CN104087681A - 利用基因芯片检测小檗碱诱导RMMVECs基因表达谱的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种利用基因芯片检测小檗碱诱导RMMVECs基因表达谱的方法，包括以下步骤：(1)制备并纯化大鼠心肌膜微血管内皮细胞RMMVECs；(2)培养二代RMMVECs，将小檗碱溶解于维持培养基中，浓度为10μg/ml，在37℃、5％CO2的条件下，将RMMVECs继续培养9h；等九步步骤；本发明成功培养了RMMVECs，并且利用基因芯片技术从基因表达水平充分验证了，提高微血管舒缩活动振幅的中药有效成分Ast和Ber能双向调节RMMVECs相关细胞因子的表达，维持细胞因子分泌的平衡，维持MVECs的正常生理功能，从而阻断了致病因子对微血管内皮细胞的伤害，发挥治疗疾病的作用。

Description

利用基因芯片检测小檗碱诱导RMMVECs基因表达谱的方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其是涉及一种利用基因芯片检测小檗碱诱导RMMVECs基因表达谱的方法。
背景技术
基因芯片(gene chip)又称为DNA阵列，为生物芯片的一种，是指将大量DNA或寡核苷酸探针密集排列形成的探针阵列。基因芯片的技术原理是DNA的碱基配对和互补，基础是杂交测序(SBH)。基因芯片采用光导原位合成或微量点样的方法，将寡核苷酸或cDNA有序地固化于支持物的表面，与已标记的待测生物样品的cDNA或cRNA杂交，通过激光共聚焦扫描等特殊设备对杂交信号的强度进行检测分析，从而判断样品中靶分子的数量。从二十世纪八十年代初SBH概念的提出，到目前的商品化基因芯片在这十几年时间里，芯片的制作技术不断完善、芯片的概念不断延伸、芯片的应用范围不断拓展，使得生物芯片技术对二十一世纪生命科学和医学的发展产生无法估量的影响。芯片所带来的巨大学术价值、社会价值和经济价值引起了多家大公司及多国政府机构的极大兴趣，并投以可观的财力，这又使芯片技术得以迅速发展。
目前基因芯片按功能可以分为表达谱基因芯片和DNA测序芯片两大类；按探针的长短可分为长探针芯片和短探针芯片。
基因芯片是后基因组时代一项重要技术，它的出现为中医药学的现代化提供了一个很好的切入点，其特点是可以在同一时刻对成千上万个基因的表达情况进行分析，形成完整的细胞基因表达谱，解决了传统中药药理研究方法周期长、耗时多、产出少的问题。微血管内皮细胞能够通过其分泌功能发挥信息的传导和调节功能，保证血液与组织液之间、血液与淋巴液之间以及血液本身的有形成分与血浆之间复杂的生理、生化以及血流动力学的内环境平衡，同时分泌多种细胞因子和局部激素，参与一系列生理和病理过程。但是在现今的微血管内皮细胞的相关研究领域中，基因芯片技术的应用还不是很普遍。张斌等应用基因芯片技术分别检测正常浓度和高浓度D-葡萄糖培养基中培养后内皮细胞的基因表达谱。结果表明高糖可能通过影响微血管内皮物质代谢、信号转导、细胞膜结构和细胞外基质等的表达而导致血管内皮功能紊乱，为进一步研究高糖对微血管内皮细胞基因表达谱的影响提供资料。YμE Fei等采用基因芯片技术研究了碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblast growth factor,bFGF)对小鼠脑微血管内皮细胞(microvascμlarendothelial cell,MVEC)株bEnd.3中血管新生相关基因表达谱的改变，结果提示：bFGF具有上调促血管新生基因表达，下调抑制血管新生基因表达的作用，两者协同作用，促进血管新生。
发明内容
本发明解决的一个技术问题就是通过对小檗碱诱导体外培养的RMMVECs产生的差异性基因表达谱的分析，来探讨提高微血管舒缩活动振幅的分子机制，从基因表达水平充分验证了，提高微血管舒缩活动振幅的中药有效成分Ber能双向调节RMMVECs相关细胞因子的表达，维持细胞因子分泌的平衡，维持MVECs的正常生理功能，从而阻断了致病因子对微血管内皮细胞的伤害，发挥治疗疾病的作用。
为了解决上述问题，本发明提供一种利用基因芯片检测小檗碱诱导RMMVECs基因表达谱的方法，包括以下步骤：
(1)制备并纯化大鼠心肌膜微血管内皮细胞RMMVECs；
(2)培养二代RMMVECs，将小檗碱溶解于维持培养基中，浓度为10μg/ml，在37℃、5％CO2的条件下，将RMMVECs继续培养9h；
(3)将RMMVECs充分裂解，提取总RNA；
(4)纯化、定量总RNA；
(5)反转录合成First-strand cDNA；
(6)合成Second-strand cDNA；
(7)体外转录合成cRNA；
(8)cRNA反转录；
(9)荧光标记后进行基因芯片杂交，最后进行数据分析。
所述方法，步骤(1)中采用差速贴壁法对所制备的RMMVECs进行纯化。
所述方法，步骤(3)中充分裂解的方法为：将RMMVECs用37℃预热的PBS清洗3遍，加入2ml Trizol溶液，静置5min，用移液枪吹打，使RMMVECs充分裂解，转入离心管，于-80℃冰箱保存待用；
提取总RNA的方法为：将于-80℃冰箱保存的溶于Trizol液中的细胞样品解冻，12000rpm，4℃离心5min，弃沉淀，将上清转入一新的离心管内；按Trizol：氯仿为5：1的体积量加入氯仿，剧烈振荡混匀至粉牛奶状，室温静置3min，12000rpm，4℃离心15min，取上清至一新离心管，加入等体积异丙醇，混匀，室温静置5min，12000rpm，4℃离心15min，可见白色RNA沉淀；弃去上清，缓慢地沿管壁加入75％乙醇1ml，使沉淀悬浮于乙醇中，7500rpm，4℃离心15min；弃去上清，再加入75％乙醇1ml，重复上步；而后吸去所有上清，待残余乙醇挥发尽后加入50μl DEPC水溶解RNA沉淀，-20℃冷冻保存。
所述方法，步骤(5)中反转录合成First-strand cDNA的方法步骤为：
E.取总RNA 500ng，调整体积到4μL；
F.加入基因表达谱外参1μl；
G.配制反转录Master Mix，其中First Strand Bμffer  Mix4μL，First StrandEnzyme Mix 1μL，轻轻混匀，短暂离心置于冰上；取配好的5μLMaster Mix分别转移至含有总RNA样品的0.2mL离心管中；
H.轻轻混匀溶液，瞬时离心后42℃反应2小时；将PCR仪的热盖温度也设置成42℃，避免溶液蒸到管壁上；反应完后冰浴5分钟。
5、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(6)中合成Second-strand cDNA的方法步骤为：
D.配制Second-strand Master Mix，其中Nμclease-free Water 13μL，Second-strand Bμffer Mix 5μL，Second-strand Enzyme Mix 2μL，轻轻混匀，短暂离心后冰浴；取上步反应完毕的样品管中加入配好的20μL Second Strand Master Mix；
E.轻轻混匀，16℃反应1小时，65℃ 10min；
F.反应结束后将反应物置于冰上继续合成反应，或者迅速冻存于-20℃。
6、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(7)中体外转录合成cRNA的方法步骤为：
E.cRNA合成：配制体外转录Master Mix，其中Nμclease-free Water4μL，T7 Bμffer Mix 20μL，T7 Enzyme Mix 6L，轻轻混匀，短暂离心，往上一反应中准备好的样品管中加入30μL Master Mix；
F.轻柔混匀，40℃反应16.5小时；
G.反应完成后，准备纯化cRNA；
H.纯化、定量cRNA。
所述方法，步骤(8)中cRNA反转录的方法步骤为：
A.取cRNA纯化产物5μg，调整体积到7.5μl，加入到0.2ml无核酸酶离心管中，加入4μl随机引物，混匀，65℃反应5分钟，冰浴5分钟；
B.配制反转录Master Mix，其中4×CbcScriptⅡ Bμffer 5μL，0.1MDTT 2μL，CbcScriptⅡ 1.5μL，轻轻混匀，短暂离心；往反应完的样品管中加入8.5μl Master Mix；
C.轻轻混匀，25℃反应10分钟，37℃反应1.5小时；
D.反应结束后加入Terminate Solμtion 5μl，混匀；
B.(5)65℃反应10分钟，室温5分钟；
E.加入Neμtralize Solμtion 1μl，混匀，准备纯化；
F.纯化、定量反转录产物。
所述方法，步骤(9)中荧光标记的方法步骤为：
E.将纯化后反转录得到的cDNA真空浓缩到14μL，60℃，5min，加入4μL随机引物，混匀；95℃反应3分钟，冰浴5分钟；
F.反应结束后加入1μL Cy3；
G.配制Mix，其中5×Klenow Bμffer 5μL，Klenow Fragment 1.2μL，向上述混合液中加入6.2μL Mix，混匀，瞬离，37℃反应1.5小时，70℃反应5分钟，冰浴5分钟，准备纯化；
H.纯化、定量标记产物；
所述方法，步骤(9)中基因芯片杂交的方法步骤为：
A.芯片的准备：
a.水合：已选定的芯片于65℃水浴锅上离水面10cm左右，蒸10-15秒；晾干10-15秒，再蒸10-15秒；
b.紫外交联：设置250；
c.第一遍洗：0.5％SDS，微波炉加热至42-45℃，摇床10min，洗去cy3；
d.第二遍洗：纯水42℃，漂洗去SDS，转入下一个洗片槽；
e.第三遍洗：纯水42℃，摇床1-2min，将SDS洗去，甩干；
B.样品的准备：
a.将cy3/cy5分别浓缩至19.2μL左右，在cy3(cy5)中加杂交液41.6μL，再将cy5(cy3)吸至cy3(cy5)中，混匀，震荡，瞬离；
b.其中杂交液配制：甲酰胺20μL，20*SSC 12μL，10*SDS 1.6μL，50*Dehart 8μL；
c.95℃，3min，期间剪1×4cm滤纸，放入芯片盒中，加100-180μL蒸馏水，准备洗液1:600mL，洗液2:1L；
d.取出PCR管，骤冷，放入架子上，准备上样；
e.用吸耳球吹吹芯片，加样时靠左点成1.5cm左右的直线，然后用枪头辅助将盖玻片盖上；
f.用枪头调整一下盖玻片的整齐程度，放入芯片盒，放入杂交仪，配平，放一水瓶保湿；设置：42℃，23小时，6转，开始Hyb杂交，杂交23小时；
C.杂交结束准备读片：杂交后洗片，扫描仪预热10min，选择小块区域：power-80，PMT-800，先扫红通道，再扫绿通道，保证饱和点(白点数)小于千分之5，扫描完成后，保存。
所述方法，步骤(9)中数据分析的方法步骤为：用LμxScan 3.0软件将扫描图像转化为信号值；根据探针信号值的P值确定基因表达(P值＜0.05)、临界表达(0.05＜P值＜0.065)和不表达(P值＞0.065)；分别对6张芯片的信号值做归一化处理后，将6组分别与空白组比较，判别某一基因是否发生表达变化：当信号比值≥2时，视为基因表达上调；当信号比值≤0.5时，视为基因表达下调；当比值介于两者之间时，视为基因未发生有生物学意义的表达变化；最后用Microsoft Excel、SμM和Clμster等软件对各组数据进行统计和聚类分析。
10μg/mL的Ast和Ber分别作用RMMVECs 9h后基因芯片结果显示，各组与空白对照组相比，差异表达基因数量如下：Ast组共2231个，其中上调2166个，下调65个；Ber组共576个，其中上调513个，下调63个。结合pathway分析结果表明，Ast和Ber组中大多数通路上有功能相近、差异表达却相反的成对基因，说明两者能双向调节RMMVECs相关细胞因子的表达。Ast和Ber组共同发生差异性表达的基因共47个，参与22个信号通路，包括肌动蛋白细胞骨架调节、钙信号通路、Notch蛋白介导的信号通路、紧密连接、粘着连接等信号通路，涉及血管容量调节、NO合酶生物合成的调节，内皮细胞分化，细胞生长和维持，平滑肌细胞的调节，蛋白质代谢与修饰，糖代谢，DNA复制等功能。
本发明成功培养了RMMVECs，并且利用基因芯片技术从基因表达水平充分验证了，提高微血管舒缩活动振幅的中药有效成分Ast和Ber能双向调节RMMVECs相关细胞因子的表达，维持细胞因子分泌的平衡，维持MVECs的正常生理功能，从而阻断了致病因子对微血管内皮细胞的伤害，发挥治疗疾病的作用。
附图说明
图1为RMMVECS正常形态A：倒置显微镜镜下照片(10×4)；B：ⅧF-Ag免疫细胞化学鉴定阳性结果(10×20)；
图2为甲醛变性电泳的生物质量鉴定，其中：(1-6:对照组RMMVECs,7-9:Ast处理组RMMVECs；10-12:Ber处理组RMMVECs；上为28S,下为18S)；
图3RMMVECs的Ast组比对照组组的信号散点图；
图4RMMVECs的Ber组比对照组的信号散点图；
图5RMMVECs的Ast组比对照组3个生物学重复的聚类图；
图6RMMVECs的Ber组比对照组的3个生物学重复的聚类图。
具体实施方式
下文中将结合附图对本发明的实施例进行详细说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互任意组合。
1.1主要仪器设备
1.2主要试剂
1.3主要溶液的配置
(1)黄芪甲苷溶液(10μg/ml)：用含2％FBS的细胞维持培养基配制，-4℃保存备用。
(2)小檗碱溶液(10μg/ml)：用含2％FBS的细胞维持培养基配制，-4℃保存备用。
1.4试验用细胞
第二代大鼠心肌膜微血管内皮细胞。
细胞制备方法
1.4.1RMMVECs的分离培养
健康7日龄大鼠3只，将其用75％的乙醇消毒，于超净工作台中打开其胸腔，摘取心脏，用4℃预冷的D-Hank’s液漂洗心脏组织3遍。随后，用另一套眼科剪剪取左心室壁，于75％乙醇中浸泡10s，然后剥离心内膜和心外膜，收集心肌于4℃预冷的D-Hank’s液内漂洗，弃上清，加入37℃预热的0.2％的Ⅱ型胶原酶4mL，剪碎后于37℃CO2培养箱内消化20min。期间，每隔5min吹打一次，以防止组织块间粘连。20min后，加入37℃预热的DMEM完全培养基4mL以终止消化过程。而后将其转入离心管，1200rpm离心8min后，弃上清，加入DMEM完全培养基6mL，混匀后接种至6孔细胞培养板内，置于37℃CO2培养箱内培养2h后，更换DMEM完全培养基，每孔2mL。此后，每隔2天更换一次DMEM完全培养基，大约4天以后即可进行传代培养。
1.4.2RMMVECs的传代培养
将长至汇合状态的单层原代细胞用37℃预热的D-Hank’s漂洗2遍，向各孔中加入0.25％的胰蛋白酶(含EDTA)，置于37℃ CO2培养箱内消化3min左右，显微镜下观察，当大多数细胞间连接变松散时，立即向各孔中加入等量DMEM完全培养基终止消化，将细胞吹打脱落并混匀，按照1：2的比例进行传代。
1.4.3RMMVECs的鉴定
采用S-P免疫细胞化学法对RMMVECs第Ⅷ因子相关抗原(F-ⅧRAg)的鉴定，具体操作如下：
(1)待细胞培养板中的细胞长成单层后，吸弃培养液，并用37℃的PBS液轻轻漂洗3次，然后吸弃洗液；
(2)向细胞培养孔中加入4℃预冷的95％乙醇以完全盖住细胞培养层，并于-20℃固定20min，吸弃乙醇，用PBS连续漂洗3次，每次3min；
(3)每孔滴加300μl兔抗大鼠第Ⅷ因子相关抗原一抗，37℃孵育3h，PBS冲洗3次，每次3min；
(4)每孔滴加200μl荧光(FITC)标记羊抗兔IgG二抗，37℃孵育45min，PBS冲洗2次，每次3min，去离子水冲洗一次，于显微镜下观察细胞形态，并拍照记录。
1.4.4结果与分析
细胞贴壁生长，原代细胞3h后贴壁，24h后基本可以看出细胞形态，大多数细胞呈短梭形和扁平的多角形。3～4d后细胞呈现典型的铺路石样，5d后达到汇合状态(图1A)。第Ⅷ因子相关抗原是内皮细胞可靠的标记物，进行第Ⅷ因子相关抗原免疫荧光染色后，核周围出现黄绿色阳性反应(图1B)，结合细胞的生长特性和形态特征，证明所培养细胞均为内皮细胞。
本试验中，我们采用差速贴壁法对所培养的RMMVECs进行纯化，因为成纤维细胞贴壁过程较快且比较牢固，一般在10-30min即可完成贴壁过程，而血管内皮细胞在短时间内尚不能粘附或者附着不够稳定；同时RMMVECs和成纤维细胞对胰酶的耐受性也不同，在进行细胞消化时，成纤维细胞就先脱壁，而微血管内皮细胞则需较长的时间才能脱壁，再经过传代处理就能获得纯度较高的RMMVECs。该法相对简单且重复性较好，所得到的RMMVECs其细胞生物学特性较为稳定，能为后续试验提供较为理想的试验材料。本试验中，我们检测所培养细胞表面的ⅧF-Ag来对其进行鉴定，这是由于ⅧF-Ag是血管内皮细胞相对比较可靠地标记物，因此，通过对所培养细胞进行ⅧF-Ag的免疫细胞化学鉴定，可获得较为可信的鉴定结果。本试验在组织取材的时候充分去除大血管，原代培养的过程中又利用差速贴壁的方法对所培养的细胞进行纯化，最后再对纯化后的细胞进行标记物抗原鉴定，从而为后续试验提供坚实可信的试验材料和试验数据。
1.5基因表达谱芯片
应用博奥公司的博奥晶芯平台大鼠全基因组寡聚核苷酸微阵列芯片(27K)，检测大鼠的基因表达谱。其制备及检测在博奥生物有限公司生物检测实验室完成。
2方法
2.1细胞的分组处理
二代培养的RMMVECs，经鉴定后用于本项试验。当RMMVECs长成汇合状态的单层时，进行分组处理。对照组：将完全培养基更换为含2％FBS的维持培养基；试验组：黄芪甲苷、小檗碱溶解于维持培养基中，浓度为10μg/ml。在37℃、5％CO2的条件下，各组RMMVECs继续培养9h。而后将RMMVECs用37℃预热的PBS清洗3遍，每板加入2ml Trizol溶液，静置5min，用移液枪吹打，使RMMVECs充分裂解，转入离心管，于-80℃冰箱保存待用。
2.2芯片杂交实验
在兽医学(中医药)实验室基因芯片室博奥晶芯平台完成杂交试验，每组3个生物学重复。
2.2.1细胞Total RNA的提取
将于-80℃冰箱保存的溶于Trizol液中的细胞样品解冻，12000rpm，4℃离心5min，弃沉淀，将上清转入一新的离心管内。按Trizol：氯仿＝5：1的体积量加入氯仿，剧烈振荡混匀至粉牛奶状，室温静置3min，12000rpm，4℃离心15min，取上清至一新离心管，加入等体积异丙醇，混匀，室温静置5min，12000rpm，4℃离心15min，可见白色RNA沉淀。小心弃去上清，缓慢地沿管壁加入75％乙醇1ml(切勿触及或吹散沉淀)，轻轻颠倒洗涤离心管管壁是沉淀悬浮于乙醇中，7500rpm，4℃离心15min。小心弃去上清，再加入75％乙醇1ml，重复上步。而后小心吸去所有上清，待残余乙醇挥发尽后加入50μl DEPC水溶解RNA沉淀，-20℃冷冻保存。取1μl用核酸蛋白测定仪检测质量，记录结果。
2.2.2细胞总RNA得质量鉴定
抽提的RMMVECs总RNA采用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳法进行质量检测。冷冻前从提取物中取0.3μg总RNA，加入1/5体积的5×加样缓冲液，调整体积到7μl左右，为消除RNA的二级结构将混合物65℃加热5min，冰上骤冷。上样前加入1.0μl溴化乙锭(EtBr，浓度1.0mg/ml)至RNA样品中，而不加EtBr至胶中，以降低电泳后的背景。甲醛变性琼脂糖凝胶(1.2％)先在1×甲醛变性琼脂糖凝胶电泳缓冲液中预电泳15min后，加入RNA样品，在5-10V/cm的电压下电泳30min，紫外灯下拍照记录。
2.2.3总RNA纯化、定量
取总RNA10μg补水至100μL；
配液：300μL RA1:300μL无水乙醇为1:1，混匀；
将以上两种液体混匀，加入纯化柱中；
10000rpm，离心30秒，弃液；
加入600μL RA3，10000rpm，离心30秒，弃液；
加入350μL RA3，10000rpm，离心30秒，弃液；
10000rmp，空甩1.5min；
将管换成1.5mL PE管，加入40μL DEPC水，10000rpm，离心1min，收集液体。
定量：取1μl用核酸蛋白测定仪检测质量，记录结果。
2.2.4反转录合成First-strand cDNA
(1)取总RNA500ng，调整体积到4μL；
(2)加入基因表达谱外参1μl(试验组加A，对照组加B)；
(3)配制反转录Master Mix(下表所示为单个反应体系用量，轻轻混匀，短暂离心置于冰上。取5μL Master Mix分别转移至含有总RNA样品的0.2mL离心管中。反转录Master Mix：
组分名称 体积
First Strand Bμffer Mix 4μL
First Strand Enzyme Mix 1μL
(4)轻轻混匀溶液，瞬时离心后42℃反应2小时。将PCR仪的热盖温度也设置成42℃，避免溶液蒸到管壁上。反应完后冰浴5分钟。立即进行后续步骤。
2.2.5合成Second-strand cDNA
(1)配制Second-strand Master Mix(下表所示为单反应体系用量)，轻轻混匀，短暂离心后冰浴。于4.1.2.5反应完毕的每个样品管中加入20μLSecond Strand Master Mix。Second Strand Master Mix：
组分名称 体积
Nμclease-free Water 13μL
Second-strand Bμffer Mix 5μL
Second-strand Enzyme Mix 2μL
(2)轻轻混匀，16℃反应1小时，65℃ 10min；
(3)反应结束后将反应物置于冰上继续合成反应，或者迅速冻存于-20℃。
2.2.6体外转录合成cRNA
1、cRNA合成
(1)配制体外转录Master Mix(下表所示为单个反应体系用量)，轻轻混匀，短暂离心，往上一反应中准备好的每个样品管中加入30μL MasterMix；体外转录Master Mix：
组分名称 体积
Nμclease-free Water 4μL
T7 Bμffer Mix 20μL
T7 Enzyme Mix 6L
(2)轻柔混匀，40℃反应16.5小时；
(3)反应完成后，准备纯化cRNA。
2、cRNA纯化、定量
(1)取总RNA 10μg补水至100μL；
(2)配液：300μL RA1:300μL无水乙醇为1:1，混匀；
(3)将以上两种液体混匀，加入纯化柱中；
(4)10000rpm，离心30秒，弃液；
(5)加入600μL RA3，10000rpm，离心30秒，弃液；
(6)加入350μL RA3，10000rpm，离心30秒，弃液；
(7)10000rmp,空甩1.5min；
(8)将管换成1.5mL PE管，加入40μL DEPC水，10000rpm，离心1min，收集液体。
(9)定量：取1μl用核酸蛋白测定仪检测质量，记录结果。
2.2.7cRNA反转录
1、cRNA反转录
(1)取cRNA纯化产物5μg，调整体积到7.5μl，加入到0.2ml无核酸酶离心管中。加入4μl Random Primer，混匀，65℃反应5分钟，冰浴5分钟；
(2)配制反转录Master Mix(下表所示为单个反应体系用量)，轻轻混匀，短暂离心。往4.1.2.7中反应完的每个样品管中加入8.5μl Master Mix；cRNA反转录Master Mix：
组分名称 体积
4×CbcScriptⅡ Bμffer 5μL
0.1M DTT 2μL
CbcScriptⅡ 1.5μL
(3)轻轻混匀，25℃反应10分钟，37℃反应1.5小时；
(4)反应结束后加入Terminate Solμtion 5μl，混匀；
(5)65℃反应10分钟，室温5分钟；
(6)加入Neμtralize Solμtion 1μl，混匀，准备纯化。
2、纯化、定量反转录产物
使用Extract II(MN公司，Cat.No.740609.250)试剂盒。
(1)26μL补水至50μL，震荡，转拍，加2倍体积NT(100μL)，将以上150μL转移至纯化柱中，10000rpm，离心30秒，弃液；
(2)加入NT3，600μL，10000rpm，离心30秒，弃液；
(3)空甩1-2min，换成1.5mL PE管；
(4)加65℃的1/2NE 30μL(1/2NE为NE15μL,DEPC水15μL)，静置1min，10000rpm，离心1min，收集液体；
(5)定量：取1μl用核酸蛋白测定仪检测质量，记录结果。
2.2.8荧光标记
1、标记反应
(1)将纯化后反转录得到的cDNA真空浓缩到14μL(60℃，5min)，加入4μL Random Primer，混匀。95℃反应3分钟，冰浴5分钟；
(2)反应结束后向对照组中加入1μL Cy5，试验组加入1μL Cy3。
(3)配制Mix(下表所示为单个反应体系用量)，向上述混合也中加入6.2μL Mix，混匀，瞬离，37℃反应1.5小时，70℃反应5分钟，冰浴5分钟，准备纯化。
注：Cy5-dCTP(Cy3-dCTP)使用GE Healthcare公司产品(Cat.No.PA55021/PA53021)。
Mix：
组分名称 体积
5×Klenow Bμffer 5μL
Klenow Fragment 1.2μL
2、纯化、定量标记产物
(1)26μL补水至50μL，震荡，转拍，加2倍体积NT(100μL)，将以上150μL转移至纯化柱中，10000rpm，离心30秒，弃液；
(2)加入NT3，600μL，10000rpm，离心30秒，弃液；
(3)空甩1-2min，换成1.5mL PE管；
(4)加65℃的1/2NE 30μL(1/2NE为NE15μL,DEPC水15μL)，静置1min，10000rpm，离心1min，收集液体；
(5)定量：取1μl用核酸蛋白测定仪检测质量，记录结果。
3、荧光物质掺入量
取1μl用核酸蛋白测定仪检测掺入量，记录结果。
2.2.9杂交前准备
1、芯片的准备
芯片预处理：扫片，洗片。
(1)水合：已选定的芯片于65℃水浴锅上离水面10cm左右，蒸10-15秒；晾干10-15秒，再蒸10-15秒。
(2)紫外交联：设置250。
(3)第一遍洗：0.5％SDS，微波炉加热至42-45℃，摇床10min，洗去cy3。
(4)第二遍洗：纯水42℃，漂洗去SDS，转入下一个洗片槽。
(5)第三遍洗：纯水42℃，摇床1-2min，将SDS洗去，甩干。
2、样品的准备
(1)将cy3/cy5分别浓缩至19.2μL左右。在cy3(cy5)中加杂交液41.6μL，再将cy5(cy3)吸至cy3(cy5)中，混匀，震荡，瞬离。
杂交液配制：
组分 体积μL
甲酰胺 20
20*SSC 12
10*SDS 1.6
50*Dehart 8μL
(2)95℃，3min。期间剪1*4cm滤纸，放入芯片盒中，加100-180μL蒸馏水。准备洗液1:600mL，洗液2:1L。
(3)取出PCR管，骤冷，放入架子上，准备上样。
(4)用吸耳球吹吹芯片，加样时靠左点成1.5cm左右的直线(标签在右边)，然后用枪头辅助将盖玻片盖上。
(5)用枪头调整一下盖玻片的整齐程度，放入芯片盒，放入杂交仪，配平，放一水瓶保湿。
设置：42℃，23小时，6转(RPM)，开始(Hyb杂交)
(6)杂交设成23小时，过夜即可。
3、杂交结束准备读片
(1)杂交后洗片，配制洗液1，洗液2
洗液1：400mL 20*SSC加水至4升+80mL10％SDS(2*SSC，0.2％SDS)
洗液2：40mL 20*SSC加水至4升(0.2*SSC)
使用体系7洗机器。
将吸液管插入洗液瓶，设置洗液，同前，选定加热，甩干。
洗液1：2次，42℃，120秒，洗液力度5；
洗液2：同上。
(2)扫描仪预热10min
选择小块区域：power-80，PMT-800，先扫红通道，再扫绿通道。保证饱和点(白点数)小于千分之5。
(3)扫描完成后，保存，命名：cy3－....、cy5－....日期参数。存成TIF和jpg格式各存。
2.3数据分析
用LμxScan3.0软件将扫描图像转化为信号值。根据探针信号值的P值确定基因表达(P值＜0.05)、临界表达(0.05＜P值＜0.065)和不表达(P值＞0.065)。分别对6张芯片的信号值做归一化处理后，将6组分别与空白组比较，判别某一基因是否发生表达变化：当信号比值≥2时，视为基因表达上调；当信号比值≤0.5时，视为基因表达下调；当比值介于两者之间时，视为基因未发生有生物学意义的表达变化。最后用和Microsoft Excel、SμM和Clμster等软件对各组数据进行统计和聚类分析。
3结果与分析
3.1总RNA质量检测
12组总RNA的OD(260/280)值浓度见表1。12组细胞的总RNA甲醛变性电泳图如图2所示。图中清晰可见28S、18S rRNA条带，且28S比18S rRNA条带亮度大于1：1。
表1 总RNA提取结果
样品名 浓度μg/μl 260/280 样品名 浓度 260/280
MAC1 0.7235 1.98 MAT1 0.5904 1.96
MAC2 0.8391 2.03 MAT2 0.7857 1.99
MAC3 0.6896 1.99 MAT3 0.6613 1.96
MBC1 0.5656 1.94 MBT1 0.6439 1.99
MBC2 0.5482 1.98 MBT2 0.7959 2.04
MBC3 0.6553 2.03 MBT3 0.5970 2.01
注：MAC1、MAC2、MAC3、MBC1、MBC2、MBC3-对照组；MAT1、MAT2、MAT3-Ast测试组；MBT1、MBT2、MBT3-Ber测试组
3.2差异表达基因
RMMEVCs的Ast处理组与对照组相比，差异表达基因共2231个，上调2166个，下调65个；生物学意义明显的差异基因详细信息见表5-3所示。Pathway结果显示，差异表达的基因共参与169个信号通路，包括钙信号通路、精氨酸和脯氨酸代谢通路、Jak-STAT(蛋白酪氨酸激酶-信号传导蛋白和转录激活物)信号通路、MAPK信号通路、p53信号通路、白细胞经内皮迁移信号通路等。差异表达的基因功能如下：细胞生长和维持、MAPK活力调节、转录调节、信号转导、新陈代谢、细胞周期等。表明Ast具有调节血管容量，调节细胞生长，维持细胞正常生理功能，调节新陈代谢等作用。
RMMEVCs的Ber处理组与对照组相比，差异表达基因共576，上调513个，下调63个。生物学意义明显的差异基因详细信息见表5-4所示。Pathway结果显示，差异表达的基因共参与98个信号通路，与Ast相一致的是，参与的信号通路同样包括钙、精氨酸和脯氨酸代谢、Jak-STAT(蛋白酪氨酸激酶-信号传导蛋白和转录激活物)、MAPK、p53、白细胞经内皮迁移等。差异表达的基因功能也包括转录调节、细胞生长和维持、新陈代谢等。此外，表达发生变化的基因还包括与心肌细胞钙离子调节、外界刺激应答等功能相关的基因，如Adcy8、Phox2b等。表明Ber同样具有调节血管容量，调节细胞生长，维持细胞正常生理功能，调节新陈代谢的作用。
Ast和Ber组分别对比空白组后共有47个共同变化差异基因，参与22个信号通路，包括肌动蛋白细胞骨架调节、钙信号通路、Notch蛋白介导的信号通路、紧密连接、粘着连接等信号通路，涉及细胞生长和维持、内皮细胞分化、血管容量调节、NO合酶生物合成的调节、DNA复制、蛋白质、糖代谢以及缺氧应答等功能。
芯片实验过程中12组相关纯化后RNA浓度、cRNA浓度、cDNA浓度、荧光物质掺入量见表2。
表2 芯片实验过程中相关结果
样品名 纯化后RNA 纯化后cRNA cDNA 荧光掺入量 样品名 纯化后RNA 纯化后cRNA cDNA 荧光掺入量
MAC1 230.8 0.9369 295.6 3.8 MAT1 189.3 0.6674 183.4 3.1
MAC2 154.2 0.9732 247.8 3.4 MAT2 178.4 0.4756 100.6 4.7
MAC3 143.6 0.8654 209.8 2.8 MAT3 146.8 0.3272 130.2 4.1
MBC1 187.6 0.3546 118.5 3.1 MBT1 189.4 0.4721 166.3 5.1
MBC2 125.5 0.3172 127.9 4.5 MBT2 220.3 0.6932 159.4 2.8
MBC3 123.7 0.2947 179.8 3.8 MBT3 135.3 0.5453 171.3 2.6
注：(RNA和cDNA浓度：ng/μl；cRNA浓度：μg/μl；荧光掺入量：pmol/μl)
各细胞Ast组和Ber组比空白组差异表达基因的散点图分别如图3、图4所示。其中x和y坐标分别代表两组基因的荧光信号强度，斜线上方为表达上调的基因，斜线下方为表达下调的基因。基因聚类图如图5、图6所示，灰色(或浅黑色)表示上调基因，更浅一些的灰色表示下调基因，黑色表示没有发生显著变化的基因。
本实验结果显示Ast处理组细胞发生差异表达的基因共2231个，其中上调2166个，下调65个，参与169个信号通路，包括MAPK信号通路、钙信号通路、PPAR信号通路、细胞粘附分子信号通路、Jak-STAT信号通路、精氨酸和脯氨酸代谢信号通路等，差异表达的基因大多与蛋白质、糖代谢、转录调节、细胞生长和维持、细胞增殖的调节、细胞凋亡、内皮细胞分化以及调节生长因子活力等功能相关。说明Ast能够促进MVECs的生长和维持，促进MVECs代谢，维持MVECs正常结构和生理功能。各基因功能及相关信息详见表5-3。
Ber处理组细胞发生差异表达的基因共576个，其中上调513个，下调63个，参与98个信号通路，包括MAPK信号通路、钙信号通路、细胞粘附分子信号通路、精氨酸和脯氨酸代谢信号通路、Jak-STAT信号通路等，差异表达的基因大多与蛋白质、糖代谢、转录调节、DNA复制、细胞生长和维持、细胞发育等相关。说明Ber同样能够促进MVECs的生长和维持，促进MVECs代谢，维持MVECs正常结构和生理功能。各基因功能及相关信息详见表5-4。
另外，pathway分析结果表明，大多数通路上有功能相近，差异表达却相反的成对基因，说明Ast和Ber能够双向调节MVEC相关细胞因子的表达，这也与实验室前期对穿黄连内酯的研究结果相一致。
Ast和Ber组共同发生差异性表达的基因共47个，参与22个信号通路，包括肌动蛋白细胞骨架调节、钙信号通路、Notch蛋白介导的信号通路、紧密连接、粘着连接等信号通路。推测Ast和Ber可能是通过调节某些信号通路从而调节MVEC相关细胞因子的表达，细胞因子又反过来作用于MVEC，维持MVEC的结构与功能稳定，达到治疗疾病的目的。另外，差异表达的基因Jag1与内皮细胞分化、生长因子活力有关；Edn1与血管容量调节、血压调节、葡萄糖运输、cAMP生物合成等功能有关；μnc13c、Myh9、Fyn参与细胞传达；Tmprss8、Phkg2、Mipep参与蛋白质代谢；RGD1305664、Rasl11b参与细胞生长和维持。此外，还包括与转录调节、离子平衡、离子运输、DNA复制和修复、糖代谢、蛋白水解等功能有关的基因，如Chst7参与糖代谢；RGD1561694参与DNA复制与修复；Prox1参与转录调节；Bace2参与蛋白水解。
综上所述，这些共同发生差异表达的基因均能促进MVECs的生长、代谢，维持MVECs的自身活力、正常结构，保证MVECs正常的生理功能，可以推测提高微血管舒缩活动振幅的中药有效成分治疗疾病可能是通过调节MVECs相关细胞因子的表达，细胞因子作用于MVECs，维持MVECs正常的结构和生理功能，使微血管分泌的局部激素和细胞因子处于平衡位点，阻断了致病因子对MVECs的伤害，进而发挥微血管内皮细胞的功能，调节细胞微环境，达到治疗疾病的目的。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.利用基因芯片检测小檗碱诱导RMMVECs基因表达谱的方法，其特征在于：包括以下步骤： 
(1)制备并纯化大鼠心肌膜微血管内皮细胞RMMVECs； 
(2)培养二代RMMVECs，将小檗碱溶解于维持培养基中，浓度为10μg/ml，在37℃、5％CO2的条件下，将RMMVECs继续培养9h； 
(3)将RMMVECs充分裂解，提取总RNA； 
(4)纯化、定量总RNA； 
(5)反转录合成First-strand cDNA； 
(6)合成Second-strand cDNA； 
(7)体外转录合成cRNA； 
(8)cRNA反转录； 
(9)荧光标记后进行基因芯片杂交，最后进行数据分析。 
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中采用差速贴壁法对所制备的RMMVECs进行纯化。 
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中充分裂解的方法为：将RMMVECs用37℃预热的PBS清洗3遍，加入2ml Trizol溶液，静置5min，用移液枪吹打，使RMMVECs充分裂解，转入离心管，于-80℃冰箱保存待用； 
提取总RNA的方法为：将于-80℃冰箱保存的溶于Trizol液中的细胞样品解冻，12000rpm，4℃离心5min，弃沉淀，将上清转入一新的离心管内；按Trizol：氯仿为5：1的体积量加入氯仿，剧烈振荡混匀至粉牛奶状，室温静置3min，12000rpm，4℃离心15min，取上清至一新离心管，加入等体积异丙醇，混匀，室温静置5min，12000rpm，4℃离心15min，可见白色RNA沉淀；弃去上清，缓慢地沿管壁加入75％乙醇1ml，使沉淀悬浮于乙醇中，7500rpm，4℃离心15min；弃去上清，再加入75％乙醇1ml，重复上步；而后吸去所有上清，待残余乙醇挥发尽后加入50μl DEPC水溶解RNA 沉淀，-20℃冷冻保存。 
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(5)中反转录合成First-strand cDNA的方法步骤为： 
A.取总RNA500ng，调整体积到4μL； 
B.加入基因表达谱外参1μl； 
C.配制反转录Master Mix，其中First Strand Bμffer Mix4μL，First Strand Enzyme Mix 1μL，轻轻混匀，短暂离心置于冰上；取配好的5μL Master Mix分别转移至含有总RNA样品的0.2mL离心管中； 
D.轻轻混匀溶液，瞬时离心后42℃反应2小时；将PCR仪的热盖温度也设置成42℃，避免溶液蒸到管壁上；反应完后冰浴5分钟。 
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(6)中合成Second-strand cDNA的方法步骤为： 
A.配制Second-strand Master Mix，其中Nμclease-free Water 13μL，Second-strand Bμffer Mix 5μL，Second-strand Enzyme Mix 2μL，轻轻混匀，短暂离心后冰浴；取上步反应完毕的样品管中加入配好的20μL Second Strand Master Mix； 
B.轻轻混匀，16℃反应1小时，65℃ 10min； 
C.反应结束后将反应物置于冰上继续合成反应，或者迅速冻存于-20℃。 
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(7)中体外转录合成cRNA的方法步骤为： 
A.cRNA合成：配制体外转录Master Mix，其中Nμclease-free Water4μL，T7 Bμffer Mix 20μL，T7 Enzyme Mix 6L，轻轻混匀，短暂离心，往上一反应中准备好的样品管中加入30μL Master Mix； 
B.轻柔混匀，40℃反应16.5小时； 
C.反应完成后，准备纯化cRNA； 
D.纯化、定量cRNA。 
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(8)中cRNA 反转录的方法步骤为： 
A.取cRNA纯化产物5μg，调整体积到7.5μl，加入到0.2ml无核酸酶离心管中，加入4μl随机引物，混匀，65℃反应5分钟，冰浴5分钟； 
B.配制反转录Master Mix，其中4×CbcScriptⅡ Bμffer 5μL，0.1M DTT 2μL，CbcScriptⅡ 1.5μL，轻轻混匀，短暂离心；往反应完的样品管中加入8.5μl Master Mix； 
C.轻轻混匀，25℃反应10分钟，37℃反应1.5小时； 
D.反应结束后加入Terminate Solμtion 5μl，混匀； 
A.(5)65℃反应10分钟，室温5分钟； 
E.加入Neμtralize Solμtion 1μl，混匀，准备纯化； 
F.纯化、定量反转录产物。 
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(9)中荧光标记的方法步骤为： 
A.将纯化后反转录得到的cDNA真空浓缩到14μL，60℃，5min，加入4μL随机引物，混匀；95℃反应3分钟，冰浴5分钟； 
B.反应结束后加入1μL Cy3； 
C.配制Mix，其中5×Klenow Bμffer 5μL，Klenow Fragment 1.2μL，向上述混合液中加入6.2μL Mix，混匀，瞬离，37℃反应1.5小时，70℃反应5分钟，冰浴5分钟，准备纯化； 
D.纯化、定量标记产物。 
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(9)中基因芯片杂交的方法步骤为： 
A.芯片的准备： 
a.水合：已选定的芯片于65℃水浴锅上离水面10cm左右，蒸10-15秒；晾干10-15秒，再蒸10-15秒； 
b.紫外交联：设置250； 
c.第一遍洗：0.5％SDS，微波炉加热至42-45℃，摇床10min，洗去cy3； 
d.第二遍洗：纯水42℃，漂洗去SDS，转入下一个洗片槽； 
e.第三遍洗：纯水42℃，摇床1-2min，将SDS洗去，甩干； 
B.样品的准备： 
a.将cy3/cy5分别浓缩至19.2μL左右，在cy3(cy5)中加杂交液41.6μL，再将cy5(cy3)吸至cy3(cy5)中，混匀，震荡，瞬离； 
b.其中杂交液配制：甲酰胺20μL，20*SSC 12μL，10*SDS 1.6μL，50*Dehart 8μL； 
c.95℃，3min，期间剪1×4cm滤纸，放入芯片盒中，加100-180μL蒸馏水，准备洗液1:600mL，洗液2:1L； 
d.取出PCR管，骤冷，放入架子上，准备上样； 
e.用吸耳球吹吹芯片，加样时靠左点成1.5cm左右的直线，然后用枪头辅助将盖玻片盖上； 
f.用枪头调整一下盖玻片的整齐程度，放入芯片盒，放入杂交仪，配平，放一水瓶保湿；设置：42℃，23小时，6转，开始Hyb杂交，杂交23小时； 
C.杂交结束准备读片：杂交后洗片，扫描仪预热10min，选择小块区域：power-80，PMT-800，先扫红通道，再扫绿通道，保证饱和点(白点数)小于千分之5，扫描完成后，保存。 
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(9)中数据分析的方法步骤为：用LμxScan3.0软件将扫描图像转化为信号值；根据探针信号值的P值确定基因表达(P值＜0.05)、临界表达(0.05＜P值＜0.065)和不表达(P值＞0.065)；分别对6张芯片的信号值做归一化处理后，将6组分别与空白组比较，判别某一基因是否发生表达变化：当信号比值≥2时，视为基因表达上调；当信号比值≤0.5时，视为基因表达下调；当比值介于两者之间时，视为基因未发生有生物学意义的表达变化；最后用Microsoft Excel、SμM和Clμster等软件对各组数据进行统计和聚类分析。 
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