CN108949912A - 一种利用基因芯片检测α-倒捻子素引发的基因表达变化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种利用基因芯片检测α‑倒捻子素对炎症细胞基因表达变化的方法，所述方法包括以下步骤：步骤一，IEC‑6细胞炎症模型的建立，步骤二、用LPS刺激后的IEC‑6细胞炎症模型测试中药。

Description

一种利用基因芯片检测α-倒捻子素引发的基因表达变化的 方法
技术领域：
本发明涉及药物筛选及其疗效检测方法，特别涉及用基因芯片检测脂多糖刺激IEC-6细胞表达谱变化的方法，从而检测脂多糖是否能够引发炎症反应，以及作为炎症模型用来测试药物对炎症模型的作用以及作用机制。
背景技术：
中药是指以中医药理论为指导，有着独特的理论体系和应用形式，用于预防和治疗疾病并具有康复与保健作用的天然药物及其加工代用品，主要包括植物药、动物药、矿物药。
中药的治疗作用长期以来是以服用后的症状变化为依据确定的，这种方法对于新的适应症显然不适用，为研究中药的新的疗效和作用机制，采用新技术势在必行。
IEC-6细胞：是大鼠正常小肠粘膜上皮细胞，可以用于营养学和抗炎药物的研究。
脂多糖是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分，脂多糖对宿主是有毒性的。脂多糖只有当细菌死亡溶解或用人工方法破坏菌细胞后才释放出来，所以叫做内毒素。其毒性成分主要为类脂质A。内毒素位于细胞壁的最外层、覆盖于细胞壁的粘肽上。各种细菌的内毒素的毒性作用较弱，大致相同，可引起发热、微循环障碍、内毒素休克及播散性血管内凝血等。内毒素耐热而稳定，抗原性弱。
脂多糖具有以下特性：
①脂质和多糖的复合物；
②为革兰氏阴性细菌外璧层中特有的一种化学成分，分子量大于 10000，结构复杂，在不同类群、甚至菌株之间都有差异。以沙门氏菌为例，其脂多糖由核心多糖、O-多糖侧链、和类脂A组成。为革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分，脂多糖是内毒素和重要群特异性抗原 (O抗原)。
脂多糖由三部分组成:类脂A、核心多糖、O-抗原。脂质A(Lipid A) 为构成内毒素活性的糖脂，以共价键联结到杂多糖链，有两部分:一是核心多糖，在有关的菌株内是恒定的；另一O特异性链(O-specific chain)是高度可变的。大肠杆菌的脂多糖在实验室免疫学中是常用的 B细胞促分裂因子即多克隆活化因子(polyclonal activator)。
脂多糖为含糖和脂质的化合物,在组成上糖的分量多于脂,故名。革兰氏阴性细菌外膜的一种主要成分。其脂酰链嵌入于细菌的外膜，其糖链暴露于细菌的表面，并具有抗原性(通常称为O抗原)。脂多糖也是细菌内毒素的主要成分。当革兰氏阴性细菌崩裂时释出，是很强的发热原。其单糖组成较特殊，包括D-葡萄糖D-半乳糖及D-甘露糖的 3，6位脱氧衍生物及一些辛醛糖。
外膜蛋白嵌合在LPS和磷脂层外膜上。结构上，它们都具有β-桶状结构，不同的外膜蛋白的β-桶由不同偶数个β-折叠片组成，从8 个到22个不等；功能上，它们具有为外膜提供通透性，维持外膜结构稳定的作用。折叠好的外膜蛋白具有极强的稳定性，常温下，在2％的强离子型表面活性剂SDS中，外膜蛋白仍然具有正常的折叠结构；而在此温度下，其他可溶蛋白在0.2％的SDS中就可以迅速失去结构。因此通常将加样前是否对样品进行95C加热去折叠的SDS-PAGE称为 denatured SDS-PAGE和semi-native SDS-PAGE，并被用来研究外膜蛋白的折叠状况。
基因芯片(gene chip)是80年代中期提出的。基因芯片的测序原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法，可以快速得到所测DNA碎片的基因序列。比如在一块基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探针。当溶液中含有带有荧光标记的核酸序列时，与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出靶核酸的序列。
基因芯片可分为三种主要类型：
1)固定在聚合物基片(尼龙膜，硝酸纤维膜等)表面上的核酸探针或cDNA片段，通常用同位素标记的靶基因与其杂交，通过放射显影技术进行检测。这种方法的优点是所需检测设备与目前分子生物学所用的放射显影技术相一致,相对比较成熟。但芯片上探针密度不高，样品和试剂的需求量大，定量检测存在较多问题。
2)用点样法固定在玻璃板上的DNA探针阵列，通过与荧光标记的靶基因杂交进行检测。这种方法点阵密度可有较大的提高，各个探针在表面上的结合量也比较一致，但在标准化和批量化生产方面仍有不易克服的困难。
3)在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷酸探针阵列,与荧光标记的靶基因杂交进行检测。该方法把微电子光刻技术与DNA化学合成技术相结合，可以使基因芯片的探针密度大大提高，减少试剂的用量，实现标准化和批量化大规模生产，有着十分重要的发展潜力。
本发明采用基因芯片技术，找到一种检测方法，使用该方法，可以观察使用脂多糖刺激IEC-6细胞基因表达谱的变化，从而判断IEC-6细胞可能的炎症发生机理，从而为中药治疗IEC-6细胞炎症提供模型和依据。
发明内容
本发明提供一种采用基因芯片技术检测IEC-6细胞基因表达谱的变化的方法，所述方法包括以下步骤：
步骤一，IEC-6细胞炎症模型的建立，方法如下：
1)，IEC-6细胞培养；
2)，脂多糖刺激建立IEC-6细胞炎症模型；
3)，分离提取LPS刺激后的IEC-6细胞总RNA；
4)，总RNA反转录成cDNA，再转化为cRNA，纯化cRNA；
5)，用基因芯片检测脂多糖刺激后的IEC-6细胞基因变化
cRNA样品和芯片杂交，然后取出芯片，洗涤后在扫描仪中扫描；根据结果判断加入脂多糖的样品和不加脂多糖的样品之间的表达变化；步骤二、用脂多糖刺激后的IEC-6细胞炎症模型测试中药，方法如下：
1)，IEC-6细胞的培养，分离，纯化；
2)，脂多糖刺激IEC-6细胞；
3)，加入中药；
4)，提取加入中药的脂多糖刺激后的IEC-6细胞的总RNA；
5)，总RNA反转录成cDNA，再转化为cRNA，纯化cRNA；
6)，基因芯片检测IEC-6细胞炎症细胞基因变化
cRNA样品和芯片杂交，然后取出芯片，洗涤后在扫描仪中扫描；
7)，根据检测结果判断加入中药的的样品和不加中药的样品之间的表达变化。
其中，所述中药为α-倒捻子素。
本发明进一步提供用LPS刺激后的IEC-6细胞炎症模型测试α-倒捻子素，方法如下：
1)，IEC-6细胞培养
培养IEC-6细胞，当IEC-6细胞融合率达90％以上时，行细胞传代；
2)，建立IEC-6细胞炎症模型
加入脂多糖刺激IEC-6细胞，得到炎症模型；
3)，向脂多糖刺激后IEC-6细胞中加入α-倒捻子素
向脂多糖刺激后IEC-6细胞中加入α-倒捻子素；
4)，对加入α-倒捻子素的细胞提取总RNA
加入试剂，使细胞完全裂解，经离心得到RNA；
5)，cRNA样品的制备
纯化总RNA，合成cDNA，将cDNA转化为aaUTP标记的cRNA，纯化 cRNA；
6)，检测
cRNA样品和芯片杂交，然后取出芯片，洗涤后在扫描仪中扫描；
7)，根据检测结果判断加入α-倒捻子素的样品和不加α-倒捻子素的样品之间的表达变化。
其中，所述1)，IEC-6细胞培养，步骤如下：
细胞培养瓶中培养IEC-6细胞，当IEC-6细胞融合率达90％以上时，用0.25％含EDTA胰酶进行消化处理，随后加入含酚红DMEM完全培养液终止胰酶消化作用，将含细胞培养液移至15mL离心管中，1000rpm 离心5min，弃去培养基，加入含酚红DMEM完全培养液，进行细胞传代。
其中，所述2)，建立IEC-6细胞炎症模型，步骤如下：
用5-15μg/ml的脂多糖刺激IEC-6细胞12-36小时作为炎症模型。其中，所述3)，向脂多糖刺激后IEC-6细胞中加入或不加α-倒捻子素，步骤如下：
分别取低、中、高三种浓度α-倒捻子素，加入刺激后的细胞悬液中 5-10小时。
其中，所述4)，对加入α-倒捻子素的细胞提取总RNA，步骤如下：
(1)细胞按试验分组处理后，弃去DMEM完全培养液，常温PBS清洗 2遍，加入1mL预冷的Trizol试剂，充分吹打使细胞使其完全裂解，置于室温反应10min；
(2)将上述液体转移到1.5mLEP管中，加入200μL氯仿，剧烈振荡15s，室温下静置3min，4℃，10,000×g低温高速离心机离心 15min，离心后，RNA溶于上层水相中；
(3)小心吸取上层水相至另一新的高压处理过的1.5mL EP管中，加入500μL异丙醇，充分混匀，室温静置10min；
(4)4℃，12,000×g离心10min，弃掉上清，RNA为白色沉淀于离心管底部，随后加入1mL 75％DEPC水配置的乙醇，温和振荡，4℃， 8,000×g离心5min，重复三次；
(5)尽量弃去上清，移液枪吸去残留液体，室温自然干燥5min，加入0.1％DEPC水20～30μL，吹吸混匀，RNA充分溶解，-80℃保存备用。
其中，所述5)，cRNA样品的制备，步骤如下：
利用Agilent 2100Bioanalyzer检查RNA的完整性，采用QIAGEN Kit纯化总RNA，一步法合成cDNA，将cDNA转化为aaUTP 标记的cRNA，QIAGEN RNeasy Mini kit纯化cRNA得到cRNA样品。所述6)，检测，步骤如下：
cRNA样品和已经制备好的含有互补DNA的基因芯片杂交，然后取出芯片于洗液1中洗涤1分钟，再将芯片放入洗液2中洗涤1分钟 (37℃)；Agilent扫描仪中扫描，分辨率为5μm，扫描仪自动以100％和10％PMT各扫描一次，两次结果Agilent软件可自动合并。
其中，所述7)，根据检测结果判断加入和不加α-倒捻子素的样品之间的表达变化，步骤如下：脂多糖处理组与空白对照组相比，如果有差异，表明脂多糖刺激IEC-6使得与炎症相关的基因表达发生了变化，加入α-倒捻子素的样品组和脂多糖处理组进行对比，如果有差异，表明α-倒捻子素对炎症细胞的基因表达具有作用。
本发明的上述方法，是通过对以下中药进行研究得到的结果，本发明所述的中药是α-倒捻子素，本发明将α-倒捻子素加入炎症细胞，以观察炎症细胞基因表达变化。
α-倒捻子素，结构式如下：
α-倒捻子素作为山竹果壳的成分，具有抗癌、抗氧化、促细胞凋亡、抗菌、植物雌激素等作用。有关文献包括：抗炎[Kim H M，2017； Franceschelli S，2016]、抗菌[Guzmán-Beltrán S，2015；Nguyen Thi Mai Phuong，2017]、抗肿瘤的作用[Yoo J H，2011；BenjakulR， 2015]。研究表明，α-倒捻子素(0-10μM)与人的牙周膜成纤维细胞(PDLF)共培养24h后MTT分析对细胞活力没有显著影响[Kwak H H， 2016]。关于α-倒捻子素的抗炎机制，部分人也做过相应研究。Chen L G等人发现α-倒捻子素可以降低LPS引起的RAW 264.7巨噬细胞分泌PGE2和NO降低，并且抑制NF-κB信号通路被激活[Chen L G,2016]。Lee L T等人发现α-倒捻子素对LPS刺激RAW 264.7巨噬细胞分泌IL-6和TNF-α有抑制作用[Lee L T，2013]。
α-倒捻子素对LPS(脂多糖)引起的IEC-6细胞炎症的作用及其作用机制尚未见报道。为研究该作用和机制，本发明采用基因芯片技术，找到一种检测方法，使用该方法，发现α-倒捻子素可以显著改善由LPS引起的细胞形态的改变，并且有效降低细胞凋亡数量。同时，发现α-倒捻子素可以显著抑制由LPS引起的引起的NO、PGE2、IL-6、 TNF-α、IL-1β分泌增多，其中10μM的α-倒捻子素效果最为显著。通过进一步测定α-倒捻子素对iNOS、COX-2、IL-6、TNF-α、IL-1 βmRNA表达的调节，证实了α-倒捻子素通过抑制炎症因子mRNA的转录从而抑制炎症因子的表达，最终抑制LPS诱导的炎症反应。
本发明以α-倒捻子素作为中药，以本发明炎症模型进行了以上实验。其中，根据检测结果判断加入和不加α-倒捻子素的样品之间的表达变化，方法如下：
(1)采用通过SAS在线分析软件完成各种相关信息分析，原始数据被导入GeneSpring软件后，按照该软件预定的Nomalization方案，获得校正后的数据；
(2)判定单张微阵列上基因是否在各样品内表达，应用GeneSpring 软件处理校正后的数据，首先判定在单张微阵列上每个基因或表达序列标签(Expressed SequenceTags,EST)是否在相应样品内表达，具体的方法是，(1)根据公式R＝(PM-MM)/(PM+MM)计算出每个探针队的R值；(2)检验R值是否大于事先设定的阈值(Tau值＝0.015)，采用单侧秩和检验(one-sided Wilcoxon’s rank test)，当探针组各 PM-MM探针对表达信号秩和检验P<0.04时，判定该基因(或EST)在样品中表达(Present,P)；P>0.06，判定为不表达(Absent,A)；当P 介于此两者之间，判定为边缘表达(Marginal,M)；随后对两组间微阵列结果进行两两比较，获取差异表达数据，即检测出微阵列上所有探针组在两两样品之间的表达变化情况，并给出它们对应的差异表达基因或EST的功能分类和相关的Pathway，判断两组间表达变化的程度则根据信号比的对数值SLR(Signal Log Ratio)；SLR＝Log2Fold，这样就确定了样品间同一探针组的表达变化倍数及变化方向；所有两样品中呈现表达的基因或EST，也就是为P或M，而不是A，如果SLR 的绝对值≥1，就具有统计学意义，可以判定该基因或EST在试验组样品内相对于对照组表达上调或下调；
(3)结果与分析：LPS处理组与对照组相比，如果有差异，表明基因参与了病毒感染、免疫系统疾病、NF-κB信号通路、Toll样受体通路，抗原加工递呈等相关信号通路中，表明LPS刺激IEC-6使得与炎症相关的基因表达发生了变化，加入α-倒捻子素的样品组和LPS处理组进行对比，如果有差异，表明α-倒捻子素对炎症细胞的基因表达具有作用。
本发明的方法中，其中所述已经制备好的含有互补DNA的基因芯片，属于现有技术，可以用现有技术方法制备，比如先提取IEC-6细胞 DNA，或者先提取LPS刺激后的IEC-6细胞DNA，采用以下方法制备成基因芯片：光引导聚合技术，压电打印法，微型机械点样法，化学喷射法。包括使用任选的以下设备：
本发明根据上述技术方案，将需要检测的样品在操作过程中，设置为空白对照组(不加入LPS，也不加入α-倒捻子素)，LPS刺激IEC-6 组(加入LPS)，LPS刺激IEC-6+α-倒捻子素组(加入LPS，也加入α-倒捻子素)三个组别，分别测定它们的cRNA序列，根据谱图进行比较分析，结果发现，α-倒捻子素对于LPS刺激IEC-6后形成的炎症具有抑制作用。
本发明将α-倒捻子素加入引发炎症反应的细胞培养液中，采用基因芯片技术对样品进行基因芯片微阵列扫描，以检测α-倒捻子素对炎症细胞基因表达的变化，从而得知α-倒捻子素的新的作用和作用机制，为下一步研究α-倒捻子素作为药物的应用打下了基础。
使用倒捻子素后，通过芯片分析倒捻子素细胞与脂多糖组细胞mRNA 表达谱，在细胞GO功能分类上主要体现在表1调整上，这前10位 GO差异极显著。表现在Pathway富集分析上，如表2所示，这前10 位Pathway差异极显著。
研究发现α-倒捻子素可以显著改善由LPS引起的细胞形态的改变，并且有效降低细胞凋亡数量。同时，α-倒捻子素可以显著抑制由LPS 引起的引起的NO、PGE2、IL-6、TNF-α、IL-1β分泌增多，其中10 μM的α-倒捻子素效果最为显著。通过进一步测定α-倒捻子素对iNOS、COX-2、IL-6、TNF-α、IL-1βmRNA表达的调节，证实了α- 倒捻子素通过抑制炎症因子mRNA的转录从而抑制炎症因子的表达。并且α-倒捻子素可以显著下调由LPS引起的TLR4和MyD88mRNA升高，其中10μM的α-倒捻子素效果最显著；证明了α-倒捻子素抑制 LPS诱导的IEC-6细胞的炎症是通过TLR4-MyD88-TAK1-NF-κB来实现的。
本发明进一步将本发明上述实验结果引申到任意一种可能具有抗炎作用的中药或其提取物，从而完成了本发明。
附图说明：
图1差异基因GO富集分析(前10位)
图2差异基因Pathway富集分析(前10位)
图3.1 LPS处理组与α-倒捻子素组比较下调基因热图，其中右侧三条代表表达量上调，左侧三条代表表达量下调。
图3.2 LPS处理组与α-倒捻子素组比较上调基因热图，其中左侧三条代表表达量上调，右侧三条代表表达量下调。
具体实施方式：
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
实施例1
材料方法
IEC-6细胞培养
2.2材料与方法
2.2.1细胞
IEC-6细胞株(CRL21592)，购自北京协和细胞资源中心(Cell Resource Center，IBMS，CAMS/PUMC)。
2.2.2试验仪器和试剂
2.2.2.1仪器
2.2.2.2实验试剂
2.2.2.3主要溶液配制
DMEM完全培养基
DMEM完全培养基由89.2％含酚红DMEM培养液+10％胎牛血清+0.7％胰岛素+0.1％双抗组成。
细胞冻存液
IEC-6细胞冻存液由70％含酚红DMEM培养液+20％胎牛血清+10％DMSO 组成。
MTT溶液
称取10mg MTT溶于2mL PBS溶液中，配置成5mg/mL的MTT溶液， 0.22μm滤膜过滤后，-20℃冻存备用。
0.1％DEPC水
1mL DEPC加入999mL双蒸水肿，混匀制成0.1％DEPC，室温过夜后高压灭菌处理，4℃保存。
RNA用75％乙醇
75mL无水乙醇加入25mL 0.1％DEPC水中制成，混匀后4℃保存备用。
α-倒捻子素(高效液相色谱检测纯度98.0％)(Tongtian，Shanghai， China)，用不含血清无色培养基配置α-倒捻子素溶液初始浓度为 500μM，0.22μm滤膜过滤除菌后分装于1.5mL离心管中，用药时稀释为相应浓度。
2.2.3试验方法
2.2.3.1IEC-6细胞培养
细胞培养瓶中培养IEC-6细胞，当IEC-6细胞融合率达90％以上时，用0.25％含EDTA胰酶进行消化处理，随后加入含酚红DMEM完全培养液终止胰酶消化作用，将含细胞培养液移至15mL离心管中，1000rpm 离心5min，弃去培养基，加入含酚红DMEM完全培养液，进行细胞传代。
2.2.3.2IEC-6细胞冻存
倒置显微镜观察细胞培养瓶中IEC-6细胞，当细胞融合率达到90％以上时，常温PBS清洗两遍后加入0.25％含有EDTA胰酶进行消化，随后加入含酚红DMEM完全培养液终止胰酶消化作用，1000rpm离心5 min，弃去上清，用预冷的细胞冻存液悬浮细胞并分装于标号的细胞冻存管中，l.5mL/管。随后按照4℃放置20min、-20℃放置2h、 -80℃过夜的步骤处理，最后将冻存管置于液氮罐中。
2.2.3.3IEC-6细胞复苏
液氮中取出细胞冻存管，迅速置于37℃水浴锅中加热至固体基本变为液态，在超净工作台中将冻存液转移至预先加入5mL DMEM培养基的离心管中，充分吹打混匀，1000rpm离心5min，按上述步骤清洗细胞三遍，最后将含有IEC-6细胞培养液转移至细胞培养瓶中，在 37℃含5％CO2条件下培养，每24h更换一次DMEM完全换培养液，当细胞融合率达到90％以上后进行传代。
2.2.3.4MTT筛选LPS刺激浓度、时间及α-倒捻子素作用浓度 1IEC-6细胞炎症模型的建立
不同浓度的LPS(0、1、5、10、20、40、80μg/ml)刺激细胞24h，结果发现10μg/ml的LPS对细胞的生长有明显的抑制作用(P＜ 0.05)，并且随着LPS浓度的增加细胞活力持续下降，因此用10μg/ml 的LPS刺激IEC-6细胞24h作为炎症模型。
α-倒捻子素对IEC-6细胞作用剂量的筛选
不同浓度的α-倒捻子素(0、1.25、2.5、5、10、20、40μM)与细胞共培养12h，并以细胞活力为检测指标进行筛选。结果发现0-10 μM的α-倒捻子素对IEC-6细胞没有明显的毒性作用，随着α-倒捻子素浓度增加细胞活力持续下降，因此选用2.5、5、10μM的α-倒捻子素作为高中低剂量组。
细胞培养瓶中培养IEC-6细胞，当细胞融合率达到90％以上时，常温 PBS清洗两遍后加入0.25％含EDTA胰酶进行消化，采用台盼兰染色细胞计数，调整细胞密度为5×104cell/mL，96孔板中每孔加入200μL 细胞，置于在37℃含5％CO2培养箱中培养。待细胞融合率达到80％后，吸取上清，常温PBS洗2遍后，加入不含血清的无色培养基200 μL，分别LPS刺激0、1、3、6、9、12h后加入10μL MTT，孵育4h 后弃去培养液，加入100μL DMSO，震荡混匀，酶标仪490nm处测定各孔的吸光值(OD)。α-倒捻子素浓度分别为2.5、5、10μM，作用细胞24h后，按照上述方法筛选出无毒剂量浓度。
2.2.3.5α-倒捻子素对LPS刺激后IEC-6细胞形态影响
筛选出无毒α-倒捻子素浓度范围，分别取低、中、高三种浓度预处理IEC-6细胞6h后，倒置显微镜观察各组细胞形态学变化。
2.2.3.6.1细胞分组及处理
细胞培养瓶中培养细胞，当IEC-6细胞融合率达到90％以上后，进行传代。细胞分为对照组、模型组、α-倒捻子素浓度分别为2.5、5、 10 M并分别预处理细胞12h后在进行LPS刺激。
2.2.3.6.2细胞总RNA的提取
(1)细胞按试验分组处理后，弃去DMEM完全培养液，常温PBS清洗 2遍，加入1mL预冷的Trizol试剂，充分吹打使细胞使其完全裂解，置于室温反应10min。
(2)将上述液体转移到1.5mLEP管中。加入200μL氯仿，剧烈振荡15s，室温下静置3min。4℃，10,000×g低温高速离心机离心 15min，离心后，RNA溶于上层水相中。
(3)小心吸取上层水相至另一新的高压处理过的1.5mL EP管中，加入500μL异丙醇，充分混匀，室温静置10min。
(4)4℃，12,000×g离心10min，弃掉上清，RNA为白色沉淀于离心管底部，随后加入1mL 75％DEPC水配置的乙醇，温和振荡。4℃， 8,000×g离心5min，重复三次。
(5)尽量弃去上清，移液枪吸去残留液体，室温自然干燥5min，加入0.1％DEPC水20～30μL，吹吸混匀，RNA充分溶解，-80℃保存备用。
(6)使用核酸蛋白仪测定RNA浓度和OD260/OD280比值，符合条件的RNA样本随后进行逆转录试验。
cRNA样品的制备
利用Agilent 2100Bioanalyzer检查RNA的完整性。采用QIAGEN Kit纯化总RNA，一步法合成cDNA，将cDNA转化为aaUTP 标记的cRNA，QIAGEN RNeasy Mini kit纯化cRNA；
3.2.6.2芯片洗涤及扫描
cRNA样品片段化和芯片杂交。然后取出芯片于洗液1中洗涤1分钟，再将芯片放入洗液2中洗涤1分钟(37℃)；Agilent扫描仪中扫描，分辨率为5μm，扫描仪自动以100％和10％PMT各扫描一次，两次结果 Agilent软件可自动合并。
3.2.6.3芯片数据分析
采用通过SAS在线分析软件完成各种相关信息分析。原始数据被导入 GeneSpring软件后，按照该软件预定的Nomalization方案，获得校正后的数据。
判定单张微阵列上基因是否在各样品内表达。应用GeneSpring软件处理校正后的数据。首先判定在单张微阵列上每个基因或表达序列标签(Expressed Sequence Tags,EST)是否在相应样品内表达。具体的方法是，(1)根据公式R＝(PM-MM)/(PM+MM)计算出每个探针队的R值；(2)检验R值是否大于事先设定的阈值(Tau值＝0.015)，采用单侧秩和检验(one-sided Wilcoxon’s rank test)，当探针组各PM-MM探针对表达信号秩和检验P<0.04时，判定该基因(或EST)在样品中表达(Present,P)；P>0.06，判定为不表达(Absent,A)；当P介于此两者之间，判定为边缘表达(Marginal,M)。
随后对两组间微阵列结果进行两辆比较，获取差异表达数据，即检测出微阵列上所有探针组在两两样品之间的表达变化情况，并给出它们对应的差异表达基因或EST的功能分类和相关的Pathway。判断两组间表达变化的程度则根据信号比的对数值SLR(SignalLog Ratio)。 SLR＝Log2Fold(Fold代表试验组相对于对照组某一探针组的表达强度的变化倍数)。这样就确定了样品间同一探针组的表达变化倍数及变化方向。所有两样品中呈现表达的基因或EST，也就是为P或M，而不是A，如果SLR的绝对值≥1(即表达倍数≥2)，就具有统计学意义，可以判定该基因或EST在试验组样品内相对于对照组表达上调或下调。检测结果最后以Excel表格的形式，将各组间的比较及原始数据值报告出来。
3.结果与分析
本发明将组别设置为空白对照组，LPS刺激IEC-6组，LPS刺激IEC-6+ α-倒捻子素组三个组别，经过测定，结果如下：
3.1LPS刺激IEC-6+α-倒捻子素组与LPS刺激IEC-6组相比，与炎症相关的差异表达基因共456个，其中上调242个，下调213个。这些差异基因主要与氧化应激反应、代谢、IL-6,生长因子、抗病毒反应、先天性免疫、炎症反应、细胞因子调控等功能有关，差异基因主要参与病毒感染、免疫系统疾病、NF-κB信号通路、Toll样受体通路，抗原加工递呈等相关信号通路中。这些都说明，LPS刺激IEC-6 使得与炎症相关的基因表达发生了变化，从而改变了细胞的免疫功能，使细胞产生炎性反应，导致细胞受损。
实施例2
模型的建立：
步骤1，IEC-6细胞培养
细胞培养瓶中培养IEC-6细胞，当IEC-6细胞融合率达90％以上时，用0.25％含EDTA胰酶进行消化处理，随后加入含酚红DMEM完全培养液终止胰酶消化作用，将含细胞培养液移至15mL离心管中，1000rpm 离心5min，弃去培养基，加入含酚红DMEM完全培养液，进行细胞传代；
IEC-6细胞冻存
倒置显微镜观察细胞培养瓶中IEC-6细胞，当细胞融合率达到90％以上时，常温PBS清洗两遍后加入0.25％含有EDTA胰酶进行消化，随后加入含酚红DMEM完全培养液终止胰酶消化作用，1000rpm离心5 min，弃去上清，用预冷的细胞冻存液悬浮细胞并分装于标号的细胞冻存管中，l.5mL/管。随后按照4℃放置20min、-20℃放置2h、 -80℃过夜的步骤处理，最后将冻存管置于液氮罐中；
IEC-6细胞复苏
液氮中取出细胞冻存管，迅速置于37℃水浴锅中加热至固体基本变为液态，在超净工作台中将冻存液转移至预先加入5mL DMEM培养基的离心管中，充分吹打混匀，1000rpm离心5min，按上述步骤清洗细胞三遍，最后将含有IEC-6细胞培养液转移至细胞培养瓶中，在 37℃含5％CO2条件下培养，每24h更换一次DMEM完全换培养液，当细胞融合率达到90％以上后进行传代；
步骤2，LPS刺激IEC-6细胞炎症模型的建立
用10μg/ml的LPS刺激IEC-6细胞24h作为炎症模型；
步骤3，细胞总RNA的提取
(1)细胞按试验分组处理后，弃去DMEM完全培养液，常温PBS清洗 2遍，加入1mL预冷的Trizol试剂，充分吹打使细胞使其完全裂解，置于室温反应10min；
(2)将上述液体转移到1.5mLEP管中。加入200μL氯仿，剧烈振荡15s，室温下静置3min。4℃，10,000×g低温高速离心机离心 15min，离心后，RNA溶于上层水相中；
(3)小心吸取上层水相至另一新的高压处理过的1.5mL EP管中，加入500μL异丙醇，充分混匀，室温静置10min；
(4)4℃，12,000×g离心10min，弃掉上清，RNA为白色沉淀于离心管底部，随后加入1mL 75％DEPC水配置的乙醇，温和振荡；4℃， 8,000×g离心5min，重复三次；
(5)尽量弃去上清，移液枪吸去残留液体，室温自然干燥5min，加入0.1％DEPC水20～30μL，吹吸混匀，RNA充分溶解，-80℃保存备用；
(6)使用核酸蛋白仪测定RNA浓度和OD260/OD280比值，符合条件的RNA样本随后进行逆转录试验；
步骤5，cRNA样品的制备
利用Agilent 2100Bioanalyzer检查RNA的完整性。采用QIAGEN Kit纯化总RNA，一步法合成cDNA，将cDNA转化为aaUTP 标记的cRNA，QIAGEN RNeasy Mini kit纯化cRNA；
步骤6，检测
cRNA样品和已经制备好的含有互补DNA的基因芯片杂交，然后取出芯片于洗液1中洗涤1分钟，再将芯片放入洗液2中洗涤1分钟 (37℃)；Agilent扫描仪中扫描，分辨率为5μm，扫描仪自动以100％和10％PMT各扫描一次，两次结果Agilent软件可自动合并；采用通过SAS在线分析软件完成各种相关信息分析。原始数据被导入 GeneSpring软件后，按照该软件预定的Nomalization方案，获得校正后的数据；
(1)根据公式R＝(PM-MM)/(PM+MM)计算出每个探针队的R值；
(2)检验R值是否大于事先设定的阈值(Tau值＝0.015)，采用单侧秩和检验(one-sided Wilcoxon’s rank test)，当探针组各PM-MM探针对表达信号秩和检验P<0.04时，判定该基因(或EST)在样品中表达(Present,P)；P>0.06，判定为不表达(Absent,A)；当P介于此两者之间，判定为边缘表达(Marginal,M)；
随后对两组间微阵列结果进行两两比较，获取差异表达数据，即检测出微阵列上所有探针组在两两样品之间的表达变化情况，并给出它们对应的差异表达基因或EST的功能分类和相关的Pathway。判断两组间表达变化的程度则根据信号比的对数值SLR(SignalLog Ratio)； SLR＝Log2Fold(Fold代表试验组相对于对照组某一探针组的表达强度的变化倍数)。这样就确定了样品间同一探针组的表达变化倍数及变化方向。所有两样品中呈现表达的基因或EST，也就是为P或M，而不是A，如果SLR的绝对值≥1(即表达倍数≥2)，就具有统计学意义，可以判定该基因或EST在试验组样品内相对于对照组表达上调或下调。检测结果最后以Excel表格的形式，将各组间的比较及原始数据值报告出来；
(3)结果与分析
LPS处理组与对照组相比，如果有差异，表明基因参与了病毒感染、免疫系统疾病、NF-κB信号通路、Toll样受体通路，抗原加工递呈等相关信号通路中，表明LPS刺激IEC-6使得与炎症相关的基因表达发生了变化。

Claims (10)

1.一种采用基因芯片技术检测IEC-6细胞基因表达谱的变化的方法，所述方法包括以下步骤：
步骤一，IEC-6细胞炎症模型的建立，方法如下：
1)，IEC-6细胞培养；
2)，脂多糖刺激建立IEC-6细胞炎症模型；
3)，分离提取LPS刺激后的IEC-6细胞总RNA；
4)，总RNA反转录成cDNA，再转化为cRNA，纯化cRNA；
5)，用基因芯片检测脂多糖刺激后的IEC-6细胞基因变化
cRNA样品和芯片杂交，然后取出芯片，洗涤后在扫描仪中扫描；根据结果判断加入脂多糖的样品和不加脂多糖的样品之间的表达变化；
步骤二、用脂多糖刺激后的IEC-6细胞炎症模型测试中药，方法如下：
1)，IEC-6细胞的培养，分离，纯化；
2)，脂多糖刺激IEC-6细胞；
3)，加入中药；
4)，提取加入中药的脂多糖刺激后的IEC-6细胞的总RNA；
5)，总RNA反转录成cDNA，再转化为cRNA，纯化cRNA；
6)，基因芯片检测IEC-6细胞炎症细胞基因变化
cRNA样品和芯片杂交，然后取出芯片，洗涤后在扫描仪中扫描；
7)，根据检测结果判断加入中药的的样品和不加中药的样品之间的表达变化。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述中药为α-倒捻子素。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤二、用LPS刺激后的IEC-6细胞炎症模型测试中药，方法如下：
1)，IEC-6细胞培养
培养IEC-6细胞，当IEC-6细胞融合率达90％以上时，行细胞传代；
2)，建立IEC-6细胞炎症模型
加入脂多糖刺激IEC-6细胞，得到炎症模型；
3)，向脂多糖刺激后IEC-6细胞中加入α-倒捻子素
向脂多糖刺激后IEC-6细胞中加入α-倒捻子素；
4)，对加入α-倒捻子素的细胞提取总RNA
加入试剂，使细胞完全裂解，经离心得到RNA；
5)，cRNA样品的制备
纯化总RNA，合成cDNA，将cDNA转化为aaUTP标记的cRNA，纯化cRNA；
6)，检测
cRNA样品和芯片杂交，然后取出芯片，洗涤后在扫描仪中扫描；
7)，根据检测结果判断加入α-倒捻子素的样品和不加α-倒捻子素的样品之间的表达变化。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，其中，所述1)，IEC-6细胞培养，步骤如下：
细胞培养瓶中培养IEC-6细胞，当IEC-6细胞融合率达90％以上时，用0.25％含EDTA胰酶进行消化处理，随后加入含酚红DMEM完全培养液终止胰酶消化作用，将含细胞培养液移至15mL离心管中，1000rpm离心5min，弃去培养基，加入含酚红DMEM完全培养液，进行细胞传代。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，其中，所述2)，建立IEC-6细胞炎症模型，步骤如下：
用5-15μg/ml的脂多糖刺激IEC-6细胞12-36小时作为炎症模型。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，其中，所述3)，向脂多糖刺激后IEC-6细胞中加入或不加α-倒捻子素，步骤如下：
分别取低、中、高三种浓度α-倒捻子素，加入刺激后的细胞悬液中5-10小时。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，其中，所述4)，对加入α-倒捻子素的细胞提取总RNA，步骤如下：
(1)细胞按试验分组处理后，弃去DMEM完全培养液，常温PBS清洗2遍，加入1mL预冷的Trizol试剂，充分吹打使细胞使其完全裂解，置于室温反应10min；
(2)将上述液体转移到1.5mLEP管中，加入200μL氯仿，剧烈振荡15s，室温下静置3min，4℃，10,000×g低温高速离心机离心15min，离心后，RNA溶于上层水相中；
(3)小心吸取上层水相至另一新的高压处理过的1.5mL EP管中，加入500μL异丙醇，充分混匀，室温静置10min；
(4)4℃，12,000×g离心10min，弃掉上清，RNA为白色沉淀于离心管底部，随后加入1mL75％DEPC水配置的乙醇，温和振荡，4℃，8,000×g离心5min，重复三次；
(5)尽量弃去上清，移液枪吸去残留液体，室温自然干燥5min，加入0.1％DEPC水20～30μL，吹吸混匀，RNA充分溶解，-80℃保存备用。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，其中，所述5)，cRNA样品的制备，步骤如下：
利用Agilent 2100 Bioanalyzer检查RNA的完整性，采用QIAGEN Kit纯化总RNA，一步法合成cDNA，将cDNA转化为aaUTP标记的cRNA，QIAGEN RNeasy Mini kit纯化cRNA得到cRNA样品。
9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，其中，所述6)，检测，步骤如下：
cRNA样品和已经制备好的含有互补DNA的基因芯片杂交，然后取出芯片于洗液1中洗涤1分钟，再将芯片放入洗液2中洗涤1分钟(37℃)；Agilent扫描仪中扫描，分辨率为5μm，扫描仪自动以100％和10％PMT各扫描一次，两次结果Agilent软件可自动合并。
10.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，其中，所述7)，根据检测结果判断加入和不加α-倒捻子素的样品之间的表达变化，步骤如下：脂多糖处理组与空白对照组相比，如果有差异，表明脂多糖刺激IEC-6使得与炎症相关的基因表达发生了变化，加入α-倒捻子素的样品组和脂多糖处理组进行对比，如果有差异，表明α-倒捻子素对炎症细胞的基因表达具有作用。
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