicone, Tokyo)を用いて、カバーガラス(幅24 mm x 長さ50 mm、厚さ No. 1, Warner Instruments No. CS-24/50)をプラットフォーム中央の丸穴以外の部分に密着させた。次いでカバーガラス上に、中央に流線型に穴開け加工(ガラス底面に接する側は幅10 mm x 長さ35 mm、曲率半径33 mm、ガラス面に接しない側すなわち上方がわずかに広くなるように加工した)を施した厚さ1 mmのシリコン板(幅20 mm x 長さ50 mm)を載せ、シリコングリースを用いずにカバーガラスと密着させた。
シリコン板上の流線型穴の上流隅に、先端をフラットにした太さ20ゲージのカテラン針をセットして、インレットとして用いた。
灌流液の排出用ステンレス管(アウトレット)は、非特許文献16に記載の方法に準じて先端部を平らにつぶした上で斜めにカットしたものを用い、真空吸引時、空気と溶液の両者を同時に吸引することで安定させる方式とした。
(a)灌流液の加温と灌流チャンバーへの供給
灌流液供給システムは、コントロール溶液用の60 mL注射筒一本と、薬剤供給用の10 mL注射筒5本を備え、電磁バルブで随時切り替えて灌流することができる。本発明に関わる実験では、60 mL注射筒を用いて5.6 mMグルコース含有画像取得用HEPES溶液を、5系統ある10 mL注射筒のうち一本を用いて2-PBLG/2-NBDLG/2-TRLG混合溶液もしくは2-PBDG/2-TRLG混合溶液、もしくは2-PBLG/2-TRLG混合溶液を投与した。以下に述べるように、両者は灌流チャンバー内でバブルを生じないよう、あらかじめ加温された上、灌流チャンバーに導かれる前に一本のチューブに合同し、流量調節器で速度調節されてから、再度インラインヒーターにて加温し共焦点顕微鏡上の灌流チャンバーに供給された。
画像取得用HEPES溶液は、アルミ製シリンジヒーター(Model SW-61, 温度制御ユニットはNo. TC-324B, Warner Instruments)中で暖められた60 mL注射筒から、溶液供給ラインのチューブ内をフラッシュするための3方活栓に接続され、続いて細くガス透過性も低いソフトチューブ(Pharmedチューブ, AY242409, Saint-Gobain Performance Plastics, Ohio)を介して超小型電磁バルブ(EXAK-3, 3 way clean valve, Takasago Electric, Nagoya)のnormally open側に接続した。電磁バルブの開閉はパルス発生装置(Master 8, AMPI社, Israel)で制御した。画像取得用HEPES溶液についてはペリスタルティックポンプ(MCPポンプ12 rollers、Ismatec)を用いてメジウムビンから60 mL注射筒内に持続的に供給し、実験中に注射筒内の溶液上面の高さが変化しないよう、溶液落下速度と等しくなるようにポンプの溶液供給スピードを精密に調整した。ペリスタルティックポンプの溶液供給速度はデジタル表示されるため、もしも灌流チャンバーへの溶液供給速度に実験中に変化があれば溶液面の高さが変わることで直ちにわかる。このように本溶液は常時更新されるため、液温維持のためシリンジヒーターSW-61は38.5℃に設定した。
一方、2-PBLGと2-TRLG混合溶液あるいは2-PBLG/2-NBDLG/2-TRLG混合溶液等は、シリンジヒーター(Model SW-6, 温度制御ユニットはNo. TC-324, Warner Instruments)にセットされ37.5℃に加温された10 mL注射筒から供給した。本注射筒は三方活栓を介して、画像取得用HEPES溶液とは別個の電磁バルブのnormally closed側に接続されており、パルス発生装置の制御によりコントロール溶液と随時切り替えて供給できる。シリンジヒーターSW-6には6本の10 mL注射筒がセットでき、1本には蒸留水を入れて加温ブロックの温度モニター用プローブを挿入した。
コントロール溶液である画像取得用HEPES溶液と、2-PBLGと2-TRLG混合溶液あるいは2-PBLG/2-NBDLG/2-TRLG混合溶液等とは、電磁バルブのアウトレットを出た後、6ポートの小型マニフォールド(MPP-6, Warner Instruments)により1本に集められた。MPP-6マニフォールドのアウトレットは短いPharmedチューブに接続し、このチューブをスクリューにより開度を増減できる流量調節器にはさみこみ、開度の調整により流量を1.2 ± 0.2 mL/分に調整した。本Pharmedチューブは、最短距離でインラインヒーター(Multi-Line In-Line Solution Heater SHM-8、温度制御ユニットはTC-324B、Warner Instruments)に接続した。これは灌流チャンバーに導入する溶液温度を、導入直前に加温するためである。SHM-8インラインヒーターの温度は灌流速度にあわせて、チャンバー中での灌流液の実測温度が、カバースリップの存在する領域で36-37℃になるように調整した。加温された溶液は短いタイゴンチューブ(R-3603, inner diameter 1/32 inch)を介して最短距離で灌流チャンバー上流に配置されたステンレスパイプ(インレット)に接続し、灌流チャンバー内に供給した。
注射筒からの溶液供給は静水圧を用いて供給圧力を決めるため、高さの違いが灌流速度の違いとなってチャンバー内の水面高の変化をもたらさないように、2-PBLGと2-TRLG混合溶液あるいは2-PBLG/2-NBDLG/2-TRLG混合溶液等ついては投与時間が短いことから一回の実験では実験中に液供給は行わず、各実験が終了するごとに液の上面が蛍光グルコースを含有しないHEPES溶液とほぼ同じ高さになるように溶液を追加した。また注射筒に接続されたチューブの長さと太さの調整により、コントロール溶液である画像取得用HEPES溶液の灌流速度と同じ速度で排出されるように慎重に調整することで、液交換による液面の変動を避けることができる。また実験終了後および開始前にはチューブ内部を十分フラッシュしてスムーズな流れを確保した。
灌流液の排出用のステンレス管(アウトレット)をタイゴンチューブで二つの大型ガラストラップに順次導き、真空ポンプ(DAP-15, ULVAC KIKO, Inc)で緩やかに吸引した。吸引圧は二つの大型ガラストラップの中間で吸引ラインから枝分かれさせたラインに設置した圧力計でモニターし、三方活栓の開閉度の制御により35kPaとなるように調整した。
灌流チャンバー内の層流の確保は、まず青色色素(Pontamine sky blue, 1 %以下の濃度に希釈して用いる)溶液をインレット付近に滴下して、流れの左右対称性、均一性と再現性を確保した。
チャンバー内灌流溶液中の各部の温度の確認は極細サーミスタープローブ(Physitemp社IT-23)を用いた(非特許文献16)。またアウトレット先端部には実験中にHEPES溶液由来の塩が付着することで吸引圧が変化するのを防ぐため、チャンバー上に設置されたオペレーション顕微鏡(POM-50II, KONAN MEDICAL, 西宮)で実験ごとに確認し、クリーニングを行った。
レーザースキャン共焦点顕微鏡(Leica製TCS-SP5システム、顕微鏡本体はDMI6000 CS trino電動倒立顕微鏡)をコンベンショナルモードで使用した。使用レーザーは、405 nmダイオードレーザーを、2-PBLGや2-PBDGの励起、2-PBLG(もしくは2-PBDG)と2-TRLGとの混合溶液を単一光源で励起する場合、またDAPIによる核のライブ染色に使用した。照射強度は音響光学偏光素子(Acoustic Optical Tunable Filter, AOTF) により十分な観察強度が得られるように使用蛍光色素に合わせて適切に調節した。また2-NBDLGおよび2-TRLGは488 nm Argon laserで励起した。スキャンスピードは200Hzもしくは400Hzを用いた。
蛍光検出は、2-PBDGもしくは2-PBLGによる青色蛍光の検出用にphotomultiplier検出器(PMT)1を2-PBLG/2-TRLGの二色検出の場合には415-580 nmの波長検出範囲で、2-PBLG/2-NBDLG/2-TRLG三色検出の場合には415-500 nmの波長検出範囲に設定して画像取得した。2-NBDLGによる緑色蛍光の検出用にPMT2(緑チャネルと名付けた、以下同じ)を500-580 nmの波長検出範囲で使用した。また、2-TRLGによる赤色蛍光の検出用にPMT3(赤チャネルと名付けた、以下同じ)を580-740 nmの波長検出範囲で使用した。以上の青、緑、および赤等の蛍光検出波長領域の選別は通常用いられるEmissionフィルター方式によらず、プリズム分光とスリットを組み合わせた方式(Leica,TCS-SP5の標準)により取得した。488nmアルゴンレーザーを使用して際のビームスプリッターは500 nm(RSP500)を使用した。405 nm用のビームスプリッターはSP5システムでは上記と独立に415 nmの固定式となる。2-PBLG/2-NBDLG/2-TRLG三色検出の実験では、蛍光励起に際し、最初に488 nm励起による2-NBDLG(緑色)と2-TRLG(赤色)の画像取得をおこない、Sequential modeにてその後直ちに405 nm励起により2-PBDLG(青色)の画像を取得した。2-PBLG/2-TRLGの二色検出の場合には、405 nmダイオードレーザーの単一励起により、2-PBLG(青色)と2-TRLG(赤色)の画像を、2-TRLGの細胞内への侵入を効果的に検出できるように赤色波長領域における検出感度を青色波長における検出感度より高くした感度設定により(青色617V、赤色738V等)同時取得した。
立体的な腫瘍細胞塊の構造的特徴を捉えるために用いた微分干渉(DIC)画像の取得は、488 nm(もしくは405nm)励起時に透過光用検出器PMT Transを同時に使用して検出(典型的な検出感度は145-200 V)したものを用いた。微分干渉方式(DIC)の画像取得に必要なポラライザーやアナライザーを光路に入れる為の切り替え時間や切り替えショックの問題を回避するため、405 nm励起による画像取得時にもDIC用ポラライザーとアナライザーは光路に入れたままとした。
本法では、xy軸への高い解像力と細胞塊の全体を視野内に含む画角を求めて対物レンズは高解像力のx40oilレンズ(HCX PL APO CS 40.0x1.25 OIL UV, NA1.25)を絞り開放で使用した。取得蛍光強度を稼ぐためPinholeサイズは3 airy unitとした。このpinhole sizeでもz軸方向に細胞内の核と細胞質を実用的に区別し得ることが取得画像で確認された。ズームは基本的に使用せず(1倍)、1024x1024もしくは512x512の画素数で、12 bitの深さで画像取得した。
なお以上の溶液の投与およびすべての画像取得は24時間一定室温(24℃)に保持された暗室内で行った。
結果を図7〜図17に示す。
図7において、培養下で3次元的な発達を示したがん細胞塊(スフェロイド、培養15日目のMIN6細胞)において、アポトーシスを起こしている細胞と、壊死を起こしている細胞、ならびにDAPIで強く染色される細胞核を有する細胞の空間的配置が確認できる。図7Aは、一定程度以上の直径(およそ100ミクロン以上)とかさ高さ(おおよそ50ミクロン以上)を呈するに至ったスフェロイドの中心部には、青色蛍光を発する4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)を異常に強く結合する核を擁する細胞が存在する。DAPIはホルマリン固定して用いずに、生きた細胞にそのまま適用している。図7Bは、ライブアポトーシスマーカーpSIVA-IANBD (IMGENEX, San Diego, USA) により、アポトーシスを起こしている細胞が緑色の蛍光で可視化されている。陽性細胞はスフェロイド周辺部などに点在している。図7Cは、赤色の蛍光は、壊死(ネクローシス)マーカーとして一般的なpropidium iodide (PI)が細胞内に侵入した細胞を示す。スフェロイド中央部付近に比較的集中していることがわかる。図7Dは、微分干渉顕微鏡イメージを示す。図7Eは、以上の重ね合わせ画像を示す。画像取得は2-PBLG/2-NBDLG/2-TRLG三色検出の方法に準じて実施した。
図9は、100μMの2-PBDLG、100μMの2-NBDLG及び20μMの2-TRLGからなる混合溶液を投与中のMIN6細胞塊の緑(A)、赤(B)、青(D)の蛍光取得画像、微分干渉顕微鏡像(C)、および以上の重ね合わせ像(E)である。細胞塊中心部の多くの細胞は細胞膜透過性が亢進しているため、投与中にいずれの蛍光標識グルコース誘導体も強く取り込む傾向がみられる。なお赤緑青の三色は重ね合わせると白色を呈する。画像は、A, B, Cの画像を数秒間かけて同時取得した後、シークエンシャルにDを画像取得したため、Dの画像取得時点では潅流液がより深く細胞塊内部に侵入している。
実施例7と同様にして、2-PBLG/2-NBDLG/2-TRLGの混合溶液の代わりに、2-PBLG/2-TRLGの混合溶液を用いた。
図14は、培養13日目のMIN6細胞塊の蛍光標識グルコース誘導体投与前のイメージである。A、Bはそれぞれ580-740 nm (赤色)および415-580 nm (青色)の波長域における蛍光取得画像。Cは微分干渉顕微鏡像。Dはこれらの重ね合わせ画像である。
図15は、20μMの2-TRLGと100μMの2-PBLGを含む蛍光混合液をMIN6細胞塊に5分間投与した後、洗い流しを開始して2分経過した時点での映像である。Aを見ると、細胞膜不透過性の2-TRLG は、主として細胞塊中心部にあり細胞膜透過性が亢進している細胞の内部に侵入している。また、この時点では細胞塊外縁や細胞塊外にある細胞組織の破片(Debris)の一部も染色されている。Bを見ると、2-PBLGも細胞膜透過性の亢進している細胞内にいったん侵入する。しかし、この時点で既に2-PBLGはこうした細胞内からの流出が進み始め、細胞塊中心部で蛍光強度が減弱しはじめている様子がわかる。その中で、いくつかの細胞の青色蛍光が異常に強い点に注意されたい。ここで実施例7のように、2-PBLGおよび2-TRLGの投与時に、2-NBDLGも同時に投与したケースでは、488 nmのアルゴンレーザーで2-NBDLGならびに2-TRLGの励起を行った後、405 nmダイオードレーザーで2-PBLGの励起を行った。この場合、2-PBLGの蛍光極大が2-NBDLGの励起波長と重なるため、局所濃度によってはFRET効果により2-PBLGの蛍光シグナルが弱まることも考えられる。また488 nmで励起された2-TRLGの580-740 nmの蛍光強度分布の中に、2-NBDLGの580nm以上の領域での(長波長側のすそ野)蛍光強度の増加によるものが混入する。一方、2-PBLG/2-TRLGの混合溶液を用いた場合には、これらFRET効果および長波長側のすそ野による影響のいずれについても回避することができるため、蛍光強度の増加を分離することが可能になり、定量化において有利である。
図17は、図16と同様だが、投与終了し、洗い流しを開始してから12分後のイメージ。引き続き2-PBLGの強陽性信号を呈する細胞が複数認められる(B, D)。
Claims (19)
- 蛍光分子団として3−カルボキシ−6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシクマリンが3−アミド結合(−CO−NH−)を介して、もしくは3−カルボキシメチル−6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシ−4−メチルクマリンが3−メチルアミド結合(−CH 2 −CO−NH−)を介して、D−グルコース、L−グルコース、D−フルクトース、L−フルクトース、D−ガラクトース、L−ガラクトース、D−マンノース、又はL−マンノースのいずれかである単糖に結合し、生きた標的細胞に取り込まれる蛍光標識糖誘導体を含む、標的細胞又は標的細胞内分子をイメージングするための組成物。
- 蛍光標識糖誘導体が、グルコースの1位、2位、3位、4位又は6位に、蛍光分子団として3−カルボキシ−6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシクマリン又は3−カルボキシメチル−6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシ−4−メチルクマリンを−NH−結合を介して結合した分子である請求項1に記載の組成物。
- 蛍光標識糖誘導体が、2−デオキシ−2−((6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシクマリン−3−イル)カルボキサミド)−D−グルコース、2−デオキシ−2−(2−(6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシ−4−メチルクマリン−3−イル)アセタミド)−D−グルコース、2−デオキシ−2−((6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシクマリン−3−イル)カルボキサミド)−L−グルコース、及び2−デオキシ−2−(2−(6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシ−4−メチルクマリン−3−イル)アセタミド)−L−グルコースからなる群より選ばれる分子である請求項1に記載の組成物。
- 蛍光標識糖誘導体が、2−デオキシ−2−((6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシクマリン−3−イル)カルボキサミド)−D−マンノース、2−デオキシ−2−((6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシクマリン−3−イル)カルボキサミド)−L−マンノース、2−デオキシ−2−(2−(6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシ−4−メチルクマリン−3−イル)アセタミド)−D−マンノース、及び2−デオキシ−2−(2−(6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシ−4−メチルクマリン−3−イル)アセタミド)−L−マンノースからなる群より選ばれる分子である請求項1に記載の組成物。
- 標的細胞又は標的細胞内分子をイメージングする方法であって、以下の工程、
a.標的細胞に、請求項1〜4のいずれか一つに記載の組成物を接触させる工程、及び
b.該標的細胞内に存在する該糖誘導体を検出する工程、
を含む細胞のイメージング方法。 - D−グルコース、L−グルコース、D−フルクトース、L−フルクトース、D−ガラクトース、L−ガラクトース、D−マンノース、又はL−マンノースのいずれかである単糖に、蛍光分子団として3−カルボキシ−6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシクマリンが3−アミド結合(−CO−NH−)を介して、もしくは3−カルボキシメチル−6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシ−4−メチルクマリンが3−メチルアミド結合(−CH 2 −CO−NH−)を介して結合し、生きた標的細胞に取り込まれる蛍光標識糖誘導体。
- 2−デオキシ−2−((6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシクマリン−3−イル)カルボキサミド)−D−グルコース、2−デオキシ−2−(2−(6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシ−4−メチルクマリン−3−イル)アセタミド)−D−グルコース、2−デオキシ−2−((6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシクマリン−3−イル)カルボキサミド)−L−グルコース、2−デオキシ−2−(2−(6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシ−4−メチルクマリン−3−イル)アセタミド)−L−グルコース、2−デオキシ−2−((6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシクマリン−3−イル)カルボキサミド)−D−マンノース、2−デオキシ−2−(2−(6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシ−4−メチルクマリン−3−イル)アセタミド)−D−マンノース、2−デオキシ−2−((6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシクマリン−3−イル)カルボキサミド)−L−マンノース、及び2−デオキシ−2−(2−(6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシ−4−メチルクマリン−3−イル)アセタミド)−L−マンノースからなる群より選ばれ、生きた標的細胞に取り込まれる蛍光標識糖誘導体。
- 2−デオキシ−2−((6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシクマリン−3−イル)カルボキサミド)−D−グルコース、又は2−デオキシ−2−((6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシクマリン−3−イル)カルボキサミド)−D−マンノースである蛍光標識糖誘導体。
- がん又はがん細胞を検出するための方法であって、以下の工程、
a.標的細胞に、蛍光分子団として3−カルボキシ−6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシクマリンが3−アミド結合(−CO−NH−)を介して、もしくは3−カルボキシメチル−6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシ−4−メチルクマリンが3−メチルアミド結合(−CH 2 −CO−NH−)を介してL−グルコースに結合し、がん細胞に取り込まれる蛍光標識L−グルコース誘導体を含有する組成物を接触させる工程、及び
b.該標的細胞内に存在する該L−グルコース誘導体を検出する工程、
を含む検出方法。 - 前記蛍光標識L−グルコース誘導体が、L−グルコースの1位、2位、3位、4位又は6位に、蛍光分子団として3−カルボキシ−6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシクマリン又は3−カルボキシメチル−6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシ−4−メチルクマリンを結合した分子である請求項9に記載の検出方法。
- 前記蛍光標識L−グルコース誘導体が、2−デオキシ−2−((6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシクマリン−3−イル)カルボキサミド)−L−グルコース、又は2−デオキシ−2−(2−(6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシ−4−メチルクマリン−3−イル)アセタミド)−L−グルコースである請求項9に記載の検出方法。
- 前記工程aにおける検出が標的細胞をイメージングすることにより行う請求項9〜11のいずれか一つに記載の検出方法。
- 前記工程aにおける組成物が、2位にスルホローダミンをスルホンアミド結合せしめた2−アミノ−2−デオキシ−L−グルコースをさらに含み、かつ前記工程bが、標的細胞内に存在する蛍光標識L−グルコース誘導体を検出する工程である、請求項9〜12のいずれか一つに記載の検出方法
- 標的細胞が腫瘍細胞塊中の細胞である、請求項9〜13のいずれか一つに記載の検出方法。
- 標的がん細胞をイメージングするためのイメージング剤であって、蛍光分子団として3−カルボキシ−6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシクマリンが3−アミド結合(−CO−NH−)を介して、もしくは3−カルボキシメチル−6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシ−4−メチルクマリンが3−メチルアミド結合(−CH 2 −CO−NH−)を介してL−グルコースに結合し、がん細胞に取り込まれる蛍光標識L−グルコース誘導体を含むがん細胞のイメージング剤。
- 前記蛍光標識L−グルコース誘導体が、L−グルコースの1位、2位、3位、4位又は6位に、蛍光分子団として3−カルボキシ−6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシクマリン又は3−カルボキシメチル−6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシ−4−メチルクマリンを−NH−結合を介して結合した蛍光標識L−グルコース誘導体である請求項15に記載のイメージング剤。
- 前記蛍光標識L−グルコース誘導体が、2−デオキシ−2−((6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシクマリン−3−イル)カルボキサミド)−L−グルコース、又は2−デオキシ−2−(2−(6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシ−4−メチルクマリン−3−イル)アセタミド)−L−グルコースである請求項15に記載のイメージング剤。
- 前記イメージング剤がさらに、2位にスルホローダミンをスルホンアミド結合せしめた2−アミノ−2−デオキシ−L−グルコースを含む請求項15〜17のいずれか一つに記載のイメージング剤。
- 2−デオキシ−2−((6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシクマリン−3−イル)カルボキサミド)−L−グルコース、又は2−デオキシ−2−(2−(6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシ−4−メチルクマリン−3−イル)アセタミド)−L−グルコースである蛍光標識L−グルコース誘導体。
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