WO2016047676A1 - 生体由来細胞を用いたがん細胞の検出方法 - Google Patents

生体由来細胞を用いたがん細胞の検出方法 Download PDF

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fluorescence
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勝也 山田
綾子 佐々木
幸輝 小野
亀代志 刀稱
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国立大学法人弘前大学
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Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting cancer cells using cells derived from living organisms, and particularly to a method for detecting cancer cells using fluorescently labeled L-glucose derivatives.
  • the present invention also relates to a set of glass slides for cell fixation and observation that can be used in the method for detecting cancer cells.
  • cancer affects half of the Japanese.
  • prognosis and QOL are expected to improve if an accurate diagnosis is made at an early stage and treatment is performed without excess or deficiency.
  • a cell cytodiagnosis
  • tissue histological examination
  • a cytologist or pathologist specializes in morphological abnormalities. , Making judgments based on experience and subjectivity.
  • precancerous lesions or borderline lesions called class III by morphology alone, and the judgment is actually divided by the examiner and pathologist, or it is sent to reexamination.
  • the decision is suspended.
  • cytodiagnosis N / C ratio, polarity, cell variants including the state of the nucleus, and structural variants such as cell stacking Test
  • a possible histological examination is performed to help determine the treatment policy.
  • cytodiagnosis is for the purpose of simply examining the presence or absence of cancer by screening, etc., and by collecting body cavity fluid such as ascites and pleural effusion at the time of cancer surgery and diagnostic purposes, whether or not seeding on the peritoneum, pleura, etc. It is also frequently used for the purpose of examining urinary tract tumors, etc., or for the purpose of finding the presence of cancer by examining urine. In some cases, histological examinations cannot be performed, such as when examining ascites or pleural effusion, or examining the presence or absence of renal pelvic cancer. In such cases, it is necessary to determine the treatment policy by cytodiagnosis.
  • cytology is performed by smearing specimens obtained from patients on glass slides, fixing with alcohol, staining and encapsulating, and observing cell morphology using a microscope, except for some advanced organs. ing. While it can be performed quickly and easily, a cytologist who specializes in testing examines the enormous number of cells contained in each glass slide for abnormalities in the morphology and nucleus. The work to go is repeated every day. It can be said that it is a world that requires many years of experience and technology to ensure that cancer cells can be found reliably without missing them.
  • the width of the class III classification varies depending on the experience and subjectivity of the examiner and cytology specialist, and there is a possibility that early treatment cannot be performed and the patient is disadvantaged. However, it must be said that there is a limit in the cell diagnosis based only on the current morphological information.
  • Liquefied cytology has also been devised as a specimen preparation method for improving this. There are reports that it is useful for reducing artifacts in specimen preparation, but that there is no significant difference from conventional methods in distinguishing between good and bad.
  • diagnosis based on such morphological abnormalities is made based on subjectivity by cytologists and cytologists, it cannot be judged only by cells in good or bad boundary states or cell morphology alone. There are cases. Thus, in the diagnosis based on the subjectivity, there are cases where opinions differ from observer to observer, and there is a case where judgment must be suspended. As an example, in a bladder cancer recurrence test, the classification classified as class III is 10% or more, and cannot be overlooked.
  • Specimens that were originally determined to be class III should be either cancer or non-cancer, but “cells that are likely to be cancer” and “cells that are not likely to be cancer” Drawing is difficult. Therefore, in order to reduce class III, an objective scale that can replace the present cytodiagnosis having such a subjective aspect, or a clear index that can be determined regardless of a great deal of experience is required.
  • Immunocytochemical staining may be performed when it is necessary to supplement the determination by general staining such as Papanicolaou staining or Giemsa staining, which is a common method in cancer cell diagnosis.
  • general staining such as Papanicolaou staining or Giemsa staining
  • cytological specimen preparation is a method based solely on the determination of “morphologically detectable abnormalities” of dead cells due to alcohol fixation, and does not necessarily appear as a morphological change. It can be pointed out that there is no way to see the "functional abnormality of cells". Even if it shows a normal cell morphology at first glance, whether it is functionally normal or not cannot be determined by ordinary cytology alone. For example, even if the cells are morphologically indistinguishable from normal cells, the cells are already infected with a virus with a high risk of cancer in the future, or abnormalities have already appeared in cell functions. In some cases, the morphological cell determination technique cannot be distinguished. In such a case, a definitive diagnosis cannot be made until the morphological abnormality is completely clarified, and as a result of repeating the examination, treatment starts later and the patient suffers disadvantages.
  • 2- [N- (7-nitrobenz--) is a novel fluorescent L-glucose derivative that does not exist in nature and does not bind to the glucose transporter GLUT and is labeled with a green fluorescent group NBD.
  • 2-oxa-1,3-diazol-4-yl) amino] -2-deoxy-L-glucose (2-NBDLG) is developed and administered to in vitro cultured cells such as pancreatic cancer cells and tumor-bearing mice Showed that cancer cells were visualized by specific uptake of 2-NBDLG into cancer cells, and that cancer cell masses consisting of cancer cells with various cell states could be imaged (patents) Reference 1).
  • the present inventors also have 2-amino-2-deoxy-L-, which is a fluorescent L-glucose derivative having a red fluorescent group and impermeable to cell membranes, having sulforhodamine 101 bonded to sulfonamide at the 2-position.
  • glucose (2-TRLG) was developed and applied to cultured cells together with 2-NBDLG, cells with damaged cell membranes or cells showing nonspecific uptake into cells due to phagocytosis, etc. It has been shown that by incorporating both 2-NBDLG and 2-TRLG into a cell, it can be distinguished from a cell that takes in only 2-NBDLG (Patent Document 1).
  • An object of the present invention is to provide a new method for detecting cancer cells using biological cells, which can be used in cytodiagnosis.
  • the present invention also provides a live imaging detection method for cancer cells using biological cells, which can be used in combination with existing cancer cell cytodiagnosis methods such as Papanicolaou staining method or Giemsa staining method. Objective.
  • the inventors of the present invention have provided a region on a thin glass or plastic plate that can hold a buffer solution using cells derived from living organisms. Or it became possible to attach and hold
  • a hydrophobic region with a water-repellent substance such as silicone in this buffer solution holding region, the effect of preventing cell drying is greatly enhanced.
  • the present inventors have found that the fluorescence emitted from the fluorescent labeling molecule in the cell can be detected by incorporating the fluorescent labeling molecule into the cell, and the present invention has been completed.
  • the cancer detection method using live imaging is used in combination with an existing cancer cell cytodiagnosis method, for example, Papanicolaou staining method or Giemsa staining method, thereby further detecting a cancer cell double detection method. Completed the invention.
  • a method for detecting cancer cells using living cells the following steps: (A) a step of incubating living cells contained in a sample collected from a human with a fluorescently labeled L-glucose derivative, wherein the fluorescently labeled L-glucose derivative is converted to 7-nitrobenz-2- An L-glucose derivative having an oxa-1,3-diazole group or a derivative thereof in the molecule; (B) stopping the cellular uptake of the L-glucose derivative; (C) depositing the cells on a thin glass or plastic plate, wherein the plate has an area on its surface for holding a buffer to keep the cells alive; And (d) detecting fluorescence emitted from the L-glucose derivative present in the cells while maintaining the cells attached to the plate in a viable state,
  • a detection method comprising: (2) The fluorescently labeled L-glucose derivative comprises an L-glucose derivative having a 7-nitrobenz-2-o
  • the detection method according to (1) above which is a mixture with 2-amino-2-deoxy-L-glucose (2-TRLG) having a sulfonamide bond.
  • (3) The detection method according to (2) further comprising determining the cell membrane damage state of the fluorescence-imaged cell using the fluorescence color tone of the fluorescence-imaged cell as an index in the fluorescence detection in the step (d).
  • An L-glucose derivative having a 7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole group or a derivative thereof as a fluorescent molecular group in the molecule is 2- [N- (7-nitrobenz-2-oxa
  • the step of stopping the incorporation of the fluorescently labeled L-glucose derivative into the cell in the step (b) is performed by treating the cell with a buffer solution containing no fluorescently labeled L-glucose derivative at 0 ° C to 5 ° C.
  • the method according to any one of (1) to (6) above, wherein the attachment of the cells to the plate in the step (c) is performed by centrifugation, and a buffer solution is added to the region immediately after the centrifugation. Detection method.
  • the above (1) to (8) further comprising: sufficiently holding a buffer solution in the region by using a buffer solution holding structure designed to surround the region of the plate.
  • the buffer solution holding structure is a structure made of silicone and having a thickness of 0.5 to 10 mm.
  • (11) The living body-derived cell according to any one of (1) to (10), wherein the cell is derived from a suspended cell fluid of a patient, a cell derived from a scraped exfoliated cell, or a cell derived from a fine needle aspirate.
  • the living body-derived cell is a cell derived from a floating cell fluid selected from a patient's sputum, urine, ascites, pleural effusion, pericardial fluid, cerebrospinal fluid, bile, pancreatic juice, joint fluid or blood (11) ) Detection method. (13) The detection method according to (12), wherein the living body-derived cell is a cell derived from ascites of an ovarian cancer patient or endometrial cancer patient.
  • Cancer comprising detection of cancer cells using a fluorescently labeled L-glucose derivative and detection of cancer cells based on Papanicolaou staining, Giemsa staining, PAS staining, Grocot staining, or immunocytochemical staining
  • a method for double detection of cells After performing the detection method according to any one of (1) to (13) above, using a glass or plastic plate with cells attached thereto, Papanicolaou staining, Giemsa staining, PAS staining, Grocot staining, or Perform immunocytochemical staining, then Comparing cancer cells detected on the basis of fluorescence with cancer cells detected on the basis of Papanicolaou stain, Giemsa stain, PAS stain, Grocot stain, or immunocytochemical stain,
  • a detection method comprising: (15) The detection method according to (14), wherein the plate has markings for indicating cell position information on a surface opposite to a surface to which cells are attached. (16) The method (14) or (15), where
  • a live imaging method by fluorescence of living body-derived cells which comprises the following steps: (A) Incubating live cells contained in a sample collected from a human with a fluorescently labeled compound; (B) a step of stopping the uptake of the fluorescently labeled compound into cells, (C) depositing the cells on a thin glass or plastic plate, where the plate has an area on its surface for holding a buffer to keep the cells alive; And (D) detecting fluorescence emitted from the fluorescently labeled compound present in the cells while maintaining the cells attached to the plate in a viable state,
  • a live cell imaging method comprising: (18) The step of stopping the incorporation of the fluorescently labeled compound into the cell in the step (B) is performed by treating the cell with a buffer solution containing no fluorescently labeled compound at 0 ° C.
  • the live cell imaging method according to 1. (19) The live cell imaging method according to (17) or (18), which comprises performing attachment of the cells in the step (C) to the plate by centrifugation, and adding a buffer to the region immediately after centrifugation. (20) The live cell imaging method according to any one of (17) to (19), wherein the plate has a thickness of 0.3 mm or less. (21) The above (17) to (20), further comprising: sufficiently holding the buffer solution in the region using a buffer solution holding structure designed to surround the region of the plate.
  • the buffer solution holding structure is a plate-shaped or ring-shaped structure having an opening corresponding to the region, and holds the buffer solution. Thick enough to do.
  • a glass or plastic plate for observing living cells using a laser confocal microscope for fixing the cells in a living state, and a buffer for maintaining the cells in a living state on the surface thereof A cell observation glass or plastic plate having a region for holding a liquid and having a thickness of 0.3 mm or less.
  • a buffer solution holding structure that is designed to surround the region of the plate according to (25) or (26), and to sufficiently hold the buffer solution in the region.
  • a buffer solution holding structure having a thickness of 0.5 to 10 mm made of silicone and having a plate shape or ring shape having an opening corresponding to the region.
  • a method for double detection of cancer cells using a sample collected from a human comprising fluorescence imaging using living cells contained in a sample including the following steps: Incubating the cells with a fluorescently labeled L-glucose derivative to detect the fluorescently labeled L-glucose derivative incorporated into the cells, wherein the L-glucose derivative is converted into 7-nitrobenz-2 as a fluorescent molecular group.
  • An L-glucose derivative having an oxa-1,3-diazole group or a derivative thereof in the molecule Detecting fluorescence emitted by the L-glucose derivative present in the cells with the cells attached on a thin glass or plastic plate, wherein the plate is capable of surviving the cells on its surface.
  • a method for detecting cancer cells comprising: And (b) a cancer detection method comprising a staining method using cells fixed with a fixative such as alcohol or formalin comprising the following steps, The plate is immersed in a fixative such as ethanol or formalin to fix the cells, and then stained by any one staining method selected from the group consisting of Papanicolaou staining, Giemsa staining, PAS staining, Grocot staining, and immunocytochemical staining. How to detect cancer cells, Detection method for cancer cells containing.
  • the cancer detection method a comprising the fluorescence imaging includes the following steps: (A-1) a step of incubating living cells contained in a sample collected from a human in a buffer containing the fluorescently labeled L-glucose derivative so as to incorporate the L-glucose derivative; (A-2) replacing the buffer solution with a buffer solution not containing the fluorescently labeled L-glucose derivative to stop the uptake of the L-glucose derivative; (A-3) The cells are fixed by attaching them to a cell attachment region on a thin glass or plastic plate, and then holding a buffer that is configured to include and surround the cell attachment region and provided on the plate A step of putting a buffer solution in the buffer solution holding region to maintain the cells in a viable state, wherein the buffer solution holding region is designed to surround the plate surface on which the cells are fixed and the buffer solution holding region.
  • the cancer detection method a comprising the fluorescence imaging includes the following steps: (A-1) a process of attaching and fixing living cells contained in a sample collected from a human to a cell attachment region on a thin glass or plastic plate; (A-2) placing the buffer solution in a buffer solution holding region for holding the buffer solution, which is configured to include and surround the cell attachment region and is provided on the plate, to maintain the cells in a viable state;
  • the buffer solution holding region is composed of a plate surface on which cells are fixed and a buffer solution holding structure designed to surround the buffer solution holding region.
  • the fluorescently labeled L-glucose derivative is 2- [N- (7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl) amino] -2-deoxy-L-glucose (2- NBDLG) and 2-amino-2-deoxy-L-glucose (2-TRLG) obtained by sulfonamide-bonding sulforhod
  • the method further includes determining the damage state of the cell membrane using the fluorescence color tone of the fluorescence-imaged cell as an index.
  • the detection method of description [6] The detection method according to any one of [1] to [5] above, wherein the method (b) is Papanicolaou staining. [7] The detection method according to any one of [1] to [6], wherein the plate has a thickness of 0.3 mm or less. [8]
  • the buffer solution holding structure is a plate-shaped or ring-shaped structure having an opening corresponding to the buffer solution holding region, and has a sufficient thickness to hold the buffer solution. The detection method according to any one of [2] to [7] above.
  • the buffer solution holding structure is a structure made of silicone and having a thickness of 0.5 to 10 mm.
  • the sample collected from the human is a cell derived from a patient's suspension cell fluid, a cell derived from a scraped exfoliated cell, or a cell derived from a fine needle aspirate.
  • the cells are cells derived from a patient's sputum, urine, ascites, pleural effusion, pericardial effusion, cerebrospinal fluid, bile, pancreatic juice, joint fluid or blood. The detection method described.
  • a cell observation glass or plastic plate structure comprising a cell observation glass or plastic plate and a buffer solution holding structure for holding a buffer solution for observing living cells using a laser confocal microscope Because A glass or plastic plate for fixing cells in a viable state, wherein the plate has a buffer holding area for holding a buffer on the surface for holding the cells in a viable state, and has a thickness.
  • a buffer solution holding structure for holding a buffer solution in the buffer solution holding region wherein the buffer solution holding structure is made of a plate-shaped or ring-shaped silicone designed to surround the buffer solution holding region
  • a buffer solution holding structure having a thickness of 0.5 to 10 mm A cell observation glass or plastic plate structure comprising
  • the detection method of the cancer cell using a new biological origin cell is provided, the detection method of the cancer using the live imaging by a fluorescent label molecule, and the cytodiagnosis of the existing cancer cell Methods, for example, double detection methods for cancer in combination with Papanicolaou staining or Giemsa staining are provided.
  • FIG. 1A shows a glass plate used for live cell imaging on an inverted microscope while floating cells are attached to the glass surface by centrifugation, and a silicone mask (buffer solution holding structure) having an opening on the glass plate. An example in which the body) is closely attached is shown.
  • a cell position identification print is applied to facilitate identification of the cell position.
  • a notch is provided in the upper left part of the glass plate for easy understanding of the orientation of the glass plate.
  • KRB solution Krebs-Ringer solution
  • a buffer solution Krebs-Ringer solution, hereinafter abbreviated as KRB solution
  • KRB solution a buffer solution
  • the mask is made of silicone, and can be easily adhered and removed without generating bubbles on the glass plate.
  • the opening of the silicone mask is larger than the square water-repellent region drawn with a pen pen, and about 1 mL of KRB solution is dropped into this opening for microscopic observation.
  • FIG. 1B is an enlarged view of a printed portion (marking) used for cell position identification applied to the back surface of the glass plate.
  • the size of the characters is 0.5 mm square, and it is shown that the characters are printed on the back surface of the glass plate at a vertical and horizontal pitch of 2 mm.
  • the background texture is a pattern of paper laid under the glass plate for the purpose of making the contrast clear and easy to see.
  • FIG. 1C is a detailed view of the glass plate shape described above.
  • FIG. 1D is a detailed view of a silicone mask shape as the buffer solution holding structure.
  • FIG. 2A is a bright-field image (objective lens magnification is 100 times) observed with a microscope in a state where ascites cells obtained at the time of surgery of an ovarian cancer (serous adenocarcinoma) patient are utilized.
  • FIG. 2B is a fluorescence microscope image in the green wavelength region after application of a KRB solution containing 100 ⁇ M 2-NBDLG and 20 ⁇ M 2-TRLG.
  • FIG. 2C is a fluorescent microscope image similar to B described above, but in the red wavelength region.
  • FIG. 2D is an overwritten image of a bright field image and a fluorescence image.
  • FIG. 2A is a bright-field image (objective lens magnification is 100 times) observed with a microscope in a state where ascites cells obtained at the time of surgery of an ovarian cancer (serous adenocarcinoma) patient are utilized.
  • FIG. 2B is a fluorescence microscope image in the green wavelength region after application of a KRB
  • FIG. 3 is a live cell imaging result of ascites cells obtained at the time of surgery for a patient with endometrial cancer (endometrioid adenocarcinoma).
  • FIG. 3A is a bright-field image (objective lens magnification is 40 times) of two living cell masses suspected to be cancer cells by morphological observation.
  • FIG. 3B is a fluorescence microscope image in the green wavelength region after application of a KRB solution containing 100 ⁇ M 2-NBDLG and 20 ⁇ M 2-TRLG.
  • FIG. 3C is a fluorescence microscope image similar to B described above, but in the red wavelength region.
  • FIG. 3D is a bright-field enlarged image of the cell cluster (Cluster1) on the right side of the screen in C (the magnification of the objective lens is 100 times).
  • FIG. 4 shows the results of matching the results of live cell imaging of ascites cells obtained during surgery of endometrial cancer (endometrioid adenocarcinoma) patients with the subsequent Papanicolaou staining results.
  • FIG. 4A is an enlarged fluorescence microscope image of the cell cluster (Cluster 1) on the right side of the screen in FIG. 3B in the green wavelength region.
  • FIG. 4B is an enlarged fluorescence microscope image in the red wavelength region of the cell cluster (Cluster 1) on the right side of the screen in FIG. 3C.
  • FIG. 4C is an overwritten image of a bright field image and a fluorescence image of the cell cluster (Cluster 1) of FIGS. 3D, 4A, and 4B.
  • FIG. 4D is a bright-field image after Papanicolaou staining of the cell cluster (Cluster 1) shown in FIGS. 3D, 4A, and 4B, ie, 2-NBDLG positive and 2-TRLG negative cell cluster.
  • FIG. 5 shows the results of matching the results of live cell imaging of ascites cells obtained during surgery of other endometrial cancer (endometrioid adenocarcinoma) patients with the subsequent Papanicolaou staining results.
  • FIG. 1 shows the results of matching the results of live cell imaging of ascites cells obtained during surgery of other endometrial cancer (endometrioid adenocarcinoma) patients with the subsequent Papanicolaou staining results.
  • FIG. 5A is a fluorescence microscope image (magnification of objective lens is 40 times) in a green wavelength region after application of a KRB solution containing 100 ⁇ M 2-NBDLG and 20 ⁇ M 2-TRLG.
  • FIG. 5B is a fluorescence microscope image similar to A described above, but in the red wavelength region.
  • FIG. 5C is an image in which the fluorescent images of A and B are superimposed on the bright field image.
  • FIG. 5D shows the results of Papanicolaou staining performed after fluorescent staining.
  • FIG. 6 is a full-field live cell imaging result of a cell attachment region of ascites cells obtained at the time of surgery of a patient with ovarian cancer (serous adenocarcinoma).
  • FIG. 6 is a full-field live cell imaging result of a cell attachment region of ascites cells obtained at the time of surgery of a patient with ovarian cancer (serous adenocarcinoma).
  • FIG. 6A shows a fluorescence microscope image in the green wavelength region of the entire cell attachment region before application of the KRB solution containing 100 ⁇ M 2-NBDLG and 20 ⁇ M 2-TRLG (magnification of objective lens is 40 times), fluorescence microscope in the red wavelength region It is an overwritten image of an image and a bright field image.
  • FIG. 6B shows a fluorescence microscope image in the green wavelength region (magnification of the objective lens is 40 times), a fluorescence microscope image in the red wavelength region, and a bright field image after applying the KRB solution containing 100 ⁇ M 2-NBDLG and 20 ⁇ M 2-TRLG. This is an overwritten image.
  • FIG. 6A shows a fluorescence microscope image in the green wavelength region of the entire cell attachment region before application of the KRB solution containing 100 ⁇ M 2-NBDLG and 20 ⁇ M 2-TRLG (magnification of objective lens is 40 times), fluorescence microscope in the red wavelength region It is an overwritten image of an image and a bright field image.
  • FIG. 7 shows the results of live cell imaging of ascites cells obtained at the time of surgery for a patient with ovarian cancer (serous adenocarcinoma).
  • FIG. 7A is a fluorescence microscope image (magnification of objective lens is 40 times) in a green wavelength region before application of a KRB solution containing 100 ⁇ M 2-NBDLG and 20 ⁇ M 2-TRLG
  • FIG. 7C is a bright field image of FIG. 7A. It is an overwritten image.
  • FIG. 7B is a fluorescence microscope image diagram in the green wavelength region after applying the KRB solution containing 100 ⁇ M 2-NBDLG and 20 ⁇ M 2-TRLG
  • FIG. 7D is an overwritten image of FIG.
  • FIG. 7A is a fluorescence microscope image (magnification of objective lens is 40 times) in a green wavelength region before application of a KRB solution containing 100 ⁇ M 2-NBDLG and 20 ⁇ M 2-TRLG
  • FIG. 7C is a bright field image of FIG
  • FIG. 8 shows the results of matching the results of live cell imaging of ascites cells obtained during surgery of ovarian cancer (serous adenocarcinoma) patients with the subsequent Papanicolaou staining results.
  • FIG. 8A is a fluorescence microscope image in the green wavelength region
  • FIG. 8B is a fluorescence microscope image in the red wavelength region.
  • FIG. 8C is an overwritten image of the bright field image shown in FIGS. 8A and 8B.
  • FIG. 8D is a bright-field image after Papanicolaou staining of the cell mass shown in FIGS. 8A and 8B, ie, 2-NBDLG positive and 2-TRLG negative cell mass.
  • FIG. 9 is an enlarged view of the Papanicolaou staining of FIG. 8D.
  • FIG. 10 is a full-field live cell imaging result of the cell adhesion region of the washed ascites cells obtained at the time of surgery for a patient with endometrial cancer (endometrial endometrioid adenocarcinoma).
  • FIG. 10A shows the fluorescence microscope image in the green wavelength region, the fluorescence microscope image in the red wavelength region, and the overlaid image of the bright field image before the KRB solution containing 100 ⁇ M 2-NBDLG and 20 ⁇ M 2-TRLG is applied. It is.
  • FIG. 10A shows the fluorescence microscope image in the green wavelength region, the fluorescence microscope image in the red wavelength region, and the overlaid image of the bright field image before the KRB solution containing 100 ⁇ M 2-NBDLG and 20 ⁇ M 2-TRLG is applied. It is.
  • FIG. 10A shows the fluorescence microscope image in the green wavelength region, the fluorescence microscope image in the red wavelength region, and the overlaid image of the bright field image before the KRB solution
  • FIG. 10B shows a fluorescence microscope image in the green wavelength region (magnification of the objective lens is 40 times), a fluorescence microscope image in the red wavelength region, and a bright field image after applying the KRB solution containing 100 ⁇ M 2-NBDLG and 20 ⁇ M 2-TRLG.
  • FIG. 11 shows live cell imaging results of washed ascites cells obtained during surgery of endometrial cancer (endometrial endometrioid adenocarcinoma) patients.
  • FIG. 11A is a fluorescence microscope image (magnification of objective lens is 40 times) in a green wavelength region before application of a KRB solution containing 100 ⁇ M 2-NBDLG and 20 ⁇ M 2-TRLG.
  • FIG. 11C is a bright-field image of FIG. 10A. It is an overwritten image.
  • FIG. 11B is a fluorescence microscope image diagram in the green wavelength region after applying the KRB solution containing 100 ⁇ M 2-NBDLG and 20 ⁇ M 2-TRLG, and FIG. 11D is an overwritten image of FIG. 10B and the bright-field image.
  • FIG. 12 shows the results of matching the results of live cell imaging of washed ascites cells obtained at the time of surgery for endometrial cancer (endometrial endometrioid adenocarcinoma) patients with the results of subsequent Papanicolaou staining.
  • FIG. 12A is a fluorescence microscope image in the green wavelength region
  • FIG. 12A is a fluorescence microscope image in the green wavelength region
  • FIG. 12B is a fluorescence microscope image in the red wavelength region.
  • FIG. 12C is an overwritten image of FIG. 12A and FIG. 12B and a bright field image.
  • FIG. 12D is a bright-field image after Papanicolaou staining of the cell mass (a, b) shown in FIGS. 12A and 12B, ie, 2-NBDLG negative and 2-TRLG negative cell mass.
  • FIG. 13 is an enlarged view of the Papanicolaou staining of FIG. 12D.
  • FIG. 14 shows a cell observation cover glass. The back of the 7 mm ⁇ 7 mm cell attachment region in the center is printed with cell position identification to facilitate cell position identification. A notch is provided in the upper left part of the glass plate for easy understanding of the orientation of the glass plate.
  • a buffer solution (Krebs-Ringer solution, hereinafter abbreviated as KRB solution) is formed by a square water-repellent region drawn on a glass plate with a commercially available tissue pen on the glass plate so as to surround the cell attachment region. Prevents the outflow of liquid and demonstrates the liquid level retention effect.
  • FIG. 15 shows a silicone mask (buffer solution holding structure) for perfusion.
  • the inner mask in the inner part is provided with an opening according to the cell attachment area, and it is composed of the outer mask in the outer part in close contact with the inner mask. Become.
  • the opening of the outer mask is fish-shaped so that the perfusion of the solution flows smoothly.
  • FIG. 16 shows a perfusion stage (specialized by System Instruments).
  • the slide plates are arranged on the left and right so that the position of the metal tube on the Inlet side and the Outlet side of the KRB solution can be fixed and finely adjusted when the glass plate is installed in the central portion.
  • the perfusion stage is set on the BZ-X700 microscope in a form attached to the microscope culture apparatus (Tokai Hit INUG2-KIW) of FIG.
  • FIG. 17 shows an image in which the culture apparatus for microscope (Tokai Hit INUG2-KIW) is set in the BZ-X700 microscope and the perfusion stage of FIG.
  • the present invention uses living cells to attach and hold cells on a thin glass or plastic plate and provide a buffer solution holding region for holding a buffer solution on the plate.
  • the present invention relates to a method for detecting a cancer cell by incorporating a specific fluorescently labeled molecule into a cell and detecting fluorescence emitted from the fluorescently labeled molecule in the cell while maintaining the cell in a living state.
  • a cancer detection method (step (a)) comprising fluorescence imaging using living cells described below can be mentioned.
  • the above step (a) further includes the following staining method (step (b)) using cells fixed with a fixative such as alcohol or formalin.
  • a fixative such as alcohol or formalin.
  • B) The plate is immersed in an ethanol fixative to fix cells, and then stained by any one staining method selected from the group consisting of Papanicolaou staining, Giemsa staining, PAS staining, Grocot staining, and immunocytochemical staining. To detect cancer cells.
  • the L-glucose derivative having a 7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole group or a derivative thereof as a fluorescent molecular group in the molecule that can be used in the step a is a patent application by the present inventors. It is specifically disclosed in patent applications WO2010 / 016587 and WO2012 / 133688.
  • a particularly preferred L-glucose derivative is 2-NBDLG.
  • the incubation temperature in the step (a) is 22 to 37.5 ° C, preferably 36 to 37.5 ° C, more preferably about 37 ° C.
  • about 37 ° C. means 36.6 ° C. to 37.5 ° C.
  • the incubation time in the step (a) is appropriately selected depending on the state of the cells, the type of fluorescently labeled L-glucose derivative used, or the detection conditions, etc., but is usually within 15 minutes, preferably 3-15 minutes. Preferably it is performed in 3 to 5 minutes.
  • the L-glucose derivative uptake is stopped by selecting a method capable of maintaining the viability of the cell and stopping the active uptake of the L-glucose derivative by the cell, for example, (i) Place the cells in a cold state, (ii) replace the buffer with a buffer that does not contain the L-glucose derivative, and (iii) add an agent that inhibits the uptake of the L-glucose derivative. Examples of (i) include placing the cells in a buffer cooled to 0 ° C.
  • (ii) it is preferable to add a step of washing with a buffer solution that does not contain an L-glucose derivative, and it is also possible to exchange it by perfusing the buffer solution that does not contain L-glucose derivatives. It is.
  • Examples of (iii) include adding a water channel inhibitor that is an inhibitor of 2-NBDLG uptake, such as phloretin, to the cell solution.
  • fluorescence observation is performed in a state where the cells are fixed while being maintained in a viable state.
  • the cells are viable on the surface.
  • a thin glass or plastic plate structure (hereinafter simply referred to as “glass or plastic plate”, “glass plate”, “plastic plate”, or “with a buffer holding region”) for holding a buffer solution for maintenance. It may be referred to as a “plate”).
  • the glass plate that can be used in the present invention is not particularly limited as long as it can detect fluorescence emitted from cells using a laser confocal microscope or the like, and is a known glass plate such as a thin glass plate (for example, a cover glass). ) Can be used so as to be suitable for use in the present invention.
  • the plastic plate that can be used in the present invention is a plastic plate made of a non-fluorescent or low-fluorescent substance in order to detect fluorescence emitted from cells using a laser confocal microscope or the like.
  • a plastic plate made of a non-fluorescent or low-fluorescent substance in order to detect fluorescence emitted from cells using a laser confocal microscope or the like.
  • CrystalCrine Molecular Dimensions
  • Correlative Microscopic Coverlips Electromo Bakelite Co., Ltd.
  • Cell Desk LF etc.
  • the glass or plastic plate that can be used in the present invention needs to be thin in order to detect fluorescence emitted from individual cells using a laser confocal microscope or the like, for example, 0.3 mm or less, preferably 0.
  • a thickness of 0.2 mm or less, particularly preferably 0.12 to 0.20 mm can be mentioned. This is generally the thickness of the glass used as a cover glass placed on the slide glass during cell observation.
  • the thin glass plate used in the method of the present invention may be referred to as a special cover glass for live cell imaging or simply a glass plate. Note that the thickness of the glass or plastic plate may be 1 mm for the purpose of detecting fluorescence emitted from the cells rather than performing fluorescence imaging of cell details (morphology, etc.).
  • An area for holding a buffer for maintaining cells on a glass or plastic plate surface in a viable state (hereinafter sometimes referred to as a “buffer holding area”) can hold a buffer on the plate.
  • This is an area configured not to flow out easily even if the plate is tilted.
  • the shape of such a region is not particularly limited, and examples thereof include a square, a circle, an ellipse, and a fish shape.
  • Such a plate is not limited to this, but is a glass or plastic plate in which a water-repellent region is created or printed on the plate so as to surround the buffer solution holding region, or a liquid so as to surround the buffer solution holding region.
  • a glass or plastic plate in which a structure (preferably a structure made of a water-repellent material such as silicone) for preventing outflow is placed on the plate can be mentioned.
  • the former include, but are not limited to, a glass or plastic plate on which water-repellent ink is printed so as to surround the buffer solution holding region.
  • a structure in the latter may be placed on the glass or plastic plate in advance, or after the cells are attached or fixed to the glass or plastic plate, and further on the glass or plastic plate. And may be integrated.
  • the buffer solution holding region includes and surrounds the cell attachment region for fixing cells, the buffer solution holding region may be approximately the same size as or compared with the cell attachment region. The size may be several times or more. However, in order to maintain cells in a sufficient amount of buffer solution, the buffer solution holding region is preferably 2 times or more, more preferably 5 times or more, more preferably 5 times or more the cell attachment region. Within double.
  • the glass or plastic plate used in the present invention may have markings for indicating cell position information on the surface opposite to the surface to which the cells are attached.
  • the marks, symbols, letters, lines, etc. on the back of the plate have the size, shape, and optical characteristics that do not hinder the visible light and fluorescence observation of the cells, and if possible, easily by aqueous solution, organic solvent, friction, etc. It is desirable that it does not disappear.
  • the ink character pattern is fixed by heat using a technique such as silk screen, small characters can be read, and the strength against water and organic solvents described above is good.
  • a glass plate In the case of a glass plate, it may be realized by marking with a diamond knife, or by processing grooves or depressions on the back surface of the glass plate, or inside the glass plate with an appropriate intensity and pulse laser etc. . This facilitates cell observation and enables cell identification in the double detection method which is one embodiment of the present invention described later.
  • the detection method of the present invention further uses a buffer holding structure (also referred to herein as a “mask”) designed to surround the buffer holding area of the glass or plastic plate to buffer the area.
  • the liquid can be sufficiently retained.
  • a mask a plate-shaped or ring-shaped structure having an opening corresponding to the region can be exemplified, but a plate-shaped structure is preferable.
  • the thickness of the mask is not particularly limited as long as it can meet the above-mentioned purpose, and the material of the mask is not particularly limited as long as it can be easily adhered without causing bubbles on the glass or plastic surface. Desirably non-fluorescent.
  • the thickness of the mask is not limited to this, but can be 0.5 to 10 mm, preferably 1 to 5 mm, more preferably 2 to 5 mm, and still more preferably 2 to 3 mm.
  • a resin such as silicone or a metal coated with a coating for improving adhesion to the plate can be used.
  • a 2 mm-thick silicone resin molded as shown in FIG. 1 or FIG. 14 can be used, and a protrusion that can be held by hand so as to be easily attached and detached may be provided. As shown in FIG. 1 or FIG.
  • the shape of the mask is always the same position if it is designed so that it can be mounted on the glass plate so that the top, bottom, left and right are asymmetric and one end of the mask coincides with the edge of the glass plate. As a result, there is no risk of accidentally covering the cell with a mask.
  • the cell adhesion region and the buffer solution holding region are approximately the same size, and the opening of the mask is also approximately the same size as the cell adhesion region.
  • the buffer solution holding region is larger than the cell attachment region (about 5 times), and the mask opening (outer mask opening) corresponding to the buffer solution holding region is also larger than the cell attachment region. large.
  • the opening of the inner mask is approximately the same size as the cell attachment region.
  • the mask used for perfusion is asymmetrical so that the orientation can be easily understood, and has a size that does not hide the sample name written on the glass plate. In addition, the structure can be easily removed without affecting the cells.
  • This mask has a nested structure, (i) an inner mask having an opening of the same size as the cell attachment region, and (ii) a shape provided with a gap that can be inserted into the inner mask and can be easily removed. It consists of an outer mask with an opening. (I) The opening of the inner mask is configured so as to include and surround the cell attachment region, and is bonded in advance to the glass or plastic plate in combination with the outer mask, and the outflow of cells to other than the cell attachment region during centrifugation Is to prevent.
  • the opening of the outer mask includes a cell attachment region and a water-repellent enclosure and is configured to surround it, but after the cell attachment, the inner mask is removed and a cover glass of a size that does not block the opening is applied.
  • the shape of the mask is such that it does not come into contact with the frosted portion and the date, sample name, etc. are not hidden or can be easily read when producing a permanent specimen using a slide glass. This may be realized by setting the mask size to a slightly small size so as not to cover the sample name description portion as in the example of FIG. 1, but when using the above-described silicone mask, Since it is easy to read the characters under the mask, it is not always necessary to reduce the size.
  • the glass plate on which such a structure is installed This corresponds to a glass plate having a region for holding a buffer for maintaining cells in a viable state on the surface thereof.
  • step a the cells are fixed to a cell adhesion region (for example, a region inside the hydrophobic region in FIG. 1) located at the approximate center of the glass plate.
  • a cell adhesion region for example, a region inside the hydrophobic region in FIG. 1
  • attachment of the cell to the glass plate in the step (a) is not limited to this, it can be performed by centrifugation or the like. Centrifugation conditions can be selected as appropriate. For example, the centrifugation can be performed at room temperature with a centrifugal force with little damage to cells.
  • the method of the present invention can also be used in combination with an automatic cell collection device (such as an auto smear device), whereby cells can be easily collected and attached to a glass plate.
  • the method of the present invention is such that the fluorescently labeled L-glucose derivative has a 7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole group or a derivative thereof as a fluorescent molecular group in the molecule.
  • the method for detecting cancer cells which is a mixture of an L-glucose derivative and 2-amino-2-deoxy-L-glucose (2-TRLG) obtained by sulfonamide-bonding sulforhodamine 101 at the 2-position. Even if the cells damaged in the cell membrane are cancer cells or non-cancer cells (including normal cells), the fluorescence-labeled glucose derivative enters the cells non-specifically. .
  • the detection of the fluorescence in the detection method of the cancer cell of this invention can be performed in accordance with a well-known method.
  • the detection of cells according to the present invention can be measured directly by fluorescence observation, or by converting fluorescence into DAB black or the like by a photoconversion method, and by measuring with an optical microscope or an electron microscope. Quantitative expression and mechanization are possible by setting appropriate reference values as well as qualitatively.
  • the target biological cell is not particularly limited as long as it is a cell derived from a patient suspected of having cancer.
  • Cell-derived cells or puncture-aspirated cell-derived cells can be mentioned, and cells derived from suspension cell fluid are preferable.
  • the floating cell fluid can be obtained from, but not limited to, patient sputum, urine, ascites, pleural effusion, pericardial fluid, cerebrospinal fluid, bile, pancreatic juice, joint fluid or blood.
  • scraped cells examples include, but are not limited to, scraped cells collected by rubbing with a cotton swab or brush from the cervix, uterine body, vaginal wall, vulva or bronchoscope from the surface of the bronchus. it can.
  • Punctured aspiration cells include, but are not limited to, cells that have been aspirated by inserting a needle into a tumor formed in the thyroid gland, mammary gland, salivary gland, liver, subcutaneous, lymph node, and the like.
  • the type of cancer to be targeted in the cancer cell detection method of the present invention is not particularly limited as long as the cells can be collected. For example, women such as ovarian cancer, endometrial cancer, cervical cancer, etc.
  • Cancer gastric cancer, colorectal cancer, biliary tract cancer, pancreatic cancer, esophageal cancer and other digestive system cancer, lung cancer and other respiratory system cancer, thyroid cancer and breast cancer, bladder
  • cerebrospinal fluid such as cancer of the urinary tract such as cancer, renal pelvis cancer, ureteral cancer, prostate cancer, hematopoietic malignancy such as leukemia and malignant lymphoma, malignant tumor infiltrating the central nervous system, etc.
  • Can include cancer.
  • Examples of using ascites-derived floating cells include ascites-derived cells of patients with ovarian cancer, endometrial cancer, stomach cancer, colon cancer, biliary tract cancer, pancreatic cancer, or esophageal cancer. Can do.
  • pleural effusion cells include lung cancer and other respiratory cancers, thyroid cancer, and breast cancer.
  • urine cells include bladder cancer, renal pelvis cancer, and ureter Cancers of the urinary tract such as cancer and prostate cancer can be mentioned.
  • blood cells include hematopoietic malignant tumors such as leukemia and malignant lymphoma.
  • the cells derived from the scraped cells include cervical cancer, endometrial cancer, cancer in the oral cavity and the like.
  • cells derived from puncture aspirate cells include breast and thyroid cancers.
  • the buffer that can be used in the method for detecting cancer cells of the present invention can be used without particular limitation as long as it is a buffer that can appropriately maintain living cells in a living state.
  • a KRB solution for example, a culture solution (for example, Dulbecco's modified Eagle medium supplemented with fetal bovine serum), an organ preservation solution (Savisol, UW preservation solution), and the like can be mentioned.
  • a cell sample collected from a living body is suspended in an appropriate buffer solution such as a Ca, Mg-free Hanks solution, which hardly causes blood clots, and is transferred to a laboratory.
  • an appropriate buffer solution such as a Ca, Mg-free Hanks solution, which hardly causes blood clots, and is transferred to a laboratory.
  • the work cannot be started immediately, it is possible to apply and observe the fluorescently labeled L-glucose derivative the next day after obtaining the cell specimen by storing at room temperature in a cool dark place.
  • the upper part of the pellet commonly called buffy coat
  • a hemolysis operation or a clot removal operation that is usually performed in cytological sample pretreatment can be added.
  • Centrifugation may be performed by a method usually used in an inspection facility, but it is preferable to perform a minimum necessary amount of centrifugation in a short time in order to keep the cells alive. For example, it may be performed once or twice between 650G-1500G and 1min-2min.
  • KRB solution may be added to the pellet to disperse the cells, and the next staining operation may be started immediately, or a large amount of buffer solution may be added and stored for up to 24 hours until the staining operation. In the latter case, the centrifugation operation is performed again before the staining operation.
  • a KRB solution 2-NBDLG and 2-TRLG are dissolved and mixed so as to have a concentration twice the final concentration, warmed at 37 degrees, and prepared (x2fLG solution).
  • an inhibitor for example, although not limited thereto, it is preferable to add a gap junction inhibitor Carbenoxolon for the purpose of excluding 2-NBDLG incorporation through gap junction / hemichannel passage.
  • the KRB solution containing the cells is mixed with the same amount of the fLG solution prepared in advance as described above, so that the cells are brought into contact with fLG for a certain period of time so that the cells can take up fLG.
  • the contact time, temperature conditions, and the like may be in accordance with known literature (see WO2012 / 133688).
  • the fLG uptake is stopped by adding a large excess of cold KRB solution (0 ° C.) and the fLG in the solution is removed by centrifugation at 0 ° C. This process may be repeated as necessary until the concentration of fLG in the solution is sufficiently reduced.
  • a cold KRB solution By using a cold KRB solution, a highly reproducible fLG uptake process can be realized.
  • Centrifugation is preferably a short time (about 1-2 min) in order not to dry the cells, and immediately after the centrifugation, a small amount of KRB solution is added to the cell adhesion region.
  • Cell samples transferred in suspension in a buffer may contain a large amount of blood cells, but in order to efficiently collect the cells of interest without performing hemolysis while maintaining the cells alive, Double centrifugation can be used.
  • centrifugation is performed once at a rotation speed such that most of the red blood cells are precipitated but the cells of interest are not precipitated, for example, 200 G-400 G, 1-3 min, and all the supernatant in which the cells of interest are present is collected.
  • the collected supernatant is centrifuged once at a rotation speed that causes all cells to settle, for example, 500 G-650 G, 1-3 min.
  • the solution above the pellet containing a large amount of red blood cells 1mL-2mL is collected.
  • the next operation may be started immediately, or a large amount of buffer solution may be added and stored for up to 24 hours. In the latter case, before the operation, the centrifugal operation is once again performed between 650G-1500G and 1min-2min.
  • 2-NBDLG and 2-TRLG are dissolved and mixed to a final concentration, warmed at 37 degrees, and prepared (fLG solution).
  • an inhibitor for example, although not limited thereto, it is preferable to add a gap junction inhibitor Carbenoxolon for the purpose of excluding 2-NBDLG incorporation through gap junction / hemichannel passage. Perfusion is performed at a rate of 0.3 mL / min-1.4 mL / min, and the above-prepared fLG solution is flowed to contact with fLG for a certain period of time so that fLG is taken up by the cells.
  • the contact time, temperature conditions, and the like may be in accordance with known literature (see WO2012 / 133688).
  • the fLG uptake is stopped and the fLG in the solution is removed. It is possible to observe the fluorescence of the cells after application after perfusion between 5 min and 15 min until the concentration of fLG in the solution is sufficiently lowered.
  • Cell imaging is not performed by capturing individual cells of interest, but by using tiling imaging that allows the entire cell attachment area to be imaged in order by one field of view and pasted together after observation. This makes it possible to overlook the cells of interest.
  • the collected cell suspension is allowed to adhere to the glass or plastic plate surface by centrifugation.
  • This centrifugation process can be achieved relatively easily by using a commercially available automatic cell collection device using a cell centrifugation function. Although it is necessary to pay attention not to dry the cells in the centrifugation, it is possible up to 10 min if a buffer holding structure (for example, a silicone mask) that does not leak liquid during the centrifugation. After centrifugation, a small amount of KRB solution is added to the cell attachment area to prevent the cells from drying.
  • a buffer holding structure for example, a silicone mask
  • the glass or plastic plate used in the present invention can be used for identifying the cell position by marking the back surface of the cell attachment region in the vicinity of the cell of interest.
  • the cell position can be easily and accurately identified by using, on the back side of the cell adhesion region of the plate to be used, a symbol / character, line or the like that can be discriminated in advance on the back side of the glass.
  • the cell adhesion region on the surface of the glass or plastic plate to be used has a structure capable of maintaining a certain amount of buffer so that the cells can survive even after centrifugation.
  • a water-repellent substance such as silicone in advance
  • a normal inverted fluorescence microscope can be used for fluorescence and bright field observation of target cells present in the cell adhesion region on the plate, and it is determined whether or not the cells are cancer cells at room temperature for at least about 1 hour. Therefore, it is possible to observe without any change in cell morphology that hinders Papanicolaou staining performed after fluorescence observation.
  • the field of view is changed while frequently moving the glass plate up, down, left, and right, so that the buffer added on the target cell is easy to move, which is particularly remarkable when using an electric stage. In addition, it is necessary to minimize the influence on cells due to evaporation of the buffer solution.
  • a mask (buffer solution holding structure) with an opening equal to or larger than the water-repellent enclosure around the cell attachment region is closely attached to the glass surface, and appropriate observation time is taken into account.
  • buffer solution holding structure By adding an amount of buffer solution to this opening, drying and changes in osmotic pressure can be prevented even during long-term microscopic observation.
  • the cells are fixed by adding a fixative such as ethanol to the cell adhesion region.
  • a fixative such as ethanol
  • the fixing solution may be added, the mask may be removed after a while, and then the glass plate may be left still in the fixing solution container to continue fixing.
  • general cell staining such as Papanicolaou staining or Giemsa staining is performed using this glass plate by a conventional method, and then a slide glass is laminated to make a permanent specimen, and then pathological cytodiagnosis is performed as usual. It is possible.
  • This holder is required to have a structure that can be easily and accurately fixed without damaging the thin glass plate, and depending on the microscope magnification, it is also necessary to correct the error within the tolerance of the shape of the glass plate. .
  • the symbols, letters, lines, etc. on the back of the glass plate are repeatedly and reliably found in the field of view near the target cell. -It is useful as a reliable method that makes it possible to accurately and easily detect target cells from the relative positional relationship with characters and lines.
  • cancer cells are detected by microscopic observation using fluorescence, it is possible to find cancer cells hidden behind other cells by microscopic observation using conventional methods. It becomes possible. Thereby, it becomes possible to improve the accuracy of diagnosis by reducing false negatives due to oversight.
  • detection of cancer cells by fluorescence makes it possible to reduce the oversight of cells that should be noted by preferentially observing cells that emit fluorescence. It becomes possible to reduce the burden on the craftsman.
  • the method of the present invention using fluorescence detection also allows mechanization of detection.
  • cancer cells are detected based on information on the presence / absence of functional abnormalities in living cells, and therefore are based solely on morphological abnormality information of cells. This makes it possible to make a determination based on information that is qualitatively different from the conventional cell determination.
  • the method for detecting a cancer cell of the present invention comprises the detection of cancer cells using the above-described fluorescently labeled L-glucose derivative, and Papanicolaou, which is a conventional cytodiagnosis staining.
  • the present invention relates to a method for double detection of cancer cells, which combines detection of cancer cells based on staining, Giemsa staining, immunocytochemical staining or the like (hereinafter sometimes simply referred to as “cancer cytological staining”).
  • the cancer cell detection method using the specific fluorescently labeled L-glucose derivative described above can detect cancer cells on a glass or plastic plate while maintaining the cells in a viable state. Further, cancer cells can be detected from the attached cells using the above-mentioned cancer cytodiagnosis staining, and cancer diagnosis based on the double detection method can be performed.
  • the double detection method of cancer cells of the present invention after fixing the cells after fluorescence observation, staining using a general staining method such as Papanicolaou staining or immunocytochemical method, Since it is a method that allows comparison of the results of staining with these conventional techniques with the same cells observed with fluorescence, information on cell status can be obtained by adding cell function information with fluorescence observation to cell morphology information with conventional techniques. Therefore, both the quality and quantity can be improved, the diagnostic accuracy can be improved, and the observation cells can be narrowed down, so that oversight is reduced. Thereby, cancer diagnosis with higher accuracy becomes possible.
  • a general staining method such as Papanicolaou staining or immunocytochemical method
  • cancer cytodiagnosis staining examples include a known method of detecting cancer by staining cells after fixing the cells on a glass plate.
  • Papanicolaou staining, Giemsa staining, PAS staining, Grocott staining, and immunocytochemical staining using an antibody against a cancer-specific marker can be mentioned, and Papanicolaou staining is preferable.
  • These staining methods can be performed based on a known ordinary method.
  • immunocytochemical staining using antibodies for good / bad discrimination examples include, for example, p53, WT-1 (Wilm's tumour-1), IMP3, Ki-67, EMA (epithelial membrane antigen), CEA, cytokeratin, Examples thereof include desmin, calretinin, D2-40 (podoplanin), TTF-1 (thyroid transcription factor), CD45, and CD146.
  • the present invention uses living cells to attach cells to a thin glass or plastic plate having a region capable of holding a buffer solution, thereby holding the cells in a living state.
  • This is a live cell imaging method in which a fluorescently labeled molecule is incorporated into a cell while maintaining the same, and fluorescence emitted from the intracellular fluorescently labeled molecule is detected.
  • One aspect of the live cell imaging method of the present invention is a method comprising the following steps.
  • Step A Incubating live cells contained in a sample collected from a human with a fluorescently labeled compound, (Step B) a step of stopping the uptake of the fluorescently labeled compound into cells, (Step C) depositing the cells on a thin glass or plastic plate, where the plate has an area on its surface to hold a buffer to keep the cells alive And (Step D) a step of detecting fluorescence emitted from the fluorescently labeled compound present in the cells while maintaining the cells attached to the plate in a viable state.
  • the glass or plastic plate in step C has a region for holding a buffer for maintaining cells in a viable state on the surface, even before cell attachment or Preferably, a plate having such a region is used prior to cell attachment.
  • the fluorescently labeled molecule that can be used in the step A is not particularly limited as long as it is a fluorescently labeled molecule that is actively incorporated into living cells, and can be appropriately selected according to the purpose of live cell imaging.
  • a fluorescent group 7-nitrobenz-2-oxa-1 that passes through the glucose transporter of a mammalian cell and is incorporated into the cell with kinetics comparable to a radiolabeled D-glucose derivative.
  • 2-amino-2-deoxy-D-glucose (2-NBDG) labeled with 1,3-diazole group (NBD) Non-patent document 1: Yamada et al., J. Biol. Chem. 275). : 22278-83, 2000).
  • the incubation in the step A is performed at a temperature of 22 to 37.5 ° C., preferably 36 to 37.5 ° C., more preferably about 37 ° C.
  • the incubation time is appropriately selected according to the purpose and the fluorescently labeled molecule to be used, but is generally within 15 minutes, preferably 3 to 15 minutes, more preferably 3 to 5 minutes.
  • the method used in the cancer cell detection method of the present invention is used to stop the incorporation of the fluorescently labeled molecule in the step B.
  • the glass or plastic plate in the live cell imaging method of the present invention, the attachment of cells to the plate, the buffer holding structure, the buffer solution, the fluorescence detection method, etc. are related to the cancer cell detection method of the present invention.
  • the above description described in (1) can be applied to the live cell imaging method of the present invention as it is.
  • Another aspect of the present invention is a thin glass or plastic plate that can be used in the cancer cell detection method and / or cell live cell imaging method of the present invention.
  • Another aspect of the present invention is a buffer solution holding structure that can be applied to such a glass or plastic plate to sufficiently hold the buffer solution on the plate.
  • Another aspect of the present invention is a plate set for cell observation in which the glass or plastic plate and the buffer solution holding structure are combined.
  • Example 1 Imaging of washed ascites cells of ovarian cancer patients using fluorescently labeled L-glucose derivative (experimental method) (1) Ascites adjustment Immediately after the start of laparotomy for ovarian cancer (serous adenocarcinoma), the excess of the washed ascites obtained by washing the peritoneal cavity with physiological saline for the purpose of collecting ascites was placed in a 50 mL centrifuge tube. Collected. Next, after centrifugation at 1500 G for 2 min at room temperature, the supernatant was removed by decantation, and then 2 mL of Krebs Ringer Buffer (KRB solution, see below) was added to disperse the pellet to obtain an ascites cell suspension.
  • KRB solution Krebs Ringer Buffer
  • KRB solution NaCl 129.0 mM, KCl 4.75 mM, KH 2 PO 4 1.19 mM, MgSO 4 .7H 2 O 1.19 mM, CaCl 2 .2H 2 O 1.0 mM, NaHCO 3 5.02 mM , D-Glucose 5.6 mM, HEPES 10.0 mM (adjusted to 17.5 NaOH to adjust pH 7.35).
  • 0.1 mM Carbenoxone (Sigma, # C4790) was added to inhibit the entry and exit of fluorescently labeled glucose via gap junction / hemichannel.
  • the KRB solution was used as a solution for preparing a fluorescently labeled L-glucose derivative (hereinafter sometimes abbreviated as “fLG”) solution.
  • the glass plate was quickly taken out, and 0.2 mL of KRB solution was immediately added to the cell adhesion region to prevent drying.
  • a silicone resin mask (see FIG. 1D) provided with an opening in the portion corresponding to the cell attachment region is closely attached to the glass plate, and about 1 mL of KRB solution is further added to the cell attachment region, thereby performing live cell imaging. A sufficient amount of buffer solution was maintained for cell maintenance.
  • glass plate 3-1) Special cover glass for live cell imaging (hereinafter referred to as “glass plate”)
  • glass plate No. made by Matsunami Glass Industry Co., Ltd. 1S (thickness 0.16-0.19 mm) cut into a size of 26 mm ⁇ 76 mm as shown in FIGS. 1A and 1C was used.
  • the upper left corner of the glass plate was cut obliquely for the purpose of facilitating the discrimination between front, back, top, bottom, left and right.
  • This diagonal notch in the glass plate is used to place the glass plate with the nail on the holder side when attaching the thin glass glass plate instead of the slide glass to the Keyence slide glass holder used by setting on the microscope stage.
  • a square water-repellent area is provided in advance using a commercially available immunohistochemical puppen (such as a super puppen liquid blocker made by Daido Sangyo) so as to surround the periphery of the cell adhesion area on the glass plate.
  • a commercially available immunohistochemical puppen such as a super puppen liquid blocker made by Daido Sangyo
  • a KRB solution was added so as not to dry the cells (FIG. 1C).
  • the area drawn with this pen is washed away with xylene contained in the encapsulant when encapsulated after fluorescence observation, and does not interfere with Papanicolaou observation.
  • the mask (buffer solution holding structure) used in close contact with the glass plate for holding the buffer solution is made of silicone with a thickness of 2 mm and is asymmetrical in the vertical and horizontal directions so that the orientation can be easily understood. It has a size that does not hide the name, etc., and can be easily adhered without generating bubbles on the glass plate, and can be easily removed without affecting the cells (FIGS. 1A and 1D). .
  • the mask mounting and removal operations are performed by manually holding a protrusion of about 4 mm provided on the top.
  • the opening of the silicone mask has a size slightly larger than the enclosure provided with a pen pen around the cell attachment region.
  • KRB solution It is for dripping about 1 mL of KRB solution. Since the mask is thick and hydrophobic, the KRB solution does not spill due to agile XYZ movement by an electric stage or the like during microscopic observation. In addition, when microscopic observation takes a long time, the structure can be replenished with a KRB solution as needed, and observation can be performed while maintaining a good cell state. A step is provided at the right end of the mask. This level difference is caused when a glass plate with a silicone mask adhered instead of a slide glass is attached to a Keyence slide glass holder that is set on the microscope stage. The structure does not interfere.
  • a commercially available filter for BZ-X700 was used for fluorescence detection, and a GFP filter for BZ-X (green channel, OP-87763, Ex 470/40 nm, Em 525/50 nm, DM 495) for 2-NBDLG fluorescence observation. nm) and a BZ-X TRITC filter (red channel, OP-87764, Ex 545/25 nm, Em 605/70 nm, DM 545 nm) for 2-TRLG fluorescence observation. For this reason, the GFP filter used in the 2-NBDLG fluorescence observation of this example hardly transmits fluorescence due to 2-TRLG and can be evaluated reflecting 2-NBDLG uptake.
  • Bright field image Monochrome, high sensitivity, transmitted illumination light quantity 25, aperture stop 20%, exposure time 1/2500 sec x40 lens (CFI Plan Apo ⁇ 40x, # 972033, NA 0.95, WD 0.25-0.16mm)
  • Bright field image High sensitivity, transmitted illumination light quantity 25, aperture stop 20%, exposure time 1 / 300s
  • Green fluorescence image High sensitivity, excitation light quantity 100%, exposure time 1 / 1.5s
  • Red fluorescent image high sensitivity, excitation light quantity 10%, exposure time 1 / 4s
  • Bright field image High sensitivity, transmitted illumination light quantity 25, aperture stop 20%, exposure time 1/50 s Green fluorescence image: high sensitivity, excitation light quantity 100%, exposure time 1 / 10s Red fluorescent image: high sensitivity, excitation light quantity 10%,
  • FIG. 2A is a bright-field image (objective lens magnification is 100 times) observed with a microscope in a state where ascites cells obtained at the time of surgery of an ovarian cancer (serous adenocarcinoma) patient are utilized. From the morphological observation, cells suspected of being cancer cells (cells surrounded by a solid line at the center of the screen) and cells that are considered normal peritoneal mesothelial cells (cells surrounded by a broken line at the upper right of the screen) are observed.
  • FIG. 2B is a fluorescence microscope image in the green wavelength region after application of a KRB solution containing 100 ⁇ M 2-NBDLG and 20 ⁇ M 2-TRLG.
  • FIG. 2C is an image similar to B described above. However, it is a fluorescence microscope image in a red wavelength region.
  • the cell fragment (Debris) on the left side of the screen emits strong red fluorescence derived from 2-TRLG, while the cell at the center of the screen (solid line) that is suspected to be a morphological cancer cell (solid line) Since cells that appear to be peritoneal mesothelial cells (broken lines) do not emit such red fluorescence, 2-NBDLG fluorescence observed in cells suspected of being cancer cells in B is due to uptake caused by cell membrane damage It is unlikely that it was brought about. Note that the slight red fluorescence of the cell at the center of the screen suspected of being a cancer cell is based on the long-wavelength side of strong 2-NBDLG fluorescence (see Non-Patent Document 1).
  • FIG. 2D is an overwritten image of a bright field image and a fluorescence image.
  • 2-NBDLG that emits green fluorescence is selectively taken up by cells suspected of being cancer cells, and is not taken up by peritoneal mesothelial cells that are normal cells, and the left cell debris emits red fluorescence 2 -The appearance of staining with TRLG is clear.
  • Example 2 Correspondence between live cell fluorescence imaging in which fluorescently labeled L-glucose derivative is applied to ascites cells of endometrial cancer patients and Papanicolaou staining results after fixation Ascites cells obtained during surgery of endometrial cancer patients Fluorescently labeled L-glucose derivative was applied to the cells, live cell fluorescence imaging was performed, and then the cells were fixed and Papanicolaou staining was performed using the same sample. And correspondence of the result of both was performed.
  • the surplus portion taken for the cytological examination in the hospital pathology department is further divided into two parts, each is dispersed in a 50 mL centrifuge tube containing 40 mL of KRB solution, and dark until the next day's application of fLG. And stored at room temperature. The next day (about 20 hours after obtaining ascites cells), centrifuge a 50 mL centrifuge tube containing 40 mL of cell suspension at 600 G for 1 min at room temperature, discard the supernatant by decantation, add 1 mL of KRB solution to the pellet, and re- Dispersed.
  • Example 2 (4) Image acquisition conditions About 22 hours after the ascites cells were obtained, observation and photographing were performed using the same equipment as in Example 1. The entire cell adhesion area on the glass plate is examined using an X10 lens (below) in a bright field, and the target cells are photographed in the same field as the marker on the back of the glass plate. It was made available for identification of cell location. Next, a bright-field image and a fluorescence image using a high-magnification lens of the target cell were acquired, and position information registration on the stage was performed using BZ-X700 dedicated software. The shooting conditions used are as follows.
  • Bright field image Monochrome, high sensitivity, transmitted illumination light 25, aperture stop 20%, exposure time 1 / 4500s
  • Bright field image when using x40 lens High sensitivity, transmitted illumination light quantity 25, aperture stop 20%, exposure time 1 / 300s
  • Green fluorescence image High sensitivity, excitation light quantity 100%, exposure time 1 / 4s Red fluorescent image: high sensitivity, excitation light quantity 10%, exposure time 1 / 10s
  • Bright field image High sensitivity, transmitted illumination light quantity 25, aperture stop 20%, exposure time 1 / 50s
  • Green fluorescence image High sensitivity, excitation light quantity 100%, exposure time 1 / 4s Red fluorescent image: high sensitivity, excitation light quantity 10%, exposure time 1 / 10s
  • Papanicolaou staining and observation After fluorescence observation, the glass plate was immersed in a container filled with 99.5% ethanol, allowed to stand for 5 minutes, and then the silicone mask was removed. After fixation with ethanol, Papanicolaou staining was performed by a conventional method, and a glass slide was attached to a glass plate in an upside down manner, and a permanent specimen was obtained. In order to observe the target cells photographed at the time of fluorescence observation in the same visual field based on the registration position information on the stage, when the glass plate and the slide glass were bonded together, both ends were aligned exactly and sealed.
  • the field of view was roughly examined using a normal upright microscope as a marker, and then the field of view was identified again based on the positional information registered in the BZ-X700 all-in-one fluorescence microscope. I observed it with a lens and photographed it.
  • the shooting conditions used are bright field color, high resolution, transmitted illumination light quantity 25, aperture stop 20%, and exposure time 1 / 1.5 s.
  • FIGS. 3A shows bright field images (the objective lens has a magnification of 40 times) of two living cell masses suspected to be cancer cells from morphological observation. The image was taken about 22 hours after fLG was applied the day after ascites was obtained (about 20 hours later). The black part on the upper right of the screen is a part of the mark for position determination written on the back surface of the glass plate.
  • FIG. 3B is a fluorescence microscope image in the green wavelength region after application of a KRB solution containing 100 ⁇ M 2-NBDLG and 20 ⁇ M 2-TRLG. It can be seen that both the two cancer cell clusters on the left and right of the screen emit fluorescence derived from 2-NBDLG.
  • FIG. 3C is a fluorescence microscope image similar to B but in the red wavelength region.
  • FIG. 3D is a bright-field enlarged image of the cell cluster (Cluster1) on the right side of the screen in C (the magnification of the objective lens is 100 times).
  • FIG. 4A is an enlarged fluorescence microscope image of the cell cluster (Cluster 1) on the right side of the screen in FIG. 3B in the green wavelength region.
  • FIG. 4B is an enlarged fluorescence microscope image in the red wavelength region of the cell cluster (Cluster 1) on the right side of the screen in FIG. 3C. Red fluorescence derived from 2-TRLG is not observed.
  • FIG. 4C is an overwritten image of a bright field image and a fluorescence image of the cell cluster (Cluster 1) of FIGS. 3D, 4A, and 4B.
  • FIG. 4D is a bright-field image after Papanicolaou staining of the cell cluster (Cluster 1) shown in FIGS. 3D, 4A, and 4B, ie, 2-NBDLG positive and 2-TRLG negative cell cluster. This is recognized as a cell cluster showing the characteristics of typical adenocarcinoma cell nuclear mode and cell assembly mode according to cytodiagnostic classification.
  • Example 3 Correspondence between Live Cell Fluorescence Imaging Applying Fluorescent Labeled L-Glucose Derivative to Ascites Cells of Endometrial Cancer Patient and Papanicolaou Staining Result After Fixation Ascites Cells Obtained at Operation of Endometrial Cancer Patients Live cell fluorescence imaging in which a fluorescently labeled L-glucose derivative was applied was performed, and then the same sample was used to perform Papanicolaou staining after fixing the cells. And correspondence of the result of both was performed. Therefore, this is an example in which cells determined to be reactive mesothelial cells were recognized.
  • the surplus portion taken for the cytological examination in the hospital pathology department is dispersed in a 15 mL centrifuge tube containing 15 mL of KRB solution, centrifuged again at room temperature at 1500 G for 2 min, and then the supernatant is removed with a dropper. Removed. Most of the pellets were red blood cells, but a large amount of red blood cells obstructed the target cells, which hinders the speculum. Red blood cells with high specific gravity are deposited on the bottom of the centrifuge tube, and a layer (buffy coat) containing components such as target cells, white blood cells, and platelets is formed on it.
  • a layer a layer (buffy coat) containing components such as target cells, white blood cells, and platelets is formed on it.
  • Example 2 the cells were redispersed in 40 mL of cold KRB solution, centrifuged again at 650 G for 1 min, the supernatant was removed, and ascites cells were dispersed in 10 mL of cold KRB solution.
  • attachment of ascites cells to a glass plate by centrifugation and a method for maintaining survival, Papanicolaou staining and observation were performed in the same manner as in Example 2.
  • Image acquisition conditions were as follows using an x40 lens. Bright field image: High sensitivity, transmitted illumination light quantity 25, aperture stop 20%, exposure time 1 / 500s Green fluorescence image: High sensitivity, excitation light quantity 100%, exposure time 1 / 4s Red fluorescent image: high sensitivity, excitation light quantity 10%, exposure time 1 / 10s
  • FIG. 5 is an enlarged view showing a region including reactive mesothelial cells confirmed as a result of live cell fluorescence imaging and Papanicolaou staining.
  • FIG. 5A is a fluorescence microscope image (magnification of objective lens is 40 times) in a green wavelength region after application of a KRB solution containing 100 ⁇ M 2-NBDLG and 20 ⁇ M 2-TRLG. A group of cells existing in the region of interest surrounded by a white line emits fluorescence derived from 2-NBDLG. The strong fluorescence to the right of the region of interest is an insoluble object with green fluorescence.
  • FIG. 5B is a fluorescence microscope image similar to A but in the red wavelength region.
  • the cell group of the region of interest does not emit red fluorescence derived from 2-TRLG, and it is not considered that 2-NBDLG fluorescence is caused by uptake due to cell membrane damage.
  • FIG. 5C is an image in which the fluorescent images of A and B are superimposed on the bright field image.
  • FIG. 5D shows the results of Papanicolaou staining performed after fluorescent staining.
  • AC the cell group existing in the region of interest surrounded by the white line is recognized as a cell group exhibiting characteristics of a nuclear mode and a cell assembly mode that are considered to be reactive mesothelial cells.
  • the cells are reactive mesothelial cells by summing up the aggregated form of cells, etc., or cells that exhibit abnormalities that are suspected of migrating to cancer, or are difficult to judge Or, a subjective element is strongly included in the diagnosis. In other words, it may be said that there is a wider range of lines between the reactive mesothelial cells and the cells exhibiting abnormalities that are suspected of moving to cancer from the examiner or cytology specialist.
  • information that is qualitatively different from conventional cell determination that has been determined solely based on morphological abnormality information of cells is obtained, and by examining the progress and prognosis of cancer, such cells It can give useful information to distinguish between good and bad.
  • Example 4 Correspondence between Live Cell Fluorescence Imaging in which Fluorescent Labeled L-Glucose Derivative was Applied to Perfusion Method on Stock Solution Ascites Cells of Ovarian Cancer Patient and Papanicolaou Staining Result after Fixation Obtained at the time of surgery for ovarian cancer patient Fluorescently labeled L-glucose derivative was applied to ascites cells, live cell fluorescence imaging was performed, and then the same sample was used to fix cells and then perform Papanicolaou staining. And correspondence of the result of both was performed.
  • Silicone mask for perfusion (buffer solution holding structure)
  • the mask used in close contact with the glass plate for the purpose of holding the buffer solution is made of silicone with a thickness of 0.5 mm, and it is asymmetrical so that the orientation can be easily understood, and the sample name written on the glass plate is not hidden.
  • the size of the glass plate was such that it could be easily adhered without causing bubbles on the glass plate, and could be easily removed without affecting the cells (FIGS. 14 and 15).
  • This silicone mask has a nested structure of an inner mask having an opening of the same size as the cell attachment region and an outer mask having a fish-shaped opening that can be fitted with the inner mask.
  • the opening of the inner mask is the same size as the frame surrounding the cell attachment region, and prevents cells from flowing out of the cell attachment region during cell attachment by centrifugation.
  • the fish mask opening of the outer mask is affixed with a cover glass that does not block the opening after cell attachment. It is possible to perform perfusion without excess or deficiency so that it overflows to the Inlet side and does not overflow to the Inlet side.
  • a dummy glass plate was placed on the perfusion stage to perfuse the KRB solution, and the temperature of the cell attachment part was set to 37.0 ⁇ 0.5 ° C. at a flow rate of 0.7 mL / min. Specifically, by setting the temperature of the top heater and bath heater of the microscope culture apparatus, the temperature in the apparatus is made constant, and about 40 mL of water is poured into the water channel in the culture apparatus and heated at the same time. The KRB solution before reaching the cells was warmed by passing a KRB solution through a thin stainless steel tube.
  • the perfusion was started at a flow rate of 0.3 mL / min while confirming the degree of cell attachment while observing the state of perfusion under a bright field. Thereafter, while increasing the flow rate by 0.1 mL / min every 1 minute, the speed was increased to 0.7 mL / min to confirm that the perfusion was stable.
  • the field of view is shifted to the right, the adjacent frame angle is set to B, the diagonal of A is set to C in the same manner, the imaging area is set at two points A and C, and the cell attachment glass is set at three points A, B, and C.
  • the upper part of the 6.3 micron from the surface was taken as the imaging surface.
  • the reason why the upper part of the cell attachment glass surface is 6.3 microns is that the cancer cell has one or more three-dimensional structures with a height, so even if focusing on the glass surface, This is because the height is not optimal for observing the nucleus and cytoplasm (need to be studied).
  • 1036 images (28 ⁇ 37) are acquired from the x40 lens field of view at the time of photographing, and the entire field of view of the cell attachment region can be photographed in about 3 minutes 30 seconds.
  • images can be expressed as a single large image by combining images (image joint) using a dedicated application.
  • An image before administration of the fluorescently labeled L-glucose derivative was a green fluorescent image, and then a bright field image was taken under the following conditions.
  • Green fluorescence image high sensitivity (Gain 6db, Binning 3x3), excitation light quantity 100%, exposure time 1 / 80s
  • Bright field image High sensitivity (Gain 6db, Binning 3x3), transmitted illumination light quantity 25%, aperture stop 20%, exposure time 1 / 500s
  • the mixed solution of 2-NBDLG and 2-TRLG (fLG solution) has 2-NBDLG of 100 ⁇ M and 2-TRLG of 20 ⁇ M, respectively.
  • the fLG solution is supplied from a different line that is branched from the KRB solution.
  • the fLG solution is preheated to 40 ° C. in a water bath to lightly remove the air in the solution, and then passed through an octopus tube trap.
  • the KRB solution line was merged before the pump.
  • Green fluorescence image High sensitivity, excitation light quantity 100%, exposure time 1 / 80s
  • Red fluorescent image high sensitivity, excitation light 5%, exposure time 1/120 s
  • Bright field image High sensitivity, transmitted illumination light quantity 25%, aperture stop 20%, exposure time 1 / 500s
  • Papanicolaou staining and observation After fluorescence observation, the cell observation cover glass was immersed in a container filled with 99.5% ethanol, allowed to stand for 5 minutes, and then the perfusion silicone mask was removed. After fixation with ethanol, Papanicolaou staining was performed by a conventional method, and a cover glass for cell observation was attached on a slide glass and sealed to obtain a permanent specimen. In order to match the image acquired during fluorescence observation with the image acquired after Papanicolaou staining, when the cell observation cover glass and the slide glass were bonded together, both ends were aligned exactly and sealed.
  • a cover glass for cell observation enclosed in a perfusion stage was set, and the imaging range and imaging plane were set in the same manner as when acquiring images during perfusion.
  • the photographing conditions are bright field color, high resolution (Gain 6db, Binning 1x1), transmitted illumination light quantity 100%, aperture stop 20%, and exposure time 1 / 7.5s.
  • FIGS. 6A is a superimposed image of a green wavelength region fluorescence image, a red wavelength region fluorescence image, and a bright field image of the entire cell adhesion region before application of fLG
  • FIG. 6B is a green wavelength region fluorescence image after fLG application.
  • FIG. 2 is a superimposed image of a fluorescence image diagram of a red wavelength region and a bright field image. It can be seen from the observation of the morphology of the Papanicolaou stained image in FIG.
  • FIG. 7A is a fluorescence microscope image in the green wavelength region before fLG application of the cell mass shown in FIG. 8D
  • FIG. 7B is a fluorescence microscope image in the green wavelength region after fLG application. Comparing these two images, it can be seen that the cancer cell cluster emits fluorescence derived from 2-NBDLG.
  • the 2-NBDLG fluorescence of this cell mass is caused by cell membrane damage. It is not considered to have been brought about by uptake. That is, the cell mass recognized as having the characteristics of cancer cell nuclear mode and cell assembly mode by cytodiagnosis after Papanicolaou staining is 2-NBDLG positive and 2-TRLG negative. This shows that the detection method of cancer cells from the physiological viewpoint is consistent with the morphological diagnosis method.
  • Example 5 Live cell fluorescence imaging in which fluorescently labeled L-glucose derivative was applied by perfusion to washed ascites cells of endometrial cancer patients, and corresponding results of Papanicolaou staining performed after fixation. Fluorescently labeled L-glucose derivative was applied to the washed ascites cells, live cell fluorescence imaging was performed, and then the same sample was used to perform Papanicolaou staining after fixing the cells. And correspondence of the result of both was performed.
  • FIG. 10, FIG. 11, FIG. 12 show the results of matching the results of live cell imaging of washed ascites cells obtained at the time of surgery for endometrial cancer (endometrial endometrioid adenocarcinoma) patients with the subsequent Papanicolaou staining results.
  • FIG. 10A is a superimposed image of a green wavelength region fluorescence image, a red wavelength region fluorescence image, and a bright field image of the entire cell adhesion region before application of fLG
  • FIG. 10B is a green wavelength region fluorescence image after fLG application.
  • FIG. 2 is a superimposed image of a fluorescence image diagram of a red wavelength region and a bright field image.
  • FIG. 11B is a fluorescence microscope image in the green wavelength region after application of a KRB solution containing 100 ⁇ M 2-NBDLG and 20 ⁇ M 2-TRLG. Neither cell a nor b emits fluorescence derived from 2-NBDLG compared to the image of FIG. 11A before application. Furthermore, neither a nor b emits red fluorescence in the fluorescent image in the red wavelength region of FIG. 12B.
  • FIG. 12D and enlarged views 13a and 13b show the results of Papanicolaou staining performed after fluorescent staining. It can be seen that one cell body is small in size, nuclei are uniform in size, and N / C is small. In addition, there is little damage to the cells due to nuclear degeneration or aggregation, and the staining results do not interfere with the morphological determination by the examiner or cytodiagnosis specialist, indicating the effectiveness of the perfusion method.
  • the method of the present invention provides a new cytodiagnosis method capable of imaging a living cell using living cells.
  • the present invention also provides a method for detecting cancer cells using a combination of a method for detecting cancer using live imaging and a cytodiagnosis method for existing cancer cells, such as Papanicolaou staining method or Giemsa staining method. .

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Abstract

　本発明は、細胞診においても用いることができる、生体由来細胞を用いたがん細胞の新たな検出方法を提供することを目的とする。特には、細胞を生きた状態でイメージングできる新たながん細胞の検出方法、並びに該方法と既存の細胞診の染色方法を組み合わせたがん細胞の二重検出方法を提供することを目的とする。　ヒトから採取した試料中に含まれる生きた細胞を、蛍光標識Ｌ－グルコース誘導体とともにインキュベートして細胞内に取り込まれた該蛍光標識Ｌ－グルコース誘導体を検出すること、及び前記細胞を薄いガラス又はプラスチックプレート上に付着させた状態で、細胞内に存在する前記Ｌ－グルコース誘導体が発する蛍光を検出すること、からなる生体由来細胞を用いたがん細胞の検出方法が提供される。さらに、アルコール等で固定された細胞を用いた染色法を組み合わせたがんの二重検出方法が提供される。

Description

生体由来細胞を用いたがん細胞の検出方法
　本発明は、生体由来細胞を用いた、がん細胞の検出方法、特には蛍光標識Ｌ－グルコース誘導体を用いたがん細胞の検出方法に関する。本発明はまた、該がん細胞の検出方法に用いることができる細胞固定・観察用のスライドガラスのセットに関する。
　現在、がんは日本人の１／２が罹患する。しかし、多くの場合、早期に的確な診断を行い、過不足のない治療を行えば、予後やＱＯＬの改善が期待される。がん細胞であるか否かの判定は、がんが疑われる部位から細胞（細胞診）もしくは組織（組織診）を取り出し、細胞検査士や病理専門医が形態学的に異常の有無を観察し、経験と主観に基づいて判断を行っている。しかし、前がん病変と呼ばれる初期の状態、あるいはクラスIIIと呼ばれる境界病変では、形態学からだけでは判定が難しいケースもあり、実際に検査士や病理医により判断が分かれたり、再検査に回して判断を保留する場合もある。これにより再検査時には進行している場合もあり、患者、病理医、検査士、臨床医、検査専門会社の全ての立場から、現在より客観的で明快な細胞評価方法の開発が切望されている状況にある。
　境界病変の的確な診断は臨床現場の悲願であるとともに、患者の一生を左右するシリアスな問題である。また、細胞形態を一つ一つ観察する従来の細胞診は、多年の経験が必要とされるため、人材の養成が追い付かず、現場の負担が大きく、見過ごしも起きるなど、長年改善が求められてきた。
　がんの有無を判定する検査においては、まず比較的侵襲の少ない「細胞診」（Ｎ／Ｃ比、極性、核の様態を含めた細胞異型、および細胞の積層等の構造異型の有無等の検査）を実施して、がん細胞が検出されるか否かを専ら形態学的に判定し、もしがん細胞もしくはその疑いのある細胞が見出された場合には、より詳細な判定が可能な組織診を行って治療方針の決定に役立てている。
　また、「細胞診」は、検診等でがんの有無を簡便に調べる目的、がんの手術時や診断目的で腹水や胸水等の体腔液を採取して腹膜や胸膜等への播種の有無を調べる目的、あるいは尿路系腫瘍等で尿を調べてがんの有無を発見する目的等からも頻繁に用いられる。腹水や胸水等の検査や、腎盂がんの有無を調べる場合等、組織診が実施できないケースもあり、このような場合、細胞診断により治療方針を決定する必要がある。
　我が国の細胞診は、一部の先端機関を除いて、患者から得られた検体をスライドガラスに塗抹し、アルコール固定後、染色、封入し、顕微鏡を用いて細胞形態を観察することで行われている。迅速簡便に実施できる一方、検査を専門に担当する細胞検査士は、スライドガラス一枚一枚に含まれる膨大な数に上る細胞を、まさに一つ一つ形態や核に異常がないか調べていく作業を連日繰り返している。いかに速く見逃しすることなく確実にがん細胞を発見できるか、多年にわたる経験と技術が必要な世界といえる。
　また、折り重なる細胞群から、たとえわずかでもがん細胞が見つかればがんと判定され、見逃しは的確な診断の遅れにつながる為、一つの細胞も見落とすことなく探しだす集中力と根気、熟練が要求されるが、検査士により違いがあることは否定できない。
　加えて、腹水や尿の中に浮遊する細胞は、観察対象とする細胞が本来存在する組織から剥離して存在している為、血流や栄養が絶たれ、細胞変性を起こしやすい。その為、形態が変化して核が濃染したり、Ｎ／Ｃ比（核／細胞質比）が増大するなど、がん細胞と鑑別の難しい細胞が認められる場合も稀でない。従って、良悪の鑑別困難ないわゆるクラスIIIとして判定され、治療方針の決定に支障を来たし、経過観察、再検査となることがある。また、クラスIII分類の幅が検査士および細胞診専門医の経験、主観により異なり、早期の治療ができずに患者に不利益を生じる可能性がある。しかし、現状の形態情報のみによる細胞診断では限界があると言わざるを得ない。
　また、光学顕微鏡による観察では、多量の血液細胞の存在により、観察対象とする細胞が見えにくくなり、的確な診断に苦慮することがある。これを改善するための標本作製法として液状化細胞診（ＬＢＣ）も考案されている。標本作製における人為的な要素の低減には役立つが、良悪の鑑別について従来法と有意な差がないとする報告もある。
　がん細胞であるか否かの判定は、従来、細胞検査士ならびに細胞診専門医が、以下のような細胞の形態学的特徴等に注目して行ってきた。
１）細胞質（cytoplasm）に対する細胞核（nucleus）の比（Ｎ／Ｃ比）の増大。
２）細胞内の核の位置や核クロマチンの様態を含めた細胞形態の異常。
３）細胞の集合状態等の異常（構造異型）。
　しかし、このような形態学的な異常に基づく診断は、細胞検査士ならびに細胞診専門医が主観に基づいて下すものであることから、良悪境界状態にある細胞や、細胞形態だけでは判断できないような場合がある。このように、主観に基づく診断では、観察者により意見が異なる場合や、判断を保留せざるを得ない場合もある。一例として、膀胱がんの再発検査においては、クラスIIIに分類される判定は１０％以上に上り、看過できないものとなっている。
　本来クラスIIIと判定された検体は、がんか、がんではないかのどちらかのはずであるのに、「がんである恐れのある細胞」と、「がんである恐れのない細胞」の線引きは難しい。そこで、クラスIIIを減らす為には、こうした主観的側面をもつ現在の細胞診断に代わり得る客観的な尺度、あるいは経験の多寡によらず判定できるような明確な指標が求められている。
　更に、日々蓄積する待ったなしの膨大な細胞診業務の中にあって、熟練した細胞検査士が異常所見をひとつひとつ人間の目によって見つけ出している現状において見逃しによる偽陰性を回避するため、的確に異常所見を拾い上げるガイドとなるような指標が必要である。
　がんの細胞診断において常法となっているパパニコロウ染色やギムザ染色等の一般染色による判定を補う必要がある場合、免疫細胞化学染色を実施する場合がある。しかしながら、一種類で良性と悪性を鑑別できるような抗体は存在せず、数種類を組み合わせる必要がある上、いずれも良悪鑑別の決定打となるまでには至っていない。
　加えて、現在の細胞診標本作製においては、アルコール固定により、死んだ細胞の、専ら「形態学的に検出可能な異常」の判定に基づいた方法であり、形態学的な変化として必ずしも表れていない「細胞の機能的な異常」を見る方法になっていないという点が指摘できる。一見正常な細胞形態を示していても、機能的にも正常であるか否かは、通常の細胞診だけでは判定しえない。例えば、形態学的に正常細胞と見分けがつかない場合であっても、細胞が将来がん化リスクの高いウイルスに既に感染していたり、あるいは細胞機能には既に異常が現れているにも関わらず、形態学的細胞判定技術では鑑別ができない場合がある。このような場合、形態学的に異常が完全に明らかになるまで確定診断できず、検査を繰り返した結果として治療開始が後れ、患者が不利益を被る。
　本発明者らは、自然界に存在せず、グルコーストランスポーターＧＬＵＴに結合しない、Ｌ－グルコースを緑色の蛍光基ＮＢＤで標識した新規蛍光Ｌ－グルコース誘導体である２－［Ｎ－（７－ニトロベンズ－２－オキサ－１，３－ジアゾール－４－イル）アミノ］－２－デオキシ－Ｌ－グルコース（２－ＮＢＤＬＧ）を開発し、すい臓がん細胞等のインビトロ培養細胞や担がんマウスに投与すると、がん細胞内への２－ＮＢＤＬＧの特異的な取り込みによりがん細胞が可視化され、多様な細胞状態を示すがん細胞から成るがん細胞塊のイメージングが可能であることを示した（特許文献１）。
　また、本発明者らは、赤色の蛍光基を有し、細胞膜不透過性の蛍光Ｌ－グルコース誘導体である、２位にスルホローダミン１０１をスルホンアミド結合した２－アミノ－２－デオキシ－Ｌ－グルコース（２－ＴＲＬＧ）を開発し、これを２－ＮＢＤＬＧと共に培養細胞に適用するインビトロ実験では、細胞膜に損傷を受けた細胞や食作用等による非特異的な細胞内への取り込みを示す細胞は、２－ＮＢＤＬＧと２－ＴＲＬＧの両者を共に細胞内に取り込むことによって２－ＮＢＤＬＧのみを取り込む細胞と識別できることを示してきた（特許文献１）。
ＷＯ２０１２／１３３６８８号公報
Yamamoto et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 21: 4088-4096, 2011
　本発明は、細胞診において用いることができる、生体由来細胞を用いたがん細胞の新たな検出方法を提供することを目的とする。本発明はまた、既存のがん細胞の細胞診断法、例えばパパニコロウ染色法やギムザ染色法と組み合わせて用いることができる、生体由来細胞を用いたがん細胞のライブイメージング検出方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記の点に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、生体由来の細胞を用いて、緩衝液を保持することができる領域を薄いガラス又はプラスチックプレート上に設けることにより、薄いガラス又はプラスチックプレート上に細胞を付着させて保持することが可能となった。この緩衝液保持領域にはシリコーン等の撥水性物質による疎水性領域を構築することで細胞の乾燥を防ぐ効果を大いに高め、この撥水性物質の乾燥防止効果により、細胞を生存状態に維持しながら蛍光標識分子を細胞内に取り込ませて細胞内の蛍光標識分子が発する蛍光を検出できることを見出し、本発明を完成させた。
　この方法を用いることにより、生体由来細胞を用いた細胞のライブイメージングが可能となるとともに、特定の蛍光標識分子を用いることにより生体由来細胞を用いたがんの検出が可能であることを見出した。そして、ライブイメージングを用いたがんの検出方法を、既存のがん細胞の細胞診断法、例えばパパニコロウ染色法やギムザ染色法と組み合わせて用いることにより、がん細胞の二重検出法という更なる発明を完成させた。
　本発明の例示的な態様は、以下の通りである。
（１）生体由来細胞を用いたがん細胞の検出方法であって、以下の工程：
（ａ）ヒトから採取した試料中に含まれる生きた細胞を、蛍光標識Ｌ－グルコース誘導体とともにインキュベートする工程、ここで、該蛍光標識Ｌ－グルコース誘導体は、蛍光分子団として７－ニトロベンズ－２－オキサ－１，３－ジアゾール基又はその誘導体を分子内に有するＬ－グルコース誘導体である、
（ｂ）細胞の前記Ｌ－グルコース誘導体の取り込みを停止する工程、
（ｃ）前記細胞を薄いガラス又はプラスチックプレート上に付着させる工程、ここで、該プレートは、その表面上に、該細胞を生存状態で維持するための緩衝液を保持するための領域を有する、及び
（ｄ）前記プレートに付着した細胞を生存状態に維持しながら、細胞内に存在する前記Ｌ－グルコース誘導体が発する蛍光を検出する工程、
を含む検出方法。
（２）前記蛍光標識Ｌ－グルコース誘導体が、蛍光分子団として７－ニトロベンズ－２－オキサ－１，３－ジアゾール基又はその誘導体を分子内に有するＬ－グルコース誘導体と、２位にスルホローダミン１０１をスルホンアミド結合した２－アミノ－２－デオキシ－Ｌ－グルコース（２－ＴＲＬＧ）との混合物である、上記（１）に記載の検出方法。
（３）工程（ｄ）における蛍光の検出において、蛍光イメージングされた細胞の蛍光色調を指標に該細胞の細胞膜損傷状態を判断することをさらに含む、上記（２）に記載の検出方法。
（４）前記の蛍光分子団として７－ニトロベンズ－２－オキサ－１，３－ジアゾール基又はその誘導体を分子内に有するＬ－グルコース誘導体が、２－［Ｎ－（７－ニトロベンズ－２－オキサ－１，３－ジアゾール－４－イル）アミノ］－２－デオキシ－Ｌ－グルコース（２－ＮＢＤＬＧ）である上記（１）～（３）のいずれか一つに記載の検出方法。
（５）工程（ａ）におけるインキュベーションを、２２～３７．５℃の温度にて３～１５分間行う、上記（１）～（４）のいずれか一つに記載の検出方法。
（６）工程（ｂ）における細胞内への蛍光標識Ｌ－グルコース誘導体の取り込みを停止する工程を、蛍光標識Ｌ－グルコース誘導体を含まない０℃～５℃の緩衝液で細胞を処理することにより行う、上記（１）～（５）のいずれか一つに記載の検出方法。
（７）前記工程（ｃ）の細胞のプレートへの付着を遠心により行い、遠心後直ちに前記領域に緩衝液を加えることを含む、上記（１）～（６）のいずれか一つに記載の検出方法。
（８）前記プレートの厚さが０．３ｍｍ以下である上記（１）～（７）のいずれか一つに記載の検出方法。
（９）前記プレートの前記領域を取り囲むように設計された緩衝液保持構造体を用いて前記領域での緩衝液の保持を十分なものとすることをさらに含む、上記（１）～（８）のいずれか一つに記載の検出方法、ここで、該緩衝液保持構造体は、前記領域に相当する開口部を有するプレート形状又はリング形状の構造体であって、前記緩衝液を保持するのに十分な厚さを有する。
（１０）前記緩衝液保持構造体がシリコーンから作られた厚さ０．５～１０ｍｍの構造体である、上記（９）に記載の検出方法。
（１１）前記生体由来細胞が、患者の浮遊細胞液由来の細胞、擦過剥離細胞由来の細胞、又は穿刺吸引細胞由来の細胞である、上記（１）～（１０）のいずれか一つに記載の検出方法。
（１２）前記生体由来細胞が、患者の喀痰、尿、腹水、胸水、心嚢液、脳脊髄液、胆汁、膵液、関節液又は血液から選ばれる浮遊細胞液から由来する細胞である、上記（１１）に記載の検出方法。
（１３）前記生体由来細胞が、卵巣がん患者又は子宮体がん患者の腹水由来の細胞である、上記（１２）に記載の検出方法。
（１４）蛍光標識Ｌ－グルコース誘導体を用いたがん細胞の検出と、パパニコロウ染色、ギムザ染色、ＰＡＳ染色、グロコット染色、又は免疫細胞化学染色に基づいたがん細胞の検出、とからなるがん細胞の二重検出方法であって、
上記（１）～（１３）のいずれか一つに記載の検出方法を行った後、細胞が付着した状態のガラス又はプラスチックプレートを用いて、パパニコロウ染色、ギムザ染色、ＰＡＳ染色、グロコット染色、又は免疫細胞化学染色を行い、次いで、
蛍光に基づいて検出されたがん細胞と、パパニコロウ染色、ギムザ染色、ＰＡＳ染色、グロコット染色、又は免疫細胞化学染色に基づいて検出されたがん細胞を比較すること、
を含む検出方法。
（１５）前記プレートが、細胞を付着させる面と反対の面に細胞の位置情報を示すためのマーキングを有する、上記（１４）に記載の検出方法。
（１６）蛍光標識Ｌ－グルコース誘導体を用いたがん細胞の検出とパパニコロウ染色に基づいたがん細胞の検出とからなるがん細胞の二重検出方法である、前記（１４）又は（１５）に記載の検出方法。
（１７）生体由来細胞の蛍光によるライブイメージング方法であって、以下の工程：
（Ａ）ヒトから採取した試料中に含まれる生きた細胞を、蛍光標識化合物とともにインキュベートする工程、
（Ｂ）細胞内への前記蛍光標識化合物の取り込みを停止する工程、
（Ｃ）前記細胞を薄いガラス又はプラスチックプレート上に付着させる工程、ここで、該プレートは、その表面上に、該細胞を生存状態で維持するための緩衝液を保持するための領域を有する、及び
（Ｄ）前記プレートに付着した細胞を生存状態に維持しながら、細胞内に存在する前記蛍光標識化合物が発する蛍光を検出する工程、
を含むライブセルイメージング方法。
（１８）工程（Ｂ）における細胞内への蛍光標識化合物の取り込みを停止する工程を、蛍光標識化合物を含まない０℃～５℃の緩衝液で細胞を処理することにより行う、上記（１７）に記載のライブセルイメージング方法。
（１９）前記工程（Ｃ）の細胞のプレートへの付着を遠心により行い、遠心後直ちに前記領域に緩衝液を加えることを含む、上記（１７）又は（１８）に記載のライブセルイメージング方法。
（２０）前記プレートの厚さが０．３ｍｍ以下である上記（１７）～（１９）のいずれか一つに記載のライブセルイメージング方法。
（２１）前記プレートの前記領域を取り囲むように設計された緩衝液保持構造体を用いて前記領域での緩衝液の保持を十分なものとすることをさらに含む、上記（１７）～（２０）のいずれか一つに記載のライブセルイメージング方法、ここで、該緩衝液保持構造体は、前記領域に相当する開口部を有するプレート形状又はリング形状の構造体であって、前記緩衝液を保持するのに十分な厚さを有する。
（２２）前記緩衝液保持構造体がシリコーンから作られた厚さ０．５～１０ｍｍの構造体である、上記（２１）に記載のライブセルイメージング方法。
（２３）前記生体由来細胞が、哺乳動物の浮遊細胞液由来の細胞、剥離細胞由来の細胞、又は穿刺吸引細胞由来の細胞である、上記（１７）～（２２）のいずれか一つに記載のライブセルイメージング方法。
（２４）前記生体由来細胞が、ヒト由来の浮遊細胞液から由来する細胞である、上記（２３）に記載のライブセルイメージング方法。
（２５）レーザー共焦点顕微鏡を用いて生きた細胞を観察するための、細胞を生存状態で固定するためのガラス又はプラスチックプレートであって、その表面上に細胞を生存状態で維持するための緩衝液を保持するための領域を有し、厚みが０．３ｍｍ以下である細胞観察用ガラス又はプラスチックプレート。
（２６）前記プレートが、さらに細胞を固定する面とは反対の面に細胞の位置情報を示すためのマーキングを有する上記（２５）に記載の細胞観察用ガラス又はプラスチックプレート。
（２７）上記（２５）又は（２６）に記載のプレートの前記領域を取り囲むように設計された、前記領域での緩衝液の保持を十分なものとするための緩衝液保持構造体であって、前記領域に相当する開口部を有するプレート形状又はリング形状の、シリコーンから作られた厚さ０．５～１０ｍｍの緩衝液保持構造体。
（２８）レーザー共焦点顕微鏡を用いて生きた細胞を観察するための、上記（２５）又は（２６）に記載のガラス又はプラスチックプレートと上記（２７）の緩衝液保持構造体からなる細胞観察用プレートセット。
　本発明の更なる例示的な態様は、以下の通りである。
［１］ヒトから採取した試料を用いたがん細胞の二重検出方法であって、
（ａ）以下の工程を含む試料中に含まれる生きた細胞を用いた蛍光イメージングからなるがんの検出方法：
前記細胞を蛍光標識Ｌ－グルコース誘導体とともにインキュベートして細胞内に取り込まれた該蛍光標識Ｌ－グルコース誘導体を検出すること、ここで、該Ｌ－グルコース誘導体は、蛍光分子団として７－ニトロベンズ－２－オキサ－１，３－ジアゾール基又はその誘導体を分子内に有するＬ－グルコース誘導体である、及び、
前記細胞を薄いガラス又はプラスチックプレート上に付着させた状態で、細胞内に存在する前記Ｌ－グルコース誘導体が発する蛍光を検出すること、ここで、該プレートは、その表面上に、該細胞を生存状態で維持するための緩衝液を保持するための領域を有し、そして、前記Ｌ－グルコース誘導体が発する蛍光が細胞内に検出された場合はその細胞ががん細胞であると判定する、
を含むがん細胞を検出する方法、
及び
（ｂ）以下の工程からなるアルコールまたはホルマリン等の固定液により固定された細胞を用いた染色法からなるがんの検出方法、
前記プレートをエタノールまたはホルマリン等の固定液に浸して細胞を固定した後、パパニコロウ染色、ギムザ染色、ＰＡＳ染色、グロコット染色、及び免疫細胞化学染色からなる群から選ばれるいずれか一つの染色方法によって染色して、がん細胞を検出する方法、
を含むがん細胞の二重検出方法。
［２］前記蛍光イメージングからなるがんの検出方法ａが以下の工程：
（ａ－１）ヒトから採取した試料中に含まれる生きた細胞を、前記蛍光標識Ｌ－グルコース誘導体を含む緩衝液中にてインキュベートし、該Ｌ－グルコース誘導体を取り込ませる工程、
（ａ－２）緩衝液を前記蛍光標識Ｌ－グルコース誘導体を含まない緩衝液に交換して該Ｌ－グルコース誘導体の取り込みを停止する工程、
（ａ－３）前記細胞を薄いガラス又はプラスチックプレート上の細胞付着領域に付着させて固定し、次いで、前記細胞付着領域を含みかつ囲むように構成されプレート上に設けられた、緩衝液を保持するための緩衝液保持領域に緩衝液を入れ、細胞を生存状態に維持する工程、ここで、前記緩衝液保持領域は、細胞が固定されたプレート面と、緩衝液保持領域を取り囲むように設計された緩衝液保持構造体から構成される、
（ａ－４）前記固定した細胞内に存在する前記Ｌ－グルコース誘導体が発する蛍光を検出する工程、及び
（ａ－５）前記蛍光の検出に基づいてがん細胞を検出する工程、
からなる上記［１］に記載の方法。
［３］前記蛍光イメージングからなるがんの検出方法ａが以下の工程：
（ａ－１）ヒトから採取した試料中に含まれる生きた細胞を、薄いガラス又はプラスチックプレート上の細胞付着領域に付着させて固定する工程、
（ａ－２）前記細胞付着領域を含みかつ囲むように構成されプレート上に設けられた、緩衝液を保持するための緩衝液保持領域に緩衝液を入れ、細胞を生存状態に維持する工程、ここで、前記緩衝液保持領域は、細胞が固定されたプレート面と、緩衝液保持領域を取り囲むように設計された緩衝液保持構造体から構成される、
（ａ－３）緩衝液を前記蛍光標識Ｌ－グルコース誘導体を含む緩衝液に交換し、次いで、プレートに固定された細胞をインキュベートし、該Ｌ－グルコース誘導体を取り込ませる工程、
（ａ－４）緩衝液を前記蛍光標識Ｌ－グルコース誘導体を含まない緩衝液に交換して該Ｌ－グルコース誘導体の取り込みを停止し、前記固定した細胞内に存在する前記Ｌ－グルコース誘導体が発する蛍光を検出する工程、及び
（ａ－５）前記蛍光の検出に基づいてがん細胞を検出する工程、
からなる上記［１］に記載の方法。
［４］前記蛍光標識Ｌ－グルコース誘導体が、、２－［Ｎ－（７－ニトロベンズ－２－オキサ－１，３－ジアゾール－４－イル）アミノ］－２－デオキシ－Ｌ－グルコース（２－ＮＢＤＬＧ）と２位にスルホローダミン１０１をスルホンアミド結合した２－アミノ－２－デオキシ－Ｌ－グルコース（２－ＴＲＬＧ）との混合物である、上記［１］～［３］のいずれか一つに記載のがん細胞の二重検出方法。
［５］前記工程（ａ－５）におけるがん細胞の検出において、蛍光イメージングされた細胞の蛍光色調を指標に該細胞の細胞膜損傷状態を判断することをさらに含む、上記［３］又は［４］に記載の検出方法。
［６］前記方法（ｂ）がパパニコロウ染色である、上記［１］～［５］のいずれか一つに記載の検出方法。
［７］前記プレートの厚さが０．３ｍｍ以下である上記［１］～［６］のいずれか一つに記載の検出方法。
［８］前記緩衝液保持構造体は、前記緩衝液保持領域に相当する開口部を有するプレート形状又はリング形状の構造体であって、前記緩衝液を保持するのに十分な厚さを有する、上記［２］～［７］のいずれか一つに記載の検出方法。
［９］前記緩衝液保持構造体がシリコーンから作られた厚さ０．５～１０ｍｍの構造体である、上記［８］に記載の検出方法。
［１０］前記ヒトから採取した試料が、患者の浮遊細胞液由来の細胞、擦過剥離細胞由来の細胞、又は穿刺吸引細胞由来の細胞である、上記［１］～［９］のいずれか一つに記載の検出方法。
［１１］前記細胞が、患者の喀痰、尿、腹水、胸水、心嚢液、脳脊髄液、胆汁、膵液、関節液又は血液から選ばれる浮遊細胞液から由来する細胞である、上記［１０］に記載の検出方法。
［１２］前記細胞が、卵巣がん患者又は子宮体がん患者の腹水由来の細胞である、上記［１１］に記載の検出方法。
［１３］前記プレートが、細胞を付着させる面と反対の面に細胞の位置情報を示すためのマーキングを有する、上記［１］～［１２］のいずれか一つに記載の検出方法。
［１４］レーザー共焦点顕微鏡を用いて生きた細胞を観察するための、細胞観察用ガラス又はプラスチックプレートと緩衝液を保持するための緩衝液保持構造体を含む細胞観察用ガラス又はプラスチックプレート構造体であって、
細胞を生存状態で固定するためのガラス又はプラスチックプレート、ここで、該プレートは、表面上に細胞を生存状態で維持するための緩衝液を保持するための緩衝液保持領域を有し、厚みが０．３ｍｍ以下であり、かつ細胞を固定する面とは反対の面に細胞の位置情報を示すためのマーキングを有する、と、
該緩衝液保持領域にて緩衝液を保持するための緩衝液保持構造体、ここで、該緩衝液保持構造体は、緩衝液保持領域を取り囲むように設計されたプレート形状又はリング形状のシリコーンから作られた厚さ０．５～１０ｍｍの緩衝液保持構造体である、
を含む細胞観察用ガラス又はプラスチックプレート構造体。
　本発明によれば、新たな生体由来細胞を用いたがん細胞の検出方法が提供されるとともに、蛍光標識分子によるライブイメージングを用いたがんの検出方法と、既存のがん細胞の細胞診断法、例えばパパニコロウ染色法やギムザ染色法と組み合わせた、がんの二重検出法が提供される。
本発明の方法で用いたスライドガラスのサイズにカットされたライブセルイメージング用特殊ガラスプレート及び緩衝液保持構造体の例を示した図である。図１Ａは、浮遊細胞を遠心操作でガラス表面に付着させたまま倒立顕微鏡上でライブセルイメージングを行う目的で使用するガラスプレート、ならびにこのガラスプレート上に開口部をもつシリコーンマスク（緩衝液保持構造体）を密着させた例を示している。ガラスプレートの細胞付着領域の裏面には、細胞位置同定用の印字を施して細胞位置の同定を容易にしている。またガラスプレート左上部にはガラスプレートの配向をわかりやすくする切欠きを設けてある。実際に使用する場合は、細胞付着領域の周囲を取り囲むように、ガラスプレート上に市販の免疫組織化学用パップペンで描いた四角い撥水性領域に緩衝液（Ｋｒｅｂｓ－Ｒｉｎｇｅｒ溶液、以後ＫＲＢ溶液と略す）を少量（０．２ｍＬ程度）加え、次に行うマスク装着完了まで細胞を乾燥させないようにする。マスクはシリコーン製で、ガラスプレート上に気泡を生じずに容易に密着させ、また取り外すことが可能である。シリコーンマスクの開口部は、パップペンで描いた四角い撥水性領域より大きく、この開口部に１ｍＬ程度のＫＲＢ溶液を滴下して顕微鏡観察を行う。マスク右端に段差を設け、キーエンス社製スライドガラスホルダーの突出部と干渉しない構造としている。図１Ｂは、ガラスプレート裏面に施された細胞位置同定用に用いる印字部分（マーキング）の拡大図である。文字の大きさは０．５ｍｍ四方で、縦横２ｍｍピッチでガラスプレートの裏面に印字されている様子が示されている。背景のテクスチャーは、透明なガラスプレートにコントラストをつけて見やすくする目的でガラスプレート下に敷いた紙の模様である。図１Ｃは、上記したガラスプレート形状の詳細図である。図１Ｄは、上記した緩衝液保持構造体であるシリコーン製マスク形状の詳細図である。 卵巣がん患者の洗浄腹水細胞のライブセルイメージングの結果である。図２Ａは、卵巣がん（漿液性腺がん）患者の手術時に得られた腹水細胞を生かした状態で顕微鏡観察した明視野像（対物レンズの倍率は１００倍）である。図２Ｂは、１００μＭの２－ＮＢＤＬＧと２０μＭの２－ＴＲＬＧを含有するＫＲＢ溶液適用後の緑色波長域における蛍光顕微鏡画像である。図２Ｃは、上記したＢと同様であるが、赤色波長域における蛍光顕微鏡画像である。図２Ｄは、明視野像と蛍光像の重ね書き画像である。 図３は、子宮体がん（類内膜腺がん）患者の手術時に得られた腹水細胞のライブセルイメージング結果である。図３Ａは、形態観察によるがん細胞の疑いのある二つの生きた細胞塊の明視野像（対物レンズの倍率は４０倍）である。図３Ｂは、１００μＭの２－ＮＢＤＬＧと２０μＭの２－ＴＲＬＧを含有するＫＲＢ溶液適用後の緑色波長域における蛍光顕微鏡画像である。図３Ｃは、上記したＢと同様であるが、赤色波長域における蛍光顕微鏡画像である。図３Ｄは、Ｃにおける画面右側の細胞塊（Ｃｌｕｓｔｅｒ１）の明視野拡大像（対物レンズの倍率は１００倍）である。 図４は、子宮体がん（類内膜腺がん）患者の手術時に得られた腹水細胞のライブセルイメージング結果をその後のパパニコロウ染色結果と対応させた結果である。図４Ａは、図３Ｂにおける画面右側の細胞塊（Ｃｌｕｓｔｅｒ１）の緑色波長域における拡大蛍光顕微鏡画像である。図４Ｂは、図３Ｃにおける画面右側の細胞塊（Ｃｌｕｓｔｅｒ１）の赤色波長域における拡大蛍光顕微鏡画像である。図４Ｃは、図３Ｄ，図４Ａ，図４Ｂの細胞塊（Ｃｌｕｓｔｅｒ１）の明視野像と蛍光像の重ね書き画像である。図４Ｄは、図３Ｄ，図４Ａ，図４Ｂで示した細胞塊（Ｃｌｕｓｔｅｒ１）、すなわち２－ＮＢＤＬＧ陽性で２－ＴＲＬＧ陰性の細胞塊を、パパニコロウ染色した後の明視野像である。 図５は、他の、子宮体がん（類内膜腺がん）患者の手術時に得られた腹水細胞のライブセルイメージング結果をその後のパパニコロウ染色結果と対応させた結果である。図５Ａは、１００μＭの２－ＮＢＤＬＧと２０μＭの２－ＴＲＬＧを含有するＫＲＢ溶液適用後の緑色波長域における蛍光顕微鏡画像（対物レンズの倍率は４０倍）である。図５Ｂは、上記したＡと同様であるが、赤色波長域における蛍光顕微鏡画像である。図５Ｃは、ＡとＢの蛍光像を明視野像に重ね合わせた画像である。図５Ｄは、蛍光染色後に実施したパパニコロウ染色の結果である。 図６は卵巣がん（漿液性腺がん）患者の手術時に得られた腹水細胞の細胞付着領域の全視野ライブセルイメージング結果である。図６Ａは１００μＭの２－ＮＢＤＬＧと２０μＭの２－ＴＲＬＧを含有するＫＲＢ溶液適用前の細胞付着領域全体の緑色波長域における蛍光顕微鏡画像（対物レンズの倍率は４０倍）、赤色波長域における蛍光顕微鏡画像、明視野像の重ね書き画像である。図６Ｂは１００μＭの２－ＮＢＤＬＧと２０μＭの２－ＴＲＬＧを含有するＫＲＢ溶液適用後の緑色波長域における蛍光顕微鏡画像（対物レンズの倍率は４０倍）、赤色波長域における蛍光顕微鏡画像、明視野像の重ね書き画像である。 図７は卵巣がん（漿液性腺がん）患者の手術時に得られた腹水細胞のライブセルイメージング結果である。図７Ａは１００μＭの２－ＮＢＤＬＧと２０μＭの２－ＴＲＬＧを含有するＫＲＢ溶液適用前の緑色波長域における蛍光顕微鏡画像（対物レンズの倍率は４０倍）で、図７Ｃは図７Ａと明視野像の重ね書き画像である。図７Ｂは１００μＭの２－ＮＢＤＬＧと２０μＭの２－ＴＲＬＧを含有するＫＲＢ溶液適用後の緑色波長域の蛍光顕微鏡画像図で、図７Ｄは図７Ｂと明視野像の重ね書き画像である。 図８は卵巣がん（漿液性腺がん）患者の手術時に得られた腹水細胞のライブセルイメージング結果をその後のパパニコロウ染色結果と対応させた結果である。図８Ａは、緑色波長域における蛍光顕微鏡画像で、図８Ｂは赤色波長域における蛍光顕微鏡画像である。図８Ｃは図８Ａ、図８Ｂと明視野像の重ね書き画像である。図８Ｄは図８Ａ、図８Ｂで示した細胞塊、すなわち２－ＮＢＤＬＧ陽性で２－ＴＲＬＧ陰性の細胞塊を、パパニコロウ染色した後の明視野像である。 図９は図８Ｄのパパニコロウ染色の拡大図である。 図１０は子宮体がん（子宮内膜類内膜腺がん）患者の手術時に得られた洗浄腹水細胞の細胞付着領域の全視野ライブセルイメージング結果である。図１０Ａは１００μＭの２－ＮＢＤＬＧと２０μＭの２－ＴＲＬＧを含有するＫＲＢ溶液適用前の細胞付着領域全体の緑色波長域における蛍光顕微鏡画像、赤色波長域における蛍光顕微鏡画像、明視野像の重ね書き画像である。図１０Ｂは１００μＭの２－ＮＢＤＬＧと２０μＭの２－ＴＲＬＧを含有するＫＲＢ溶液適用後の緑色波長域における蛍光顕微鏡画像（対物レンズの倍率は４０倍）、赤色波長域における蛍光顕微鏡画像、明視野像の重ね書き画像である。 図１１は子宮体がん（子宮内膜類内膜腺がん）患者の手術時に得られた洗浄腹水細胞のライブセルイメージング結果である。図１１Ａは１００μＭの２－ＮＢＤＬＧと２０μＭの２－ＴＲＬＧを含有するＫＲＢ溶液適用前の緑色波長域における蛍光顕微鏡画像（対物レンズの倍率は４０倍）で、図１１Ｃは図１０Ａと明視野像の重ね書き画像である。図１１Ｂは１００μＭの２－ＮＢＤＬＧと２０μＭの２－ＴＲＬＧを含有するＫＲＢ溶液適用後の緑色波長域の蛍光顕微鏡画像図で、図１１Ｄは図１０Ｂと明視野像の重ね書き画像である。 図１２は子宮体がん（子宮内膜類内膜腺がん）患者の手術時に得られた洗浄腹水細胞のライブセルイメージング結果をその後のパパニコロウ染色結果と対応させた結果である。図１２Ａは、緑色波長域における蛍光顕微鏡画像で、図１２Ｂは赤色波長域における蛍光顕微鏡画像である。図１２Ｃは図１２Ａ、図１２Ｂと明視野像の重ね書き画像である。図１２Ｄは図１２Ａ、図１２Ｂで示した細胞塊（ａ、ｂ）、すなわち２－ＮＢＤＬＧ陰性で２－ＴＲＬＧ陰性の細胞塊を、パパニコロウ染色した後の明視野像である。 図１３は図１２Ｄのパパニコロウ染色の拡大図である。 図１４は細胞観察用カバーガラスである。中央部にある7ｍｍ×７ｍｍの細胞付着領域の裏面には細胞位置同定用の印字を施して細胞位置の同定を容易にしている。またガラスプレート左上部にはガラスプレートの配向をわかりやすくする切欠きを設けてある。実際に使用する場合は、細胞付着領域の周囲を取り囲むように、ガラスプレート上に市販の免疫組織化学用パップペンで描いた四角い撥水性領域により緩衝液（Ｋｒｅｂｓ－Ｒｉｎｇｅｒ溶液、以後ＫＲＢ溶液と略す）の流出を防ぎ、液量保持効果を発揮する。 図１５は潅流用のシリコーンマスク（緩衝液保持構造体）である。内側部分にあるインナーマスクは細胞付着領域に合わせて開口部を設けており、インナーマスクに密着する形でその外側部分にあるアウターマスクで構成され、潅流時にはインナーマスクを取り外しアウターマスクだけの状態となる。アウターマスクの開口部分は溶液の潅流がよどみなく流れるように魚型になっている。 図１６は潅流ステージ（システムインスツルメンツ社特製）である。中央部分にガラスプレートを設置した際に、ＫＲＢ溶液のＩｎｌｅｔ側とＯｕｔｌｅｔ側の金属管の位置の固定と微調整が可能なようにスライド板が左右に配置されている。潅流ステージは図１５の顕微鏡用培養装置（東海ヒットＩＮＵＧ２－ＫＩＷ）に装着された形で、ＢＺ－Ｘ７００顕微鏡にセットされる。 図１７は顕微鏡用培養装置（東海ヒットＩＮＵＧ２－ＫＩＷ）をＢＺ－Ｘ７００顕微鏡にセットし図１４の潅流ステージを装着後、ガラスプレートを設置しＫＲＢ溶液を潅流中の画像である。
　本発明の一つの態様において、本発明は、生体由来細胞を用いて、薄いガラス又はプラスチックプレートに細胞を付着させて保持するとともに、プレート上に緩衝液を保持する緩衝液保持領域を設けることにより細胞を生存状態に維持しながら、特定の蛍光標識分子を細胞内に取り込ませて細胞内の蛍光標識分子が発する蛍光を検出することにより、がん細胞を検出する方法に関する。
　本発明のがん細胞の検出方法の一つの態様として、以下に記載の生きた細胞を用いた蛍光イメージングからなるがんの検出方法（工程（ａ））をあげることができる。
（ｉ）前記細胞を蛍光標識Ｌ－グルコース誘導体とともにインキュベートして細胞内に取り込まれた該蛍光標識Ｌ－グルコース誘導体を検出すると、ここで、該Ｌ－グルコース誘導体は、蛍光分子団として７－ニトロベンズ－２－オキサ－１，３－ジアゾール基又はその誘導体を分子内に有するＬ－グルコース誘導体である、及び、
（ｉｉ）前記細胞を薄いガラス又はプラスチックプレート上に付着させた状態で、細胞内に存在する前記Ｌ－グルコース誘導体が発する蛍光を検出すること、ここで、該プレートは、その表面上に、該細胞を生存状態で維持するための緩衝液を保持するための領域を有し、そして、前記Ｌ－グルコース誘導体が発する蛍光が細胞内に検出された場合はその細胞ががん細胞であると判定する、
を含むがん細胞を検出する方法。
　本発明のがん細胞の検出方法の一つの態様として、上記工程（ａ）にさらに以下のアルコールまたはホルマリン等の固定液で固定された細胞を用いた染色法（工程（ｂ））を含むがん細胞の二重検出方法をあげることができる。
（ｂ）前記プレートをエタノール固定液に浸して細胞を固定した後、パパニコロウ染色、ギムザ染色、ＰＡＳ染色、グロコット染色、及び免疫細胞化学染色からなる群から選ばれるいずれか一つの染色方法によって染色して、がん細胞を検出する方法。
　前記工程ａにおいて用いることができる、蛍光分子団として７－ニトロベンズ－２－オキサ－１，３－ジアゾール基又はその誘導体を分子内に有するＬ－グルコース誘導体は、本発明者らによる特許出願である特許出願ＷＯ２０１０／０１６５８７号公報、およびＷＯ２０１２／１３３６８８号公報に具体的に開示されている。例えば、これに限定されないが、２－［Ｎ－（７－ニトロベンズ－２－オキサ－１，３－ジアゾール－４－イル）アミノ］－２－デオキシ－Ｌ－グルコース（２－ＮＢＤＬＧ）、４－デオキシ－４－［Ｎ－（７－ニトロベンズ－２－オキサ－１，３－ジアゾール－４－イル）アミノ］－Ｌ－グルコース（４－ＮＢＤＬＧ）、６－デオキシ－［Ｎ－（７－ニトロベンズ－２－オキサ－１，３－ジアゾール－４－イル）アミノ］－Ｌ－グルコース（６－ＮＢＤＬＧ）、２－デオキシ－２－［Ｎ－７－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノスルホニル）ベンズ－２－オキサ－１，３－ジアゾール－４－イル）アミノ］－Ｌ－グルコース（２－ＤＢＤＬＧ）などが挙げられる。特に好ましいＬ－グルコース誘導体は、２－ＮＢＤＬＧである。
　前記工程（ａ）におけるインキュベーション温度は、２２～３７．５℃、好ましくは３６～３７．５℃、より好ましくは約３７℃にて行う。ここで、約３７℃とは、３６．６℃～３７．５℃を意味する。前記工程（ａ）におけるインキュベーション時間は、細胞の状態、用いる蛍光標識Ｌ－グルコース誘導体の種類、又は検出条件等により適宜選択されるが、通常は、１５分以内、好ましくは３～１５分、より好ましくは３～５分で行う。
　前記工程（ａ）における、Ｌ－グルコース誘導体の取り込みの停止は、細胞の生存状態を維持でき、かつ、細胞によるＬ－グルコース誘導体の能動的取り込みを停止できる方法が選択され、例えば、（ｉ）細胞を低温状態に置く、（ｉｉ）Ｌ－グルコース誘導体を含まない緩衝液に交換する、（ｉｉｉ）Ｌ－グルコース誘導体の取り込みを阻害する薬剤を加える、を挙げることができる。（ｉ）としては、例えば、細胞を０℃に冷却した緩衝液中に置くことを挙げることができる。（ｉｉ）としては、Ｌ－グルコース誘導体を含まない緩衝液に交換する際に不含緩衝液で洗浄する工程を加えるのが好ましく、また、不含緩衝液を灌流させることにより交換することも可能である。（ｉｉｉ）としては、例えば、２－ＮＢＤＬＧの取り込み阻害剤である水チャンネル阻害剤、例えばフロレチンを細胞溶液に添加することを挙げることができる。
　本発明においては、細胞を生存状態で維持しながら固定した状態で蛍光観察を行うことが特徴であり、細胞を固定して蛍光観察するための支持体として、表面上に該細胞を生存状態で維持するための緩衝液を保持するための領域（緩衝液保持領域）を有する薄いガラス又はプラスチックプレート構造体（以下、単に「ガラス又はプラスチックプレート」、「ガラスプレート」、「プラスチックプレート」、又は「プレート」という場合がある）を用いることを特徴とする。
　本発明で用いることができるガラスプレートは、レーザー共焦点顕微鏡等を用いて細胞から発する蛍光を検出できるものであれば特に制限がなく、公知のガラスプレート、例えば、薄いガラスプレート（例えば、カバーガラス）を本発明での使用に適したように加工したものを用いることができる。
　本発明で用いることができるプラスチックプレートは、レーザー共焦点顕微鏡等を用いて細胞から発する蛍光を検出するために、無蛍光又は低蛍光の物質から作られたプラスチックプレートである。これに限定されないが、例えば、ＣｒｙｓｔａｌＣｌｅｎｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ社）や、Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｖｅ　Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ　Ｃｏｖｅｒｓｌｉｐｓ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ　Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、セルデスクＬＦ等（住友ベークライト（株）製）の自己蛍光の低いプラスチック製カバースリップをあげることができる。
　本発明で用いることができるガラス又はプラスチックプレートは、レーザー共焦点顕微鏡等を用いて個々の細胞から発する蛍光を検出するために、薄いことが必要であり、例えば、０．３ｍｍ以下、好ましくは０．２ｍｍ以下、特に好ましくは０．１２～０．２０ｍｍの厚さを挙げることができる。これは一般には、細胞観察の際に、スライドガラスに載せるカバーガラスとして用いるガラスの厚さである。本明細書では、本発明の方法で用いる薄いガラスプレートを、ライブセルイメージング用特殊カバーガラス、或いは単にガラスプレートという場合がある。
　なお、細胞の詳細（形態等）を蛍光イメージングするのではなく、細胞から発する蛍光を検出する目的であれば、ガラス又はプラスチックプレートの厚さは１ｍｍでもよい。
　ガラス又はプラスチックプレート表面上の細胞を生存状態で維持するための緩衝液を保持するための領域（以下、「緩衝液保持領域」という場合がある）とは、プレート上に緩衝液を保持でき、プレート傾けても容易に流れ出さないように構成されている領域である。このような領域の形は特に制限なく、例えば、四角、円形、楕円形、魚型、等の形をあげることができる。このようなプレートとしては、これに限定されないが、緩衝液保持領域を囲むように撥水性領域がプレート上に作成又は印刷されたガラス又はプラスチックプレート、又は、緩衝液保持領域を囲むように液の流出を防止する構造体（好ましくは、撥水性物質、例えばシリコーンからなる構造体）をプレート上に設置したガラス又はプラスチックプレートを挙げることができる。前者としては、これに限定されないが、緩衝液保持領域を取り囲むように撥水性インキが印刷されたガラス又はプラスチックプレートを挙げることができる。後者におけるこのような構造体は、前もってガラス又はプラスチックプレート上に設置されていても、又は、ガラス又はプラスチックプレートに細胞を付着又は固定した後に設置してもよいし、さらには、ガラス又はプラスチックプレートと一体となっていてもよい。
　なお、緩衝液保持領域は、細胞を固定する細胞付着領域を含みかつそれを囲むように構成されるが、緩衝液保持領域は、細胞付着領域と、ほぼ同じ大きさであっても或いはそれ比べて数倍以上の大きさであっても良い。但し、十分な量の緩衝液の中で細胞を維持するために、緩衝液保持領域は細胞付着領域に対し、好ましくは２倍以上、さらに好ましくは５倍以上であるが、一方、好ましくは１０倍以内である。
　本発明で用いるガラス又はプラスチックプレートは、細胞を付着する面とは反対の面に、細胞の位置情報を示すためのマーキングを有していてもよい。このプレート裏面の印、記号・文字・線等は、細胞の可視光ならびに蛍光観察に支障をきたさない大きさ、形、光学的特性を備え、可能であれば水溶液、有機溶媒、摩擦等により容易に消失しないものであることが望ましい。シルクスクリーン等の技術を用いて熱によりインクの文字パターンを固着させて用いると小さい文字の判読も可能で上記の水や有機溶媒に対する強度もあり良好である。ガラスプレートの場合は、ダイアモンドナイフを用いて印をつけ、もしくは適切な強度とパルスレーザー等を用いてガラスプレートの裏面、もしくはガラスプレートの内部に溝や窪みを加工することで実現してもよい。これにより、細胞の観察が容易となるほか、後に記す本発明の一態様である二重検出法において細胞の特定が可能となる。
　本発明の検出方法においてはさらに、ガラス又はプラスチックプレートの緩衝液保持領域を取り囲むように設計された緩衝液保持構造体（本明細書中では「マスク」とも言う）を用いて前記領域での緩衝液の保持を十分なものとすることもできる。このようなマスクとしては、前記領域に相当する開口部を有するプレート形状又はリング形状の構造体をあげることができるが、好ましくはプレート形状である。マスクの厚みは、上記の目的に叶うものであればよく、マスクの素材は、ガラス又はプラスチック表面に気泡を生じずに容易に密着させることが可能であれば特に制限がないが、加えて、無蛍光であることが望ましい。
　マスクの厚さは、これに制限されないが、０．５～１０ｍｍ、好ましくは１～５ｍｍ、より好ましくは２～５ｍｍ、さらに好ましくは２～３ｍｍを挙げることができ、マスクの素材は、これに限定されないが、例えば、シリコーンなどの樹脂、プレートへの密着性をあげるためのコーティングを施した金属をあげることができる。また、マスクの開口部は、ガラスにマスクを密着させる途中で細胞付着領域にマスクが接触せず、かつ、取り付け・取り外しが容易であることが望ましい。例えば、図１又は図１４のように成形した厚さ２ｍｍのシリコーン樹脂を用いることもでき、取り付け・取り外しが容易であるように手でもてるような突起を設けてもよい。
　マスクの形は、図１又は図１４のように、上下左右が非対称で、マスクの一端がガラスプレートの辺縁と一致するようにしてガラスプレート上に装着できるように設計すれば、いつも同じ位置に開口部がくることとなり、誤って細胞の上にマスクをかぶせてしまうような恐れがなくなる。
　図１においては、細胞付着領域と緩衝液保持領域がほぼ同じ大きさであり、マスクの開口部もまた細胞付着領域とほぼ同じ大きさとなっている。図１４は、細胞付着領域に比べて緩衝液保持領域が大きくなっており（約５倍）、緩衝液保持領域に対応するマスクの開口部（アウターマスクの開口部）も細胞付着領域に比べて大きい。図１４の例においては、インナーマスクの開口部が細胞付着領域とほぼ同じ大きさである。
　かん流に用いるマスク（緩衝液保持構造体）は、配向が容易にわかるよう上下左右非対称でかつガラスプレート上に表記したサンプル名等を隠さない大きさとし、ガラスプレート上に気泡を生じずに容易に密着させることが可能で、また細胞に影響を与えずに容易に取り外すことが可能な構造とした。本マスクは入れ子構造となっており、（ｉ）細胞付着領域と同サイズの開口を持つインナーマスクと、（ｉｉ）インナーマスクを填め込むことが可能で且つインナーマスクを取り外しやすい間隙を設けた形状の開口を持つアウターマスクで構成される。
　（ｉ）インナーマスクの開口部は細胞付着領域を含みそれをかつ囲むように構成され、前もってアウターマスクと組み合わせてガラス又はプラスチックプレートに密着させ、遠心操作時は細胞付着領域以外への細胞の流出を防ぐものである。遠心操作の後にインナーマスクは取り除くが、インナーマスクの開口に保持されていた緩衝液が細胞付着領域の外に流出し、細胞が乾燥してしまう可能性がある。そのため、撥水性の囲みを細胞付着領域の外周上又はその外側に設けることが好ましい。
　（ｉｉ）アウターマスクの開口は、細胞付着領域と撥水性の囲みを含みかつそれを囲むように構成されるが、細胞付着後にインナーマスクを外し、開口を塞がないサイズのカバーガラスを貼りつけた状態でＫＲＢ溶液によるかん流を開始した場合、Ｉｎｌｅｔから流入したＫＲＢ溶液がＯｕｔｌｅｔ側へ流出し、かつ過剰に流入させた場合にもＩｎｌｅｔ側に溢れるのではなくＯｕｔｌｅｔ側に溢れていくような形状（以下、「魚型開口」という）とした。
　また、本マスクのガラスプレート上への正確な取り付けを可能にするため、マスクとガラスプレートを相互に一定の位置関係で密着することを助けるような適切な治具を作製して用いることも効果的である。マスクの形状は、スライドガラスを使用して永久標本を作製する際に、フロスト部分に接触せず、かつ日付、サンプル名等が隠れないように、もしくは容易に判読できることが望ましい。これはマスクのサイズを図１の例のように、サンプル名称記載部分を覆わないようなやや小さなサイズとすることで実現してもよいが、上記したシリコーン製マスクを用いた場合には、シリコーンマスクの下の文字の判読も容易であるため、必ずしも小さくする必要はない。
　このような構造体を、前記の緩衝液保持領域を囲むように液の流出を防止する構造体として用いることも可能であり、係る場合は、このような構造体を設置したガラスプレートは、本発明の、その表面上に細胞を生存状態で維持するための緩衝液を保持するための領域を有するガラスプレートに該当する。
　工程ａにおいて、細胞はガラスプレートのほぼ中央に位置する細胞付着領域（例えば、図１における、疎水性領域の内側の領域）に固定される。工程（ａ）におけるガラスプレートへの細胞の付着は、これに限定されないが、遠心等により行うことができる。遠心の条件は適宜選択できるが、例えば、室温にて、細胞へのダメージが少ない遠心力にて行うことができる。また、本発明の方法は、自動細胞収集装置（オートスメア装置等）と組み合わせて用いることも可能であり、それにより、容易に細胞を収集しガラスプレートへと付着できる。
　本発明の他の一つの態様において、本発明の方法は、蛍光標識Ｌ－グルコース誘導体が、蛍光分子団として７－ニトロベンズ－２－オキサ－１，３－ジアゾール基又はその誘導体を分子内に有するＬ－グルコース誘導体と、２位にスルホローダミン１０１をスルホンアミド結合した２－アミノ－２－デオキシ－Ｌ－グルコース（２－ＴＲＬＧ）との混合物である、前記がん細胞の検出方法である。
　細胞膜に損傷を受けた細胞は、仮にがん細胞であったとしても、あるいは非がん細胞（正常細胞を含む）であったとしても、蛍光標識グルコース誘導体が非特異的に細胞内に侵入する。上記の蛍光標識Ｌ－グルコース誘導体の混合物を用いることにより、このような細胞膜に損傷を受けた非がん細胞に蛍光標識グルコース誘導体が非特異的に取り込まれる場合を、がん細胞における取り込みと識別することができる。
　腹水細胞や尿中にある細胞は、本来細胞生存に適さないと考えられる環境にあるため、完全な生細胞と完全な死細胞の中間状態にある細胞の数が多い。これらの細胞の一部は細胞膜の透過性が亢進しているが、細胞は死んでいない。こうした細胞の状態を的確に捉えることはがん細胞を検出する上で重要な情報を与える。
　２－ＴＲＬＧという立体的に中程度のかさ高さと適度な脂溶性を有する蛍光基と、Ｌ－グルコースという水溶性でかつＧＬＵＴに結合しない分子を分子内に併せ持つ誘導体を用いることにより、様々な状態の細胞の判定識別が可能となるという特徴を発揮する。これに対して従来から知られているｐｒｏｐｉｄｉｕｍ　ｉｏｄｉｄｅやＤＡＰＩなど細胞膜損傷部から細胞内に侵入して核に不可逆的に結合する分子を用いた場合や単にかさの大きなデキストラン等に蛍光基を結合した分子を用いる等した場合には、細胞状態の違いを正確に表現することができない。すなわち、大型で赤色の蛍光基テキサスレッドを結合した蛍光Ｌ－グルコース誘導体２－ＴＲＬＧと緑色の蛍光基ＮＢＤを結合した２－ＮＢＤＬＧとを同時にがん細胞に適用することで、細胞が蛍光標識Ｌ－グルコース誘導体を取り込む様子の違いを、緑色から赤色に至る連続的な蛍光カラーをもって識別することを可能にしている。これは従来の蛍光分子プローブによる細胞診技術に見られない大きな特徴である。
　また、本発明のがん細胞の検出方法における蛍光の検出は、公知の方法に従って行うことができる。また本発明による細胞の検出は、直接的に蛍光観察によっても、あるいは蛍光をフォトコンバージョン法によりＤＡＢ黒などに変換した上、光学顕微鏡や電子顕微鏡観察によっても計測でき、細胞機能の異常の程度を、定性的のみならず、適切な基準値を設定することにより、定量表現や機械化が可能である。
　本発明のがん細胞の検出方法において、対象とする生体由来細胞は、がんが疑われる患者から由来する細胞であれば特に限定されないが、例えば、患者の浮遊細胞液由来の細胞、擦過剥離細胞由来の細胞、又は穿刺吸引細胞由来の細胞を挙げることができる、好ましくは、浮遊細胞液由来の細胞である。浮遊細胞液は、これに限定されないが、例えば、患者の喀痰、尿、腹水、胸水、心嚢液、脳脊髄液、胆汁、膵液、関節液又は血液から得ることができる。擦過剥離細胞としては、これに限定されないが、例えば、子宮頸部、子宮体部、膣壁、外陰部や気管支鏡下で気管支表面などから綿棒やブラシで擦って採取した擦過細胞をあげることができる。穿刺吸引細胞としては、これに限定されないが、甲状腺、乳腺、唾液腺、肝臓、皮下、リンパ節などにできた腫瘍に針を刺して吸引した細胞をあげることができる。
　また、本発明のがん細胞の検出方法において対象とするがんの種類は、細胞が採取できる限り特に限定されず、例えば、卵巣がん、子宮体がん、子宮頸がん、等の婦人科のがんや、胃がん、大腸がん、胆道がん、膵臓がん、食道がん等の消化器系のがん、肺がん等の呼吸器系のがん、甲状腺がんや乳がん、膀胱がん、腎盂がん、尿管がん、前立腺がん等の尿路系のがん、白血病、悪性リンパ腫等の造血器悪性腫瘍、中枢神経系に浸潤した悪性腫瘍等、脳脊髄液を対象とするがん等を挙げることができる。
　腹水由来の浮遊細胞を用いる例としては、例えば、卵巣がん、子宮体がん、胃がん、大腸がん、胆道がん、膵臓がん、又は食道がんの患者の腹水由来の細胞をあげることができる。その他、胸水由来の浮遊細胞を用いる例としては、肺がん等の呼吸器系のがん、甲状腺がん、乳がんを、尿由来の細胞を用いる例としては、膀胱がん、腎盂がん、尿管がん、前立腺がん等の尿路系のがんをあげることができる。血液の細胞を用いる例としては、白血病、悪性リンパ腫等の造血器悪性腫瘍をあげることができる。擦過剥離細胞由来の細胞を用いる例としては、子宮頸がん、子宮内膜がん、口腔内のがん等あげることができる。穿刺吸引細胞由来の細胞を用いる例としては、乳腺と甲状腺のがんをあげることができる。
　本発明のがん細胞の検出方法において用いることができる緩衝液は、生体由来細胞を生存状態に適切に維持できる緩衝液であれば特に制限なく用いることができる。これに限定されないが、例えば、ＫＲＢ溶液、培養液（例えばＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　ｍｅｄｉｕｍ　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ）、臓器保存液（Ｓａｖｉｏｓｏｌ、ＵＷ保存液）等をあげることができる。
　以下、本発明による蛍光標識Ｌ－グルコース誘導体を用いたライブセルイメージングとパパニコロウ染色による二重検出法を例に、本発明の検出方法の一連の工程について以下に記載するが、本発明はこれに限定されるものでなく、また、本発明の目的を脱しない範囲において公知の技術等を用いて種々の変更が可能である。
　生体から採取した細胞検体を、血餅を生じにくいＣａ，Ｍｇ－ｆｒｅｅ Ｈａｎｋｓ溶液等の適切な緩衝液に懸濁させて検査室に移送する。直ちに作業を開始できない場合、冷暗所で室温保存することにより、細胞検体入手の翌日に蛍光標識Ｌ－グルコース誘導体の適用および観察を実施することも可能である。また、血球が多量に含まれる場合は、ペレットの上部（通称バフィーコート）を採取し、あるいは細胞診検体前処理で通常行われる溶血操作や、血餅除去操作を加えることも可能である。
以下、細胞に２－ＮＢＤＬＧと２－ＴＲＬＧを処理した後に、細胞をガラスプレート上に付着させ、その後、蛍光を観察することによりがんを検出する態様について説明する。
　遠心操作により細胞の存在する沈殿と上清とに分ける。遠心条件は検査施設で通常用いている方法によればよいが、細胞を生かした状態で維持するため、短時間で必要最小限の遠心操作を行うのが好ましい。例えば６５０Ｇ－１５００Ｇ，１ｍｉｎ－２ｍｉｎの間で１回もしくは２回行えばよい。ペレットに少量のＫＲＢ溶液を加えて細胞を分散し、直ちに次の染色操作を開始しても良く、また多量の緩衝液を加えて染色操作まで最大２４時間程度保存することも可能である。後者では染色操作の前に、再度遠心操作を行う。
　ＫＲＢ溶液に、２－ＮＢＤＬＧと２－ＴＲＬＧを終濃度の二倍の濃度となるように溶解して混合し、３７度で温め、準備しておく（ｘ２ｆＬＧ溶液）。ここで、目的に応じてＫＲＢ溶液に阻害剤を加えておくことが可能である。例えば、これに限定されないが、２－ＮＢＤＬＧのギャップ結合/ヘミチャネル通過による取り込みを除外する目的で、ギャップ結合阻害剤Ｃａｒｂｅｎｏｘｏｌｏｎを加えておくことが好ましい。細胞入りのＫＲＢ溶液を、上記であらかじめ用意した等量のｆＬＧ溶液と混和することにより、一定時間ｆＬＧと接触させ、細胞にｆＬＧを取り込ませる。接触時間や温度条件等は公知の文献によればよい（ＷＯ２０１２／１３３６８８号公報参照）。大過剰の冷ＫＲＢ溶液（０℃）を加えることで、ｆＬＧ取り込みを停止させ、０℃で遠心により溶液中のｆＬＧを取り除く。溶液中のｆＬＧの濃度が十分下がるまで、必要に応じてこのプロセスを繰り返しても良い。冷ＫＲＢ溶液を用いることで、再現性の高いｆＬＧ取り込みプロセスを実現できる。
　適量の冷ＫＲＢ溶液に細胞を浮遊させ、上記したガラス又はプラスチックプレート表面に遠心操作で細胞を付着させる。この遠心プロセスには、市販の細胞遠心機能を利用した自動細胞収集装置を利用すれば比較的容易に達成可能である。遠心は細胞を乾燥させないため短時間であることが望ましく（１－２ｍｉｎ程度）、遠心終了後は直ちにＫＲＢ溶液を細胞付着領域に少量加える。
　以下、細胞をガラスプレート上に付着させた後に、細胞に２－ＮＢＤＬＧと２－ＴＲＬＧを処理し、細胞内にとりこまれた蛍光を観察することによりがんを検出する態様について説明する。
　緩衝液に懸濁させて移送された細胞検体には血球が多量に含まれる場合があるが、細胞を生かした状態で維持しながら溶血作業を行わずとも効率よく関心細胞を収集するために、二重遠心法を用いることが可能である。はじめに、大半の赤血球は沈殿するが関心細胞は沈殿しない様な回転数、例えば２００Ｇ－４００Ｇ，１－３ｍｉｎの間で１回遠心を行い、関心細胞が存在している上清をすべて回収する。次いで回収した上清を、全ての細胞を沈殿させる様な回転数、例えば５００Ｇ－６５０Ｇ，１－３ｍｉｎの間で１回遠心を行い、上清のうち、赤血球を多量に含むペレットの上部の溶液を１ｍＬ－２ｍＬ採取する。直ちに次の操作を開始しても良く、また多量の緩衝液を加えて最大２４時間程度保存することも可能である。後者では操作の前に、再度６５０Ｇ－１５００Ｇ，１ｍｉｎ－２ｍｉｎの間で１回遠心操作を行う。
　ＫＲＢ溶液に、２－ＮＢＤＬＧと２－ＴＲＬＧを終濃度となるように溶解して混合し、３７度で温め、準備しておく（ｆＬＧ溶液）。ここで、目的に応じてＫＲＢ溶液に阻害剤を加えておくことが可能である。例えば、これに限定されないが、２－ＮＢＤＬＧのギャップ結合/ヘミチャネル通過による取り込みを除外する目的で、ギャップ結合阻害剤Ｃａｒｂｅｎｏｘｏｌｏｎを加えておくことが好ましい。
　０．３ｍＬ／ｍｉｎ－１．４ｍＬ／ｍｉｎの速度でかん流を行い、上記であらかじめ用意したｆＬＧ溶液を流すことにより、一定時間ｆＬＧと接触させ、細胞にｆＬＧを取り込ませる。接触時間や温度条件等は公知の文献によればよい（ＷＯ２０１２／１３３６８８号公報参照）。ｆＬＧ溶液からＫＲＢ溶液へかん流を切り替えることによって、ｆＬＧ取り込みを停止させ、溶液中のｆＬＧを取り除く。溶液中のｆＬＧの濃度が十分下がるまでかん流を５ｍｉｎ－１５ｍｉｎの間で行った後に、適用後の細胞の蛍光を観察することが可能である。細胞の撮影は関心細胞を個別に撮影するのではなく、細胞付着領域全域をひと視野ずつ順に撮影し、観察終了後に貼り合わせを行うことが可能なタイリング撮影を用いることで、あとから全範囲を見直すことが可能となり、関心細胞の見落とし防止が実現できる。また、かん流によるｆＬＧ溶液適用の前に、細胞の自家蛍光を観察することが可能であり、ｆＬＧ適用前後の画像を用いて、細胞が蛍光標識Ｌ－グルコース誘導体を取り込んだか否かをより正確に判じることが可能である。
　
　採取した細胞浮遊液を、上記したガラス又はプラスチックプレート表面に遠心操作で細胞を付着させる。この遠心プロセスには、市販の細胞遠心機能を利用した自動細胞収集装置を利用すれば比較的容易に達成可能である。遠心は細胞を乾燥させないように注意を払う必要があるが、遠心中に液体を漏らさない緩衝液保持構造体（例えば、シリコーンマスク）であれば１０ｍｉｎまでは可能である。遠心終了後はＫＲＢ溶液を細胞付着領域に少量加え細胞の乾燥を防ぐ。
　以下、ガラス又はプラスチックプレート、及び蛍光観察後の染色法について説明するが、これらの内容は、蛍光物質の観察を、ガラスプレート上に細胞を付着させる前に行う場合又は付着させた後に行う場合のいずれの態様において用いる場合にも当てはまる。
　本発明で使用するガラス又はプラスチックプレートは、細胞付着領域の裏面に、関心細胞の近傍に印をつけることで細胞位置の同定に役立てることができる。この目的で、使用するプレートの細胞付着領域の裏面に、あらかじめ判別可能な記号・文字、線等がガラス裏面に印字もしくは刻印したものを用いることで細胞位置の同定が容易でまた正確になる。
　使用するガラス又はプラスチックプレート表面の細胞付着領域は、遠心操作後にも細胞が生存できるように、緩衝液を一定量維持できる構造とすることが重要となる。この目的で、操作中の細胞の乾燥を防ぎ、細胞が常に緩衝液に浸っているようにする為、細胞付着領域周囲をあらかじめシリコーン等の撥水性物質で囲んでおくことが効果的であり、このことで検査士の経験や技量によらずに細胞を乾燥させることなく操作できることが可能となる。
　また、操作中にプレートの表裏や上下左右の向きが容易にわかるように、プレートの四隅の一か所を斜めにカットしておくと配向が明瞭となる。
　プレート上の細胞付着領域に存在する目的細胞の蛍光および明視野観察には、通常の倒立蛍光顕微鏡を用いることができ、室温下で少なくとも１時間程度、がん細胞であるか否かを判断するために蛍光観察後に実施するパパニコロウ染色に支障をきたすような細胞形態の変化なく観察する事が可能である。顕微鏡観察中には、上下左右に頻繁にガラスプレートを動かしながら視野を変えていくため、目的細胞上に添加した緩衝液が動きやすく、これは電動ステージを用いる場合には特に著しい。また、緩衝液が蒸発することによる細胞への影響を最小限とする必要がある。これらの目的で、細胞付着領域周囲にある撥水性の囲みと同程度かそれより大きい開口部を設けたマスク（緩衝液保持構造体）をガラス面上に密着させ、観察時間を考慮した適切な量の緩衝液をこの開口部に添加することで、長時間の顕微鏡観察中にも乾燥や浸透圧の変化を防ぐことができる。
　蛍光観察後は、細胞付着領域にエタノール等の固定液を加えることにより細胞固定を行う。固定液により細胞がはがれないように、固定液を添加してしばらく後にマスクを外し、次いでガラスプレートを固定液漕内に静置して更に固定を継続しても良い。固定の後、常法によりパパニコロウ染色、ギムザ染色などの一般の細胞染色を本ガラスプレートを用いて行い、これにスライドガラスを張り合わせて永久標本とした後、通常と同様の病理細胞診断を実施することが可能である。
　前項に述べたパパニコロウ染色、ギムザ染色などの一般的な細胞染色を行った結果と、蛍光標識Ｌ－グルコース誘導体による蛍光観察結果との同一細胞での比較は、前記したガラスプレート裏面の記号・文字・線等を利用して目的細胞のガラスプレート上の位置を知ることで実現できるが、顕微鏡写真を撮っておけばより精確である。また、電動ＸＹステージを用いて、目的細胞の上での位置を記憶させてもよいが、その場合にはステージ上でのガラスプレートの向きや位置を、観察時にいつも同じように保持するための適切なホルダーが必要となる。このホルダーは、薄いガラスプレートを損傷せずに、簡便かつ正確に固定できる構造を有することが求められ、また顕微鏡倍率によっては、ガラスプレートの形状の公差の範囲内で誤差を補正する必要もある。いずれにせよ、手動ステージを用いる場合にも、電動ステージを用いる場合にも、前記したガラスプレート裏面の記号・文字・線等は、目的細胞付近の視野を繰り返し迅速確実に見出し、かつこれらの記号・文字・線との相対的な位置関係から目的細胞を正確かつ容易に検出することを可能にする信頼性の高い方法として役立つ。
　本発明のがん細胞の検出方法においては、蛍光を用いた顕微鏡観察によりがん細胞の検出を行うので、従来法による顕微鏡観察では他の細胞に隠れて見過ごされたがん細胞を見つけ出すことが可能となる。これにより、見逃しによる誤陰性を低減させて診断精度を向上させることが可能となる。また、蛍光によりがん細胞の検出が可能となるため、蛍光を発する細胞から優先的に観察することで注意すべき細胞の見逃しの軽減に役立てることができ、検査業務の効率化を図り、検査士の負担を軽減することが可能となる。さらに、蛍光検出を用いた本発明の方法は、検出の機械化も可能となる。
　また、本発明のがん細胞の検出方法においては、生きた細胞の機能的な異常の有無という情報をもとにがん細胞の検出を行うので、専ら細胞の形態的な異常情報のみに基づいて判定していた従来の細胞判定とは質的に異なる情報に基づく判断が可能となる。
　本発明の別の一つの態様において、本発明のがん細胞の検出方法は、上記した蛍光標識Ｌ－グルコース誘導体を用いたがん細胞の検出と、常法である細胞診染色である、パパニコロウ染色、ギムザ染色、又は免疫細胞化学的染色等（以下、単に「がん細胞診染色」という場合がある）に基づいたがん細胞の検出、を組み合わせたがん細胞の二重検出方法に関する。
　上記した特定の蛍光標識Ｌ－グルコース誘導体を用いたがん細胞の検出方法は、細胞を生存状態に維持したままガラス又はプラスチックプレート上においてがん細胞の検出が行えるので、それに次いで、プレート上に付着した細胞を、さらに、上記がん細胞診染色を用いてがん細胞の検出を行うことができ、二重の検出法に基づくがん診断が行える。
　係る場合、プレートに細胞の位置情報を示すためのマーキングをつけておけば、本発明に基づく蛍光標識Ｌ－グルコース誘導体を用いて検出したがん細胞と、次いで行うがん細胞診染色によって検出したがん細胞とが、同じ細胞であるかを判断することが可能となり、同じ細胞について、細胞の機能異常に基づくがん細胞の検出と、細胞の形態異常又はマーカー検出に基づくがん細胞の検出とを組み合わせて行うことが可能となる。
　このように、本発明のがん細胞の二重検出方法においては、蛍光観察後の細胞を固定した後、パパニコロウ染色等の一般的染色方法あるいは免疫細胞化学的手法等を使用して染色し、蛍光観察した細胞と同一細胞でこれらの従来技術による染色結果との比較を可能にする方法であることから、従来技術による細胞形態情報に蛍光観察による細胞機能情報を加えることで、細胞状態に対する情報が質・量共に増え、診断精度の向上が図れ、さらには、観察細胞を絞ることができるために見逃しも軽減される。これにより、より精度の高いがん診断が可能となる。
　本発明において用いることができるがん細胞診染色としては、細胞をガラスプレートに固定化した後に細胞を染色してがんを検出する公知の方法をあげることができる。これに限定されないが、例えば、パパニコロウ染色、ギムザ染色、ＰＡＳ染色、グロコット染色、がん特異的マーカーに対する抗体を用いた免疫細胞化学染色をあげることができ、好ましくはパパニコロウ染色である。これらの染色法は、公知の常法に基づいて行うことができる。
　良悪鑑別の為の抗体を用いた免疫細胞化学染色としては、例えば、ｐ５３、ＷＴ－１（Ｗｉｌｍ’ｓ　ｔｕｍｏｒ－１）、ＩＭＰ３、Ｋｉ－６７、ＥＭＡ（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ａｎｔｉｇｅｎ）、ＣＥＡ、ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ、ｄｅｓｍｉｎ、ｃａｌｒｅｔｉｎｉｎ、Ｄ２－４０（ｐｏｄｏｐｌａｎｉｎ）、ＴＴＦ－１（ｔｈｙｒｏｉｄ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ）、ＣＤ４５、ＣＤ１４６等をあげることができる。
　本発明の一つの態様において、本発明は、生体由来細胞を用いて、緩衝液を保持することができる領域を有する薄いガラス又はプラスチックプレートに細胞を付着させて保持することにより、細胞を生存状態に維持しながら蛍光標識分子を細胞内に取り込ませて細胞内の蛍光標識分子が発する蛍光を検出することによるライブセルイメージング方法である。
　本発明のライブセルイメージング方法の一つの態様として、以下の工程からなる方法をあげることができる。
（工程Ａ）ヒトから採取した試料中に含まれる生きた細胞を、蛍光標識化合物とともにインキュベートする工程、
（工程Ｂ）細胞内への前記蛍光標識化合物の取り込みを停止する工程、
（工程Ｃ）前記細胞を薄いガラス又はプラスチックプレート上に付着させる工程、ここで、該プレートは、その表面上に、該細胞を生存状態で維持するための緩衝液を保持するための領域を有する、及び
（工程Ｄ）前記プレートに付着した細胞を生存状態に維持しながら、細胞内に存在する前記蛍光標識化合物が発する蛍光を検出する工程。
　なお工程Ｃにおけるガラス又はプラスチックプレートが、その表面上に細胞を生存状態で維持するための緩衝液を保持するための領域を有するのは、細胞の付着に先立ってであっても、或いは、細胞の付着後であってもよいが、好ましくは、細胞の付着に先立ってそのような領域を有するプレートが用いられる。
　前記工程Ａにおいて用いることができる、蛍光標識分子は、生きた細胞内に能動的に取り込まれる蛍光標識分子であれば特に制限がなく、ライブセルイメージングの目的に応じて、適宜選択可能である。
　これに限定されないが、例えば、哺乳動物細胞のグルコーストランスポーターを通過して、放射性標識Ｄ－グルコース誘導体に匹敵するキネティクスをもって細胞内に取り込まれる、蛍光基である７－ニトロベンズ－２－オキサ－１，３－ジアゾール基（ＮＢＤ）で標識した２－アミノ－２－デオキシ－Ｄ－グルコース（２－ＮＢＤＧ）をあげることができる（非特許文献１：Yamada et al., J. Biol. Chem. 275: 22278-83, 2000）。
　前記工程Ａにおけるインキュベーションは、温度は、２２～３７．５℃、好ましくは３６～３７．５℃、より好ましくは約３７℃にて行う。インキュベーション時間は、目的及び用いる蛍光標識分子に応じて適宜選択されるが、一般には、１５分以内、好ましくは３～１５分、より好ましくは３～５分で行う。
　前記工程Ｂにおける蛍光標識分子の取り込みの停止は、本発明のがん細胞の検出方法において用いられる方法が用いられる。
　また、本発明のライブセルイメージング方法におけるガラス又はプラスチックプレート、プレートへの細胞の付着、緩衝液保持構造体、緩衝液、蛍光検出方法その他については、本発明のがん細胞の検出方法との関連で記載された上記内容がそのまま本発明のライブセルイメージング方法においても適用できる。
　本発明の別の態様は、本発明のがん細胞の検出方法及び／又は細胞のライブセルイメージング方法に用いることができる薄いガラス又はプラスチックプレートである。
　本発明のまた別の態様は、そのようなガラス又はプラスチックプレートに適用できる、プレート上で緩衝液の保持を十分なものとするための緩衝液保持構造体である。
　本発明の他の別の態様は、上記ガラス又はプラスチックプレートと上記緩衝液保持構造体を組み合わせた細胞観察用プレートセットである。
　以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。
　なお、実験は、弘前大学大学院医学研究科倫理委員会承認を経て、インフォームドコンセントを得た被験者に対して行った。
実施例１：卵巣がん患者の洗浄腹水細胞の蛍光標識Ｌ－グルコース誘導体を用いたイメージング
（実験方法）
（１）腹水の調整
　卵巣がん（漿液性腺がん）の開腹手術開始直後、腹水採取の目的で腹腔内を生理食塩水で洗浄して得られた洗浄腹水の余剰分を５０ｍＬの遠沈管に採取した。次いで１５００Ｇ，２ｍｉｎ室温にて遠心後、上清をデカンテーションで除去した後、Krebs Ringer Buffer（ＫＲＢ溶液、下記参照）を２ｍＬ加えてペレットを分散させ、腹水細胞浮遊液とした。
（１－１）ＫＲＢ溶液
ＮａＣｌ　１２９．０ｍＭ，ＫＣｌ　４．７５ｍＭ，ＫＨ2ＰＯ4　１．１９ｍＭ，ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ　１．１９ｍＭ，ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ　１．０ｍＭ，ＮａＨＣＯ3　５．０２ｍＭ，Ｄ－Ｇｌｕｃｏｓｅ　５．６ｍＭ，ＨＥＰＥＳ　１０．０ｍＭ（１Ｍ　ＮａＯＨを適量加えｐＨ７．３５に調整）。ｇａｐ　ｊｕｎｃｔｉｏｎ／ｈｅｍｉｃｈａｎｎｅｌを経由する蛍光標識グルコースの出入りを阻害する目的で０．１ｍＭ　Ｃａｒｂｅｎｏｘｏｌｏｎｅ（Ｓｉｇｍａ，＃Ｃ４７９０）を加えた。なおＫＲＢ溶液は、蛍光標識Ｌ－グルコース誘導体（以下、「ｆＬＧ」と略す場合がある。）溶液を作成するための溶液として使用した。
（２）卵巣がん手術時に得られた腹水細胞への蛍光標識Ｌ－グルコース誘導体の適用
　上記した腹水細胞浮遊液を５０ｍＬ遠沈管に１ｍＬとり、下記のｘ２ ｆＬＧ溶液を１ｍＬ加えて混和し、３７℃ウォーターバス中で５ｍｉｎ間ｆＬＧを細胞に接触させた。その後、０℃の冷ＫＲＢ溶液３８ｍＬを加えることで、細胞へのｆＬＧの取り込みを停止させ、０℃にて１５００Ｇ ２ｍｉｎ間の遠心を行い、上清をデカンテーションで除去することで溶液中のｆＬＧ濃度を低下させた。ペレットに再度上記冷ＫＲＢ溶液 ４０ｍＬを加えて細胞を分散させ、０℃にて１５００Ｇ １ｍｉｎ間、遠心を行った後、上清を取り除いて、冷ＫＲＢ溶液 ５ｍＬに細胞を分散させた。
（２－１）ｘ２ ｆＬＧ溶液の調製
　２－ＮＢＤＬＧと２－ＴＲＬＧの混合溶液（ｆＬＧ溶液）は、それぞれ２－ＮＢＤＬＧが２００μＭ、２－ＴＲＬＧが４０μＭとなるように、ＫＲＢ溶液に特許文献ＷＯ２０１２／１３３６８８に記載した方法で溶解して作製した。
（３）遠心操作によるガラスプレートへの腹水細胞の付着ならびに細胞の生存維持
　市販の自動細胞収集装置ＣＦ－１２Ｄ（サクラファインテックジャパン株式会社製）を用い、本装置専用の６ｍＬチャンバーセット（サクラファインテックジャパン株式会社製、プラスチック製チャンバー、金属製チャンバーホルダー、専用ペーパーフィルターから成る）に、スライドガラスのサイズにカットされたガラスプレート（図１Ｃ）をあらかじめセットしておいた。次いで、（２）で作製したｆＬＧ適用後の腹水細胞浮遊液 ５ｍＬを上記ＣＦ－１２Ｄ専用プラスチック製チャンバーに移し、室温にて１４００ｒｐｍ １ｍｉｎ間の遠心を行った。
　遠心終了後、すばやくガラスプレートを取り出し、直ちに細胞付着領域に０．２ｍＬのＫＲＢ溶液を加えることで乾燥を防いだ。次いで、細胞付着領域に相当する部分に開口部を設けたシリコーン樹脂製マスク（図１Ｄ参照）をガラスプレート上に密着させ、ＫＲＢ溶液を更に１ｍＬ程度細胞付着領域に加えることで、ライブセルイメージング中の細胞維持に十分な量の緩衝液を確保できるようにした。
（３－１）ライブセルイメージング用特殊カバーガラス（以後「ガラスプレート」と呼ぶ）
　ガラスプレートには、松浪硝子工業株式会社製のＮｏ．１Ｓ（厚み０．１６－０．１９ｍｍ）を図１Ａおよび１Ｃに示すように２６ｍｍＸ７６ｍｍのサイズに切断したものを用いた。また、表裏上下左右の判別を容易にする目的で、ガラスプレートの左上の角を斜めにカットした。このガラスプレートの斜めの切欠きは、顕微鏡ステージ上にセットして用いるキーエンス社製スライドガラスホルダーに、スライドガラスの代わりに薄く割れやすい本ガラスプレートを装着する際、ホルダー側の爪でガラスプレートを破損せず、かつホルダー上にガラスプレートをセットする際の位置の誤差によって細胞の同定が困難にならない程度のサイズとした。また、本ガラスプレート上の細胞付着領域の周囲を取り囲むように、あらかじめ市販の免疫組織化学用パップペン（大道産業製スーパーパップペンリキッドブロッカー等）を用いて四角い撥水性領域を設け、自動細胞収集装置を用いた腹水浮遊細胞の遠心操作終了後、細胞を乾燥させないように少量（０．２ｍＬ）のＫＲＢ溶液を加えて貯留できる構造とした（図１Ｃ）。このパップペンで描いた領域は、蛍光観察後に封入する際に封入剤に含まれるキシレンで洗い流され、パパニコロウ観察の邪魔にならない。
（３－２）緩衝液保持用シリコーンマスク（緩衝液保持構造体）
　緩衝液保持の目的でガラスプレート上に密着させて用いるマスク（緩衝液保持構造体）は、厚さ２ｍｍのシリコーン製で、配向が容易にわかるよう上下左右非対称でかつガラスプレート上に表記したサンプル名等を隠さない大きさとし、ガラスプレート上に気泡を生じずに容易に密着させることが可能で、また細胞に影響を与えずに容易に取り外すことが可能な構造とした（図１Ａおよび１Ｄ）。マスクの装着および取り外し操作は、上部に設けた４ｍｍほどの突出部を手で持って行う。シリコーンマスクの開口部は、細胞付着領域周囲にパップペンで施した囲みよりわずかに大きいサイズとしている。１ｍＬ程度のＫＲＢ溶液を滴下するためのものである。マスクは厚く、疎水性であるため、顕微鏡観察中の電動ステージ等による俊敏なＸＹＺの動きによってもＫＲＢ溶液がこぼれない。また顕微鏡観察が長時間にわたる場合は、必要に応じてＫＲＢ溶液を随時補充することが可能な構造としており、細胞状態を良好に保ちながら観察することが可能である。マスク右端には段差が設けられている。この段差は、顕微鏡ステージ上にセットして用いるキーエンス社製スライドガラスホルダーに、スライドガラスの代わりにシリコーンマスクを密着させたガラスプレートを装着する際に、ホルダー側の突出部と厚いシリコーンマスクとが干渉しない構造としている。
（４）画像取得
　蛍光観察にはオールインワン蛍光顕微鏡ＢＺ－Ｘ７００（キーエンス株式会社）を用いて専用スライドガラスホルダーにガラスプレートをセットして次のような手順で観察撮影を行った。まずガラスプレート上の細胞付着領域の全域をＸ２０レンズ（下記）を用いて明視野下に検鏡した。本標本中にごく少数みられたがん細胞の可能性のある細胞を撮影した。対象細胞は、Ｘ４０ないしはＸ１００の高倍で明視野画像ならびに蛍光画像を取得した。蛍光検出には、ＢＺ－Ｘ７００用の市販フィルタを用い、２－ＮＢＤＬＧ蛍光観察用にＢＺ－Ｘ用ＧＦＰフィルタ（緑チャネル、ＯＰ－８７７６３、Ｅｘ ４７０／４０ ｎｍ、Ｅｍ ５２５／５０ ｎｍ、ＤＭ ４９５ ｎｍ）を、また２－ＴＲＬＧ蛍光観察用にＢＺ－Ｘ ＴＲＩＴＣフィルタ（赤チャネル、ＯＰ－８７７６４、Ｅｘ ５４５／２５ ｎｍ、Ｅｍ ６０５／７０ ｎｍ、ＤＭ ５４５ ｎｍ）を用いた。
このため、本実施例の２－ＮＢＤＬＧ蛍光観察に用いたＧＦＰフィルタは２－ＴＲＬＧによる蛍光をほとんど透過せず２－ＮＢＤＬＧの取り込みを反映した評価が可能であるが、２－ＴＲＬＧ蛍光観察用に用いたＴＲＩＴＣフィルタは、励起光が２－ＴＲＬＧのみならず２－ＮＢＤＬＧをもわずかに励起する。このため、２－ＮＢＤＬＧ蛍光が強い場合には、赤チャネルに２－ＴＲＬＧに起因する蛍光に加えて、２－ＮＢＤＬＧに起因する蛍光もわずかにみられ、結果の解釈においては注意が必要である。この問題は、２－ＴＲＬＧ専用に設計された５６５ｎｍ付近の励起光を用いる蛍光フィルタを利用することで大きく軽減することが可能である。なお実施例で用いた撮影条件は下記の通りである。
ｘ２０レンズ　（ＣＦＩ　Ｐｌａｎ　Ａｐｏ　λ２０Ｘ、＃９７２０３２、ＮＡ　０．７５、ＷＤ　１．００　ｍｍ）
　　明視野画像：モノクロ、高感度、透過照明光量２５、開口絞り２０％、露光時間１／２５００ ｓｅｃ
ｘ４０レンズ（ＣＦＩ　Ｐｌａｎ　Ａｐｏ　λ４０ｘ、＃９７２０３３、ＮＡ　０．９５、ＷＤ　０．２５－０．１６ｍｍ）
　　明視野画像：高感度、透過照明光量２５、開口絞り２０％、露光時間１／３００ｓ
　　緑色蛍光画像：高感度、励起光量１００％、露光時間１／１．５ｓ
　　赤色蛍光画像：高感度、励起光量１０％、露光時間１／４ｓ
ｘ１００レンズ（ＣＦＩ　Ｐｌａｎ　Ａｐｏ　λ１００ｘ，　＃９７２０３７、ＮＡ　１．４５、ＷＤ　０．１３ｍｍ、油浸）　使用時
　　明視野画像：高感度、透過照明光量２５、開口絞り２０％、露光時間１／５０ｓ
　　緑色蛍光画像：高感度、励起光量１００％、露光時間１／１０ｓ
　　赤色蛍光画像：高感度、励起光量１０％、露光時間１／１０ｓ
（実験結果）
　得られたイメージング画像を図２に示す。図２Ａは、卵巣がん（漿液性腺がん）患者の手術時に得られた腹水細胞を生かした状態で顕微鏡観察した明視野像（対物レンズの倍率は１００倍）である。形態観察から、がん細胞の疑いのある細胞（画面中央の実線で囲まれた細胞）ならびに正常な腹膜中皮細胞とみられる細胞（画面右上にある破線で囲まれた細胞）を認める。図２Ｂは、１００μＭの２－ＮＢＤＬＧと２０μＭの２－ＴＲＬＧを含有するＫＲＢ溶液適用後の緑色波長域における蛍光顕微鏡画像である。形態的にがん細胞の疑いのある画面中央の細胞（実線）は、２－ＮＢＤＬＧに由来する強い蛍光を発しているのに対し、画面右上の腹膜中皮細胞とみられる細胞（破線）は２－ＮＢＤＬＧの蛍光を発していない。図２Ｃは、上記したＢと同様の画像である。ただし、赤色波長域における蛍光顕微鏡画像である。画面左側にある細胞の破片（Ｄｅｂｒｉｓ）が２－ＴＲＬＧに由来する強い赤色蛍光を発しているのに対して、形態的にがん細胞の疑いのある画面中央の細胞（実線）も、画面右上の腹膜中皮細胞とみられる細胞（破線）もこのような赤色蛍光を発していないことから、Ｂでがん細胞の疑いのある細胞に認められた２－ＮＢＤＬＧ蛍光が細胞膜損傷に起因する取り込みによってもたらされたものであるとは考えにくい。なお、がん細胞の疑いのある画面中央の細胞の示すわずかな赤色蛍光は、強い２－ＮＢＤＬＧ蛍光の長波長側の裾野（非特許文献１参照）が、使用した市販オールインワン型蛍光顕微鏡の蛍光フィルタを通過した成分を反映したと考えられる。図２Ｄは、明視野像と蛍光像の重ね書き画像である。緑色蛍光を発する２－ＮＢＤＬＧががん細胞の疑いのある細胞に選択的に取り込まれ、正常細胞である腹膜中皮細胞には取り込まれていない様子、ならびに左側の細胞破片が赤色蛍光を発する２－ＴＲＬＧで染色されている様子が明瞭である。
実施例２：子宮体がん患者の腹水細胞に蛍光標識Ｌ－グルコース誘導体を適用したライブセル蛍光イメージングと、固定後に行ったパパニコロウ染色結果の対応
　子宮体がん患者の手術時に得られた腹水細胞に蛍光標識Ｌ－グルコース誘導体を適用し、ライブセル蛍光イメージングを行い、次いで、同じ試料を用いて、細胞を固定後にパパニコロウ染色を行った。そして、両者の結果の対応を行った。
（実験方法）
（１）腹水の調整
　子宮体がん（類内膜腺がん）の開腹手術開始直後、実施例１と同様の方法で腹腔内を生理食塩水で洗浄して得られた洗浄腹水を、あらかじめＨａｎｋｓ溶液５ｍＬを入れておいた５０ｍＬ遠沈管に加えた。得られた腹水浮遊液を１５００Ｇ，２ｍｉｎ室温で遠心後、上清をデカンテーションで除去した。次いで、溶血用市販塩化アンモニウム溶液３０ｍＬを加え、２分間静置した後、１５００Ｇ，２ｍｉｎ室温で遠心後、上清をデカンテーションで除去した。このペレットのうち、病院病理部で細胞診検査に使用する部分をとった余剰分を更に２分割して、それぞれＫＲＢ溶液４０ｍＬの入った５０ｍＬ遠沈管に分散させ、翌日のｆＬＧの適用まで暗所で室温保管した。
　翌日（腹水細胞入手の約２０時間後）、細胞浮遊液４０ｍＬの入った５０ｍＬ遠沈管を６００Ｇ，１ｍｉｎ，室温で遠心後、上清をデカンテーションで廃棄し、ペレットにＫＲＢ溶液を１ｍＬ加えて再分散させた。
（２）蛍光標識Ｌ－グルコース誘導体の子宮体がん腹水細胞への適用
　実施例１（２－１）と同様にして調整した ｘ２ ｆＬＧ溶液を１ｍＬ加えて混和し、３７℃ウォーターバス中で５ｍｉｎ間ｆＬＧを細胞に接触させた。その後、０℃の冷ＫＲＢ溶液３８ｍＬを加えることで、細胞へのｆＬＧの取り込みを停止させ、０℃にて６００Ｇ，１ｍｉｎ間の遠心を行い、上清をデカンテーションで除去することで溶液中のｆＬＧ濃度を低下させた。さらに冷ＫＲＢ溶液４０ｍＬに細胞を再分散させ、再度６００Ｇ，１ｍｉｎ間遠心を行った後上清を除き、冷ＫＲＢ溶液１０ｍＬに腹水細胞を分散させた。
（３）遠心操作によるガラスプレートへの腹水細胞の付着ならびに生存維持方法
　実施例１と同様にして行った。ただしガラスプレート上での細胞位置同定をより容易にするため、細胞付着領域の裏面にあらかじめ耐水性のペンで印を３点つけたガラスプレートを用いた。なお、細胞位置をより簡単に知る目的で、ガラスプレートの細胞付着領域の裏面に、あらかじめ細胞位置同定用の印字を２ｍｍ間隔で施しておくことも可能である。これにより、細胞位置の同定ははるかに容易になる。
（４）画像取得条件
　腹水細胞入手の約２２時間後、実施例１と同一機器を用いて観察および撮影を行った。ガラスプレート上の細胞付着領域の全域を明視野下にＸ１０レンズ（下記）を用いて検鏡し、目的細胞は、ガラスプレートの裏面につけたマーカーと同一視野で撮影しておき、パパニコロウ染色後の細胞位置の同定に利用できるようにした。次いで目的細胞の高倍レンズを用いた明視野画像ならびに蛍光画像を取得し、ＢＺ－Ｘ７００用専用ソフトウェアでステージ上での位置情報登録を行った。用いた撮影条件は下記の通りである。
ｘ１０レンズ（ＣＦＩ　Ｐｌａｎ　Ａｐｏ　λ１０ｘ、＃９７２０３１、ＮＡ　０．４５、ＷＤ　４．００　ｍｍ）
　　明視野画像：モノクロ、高感度、透過照明光２５、開口絞り２０％、露光時間１／４５００ｓ
ｘ４０レンズ使用時
　　明視野画像：高感度、透過照明光量２５、開口絞り２０％、露光時間１／３００ｓ
　　緑色蛍光画像：高感度、励起光量１００％、露光時間１／４ｓ
　　赤色蛍光画像：高感度、励起光量１０％、露光時間１／１０ｓ
ｘ１００レンズ使用時
　　明視野画像：高感度、透過照明光量２５、開口絞り２０％、露光時間１／５０ｓ
　　緑色蛍光画像：高感度、励起光量１００％、露光時間１／４ｓ
　　赤色蛍光画像：高感度、励起光量１０％、露光時間１／１０ｓ
（５）パパニコロウ染色ならびに観察
　蛍光観察後、９９．５％エタノールを満たした容器中にガラスプレートを浸漬し、５ｍｉｎ静置した後にシリコーンマスクを外した。エタノール固定後、常法によりパパニコロウ染色を行い、通常とは上下逆に、ガラスプレート上にスライドガラスを貼り合わせて封入し、永久標本とした。蛍光観察時に撮影した目的細胞を、ステージ上での登録位置情報を基に同一視野で明視野観察するため、ガラスプレートとスライドガラスを貼り合わせる際、両者の端を正確に揃えて封入した。染色後の観察は、通常の正立顕微鏡を用いてマーカーを目印に大まかに視野を調べた後、ＢＺ－Ｘ７００オールインワン蛍光顕微鏡に登録させた位置情報をもとに再度視野の同定を行い、ｘ４０レンズで観察し、撮影した。用いた撮影条件は、明視野カラー、高解像度、透過照明光量２５、開口絞り２０％、露光時間１／１．５ｓである。
（実験結果）
　子宮体がん（類内膜腺がん）患者の手術時に得られた腹水細胞のライブセルイメージング結果をその後のパパニコロウ染色結果と対応させた結果を図３及び図４に示す。図３Ａは、形態観察からがん細胞の疑いのある二つの生きた細胞塊の明視野像（対物レンズの倍率は４０倍）を示している。腹水入手翌日（約２０時間後）にｆＬＧを適用し、約２２時間後に撮影したものである。画面右上の黒い部分は、ガラスプレート裏面に記された位置判別用の印の一部である。図３Ｂは、１００μＭの２－ＮＢＤＬＧと２０μＭの２－ＴＲＬＧを含有するＫＲＢ溶液適用後の緑色波長域における蛍光顕微鏡画像である。画面左と右の二つのがん細胞塊のいずれも、２－ＮＢＤＬＧに由来する蛍光を発していることが判る。図３Ｃは、Ｂと同様であるが、赤色波長域における蛍光顕微鏡画像である。画面左側の細胞塊が２－ＴＲＬＧに由来する赤色蛍光を発しており、Ｂでがん細胞の疑いのある細胞に認められた２－ＮＢＤＧ蛍光には細胞膜損傷に起因する取り込みによってもたらされたものが含まれることを示唆しているのに対して、画面右側の細胞塊（Ｃｌｕｓｔｅｒ１）は２－ＴＲＬＧに由来する赤色蛍光を発しておらず、２－ＮＢＤＬＧ蛍光が細胞膜損傷に起因する取り込みによってもたらされたものであるとは考えられない。図３Ｄは、Ｃにおける画面右側の細胞塊（Ｃｌｕｓｔｅｒ１）の明視野拡大像（対物レンズの倍率は１００倍）である。図４Ａは、図３Ｂにおける画面右側の細胞塊（Ｃｌｕｓｔｅｒ１）の緑色波長域における拡大蛍光顕微鏡画像である。核を除いた細胞質部分に２－ＮＢＤＬＧが取り込まれている様子がわかる。図４Ｂは、図３Ｃにおける画面右側の細胞塊（Ｃｌｕｓｔｅｒ１）の赤色波長域における拡大蛍光顕微鏡画像である。２－ＴＲＬＧに由来する赤色蛍光は認められない。図４Ｃは、図３Ｄ，図４Ａ，図４Ｂの細胞塊（Ｃｌｕｓｔｅｒ１）の明視野像と蛍光像の重ね書き画像である。図４Ｄは、図３Ｄ，図４Ａ，図４Ｂで示した細胞塊（Ｃｌｕｓｔｅｒ１）、すなわち２－ＮＢＤＬＧ陽性で２－ＴＲＬＧ陰性の細胞塊を、パパニコロウ染色した後の明視野像である。これは、細胞診断学上の分類では典型的な腺がん細胞の核様態ならびに細胞集合様態の特徴を示している細胞塊であると認められる。
実施例３：子宮体がん患者の腹水細胞に蛍光標識Ｌ－グルコース誘導体を適用したライブセル蛍光イメージングと、固定後に行ったパパニコロウ染色結果の対応
　子宮体がん患者の手術時に得られた腹水細胞に蛍光標識Ｌ－グルコース誘導体を適用したライブセル蛍光イメージングを行い、次いで、同じ試料を用いて、細胞を固定後にパパニコロウ染色を行った。そして、両者の結果の対応を行った。そこで、反応性中皮細胞と判定された細胞を認めた例である。
（実験方法）
（１）腹水の調整
　子宮体がんの開腹手術開始直後、実施例１と同様の方法で腹腔内を生理食塩水で洗浄して得られた洗浄腹水を、あらかじめＨａｎｋｓ溶液５ｍＬをいれておいた５０ｍＬ遠沈管に加えた。得られた腹水浮遊液を１５００Ｇ，２ｍｉｎ室温で遠心後、上清をスポイトを用いて除去した。このペレットのうち、病院病理部で細胞診検査に使用する部分をとった余剰分をＫＲＢ溶液１５ｍＬの入った１５ｍＬ遠沈管に分散させ、再度１５００Ｇ，２ｍｉｎ室温で遠心した後、上清をスポイトを用いて除去した。ペレットの大部分は赤血球であったが、多量の赤血球が目的細胞を覆い隠すため検鏡の妨げとなる。遠沈管の底には比重の大きい赤血球が沈殿し、その上に目的細胞や白血球、血小板などの成分を含む層（バフィーコート）を形成するため、赤血球量を抑える目的でバフィーコートを含むペレットの上部１／３程度をスポイトで採取し、ＫＲＢ溶液１５ｍＬの入った５０ｍＬ遠沈管に分散させ、ｆＬＧの適用まで暗所で室温保管した。
　細胞浮遊液１５ｍＬの入った５０ｍＬ遠沈管を６００Ｇ，１ｍｉｎ室温で遠心後、上清をデカンテーションで廃棄し、ペレットにＫＲＢ溶液を１ｍＬ加えて再分散させた。
（２）蛍光標識Ｌ－グルコース誘導体の子宮体がん腹水細胞への適用
　実施例１（２－１）と同様にして調整した ｘ２ ｆＬＧ溶液を１ｍＬ加えて混和し、３７℃ウォーターバス中で５ｍｉｎ間ｆＬＧを細胞に接触させた。その後、０℃の冷ＫＲＢ溶液３８ｍＬを加えることで、細胞へのｆＬＧの取り込みを停止させ、０℃にて６５０Ｇ，１ｍｉｎ間の遠心を行い、上清をデカンテーションで除去することで溶液中のｆＬＧ濃度を低下させた。さらに冷ＫＲＢ溶液４０ｍＬに細胞を再分散させ、再度６５０Ｇ，１ｍｉｎ間遠心を行った後上清を除き、冷ＫＲＢ溶液１０ｍＬに腹水細胞を分散させた。
　なお、遠心操作によるガラスプレートへの腹水細胞の付着ならびに生存維持方法、パパニコロウ染色ならびに観察は、実施例２と同様の方法で行った。
　画像取得条件は、ｘ４０レンズを使用し、下記の通りとした。
　　明視野画像：高感度、透過照明光量２５、開口絞り２０％、露光時間１／５００ｓ
　　緑色蛍光画像：高感度、励起光量１００％、露光時間１／４ｓ
　　赤色蛍光画像：高感度、励起光量１０％、露光時間１／１０ｓ
（実験結果）
　図５は、ライブセル蛍光イメージングとパパニコロウ染色の結果確認された反応性中皮細胞を含む領域を拡大して示したものである。図５Ａは、１００μＭの２－ＮＢＤＬＧと２０μＭの２－ＴＲＬＧを含有するＫＲＢ溶液適用後の緑色波長域における蛍光顕微鏡画像（対物レンズの倍率は４０倍）である。白線で囲まれた関心領域に存在する細胞群が２－ＮＢＤＬＧに由来する蛍光を発している。関心領域の右にある強い蛍光は、緑色蛍光を持つ不溶性物体である。図５Ｂは、Ａと同様であるが、赤色波長域における蛍光顕微鏡画像である。関心領域の細胞群は２－ＴＲＬＧに由来する赤色蛍光を発しておらず、２－ＮＢＤＬＧ蛍光が細胞膜損傷に起因する取り込みによってもたらされたものであるとは考えられない。図５Ｃは、ＡとＢの蛍光像を明視野像に重ね合わせた画像である。図５Ｄは、蛍光染色後に実施したパパニコロウ染色の結果である。Ａ－Ｃにおいて白線で囲まれた関心領域に存在する細胞群は、反応性中皮細胞と思われる核様態ならびに細胞集合様態の特徴を示している細胞群であると認められる。本例のような腹水由来の細胞診検体に、Ｎ／Ｃ比が大きい細胞群が認められた場合には、核の大小不同の有無や極性、核小体やクロマチンの様態、細胞自体の大きさ、あるいは細胞の集合形態等を総合して、反応性中皮細胞と判断するか、あるいはがんに移行する可能性が疑われる異常を呈している細胞と判断するか、あるいは判断が難しいケースとするか、診断に主観的要素が強く含まれる。言い換えると、どこまでが反応性中皮で、どこからががんに移行する可能性が疑われる異常を呈している細胞かの線引きが、検査士や細胞診専門医により幅があると言ってよい。本発明により、専ら細胞の形態的な異常情報のみに基づいて判定していた従来の細胞判定とは質的に異なる情報が得られ、がんの経過や予後を調べることで、このような細胞の良悪鑑別に役立つ情報を与えることができる。
（実施例４）
実施例４：卵巣がん患者の原液腹水細胞に潅流法により蛍光標識Ｌ－グルコース誘導体を適用したライブセル蛍光イメージングと、固定後に行ったパパニコロウ染色結果の対応
　卵巣がん患者の手術時に得られた腹水細胞に蛍光標識Ｌ－グルコース誘導体を適用し、ライブセル蛍光イメージングを行い、次いで、同じ試料を用いて、細胞を固定後にパパニコロウ染色を行った。そして、両者の結果の対応を行った。
（実験方法）
（１）腹水の調整
　卵巣がん（漿液性腺がん）の開腹手術開始直後、腹腔内より採取された腹水原液の余剰分を、あらかじめＨａｎｋｓ溶液５ｍＬをいれておいた５０ｍＬ遠沈管に加えた。得られた腹水浮遊液について竹串でフィブリンの有無を確認した後、メッシュに通して脂肪、不純物を取り除いた。次いで５０ｍＬ遠沈管２本に半量ずつ分注し、１５００Ｇ，２ｍｉｎ室温で遠心後、２本の遠沈管それぞれの上清を、電動ピペットを用いて液面側から静かに７．５ｍＬまで取り除き、さらにスポイトを用いて１ｍＬを残して除去した。遠沈管底部には赤血球等を含む沈殿層が存在するが、その上表面から１ｍＬ分を沈殿層の赤血球を吸わないようにスポイトとマイクロピペットを用いて採取し、腹水細胞浮遊液とした。
（２）遠心操作によるガラスプレートへの腹水細胞の付着ならびに生存維持方法
　市販の自動細胞収集装置ＣＦ－１２Ｄ（サクラファインテックジャパン株式会社製）を用い、ガラスプレートへの腹水細胞の付着を行った。具体的には、本装置専用の１ｍＬチャンバーセット（サクラファインテックジャパン株式会社製、プラスチック製チャンバー）に、２５．７ｘ７５．０ｍｍのサイズにカットされたガラスプレート（図１４）に、潅流用シリコーンマスク（図１５、アウターマスクとインナーマスクから構成される）を密着させたものを予めセットしておいた。次いで、（１）で調整した腹水細胞浮遊液１ｍLを上記ＣＦ－１２Ｄ専用プラスチック製チャンバーに移し、室温にて１４００ｒｐｍ １ｍｉｎ間の遠心を行った。
遠心終了後、すばやくガラスプレートを取り出し、直ちに細胞付着領域にＫＲＢ溶液を加えることで乾燥を防いだ。次いで、細胞付着領域に相当する部分に開口部を設けたインナーマスクを取り除き、更にＫＲＢ溶液をアウターマスクの魚型開口部に加えることでライブセルイメージング中の細胞維持に十分な量の緩衝液を確保できるようにした。かん流をスムーズに行うため、魚型開口部を完全にふさがない程度の大きさのカバーガラス（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ ＭＩＣＲＯ ＣＯＶＥＲ ＧＬＡＳＳ：２２ｘ２２ｍｍ）を密着させた後、かん還流ステージへの装着までの間、湿潤箱に入れて保管した。
（２－１）かん流用ライブセルイメージング用特殊カバーガラス（ガラスプレート）
　ガラスプレートには、松浪硝子工業株式会社製のＮｏ．１Ｓ（厚み０．１６－０．１９ｍｍ）を図１Ａ(要変更)および１Ｃ(要変更)に示すように２５．７ｍｍｘ７５．０ｍｍのサイズに切断したものを用いた。また、表裏上下左右の判別を容易にする目的で、ガラスプレートの左上の角を斜めにカットした。このガラスプレートの斜めの切欠きは、顕微鏡ステージ上にセットして用いるシステムインスツルメンツ社製の特注かん流ステージへ、薄く割れやすい本ガラスプレートを装着する際、位置の誤差によって細胞の同定が困難にならない程度のサイズとした。
（２－２）かん流用シリコーンマスク（緩衝液保持構造体）
　緩衝液保持の目的でガラスプレート上に密着させて用いるマスクは、厚さ０．５ｍｍのシリコーン製で、配向が容易にわかるよう上下左右非対称でかつガラスプレート上に表記したサンプル名等を隠さない大きさとし、ガラスプレート上に気泡を生じずに容易に密着させることが可能で、また細胞に影響を与えずに容易に取り外すことが可能な構造とした（図１４および図１５）。本シリコーンマスクは、細胞付着領域と同サイズの開口を持つインナーマスクと、インナーマスクを填め込むことが可能な魚型の開口を持つアウターマスクの、入れ子構造となっている。インナーマスクの開口部は細胞付着領域を囲む枠線と同じサイズとしており、遠心操作による細胞付着の際に、細胞付着領域以外への細胞の流出を防ぐものである。アウターマスクの魚型開口は、細胞付着後に開口を塞がないサイズのカバーガラスを貼りつけることで、魚の頭側をＩｎｌｅｔ、尾側をＯｕｔｌｅｔとした時に、Ｉｎｌｅｔから流入する溶液が自然とＯｕｔｌｅｔ側に溢れ出し、Ｉｎｌｅｔ側には溢れ出ない様な過不足のないかん流を可能とするものである。
（３）ガラスプレートの潅流ステージへの装着と潅流
　腹水細胞浮遊液の調整が済むまでに、顕微鏡用培養装置（東海ヒットＩＮＵＧ２－ＫＩＷ）をＢＺ－Ｘ７００にセットした後、潅流ステージ（図１６、図１７）を装着したうえで、潅流ポンプ（ＩＳＭＡＴＥＣ）と潅流ラインを接続した。かん流にはＫＲＢ溶液を用い、供給元の溶液瓶を４０℃のウォーターバス内で予め加温することで、溶液に溶け込んだ気泡がかん流ライン内に入らない様にした。また、ラインの始まりにタコ管トラップを設けることで、さらに気泡の流入を防いだ。潅流ステージの上にはダミーのガラスプレートを載せてＫＲＢ溶液の潅流を行い、流速が０.７ｍＬ/ｍiｎにおいて細胞付着部分の温度が３７.０±０．５℃になるように設定した。具体的には、顕微鏡用培養装置のトップヒータ、バスヒータの温度を設定することで装置内の温度を一定とし、さらに培養装置内の水路に４０ｍＬ程度の水を注いで同時に加温し、この中に細いステンレスの管を這わせてＫＲＢ溶液を通すことで、予め細胞に到達する前のＫＲＢ溶液を温めた。
細胞の付着したガラスプレートを、かん流用シリコーンマスクの魚型開口部の頭にあたる部分が潅流装置のＩｎｌｅｔ側に、開口部の尾にあたる部分をＯｕｔｌｅｔ側になるよう潅流ステージにセットし、潅流スタート時にはかん流の様子を明視野下に検鏡しながら、細胞の付着具合を確認しながら流速０.３ｍＬ/ｍiｎで潅流を開始した。その後１分おきに流速を０.１ｍＬ/ｍiｎずつ上げながら、０.７ｍＬ/ｍiｎまで速度を上げ、潅流が安定していることを確認した。
（４）腹水細胞への蛍光標識Ｌ－グルコース誘導体の適用と画像取得
　画像取得は、数か所を手動で撮影する方法ではなく、視野を横にずらしながら指定した範囲内を順に撮影するタイリングの手法を用いた。具体的には、まず細胞観察用カバーガラスの細胞付着領域の全視野をｘ１０レンズで取得した後、ｘ４０レンズに切り替え、３点を指定することで撮影範囲と焦点を設定した。具体的には、細胞付着領域を囲む枠線の左上をＡとし、枠が画面上の左端に位置するよう配置した。さらに細胞付着ガラス面から６．３ミクロン上部を撮影面として定めた。視野を右にずらし、隣の枠角をＢとして、さらにＡの対角をＣとして同様に設定し、Ａ、Ｃの２点で撮影領域を、Ａ、Ｂ、Ｃの３点において細胞付着ガラス面から６．３ミクロン上部を撮影面とした。細胞付着ガラス面から６．３ミクロン上部を撮影面とした理由は、がん細胞が概ね高さを持った一個あるいは複数個の立体構造をとっているため、ガラス面に焦点を合わせても、その核や細胞質を観察するために最適な高さではないためである(要検討)。以上の操作によって、撮影時にはｘ40レンズの視野で１０３６枚（２８ｘ３７）の画像を取得することになり、撮影時間にして約３分３０秒で細胞付着領域の全視野を撮影可能となる。画像解析の際、専用アプリケーションを用いて画像を貼り合わせ（イメージジョイント）、一枚の大きな画像として表現が可能である。蛍光標識Ｌ－グルコース誘導体の投与前の画像は緑色蛍光画像、次いで明視野画像を次の条件で撮影した。
緑色蛍光画像：高感度（Ｇａｉｎ ６ｄｂ，Ｂｉｎｎｉｎｇ ３ｘ３）、励起光量１００％、露光時間１／８０ｓ
明視野画像：高感度（Ｇａｉｎ ６ｄｂ，Ｂｉｎｎｉｎｇ ３ｘ３）、透過照明光量２５％、開口絞り２０％、露光時間１／５００ｓ
蛍光標識Ｌ－グルコース誘導体の投与
（４－１）蛍光標識Ｌ－グルコース誘導体溶液の調製
　２－ＮＢＤＬＧと２－ＴＲＬＧの混合溶液（ｆＬＧ溶液）は、それぞれ２－ＮＢＤＬＧが１００μＭ、２－ＴＲＬＧが２０μＭとなるように、ＫＲＢ溶液に特許文献ＷＯ２０１２／１３３６８８に記載した方法で溶解して作製した。
ｆＬＧ溶液は、ＫＲＢ溶液とは枝分かれした異なるラインから供給し、ＫＲＢ溶液と同様に予めウォーターバスで４０℃に加温して液中の空気を軽く除去した後に、タコ管トラップを経、かん流ポンプ手前でＫＲＢ溶液のラインと合流させた。５分間投与した後、画像取得直前には（４）と同様の方法で撮影面の再設定を行い、ＫＲＢ溶液に切り替えて１０分後に投与後の画像を緑、赤、明視野の順で、次の条件で撮影した。
緑色蛍光画像：高感度、励起光量１００％、露光時間１／８０ｓ
赤色蛍光画像：高感度、励起光量５％、露光時間１／１２０ｓ
明視野画像：高感度、透過照明光量２５％、開口絞り２０％、露光時間１／５００ｓ
（５）パパニコロウ染色ならびに観察
　蛍光観察後、９９．５％エタノールを満たした容器中に細胞観察用カバーガラスを浸漬し、５ｍｉｎ静置した後に潅流用シリコーンマスクを外した。エタノール固定後、常法によりパパニコロウ染色を行い、スライドガラス上に細胞観察用カバーガラスを貼り合わせて封入し、永久標本とした。蛍光観察時に撮影取得した画像と、パパニコロウ染色後の撮影取得した画像を合わせるために、細胞観察用カバーガラスとスライドガラスを貼り合わせる際、両者の端を正確に揃えて封入した。染色後の観察は、潅流ステージに封入した細胞観察用カバーガラスをセットして、かん流中の画像取得時と同様の撮影範囲、撮影面の設定を行った。撮影条件は、明視野カラー、高解像度（Gain 6db, Binning 1x1）、透過照明光量１００％、開口絞り２０％、露光時間１／７．５ｓである。
（実験結果）
　卵巣がん（漿液性腺がん）患者の手術時に得られた腹水細胞のライブセルイメージング結果をその後のパパニコロウ染色結果と対応させた結果を図６、図７、図８及び図９に示す。図６ＡはｆＬＧ適用前の細胞付着領域全体の緑色波長域の蛍光画像、赤色波長域の蛍光画像図、明視野画像の重ね合わせ画像であり、図６ＢはｆＬＧ適用後の緑色波長域の蛍光画像、赤色波長域の蛍光画像図、明視野画像の重ね合わせ画像である。図８Ｄとその拡大図である図９のパパニコロウ染色画像の形態観察から、がん細胞の細胞塊の特徴を示していることがわかる。すなわち、１個の細胞体が大きい、核が大きく細胞質に対する割合Ｎ/Ｃが大きい、クロマチンも濃縮している等の特徴を有している。図７Ａは図８Ｄで示された細胞塊のｆＬＧ適用前の緑色波長域における蛍光顕微鏡画像で、対して図７ＢはｆＬＧ適用後の緑色波長域における蛍光顕微鏡画像である。
　この２つの画像を比較するとがん細胞塊が２－ＮＢＤＬＧに由来する蛍光を発していることが判る。図８Ｂは同様の細胞塊のｆＬＧ適用後の赤色波長域における蛍光顕微鏡画像であるが、２－ＴＲＬＧに由来する赤色蛍光を発しておらず、この細胞塊の２－ＮＢＤＬＧ蛍光が細胞膜損傷に起因する取り込みによってもたらされたものであるとは考えられない。すなわちパパニコロウ染色した後の細胞診断学でがん細胞の核様態ならびに細胞集合様態の特徴を示していると認められる細胞塊が、２－ＮＢＤＬＧ陽性で２－ＴＲＬＧ陰性を示しており、本発明による生理的に見たがん細胞の検出法が形態学的な診断法と一致していることを示している。
実施例５：子宮体がん患者の洗浄腹水細胞に潅流法により蛍光標識Ｌ－グルコース誘導体を適用したライブセル蛍光イメージングと、固定後に行ったパパニコロウ染色結果の対応
子宮体がん患者の手術時に得られた洗浄腹水細胞に蛍光標識Ｌ－グルコース誘導体を適用し、ライブセル蛍光イメージングを行い、次いで、同じ試料を用いて、細胞を固定後にパパニコロウ染色を行った。そして、両者の結果の対応を行った。
（実験方法）
（１）洗浄腹水の調整
　子宮体がん（子宮内膜類内膜腺がん）の開腹手術開始直後、実施例１と同様の方法で得られた洗浄腹水を、あらかじめＨａｎｋｓ溶液５ｍＬをいれておいた５０ｍＬ遠沈管に加えた。腹水浮遊液を実施例４と同様の方法でフィブリン、脂肪、不純物を取り除いた。次いで５０ｍＬ遠沈管に半量を分注し、１５００Ｇ，２ｍｉｎ室温で遠心後した。
　上清を実施例４と同様の方法で処理し、腹水細胞浮遊液１ｍＬを採取した。
（２）遠心操作によるガラスプレートへの洗浄腹水細胞の付着ならびに生存維持方法
　（１）で採取した腹水細胞浮遊液１ｍＬを実施例４と同様に、ＣＦ－１２Ｄ専用プラスチック製チャンバーに移し、室温にて１４００ｒｐｍ １ｍｉｎ間の遠心を行うことで腹水細胞をガラスプレートに付着させ、実施例４と同様の処置をし、かん還流ステージへの装着までの間、湿潤箱に入れて保管した。
（３）ガラスプレートの潅流ステージへの装着と潅流
　実施例４と同様にして行った。
（４）洗浄腹水細胞への蛍光標識Ｌ－グルコース誘導体の適用と画像取得
　実施例４と同様にして行った。蛍光標識Ｌ－グルコース誘導体の投与前の画像は緑色蛍光画像のみを撮影した。また、ｆＬＧ溶液を５分間投与した後、ＫＲＢ溶液に切り替えて１０分後に投与後の画像を緑、赤、明視野の順で撮影した。エタノール固定後のパパニコロウ染色についても同様である。
（実験結果）
　子宮体がん（子宮内膜類内膜腺がん）患者の手術時に得られた洗浄腹水細胞のライブセルイメージング結果とその後のパパニコロウ染色結果と対応させた結果を図１０、図１１、図１２及び図１３に示す。図１０ＡはｆＬＧ適用前の細胞付着領域全体の緑色波長域の蛍光画像、赤色波長域の蛍光画像図、明視野画像の重ね合わせ画像であり、図１０ＢはｆＬＧ適用後の緑色波長域の蛍光画像、赤色波長域の蛍光画像図、明視野画像の重ね合わせ画像である。図１１Ｃ、図１１Ｄ及び図１２Ｄ、図１３ａ，ｂの形態観察から、中皮細胞とマクロファージ細胞とみられる細胞（画面のａ及びｂの細胞塊）を認める。図１１Ｂは、１００μＭの２－ＮＢＤＬＧと２０μＭの２－ＴＲＬＧを含有するＫＲＢ溶液適用後の緑色波長域における蛍光顕微鏡画像である。ａ、ｂどちらの細胞塊とも適用前の図１１Ａの画像と比較して、２－ＮＢＤＬＧに由来する蛍光を発していない。さらに図１２Ｂの赤色波長域における蛍光画像においてもａ、ｂどちらも赤色蛍光を発していない。このことから細胞膜損傷を来たしていない正常な中皮細胞およびマクロファージ細胞には２－ＮＢＤＬＧが取りこまれない様子がわかる。図１２Ｄとその拡大図１３ａ，ｂは蛍光染色後に実施したパパニコロウ染色の結果である。１個の細胞体の大きさが小さく、核は大きさが一様でＮ/Ｃも小さい特徴がわかる。また核の変性や凝集による細胞へのダメージが少なく、検査士や細胞診専門医による形態判定に何ら支障を来たさない染色結果であり、潅流法による有効性が示されている。
　上記の詳細な記載は、本発明の目的および対象を単に説明するものであり、添付の特許請求の範囲を限定するものではない。添付の特許請求の範囲から離れることなしに、記載された実施態様に対しての、種々の変更および置換は、本明細書に記載された教示より当業者にとって明らかである。
　本発明の方法は、生体由来細胞を用いた細胞を生きた状態でイメージングできる新たな細胞診断方法を提供する。本発明はまた、ライブイメージングを用いたがんの検出方法と、既存のがん細胞の細胞診断法、例えばパパニコロウ染色法やギムザ染色法と組み合わせた、がん細胞の二重検出法を提供する。

Claims (14)

  1. 　ヒトから採取した試料を用いたがん細胞の二重検出方法であって、
    （ａ）以下の工程を含む試料中に含まれる生きた細胞を用いた蛍光イメージングからなるがんの検出方法：
    　細胞を蛍光標識Ｌ－グルコース誘導体とともにインキュベートして細胞内に取り込まれた該蛍光標識Ｌ－グルコース誘導体を検出すること、ここで、該Ｌ－グルコース誘導体は、蛍光分子団として７－ニトロベンズ－２－オキサ－１，３－ジアゾール基又はその誘導体を分子内に有するＬ－グルコース誘導体である、及び、
    前記細胞を薄いガラス又はプラスチックプレート上に付着させた状態で、細胞内に存在する前記Ｌ－グルコース誘導体が発する蛍光を検出すること、ここで、該プレートは、その表面上に、該細胞を生存状態で維持するための緩衝液を保持するための領域を有し、そして、前記Ｌ－グルコース誘導体が発する蛍光が細胞内に検出された場合はその細胞ががん細胞であると判定する、
    を含むがん細胞を検出する方法、
    及び
    （ｂ）以下の工程からなるアルコール固定された細胞を用いた染色法からなるがんの検出方法、
    　前記プレートをエタノール固定液に浸して細胞を固定した後、パパニコロウ染色、ギムザ染色、ＰＡＳ染色、グロコット染色、及び免疫細胞化学染色からなる群から選ばれるいずれか一つの染色方法によって染色して、がん細胞を検出する方法、
    を含むがん細胞の二重検出方法。
  2. 　前記蛍光イメージングからなるがんの検出方法ａが以下の工程：
    （ａ－１）ヒトから採取した試料中に含まれる生きた細胞を、記蛍光標識Ｌ－グルコース誘導体を含む緩衝液中にてインキュベートし、該Ｌ－グルコース誘導体を取り込ませる工程、
    （ａ－２）緩衝液を前記蛍光標識Ｌ－グルコース誘導体を含まない緩衝液に交換して該Ｌ－グルコース誘導体の取り込みを停止する工程、
    （ａ－３）前記細胞を薄いガラス又はプラスチックプレート上の細胞付着領域に付着させて固定し、次いで、前記細胞付着領域を含みかつ囲むように構成されプレート上に設けられた緩衝液を保持するための緩衝液保持領域に緩衝液を入れ、細胞を生存状態に維持する工程、ここで、前記緩衝液保持領域は、細胞が固定されたプレート面と、緩衝液保持領域を取り囲むように設計された緩衝液保持構造体から構成される、
    （ａ－４）前記固定した細胞内に存在する前記Ｌ－グルコース誘導体が発する蛍光を検出する工程、及び
    （ａ－５）前記蛍光の検出に基づいてがん細胞を検出する工程、
    からなる請求項１に記載の方法。
  3. 　前記工程ａが以下の工程：
    （ａ－１）ヒトから採取した試料中に含まれる生きた細胞を、薄いガラス又はプラスチックプレート上の細胞付着領域に付着させて固定する工程、
    （ａ－２）前記細胞付着領域を含みかつ囲むように構成されプレート上に設けられた緩衝液を保持するための緩衝液保持領域に緩衝液を入れ、細胞を生存状態に維持する工程、ここで、前記緩衝液保持領域は、細胞が固定されたプレート面と、緩衝液保持領域を取り囲むように設計された緩衝液保持構造体から構成される、
    （ａ－３）緩衝液を前記蛍光標識Ｌ－グルコース誘導体を含む緩衝液に交換し、次いで、プレートに固定された細胞をインキュベートし、該Ｌ－グルコース誘導体を取り込ませる工程、
    （ａ－４）緩衝液を前記蛍光標識Ｌ－グルコース誘導体を含まない緩衝液に交換して該Ｌ－グルコース誘導体の取り込みを停止し、前記固定した細胞内に存在する前記Ｌ－グルコース誘導体が発する蛍光を検出する工程、及び
    （ａ－５）前記蛍光の検出に基づいてがん細胞を検出する工程、
    からなる請求項１に記載の方法。
  4. 　前記蛍光標識Ｌ－グルコース誘導体が、２－［Ｎ－（７－ニトロベンズ－２－オキサ－１，３－ジアゾール－４－イル）アミノ］－２－デオキシ－Ｌ－グルコース（２－ＮＢＤＬＧ）と、２位にスルホローダミン１０１をスルホンアミド結合した２－アミノ－２－デオキシ－Ｌ－グルコース（２－ＴＲＬＧ）との混合物である、請求項１～３のいずれか一つに記載のがん細胞の二重検出方法。
  5. 　前記工程（ａ－５）におけるがん細胞の検出において、蛍光イメージングされた細胞の蛍光色調を指標に該細胞の細胞膜損傷状態を判断することをさらに含む、請求項３又は４に記載の検出方法。
  6. 　前記方法（ｂ）がパパニコロウ染色である請求項１～５のいずれか一つに記載の検出方法。
  7. 　前記プレートの厚さが０．３ｍｍ以下である上記請求項１～６のいずれか一つに記載の検出方法。
  8. 　前記衝液保持構造体は、前記緩衝液保持領域に相当する開口部を有するプレート形状又はリング形状の構造体であって、前記緩衝液を保持するのに十分な厚さを有する、請求項２～７のいずれか一つに記載の検出方法。
  9. 　前記緩衝液保持構造体がシリコーンから作られた厚さ０．５～１０ｍｍの構造体である、請求項８に記載の検出方法。
  10. 　前記ヒトから採取した試料が、患者の浮遊細胞液由来の細胞、擦過剥離細胞由来の細胞、又は穿刺吸引細胞由来の細胞である、請求項１～９のいずれか一つに記載の検出方法。
  11. 　前記細胞が、患者の喀痰、尿、腹水、胸水、心嚢液、脳脊髄液、胆汁、膵液、関節液又は血液から選ばれる浮遊細胞液から由来する細胞である、請求項１０に記載の検出方法。
  12. 　前記細胞が、卵巣がん患者又は子宮体がん患者の腹水由来の細胞である、請求項１１に記載の検出方法。
  13. 　前記プレートが、細胞を付着させる面と反対の面に細胞の位置情報を示すためのマーキングを有する、請求項１～１２のいずれか一つに記載の検出方法。
  14. 　レーザー共焦点顕微鏡を用いて生きた細胞を観察するための、細胞観察用ガラス又はプラスチックプレートと緩衝液を保持するための緩衝液保持構造体を含む細胞観察用ガラス又はプラスチックプレート構造体であって、
    細胞を生存状態で固定するためのガラス又はプラスチックプレート、ここで、該プレートは、表面上に細胞を生存状態で維持するための緩衝液を保持するための緩衝液保持領域を有し、厚みが０．３ｍｍ以下であり、かつ細胞を固定する面とは反対の面に細胞の位置情報を示すためのマーキングを有する、と、
    該緩衝液保持領域にて緩衝液を保持するための緩衝液保持構造体、ここで、該緩衝液保持構造体は、緩衝液保持領域を取り囲むように設計されたプレート形状又はリング形状のシリコーンから作られた厚さ０．５～１０ｍｍの緩衝液保持構造体である、
    を含む細胞観察用ガラス又はプラスチックプレート構造体。
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