JP6670503B2 - 生体由来細胞を用いたがん細胞の検出方法 - Google Patents
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Description
1)細胞質(cytoplasm)に対する細胞核(nucleus)の比(N/C比)の増大。
2)細胞内の核の位置や核クロマチンの様態を含めた細胞形態の異常。
3)細胞の集合状態等の異常(構造異型)。
この方法を用いることにより、生体由来細胞を用いた細胞のライブイメージングが可能となるとともに、特定の蛍光標識分子を用いることにより生体由来細胞を用いたがんの検出が可能であることを見出した。そして、ライブイメージングを用いたがんの検出方法を、既存のがん細胞の細胞診断法、例えばパパニコロウ染色法やギムザ染色法と組み合わせて用いることにより、がん細胞の二重検出法という更なる発明を完成させた。
(1)生体由来細胞を用いたがん細胞の検出方法であって、以下の工程:
(a)ヒトから採取した試料中に含まれる生きた細胞を、蛍光標識L−グルコース誘導体とともにインキュベートする工程、ここで、該蛍光標識L−グルコース誘導体は、蛍光分子団として7−ニトロベンズ−2−オキサ−1,3−ジアゾール基又はその誘導体を分子内に有するL−グルコース誘導体である、
(b)細胞の前記L−グルコース誘導体の取り込みを停止する工程、
(c)前記細胞を薄いガラス又はプラスチックプレート上に付着させる工程、ここで、該プレートは、その表面上に、該細胞を生存状態で維持するための緩衝液を保持するための領域を有する、及び
(d)前記プレートに付着した細胞を生存状態に維持しながら、細胞内に存在する前記L−グルコース誘導体が発する蛍光を検出する工程、
を含む検出方法。
(2)前記蛍光標識L−グルコース誘導体が、蛍光分子団として7−ニトロベンズ−2−オキサ−1,3−ジアゾール基又はその誘導体を分子内に有するL−グルコース誘導体と、2位にスルホローダミン101をスルホンアミド結合した2−アミノ−2−デオキシ−L−グルコース(2−TRLG)との混合物である、上記(1)に記載の検出方法。
(3)工程(d)における蛍光の検出において、蛍光イメージングされた細胞の蛍光色調を指標に該細胞の細胞膜損傷状態を判断することをさらに含む、上記(2)に記載の検出方法。
(4)前記の蛍光分子団として7−ニトロベンズ−2−オキサ−1,3−ジアゾール基又はその誘導体を分子内に有するL−グルコース誘導体が、2−[N−(7−ニトロベンズ−2−オキサ−1,3−ジアゾール−4−イル)アミノ]−2−デオキシ−L−グルコース(2−NBDLG)である上記(1)〜(3)のいずれか一つに記載の検出方法。
(5)工程(a)におけるインキュベーションを、22〜37.5℃の温度にて3〜15分間行う、上記(1)〜(4)のいずれか一つに記載の検出方法。
(6)工程(b)における細胞内への蛍光標識L−グルコース誘導体の取り込みを停止する工程を、蛍光標識L−グルコース誘導体を含まない0℃〜5℃の緩衝液で細胞を処理することにより行う、上記(1)〜(5)のいずれか一つに記載の検出方法。
(7)前記工程(c)の細胞のプレートへの付着を遠心により行い、遠心後直ちに前記領域に緩衝液を加えることを含む、上記(1)〜(6)のいずれか一つに記載の検出方法。
(8)前記プレートの厚さが0.3mm以下である上記(1)〜(7)のいずれか一つに記載の検出方法。
(9)前記プレートの前記領域を取り囲むように設計された緩衝液保持構造体を用いて前記領域での緩衝液の保持を十分なものとすることをさらに含む、上記(1)〜(8)のいずれか一つに記載の検出方法、ここで、該緩衝液保持構造体は、前記領域に相当する開口部を有するプレート形状又はリング形状の構造体であって、前記緩衝液を保持するのに十分な厚さを有する。
(10)前記緩衝液保持構造体がシリコーンから作られた厚さ0.5〜10mmの構造体である、上記(9)に記載の検出方法。
(11)前記生体由来細胞が、患者の浮遊細胞液由来の細胞、擦過剥離細胞由来の細胞、又は穿刺吸引細胞由来の細胞である、上記(1)〜(10)のいずれか一つに記載の検出方法。
(12)前記生体由来細胞が、患者の喀痰、尿、腹水、胸水、心嚢液、脳脊髄液、胆汁、膵液、関節液又は血液から選ばれる浮遊細胞液から由来する細胞である、上記(11)に記載の検出方法。
(13)前記生体由来細胞が、卵巣がん患者又は子宮体がん患者の腹水由来の細胞である、上記(12)に記載の検出方法。
(14)蛍光標識L−グルコース誘導体を用いたがん細胞の検出と、パパニコロウ染色、ギムザ染色、PAS染色、グロコット染色、又は免疫細胞化学染色に基づいたがん細胞の検出、とからなるがん細胞の二重検出方法であって、
上記(1)〜(13)のいずれか一つに記載の検出方法を行った後、細胞が付着した状態のガラス又はプラスチックプレートを用いて、パパニコロウ染色、ギムザ染色、PAS染色、グロコット染色、又は免疫細胞化学染色を行い、次いで、
蛍光に基づいて検出されたがん細胞と、パパニコロウ染色、ギムザ染色、PAS染色、グロコット染色、又は免疫細胞化学染色に基づいて検出されたがん細胞を比較すること、
を含む検出方法。
(15)前記プレートが、細胞を付着させる面と反対の面に細胞の位置情報を示すためのマーキングを有する、上記(14)に記載の検出方法。
(16)蛍光標識L−グルコース誘導体を用いたがん細胞の検出とパパニコロウ染色に基づいたがん細胞の検出とからなるがん細胞の二重検出方法である、前記(14)又は(15)に記載の検出方法。
(A)ヒトから採取した試料中に含まれる生きた細胞を、蛍光標識化合物とともにインキュベートする工程、
(B)細胞内への前記蛍光標識化合物の取り込みを停止する工程、
(C)前記細胞を薄いガラス又はプラスチックプレート上に付着させる工程、ここで、該プレートは、その表面上に、該細胞を生存状態で維持するための緩衝液を保持するための領域を有する、及び
(D)前記プレートに付着した細胞を生存状態に維持しながら、細胞内に存在する前記蛍光標識化合物が発する蛍光を検出する工程、
を含むライブセルイメージング方法。
(18)工程(B)における細胞内への蛍光標識化合物の取り込みを停止する工程を、蛍光標識化合物を含まない0℃〜5℃の緩衝液で細胞を処理することにより行う、上記(17)に記載のライブセルイメージング方法。
(19)前記工程(C)の細胞のプレートへの付着を遠心により行い、遠心後直ちに前記領域に緩衝液を加えることを含む、上記(17)又は(18)に記載のライブセルイメージング方法。
(20)前記プレートの厚さが0.3mm以下である上記(17)〜(19)のいずれか一つに記載のライブセルイメージング方法。
(21)前記プレートの前記領域を取り囲むように設計された緩衝液保持構造体を用いて前記領域での緩衝液の保持を十分なものとすることをさらに含む、上記(17)〜(20)のいずれか一つに記載のライブセルイメージング方法、ここで、該緩衝液保持構造体は、前記領域に相当する開口部を有するプレート形状又はリング形状の構造体であって、前記緩衝液を保持するのに十分な厚さを有する。
(22)前記緩衝液保持構造体がシリコーンから作られた厚さ0.5〜10mmの構造体である、上記(21)に記載のライブセルイメージング方法。
(23)前記生体由来細胞が、哺乳動物の浮遊細胞液由来の細胞、剥離細胞由来の細胞、又は穿刺吸引細胞由来の細胞である、上記(17)〜(22)のいずれか一つに記載のライブセルイメージング方法。
(24)前記生体由来細胞が、ヒト由来の浮遊細胞液から由来する細胞である、上記(23)に記載のライブセルイメージング方法。
(26)前記プレートが、さらに細胞を固定する面とは反対の面に細胞の位置情報を示すためのマーキングを有する上記(25)に記載の細胞観察用ガラス又はプラスチックプレート。
(27)上記(25)又は(26)に記載のプレートの前記領域を取り囲むように設計された、前記領域での緩衝液の保持を十分なものとするための緩衝液保持構造体であって、前記領域に相当する開口部を有するプレート形状又はリング形状の、シリコーンから作られた厚さ0.5〜10mmの緩衝液保持構造体。
(28)レーザー共焦点顕微鏡を用いて生きた細胞を観察するための、上記(25)又は(26)に記載のガラス又はプラスチックプレートと上記(27)の緩衝液保持構造体からなる細胞観察用プレートセット。
[1]ヒトから採取した試料を用いたがん細胞の二重検出方法であって、
(a)以下の工程を含む試料中に含まれる生きた細胞を用いた蛍光イメージングからなるがんの検出方法:
前記細胞を蛍光標識L−グルコース誘導体とともにインキュベートして細胞内に取り込まれた該蛍光標識L−グルコース誘導体を検出すること、ここで、該L−グルコース誘導体は、蛍光分子団として7−ニトロベンズ−2−オキサ−1,3−ジアゾール基又はその誘導体を分子内に有するL−グルコース誘導体である、及び、
前記細胞を薄いガラス又はプラスチックプレート上に付着させた状態で、細胞内に存在する前記L−グルコース誘導体が発する蛍光を検出すること、ここで、該プレートは、その表面上に、該細胞を生存状態で維持するための緩衝液を保持するための領域を有し、そして、前記L−グルコース誘導体が発する蛍光が細胞内に検出された場合はその細胞ががん細胞であると判定する、
を含むがん細胞を検出する方法、
及び
(b)以下の工程からなるアルコールまたはホルマリン等の固定液により固定された細胞を用いた染色法からなるがんの検出方法、
前記プレートをエタノールまたはホルマリン等の固定液に浸して細胞を固定した後、パパニコロウ染色、ギムザ染色、PAS染色、グロコット染色、及び免疫細胞化学染色からなる群から選ばれるいずれか一つの染色方法によって染色して、がん細胞を検出する方法、
を含むがん細胞の二重検出方法。
[2]前記蛍光イメージングからなるがんの検出方法aが以下の工程:
(a−1)ヒトから採取した試料中に含まれる生きた細胞を、前記蛍光標識L−グルコース誘導体を含む緩衝液中にてインキュベートし、該L−グルコース誘導体を取り込ませる工程、
(a−2)緩衝液を前記蛍光標識L−グルコース誘導体を含まない緩衝液に交換して該L−グルコース誘導体の取り込みを停止する工程、
(a−3)前記細胞を薄いガラス又はプラスチックプレート上の細胞付着領域に付着させて固定し、次いで、前記細胞付着領域を含みかつ囲むように構成されプレート上に設けられた、緩衝液を保持するための緩衝液保持領域に緩衝液を入れ、細胞を生存状態に維持する工程、ここで、前記緩衝液保持領域は、細胞が固定されたプレート面と、緩衝液保持領域を取り囲むように設計された緩衝液保持構造体から構成される、
(a−4)前記固定した細胞内に存在する前記L−グルコース誘導体が発する蛍光を検出する工程、及び
(a−5)前記蛍光の検出に基づいてがん細胞を検出する工程、
からなる上記[1]に記載の方法。
[3]前記蛍光イメージングからなるがんの検出方法aが以下の工程:
(a−1)ヒトから採取した試料中に含まれる生きた細胞を、薄いガラス又はプラスチックプレート上の細胞付着領域に付着させて固定する工程、
(a−2)前記細胞付着領域を含みかつ囲むように構成されプレート上に設けられた、緩衝液を保持するための緩衝液保持領域に緩衝液を入れ、細胞を生存状態に維持する工程、ここで、前記緩衝液保持領域は、細胞が固定されたプレート面と、緩衝液保持領域を取り囲むように設計された緩衝液保持構造体から構成される、
(a−3)緩衝液を前記蛍光標識L−グルコース誘導体を含む緩衝液に交換し、次いで、プレートに固定された細胞をインキュベートし、該L−グルコース誘導体を取り込ませる工程、
(a−4)緩衝液を前記蛍光標識L−グルコース誘導体を含まない緩衝液に交換して該L−グルコース誘導体の取り込みを停止し、前記固定した細胞内に存在する前記L−グルコース誘導体が発する蛍光を検出する工程、及び
(a−5)前記蛍光の検出に基づいてがん細胞を検出する工程、
からなる上記[1]に記載の方法。
[4]前記蛍光標識L−グルコース誘導体が、、2−[N−(7−ニトロベンズ−2−オキサ−1,3−ジアゾール−4−イル)アミノ]−2−デオキシ−L−グルコース(2−NBDLG)と2位にスルホローダミン101をスルホンアミド結合した2−アミノ−2−デオキシ−L−グルコース(2−TRLG)との混合物である、上記[1]〜[3]のいずれか一つに記載のがん細胞の二重検出方法。
[5]前記工程(a−5)におけるがん細胞の検出において、蛍光イメージングされた細胞の蛍光色調を指標に該細胞の細胞膜損傷状態を判断することをさらに含む、上記[3]又は[4]に記載の検出方法。
[6]前記方法(b)がパパニコロウ染色である、上記[1]〜[5]のいずれか一つに記載の検出方法。
[7]前記プレートの厚さが0.3mm以下である上記[1]〜[6]のいずれか一つに記載の検出方法。
[8]前記緩衝液保持構造体は、前記緩衝液保持領域に相当する開口部を有するプレート形状又はリング形状の構造体であって、前記緩衝液を保持するのに十分な厚さを有する、上記[2]〜[7]のいずれか一つに記載の検出方法。
[9]前記緩衝液保持構造体がシリコーンから作られた厚さ0.5〜10mmの構造体である、上記[8]に記載の検出方法。
[10]前記ヒトから採取した試料が、患者の浮遊細胞液由来の細胞、擦過剥離細胞由来の細胞、又は穿刺吸引細胞由来の細胞である、上記[1]〜[9]のいずれか一つに記載の検出方法。
[11]前記細胞が、患者の喀痰、尿、腹水、胸水、心嚢液、脳脊髄液、胆汁、膵液、関節液又は血液から選ばれる浮遊細胞液から由来する細胞である、上記[10]に記載の検出方法。
[12]前記細胞が、卵巣がん患者又は子宮体がん患者の腹水由来の細胞である、上記[11]に記載の検出方法。
[13]前記プレートが、細胞を付着させる面と反対の面に細胞の位置情報を示すためのマーキングを有する、上記[1]〜[12]のいずれか一つに記載の検出方法。
[14]レーザー共焦点顕微鏡を用いて生きた細胞を観察するための、細胞観察用ガラス又はプラスチックプレートと緩衝液を保持するための緩衝液保持構造体を含む細胞観察用ガラス又はプラスチックプレート構造体であって、
細胞を生存状態で固定するためのガラス又はプラスチックプレート、ここで、該プレートは、表面上に細胞を生存状態で維持するための緩衝液を保持するための緩衝液保持領域を有し、厚みが0.3mm以下であり、かつ細胞を固定する面とは反対の面に細胞の位置情報を示すためのマーキングを有する、と、
該緩衝液保持領域にて緩衝液を保持するための緩衝液保持構造体、ここで、該緩衝液保持構造体は、緩衝液保持領域を取り囲むように設計されたプレート形状又はリング形状のシリコーンから作られた厚さ0.5〜10mmの緩衝液保持構造体である、
を含む細胞観察用ガラス又はプラスチックプレート構造体。
本発明のがん細胞の検出方法の一つの態様として、以下に記載の生きた細胞を用いた蛍光イメージングからなるがんの検出方法(工程(a))をあげることができる。
(i)前記細胞を蛍光標識L−グルコース誘導体とともにインキュベートして細胞内に取り込まれた該蛍光標識L−グルコース誘導体を検出すると、ここで、該L−グルコース誘導体は、蛍光分子団として7−ニトロベンズ−2−オキサ−1,3−ジアゾール基又はその誘導体を分子内に有するL−グルコース誘導体である、及び、
(ii)前記細胞を薄いガラス又はプラスチックプレート上に付着させた状態で、細胞内に存在する前記L−グルコース誘導体が発する蛍光を検出すること、ここで、該プレートは、その表面上に、該細胞を生存状態で維持するための緩衝液を保持するための領域を有し、そして、前記L−グルコース誘導体が発する蛍光が細胞内に検出された場合はその細胞ががん細胞であると判定する、
を含むがん細胞を検出する方法。
(b)前記プレートをエタノール固定液に浸して細胞を固定した後、パパニコロウ染色、ギムザ染色、PAS染色、グロコット染色、及び免疫細胞化学染色からなる群から選ばれるいずれか一つの染色方法によって染色して、がん細胞を検出する方法。
本発明で用いることができるガラスプレートは、レーザー共焦点顕微鏡等を用いて細胞から発する蛍光を検出できるものであれば特に制限がなく、公知のガラスプレート、例えば、薄いガラスプレート(例えば、カバーガラス)を本発明での使用に適したように加工したものを用いることができる。
本発明で用いることができるプラスチックプレートは、レーザー共焦点顕微鏡等を用いて細胞から発する蛍光を検出するために、無蛍光又は低蛍光の物質から作られたプラスチックプレートである。これに限定されないが、例えば、CrystalClene(Molecular Dimensions社)や、Correlative Microscopy Coverslips(Electron Microscopy Sciences社)、セルデスクLF等(住友ベークライト(株)製)の自己蛍光の低いプラスチック製カバースリップをあげることができる。
本発明で用いることができるガラス又はプラスチックプレートは、レーザー共焦点顕微鏡等を用いて個々の細胞から発する蛍光を検出するために、薄いことが必要であり、例えば、0.3mm以下、好ましくは0.2mm以下、特に好ましくは0.12〜0.20mmの厚さを挙げることができる。これは一般には、細胞観察の際に、スライドガラスに載せるカバーガラスとして用いるガラスの厚さである。本明細書では、本発明の方法で用いる薄いガラスプレートを、ライブセルイメージング用特殊カバーガラス、或いは単にガラスプレートという場合がある。
なお、細胞の詳細(形態等)を蛍光イメージングするのではなく、細胞から発する蛍光を検出する目的であれば、ガラス又はプラスチックプレートの厚さは1mmでもよい。
なお、緩衝液保持領域は、細胞を固定する細胞付着領域を含みかつそれを囲むように構成されるが、緩衝液保持領域は、細胞付着領域と、ほぼ同じ大きさであっても或いはそれ比べて数倍以上の大きさであっても良い。但し、十分な量の緩衝液の中で細胞を維持するために、緩衝液保持領域は細胞付着領域に対し、好ましくは2倍以上、さらに好ましくは5倍以上であるが、一方、好ましくは10倍以内である。
マスクの厚さは、これに制限されないが、0.5〜10mm、好ましくは1〜5mm、より好ましくは2〜5mm、さらに好ましくは2〜3mmを挙げることができ、マスクの素材は、これに限定されないが、例えば、シリコーンなどの樹脂、プレートへの密着性をあげるためのコーティングを施した金属をあげることができる。また、マスクの開口部は、ガラスにマスクを密着させる途中で細胞付着領域にマスクが接触せず、かつ、取り付け・取り外しが容易であることが望ましい。例えば、図1又は図14のように成形した厚さ2mmのシリコーン樹脂を用いることもでき、取り付け・取り外しが容易であるように手でもてるような突起を設けてもよい。
マスクの形は、図1又は図14のように、上下左右が非対称で、マスクの一端がガラスプレートの辺縁と一致するようにしてガラスプレート上に装着できるように設計すれば、いつも同じ位置に開口部がくることとなり、誤って細胞の上にマスクをかぶせてしまうような恐れがなくなる。
図1においては、細胞付着領域と緩衝液保持領域がほぼ同じ大きさであり、マスクの開口部もまた細胞付着領域とほぼ同じ大きさとなっている。図14は、細胞付着領域に比べて緩衝液保持領域が大きくなっており(約5倍)、緩衝液保持領域に対応するマスクの開口部(アウターマスクの開口部)も細胞付着領域に比べて大きい。図14の例においては、インナーマスクの開口部が細胞付着領域とほぼ同じ大きさである。
(i)インナーマスクの開口部は細胞付着領域を含みそれをかつ囲むように構成され、前もってアウターマスクと組み合わせてガラス又はプラスチックプレートに密着させ、遠心操作時は細胞付着領域以外への細胞の流出を防ぐものである。遠心操作の後にインナーマスクは取り除くが、インナーマスクの開口に保持されていた緩衝液が細胞付着領域の外に流出し、細胞が乾燥してしまう可能性がある。そのため、撥水性の囲みを細胞付着領域の外周上又はその外側に設けることが好ましい。
(ii)アウターマスクの開口は、細胞付着領域と撥水性の囲みを含みかつそれを囲むように構成されるが、細胞付着後にインナーマスクを外し、開口を塞がないサイズのカバーガラスを貼りつけた状態でKRB溶液によるかん流を開始した場合、Inletから流入したKRB溶液がOutlet側へ流出し、かつ過剰に流入させた場合にもInlet側に溢れるのではなくOutlet側に溢れていくような形状(以下、「魚型開口」という)とした。
このような構造体を、前記の緩衝液保持領域を囲むように液の流出を防止する構造体として用いることも可能であり、係る場合は、このような構造体を設置したガラスプレートは、本発明の、その表面上に細胞を生存状態で維持するための緩衝液を保持するための領域を有するガラスプレートに該当する。
細胞膜に損傷を受けた細胞は、仮にがん細胞であったとしても、あるいは非がん細胞(正常細胞を含む)であったとしても、蛍光標識グルコース誘導体が非特異的に細胞内に侵入する。上記の蛍光標識L−グルコース誘導体の混合物を用いることにより、このような細胞膜に損傷を受けた非がん細胞に蛍光標識グルコース誘導体が非特異的に取り込まれる場合を、がん細胞における取り込みと識別することができる。
2−TRLGという立体的に中程度のかさ高さと適度な脂溶性を有する蛍光基と、L−グルコースという水溶性でかつGLUTに結合しない分子を分子内に併せ持つ誘導体を用いることにより、様々な状態の細胞の判定識別が可能となるという特徴を発揮する。これに対して従来から知られているpropidium iodideやDAPIなど細胞膜損傷部から細胞内に侵入して核に不可逆的に結合する分子を用いた場合や単にかさの大きなデキストラン等に蛍光基を結合した分子を用いる等した場合には、細胞状態の違いを正確に表現することができない。すなわち、大型で赤色の蛍光基テキサスレッドを結合した蛍光L−グルコース誘導体2−TRLGと緑色の蛍光基NBDを結合した2−NBDLGとを同時にがん細胞に適用することで、細胞が蛍光標識L−グルコース誘導体を取り込む様子の違いを、緑色から赤色に至る連続的な蛍光カラーをもって識別することを可能にしている。これは従来の蛍光分子プローブによる細胞診技術に見られない大きな特徴である。
また、本発明のがん細胞の検出方法における蛍光の検出は、公知の方法に従って行うことができる。また本発明による細胞の検出は、直接的に蛍光観察によっても、あるいは蛍光をフォトコンバージョン法によりDAB黒などに変換した上、光学顕微鏡や電子顕微鏡観察によっても計測でき、細胞機能の異常の程度を、定性的のみならず、適切な基準値を設定することにより、定量表現や機械化が可能である。
また、本発明のがん細胞の検出方法において対象とするがんの種類は、細胞が採取できる限り特に限定されず、例えば、卵巣がん、子宮体がん、子宮頸がん、等の婦人科のがんや、胃がん、大腸がん、胆道がん、膵臓がん、食道がん等の消化器系のがん、肺がん等の呼吸器系のがん、甲状腺がんや乳がん、膀胱がん、腎盂がん、尿管がん、前立腺がん等の尿路系のがん、白血病、悪性リンパ腫等の造血器悪性腫瘍、中枢神経系に浸潤した悪性腫瘍等、脳脊髄液を対象とするがん等を挙げることができる。
腹水由来の浮遊細胞を用いる例としては、例えば、卵巣がん、子宮体がん、胃がん、大腸がん、胆道がん、膵臓がん、又は食道がんの患者の腹水由来の細胞をあげることができる。その他、胸水由来の浮遊細胞を用いる例としては、肺がん等の呼吸器系のがん、甲状腺がん、乳がんを、尿由来の細胞を用いる例としては、膀胱がん、腎盂がん、尿管がん、前立腺がん等の尿路系のがんをあげることができる。血液の細胞を用いる例としては、白血病、悪性リンパ腫等の造血器悪性腫瘍をあげることができる。擦過剥離細胞由来の細胞を用いる例としては、子宮頸がん、子宮内膜がん、口腔内のがん等あげることができる。穿刺吸引細胞由来の細胞を用いる例としては、乳腺と甲状腺のがんをあげることができる。
生体から採取した細胞検体を、血餅を生じにくいCa,Mg−free Hanks溶液等の適切な緩衝液に懸濁させて検査室に移送する。直ちに作業を開始できない場合、冷暗所で室温保存することにより、細胞検体入手の翌日に蛍光標識L−グルコース誘導体の適用および観察を実施することも可能である。また、血球が多量に含まれる場合は、ペレットの上部(通称バフィーコート)を採取し、あるいは細胞診検体前処理で通常行われる溶血操作や、血餅除去操作を加えることも可能である。
遠心操作により細胞の存在する沈殿と上清とに分ける。遠心条件は検査施設で通常用いている方法によればよいが、細胞を生かした状態で維持するため、短時間で必要最小限の遠心操作を行うのが好ましい。例えば650G−1500G,1min−2minの間で1回もしくは2回行えばよい。ペレットに少量のKRB溶液を加えて細胞を分散し、直ちに次の染色操作を開始しても良く、また多量の緩衝液を加えて染色操作まで最大24時間程度保存することも可能である。後者では染色操作の前に、再度遠心操作を行う。
緩衝液に懸濁させて移送された細胞検体には血球が多量に含まれる場合があるが、細胞を生かした状態で維持しながら溶血作業を行わずとも効率よく関心細胞を収集するために、二重遠心法を用いることが可能である。はじめに、大半の赤血球は沈殿するが関心細胞は沈殿しない様な回転数、例えば200G−400G,1−3minの間で1回遠心を行い、関心細胞が存在している上清をすべて回収する。次いで回収した上清を、全ての細胞を沈殿させる様な回転数、例えば500G−650G,1−3minの間で1回遠心を行い、上清のうち、赤血球を多量に含むペレットの上部の溶液を1mL−2mL採取する。直ちに次の操作を開始しても良く、また多量の緩衝液を加えて最大24時間程度保存することも可能である。後者では操作の前に、再度650G−1500G,1min−2minの間で1回遠心操作を行う。
0.3mL/min−1.4mL/minの速度でかん流を行い、上記であらかじめ用意したfLG溶液を流すことにより、一定時間fLGと接触させ、細胞にfLGを取り込ませる。接触時間や温度条件等は公知の文献によればよい(WO2012/133688号公報参照)。fLG溶液からKRB溶液へかん流を切り替えることによって、fLG取り込みを停止させ、溶液中のfLGを取り除く。溶液中のfLGの濃度が十分下がるまでかん流を5min−15minの間で行った後に、適用後の細胞の蛍光を観察することが可能である。細胞の撮影は関心細胞を個別に撮影するのではなく、細胞付着領域全域をひと視野ずつ順に撮影し、観察終了後に貼り合わせを行うことが可能なタイリング撮影を用いることで、あとから全範囲を見直すことが可能となり、関心細胞の見落とし防止が実現できる。また、かん流によるfLG溶液適用の前に、細胞の自家蛍光を観察することが可能であり、fLG適用前後の画像を用いて、細胞が蛍光標識L−グルコース誘導体を取り込んだか否かをより正確に判じることが可能である。
本発明で使用するガラス又はプラスチックプレートは、細胞付着領域の裏面に、関心細胞の近傍に印をつけることで細胞位置の同定に役立てることができる。この目的で、使用するプレートの細胞付着領域の裏面に、あらかじめ判別可能な記号・文字、線等がガラス裏面に印字もしくは刻印したものを用いることで細胞位置の同定が容易でまた正確になる。
使用するガラス又はプラスチックプレート表面の細胞付着領域は、遠心操作後にも細胞が生存できるように、緩衝液を一定量維持できる構造とすることが重要となる。この目的で、操作中の細胞の乾燥を防ぎ、細胞が常に緩衝液に浸っているようにする為、細胞付着領域周囲をあらかじめシリコーン等の撥水性物質で囲んでおくことが効果的であり、このことで検査士の経験や技量によらずに細胞を乾燥させることなく操作できることが可能となる。
また、操作中にプレートの表裏や上下左右の向きが容易にわかるように、プレートの四隅の一か所を斜めにカットしておくと配向が明瞭となる。
プレート上の細胞付着領域に存在する目的細胞の蛍光および明視野観察には、通常の倒立蛍光顕微鏡を用いることができ、室温下で少なくとも1時間程度、がん細胞であるか否かを判断するために蛍光観察後に実施するパパニコロウ染色に支障をきたすような細胞形態の変化なく観察する事が可能である。顕微鏡観察中には、上下左右に頻繁にガラスプレートを動かしながら視野を変えていくため、目的細胞上に添加した緩衝液が動きやすく、これは電動ステージを用いる場合には特に著しい。また、緩衝液が蒸発することによる細胞への影響を最小限とする必要がある。これらの目的で、細胞付着領域周囲にある撥水性の囲みと同程度かそれより大きい開口部を設けたマスク(緩衝液保持構造体)をガラス面上に密着させ、観察時間を考慮した適切な量の緩衝液をこの開口部に添加することで、長時間の顕微鏡観察中にも乾燥や浸透圧の変化を防ぐことができる。
上記した特定の蛍光標識L−グルコース誘導体を用いたがん細胞の検出方法は、細胞を生存状態に維持したままガラス又はプラスチックプレート上においてがん細胞の検出が行えるので、それに次いで、プレート上に付着した細胞を、さらに、上記がん細胞診染色を用いてがん細胞の検出を行うことができ、二重の検出法に基づくがん診断が行える。
このように、本発明のがん細胞の二重検出方法においては、蛍光観察後の細胞を固定した後、パパニコロウ染色等の一般的染色方法あるいは免疫細胞化学的手法等を使用して染色し、蛍光観察した細胞と同一細胞でこれらの従来技術による染色結果との比較を可能にする方法であることから、従来技術による細胞形態情報に蛍光観察による細胞機能情報を加えることで、細胞状態に対する情報が質・量共に増え、診断精度の向上が図れ、さらには、観察細胞を絞ることができるために見逃しも軽減される。これにより、より精度の高いがん診断が可能となる。
良悪鑑別の為の抗体を用いた免疫細胞化学染色としては、例えば、p53、WT−1(Wilm’s tumor−1)、IMP3、Ki−67、EMA(epithelial membrane antigen)、CEA、cytokeratin、desmin、calretinin、D2−40(podoplanin)、TTF−1(thyroid transcription factor)、CD45、CD146等をあげることができる。
本発明のライブセルイメージング方法の一つの態様として、以下の工程からなる方法をあげることができる。
(工程A)ヒトから採取した試料中に含まれる生きた細胞を、蛍光標識化合物とともにインキュベートする工程、
(工程B)細胞内への前記蛍光標識化合物の取り込みを停止する工程、
(工程C)前記細胞を薄いガラス又はプラスチックプレート上に付着させる工程、ここで、該プレートは、その表面上に、該細胞を生存状態で維持するための緩衝液を保持するための領域を有する、及び
(工程D)前記プレートに付着した細胞を生存状態に維持しながら、細胞内に存在する前記蛍光標識化合物が発する蛍光を検出する工程。
なお工程Cにおけるガラス又はプラスチックプレートが、その表面上に細胞を生存状態で維持するための緩衝液を保持するための領域を有するのは、細胞の付着に先立ってであっても、或いは、細胞の付着後であってもよいが、好ましくは、細胞の付着に先立ってそのような領域を有するプレートが用いられる。
これに限定されないが、例えば、哺乳動物細胞のグルコーストランスポーターを通過して、放射性標識D−グルコース誘導体に匹敵するキネティクスをもって細胞内に取り込まれる、蛍光基である7−ニトロベンズ−2−オキサ−1,3−ジアゾール基(NBD)で標識した2−アミノ−2−デオキシ−D−グルコース(2−NBDG)をあげることができる(非特許文献1:Yamada et al., J. Biol. Chem. 275: 22278-83, 2000)。
また、本発明のライブセルイメージング方法におけるガラス又はプラスチックプレート、プレートへの細胞の付着、緩衝液保持構造体、緩衝液、蛍光検出方法その他については、本発明のがん細胞の検出方法との関連で記載された上記内容がそのまま本発明のライブセルイメージング方法においても適用できる。
本発明のまた別の態様は、そのようなガラス又はプラスチックプレートに適用できる、プレート上で緩衝液の保持を十分なものとするための緩衝液保持構造体である。
本発明の他の別の態様は、上記ガラス又はプラスチックプレートと上記緩衝液保持構造体を組み合わせた細胞観察用プレートセットである。
なお、実験は、弘前大学大学院医学研究科倫理委員会承認を経て、インフォームドコンセントを得た被験者に対して行った。
(実験方法)
(1)腹水の調整
卵巣がん(漿液性腺がん)の開腹手術開始直後、腹水採取の目的で腹腔内を生理食塩水で洗浄して得られた洗浄腹水の余剰分を50mLの遠沈管に採取した。次いで1500G,2min室温にて遠心後、上清をデカンテーションで除去した後、Krebs Ringer Buffer(KRB溶液、下記参照)を2mL加えてペレットを分散させ、腹水細胞浮遊液とした。
(1−1)KRB溶液
NaCl 129.0mM,KCl 4.75mM,KH2PO4 1.19mM,MgSO4・7H2O 1.19mM,CaCl2・2H2O 1.0mM,NaHCO3 5.02mM,D−Glucose 5.6mM,HEPES 10.0mM(1M NaOHを適量加えpH7.35に調整)。gap junction/hemichannelを経由する蛍光標識グルコースの出入りを阻害する目的で0.1mM Carbenoxolone(Sigma,#C4790)を加えた。なおKRB溶液は、蛍光標識L−グルコース誘導体(以下、「fLG」と略す場合がある。)溶液を作成するための溶液として使用した。
上記した腹水細胞浮遊液を50mL遠沈管に1mLとり、下記のx2 fLG溶液を1mL加えて混和し、37℃ウォーターバス中で5min間fLGを細胞に接触させた。その後、0℃の冷KRB溶液38mLを加えることで、細胞へのfLGの取り込みを停止させ、0℃にて1500G 2min間の遠心を行い、上清をデカンテーションで除去することで溶液中のfLG濃度を低下させた。ペレットに再度上記冷KRB溶液 40mLを加えて細胞を分散させ、0℃にて1500G 1min間、遠心を行った後、上清を取り除いて、冷KRB溶液 5mLに細胞を分散させた。
(2−1)x2 fLG溶液の調製
2−NBDLGと2−TRLGの混合溶液(fLG溶液)は、それぞれ2−NBDLGが200μM、2−TRLGが40μMとなるように、KRB溶液に特許文献WO2012/133688に記載した方法で溶解して作製した。
市販の自動細胞収集装置CF−12D(サクラファインテックジャパン株式会社製)を用い、本装置専用の6mLチャンバーセット(サクラファインテックジャパン株式会社製、プラスチック製チャンバー、金属製チャンバーホルダー、専用ペーパーフィルターから成る)に、スライドガラスのサイズにカットされたガラスプレート(図1C)をあらかじめセットしておいた。次いで、(2)で作製したfLG適用後の腹水細胞浮遊液 5mLを上記CF−12D専用プラスチック製チャンバーに移し、室温にて1400rpm 1min間の遠心を行った。
遠心終了後、すばやくガラスプレートを取り出し、直ちに細胞付着領域に0.2mLのKRB溶液を加えることで乾燥を防いだ。次いで、細胞付着領域に相当する部分に開口部を設けたシリコーン樹脂製マスク(図1D参照)をガラスプレート上に密着させ、KRB溶液を更に1mL程度細胞付着領域に加えることで、ライブセルイメージング中の細胞維持に十分な量の緩衝液を確保できるようにした。
ガラスプレートには、松浪硝子工業株式会社製のNo.1S(厚み0.16−0.19mm)を図1Aおよび1Cに示すように26mmX76mmのサイズに切断したものを用いた。また、表裏上下左右の判別を容易にする目的で、ガラスプレートの左上の角を斜めにカットした。このガラスプレートの斜めの切欠きは、顕微鏡ステージ上にセットして用いるキーエンス社製スライドガラスホルダーに、スライドガラスの代わりに薄く割れやすい本ガラスプレートを装着する際、ホルダー側の爪でガラスプレートを破損せず、かつホルダー上にガラスプレートをセットする際の位置の誤差によって細胞の同定が困難にならない程度のサイズとした。また、本ガラスプレート上の細胞付着領域の周囲を取り囲むように、あらかじめ市販の免疫組織化学用パップペン(大道産業製スーパーパップペンリキッドブロッカー等)を用いて四角い撥水性領域を設け、自動細胞収集装置を用いた腹水浮遊細胞の遠心操作終了後、細胞を乾燥させないように少量(0.2mL)のKRB溶液を加えて貯留できる構造とした(図1C)。このパップペンで描いた領域は、蛍光観察後に封入する際に封入剤に含まれるキシレンで洗い流され、パパニコロウ観察の邪魔にならない。
緩衝液保持の目的でガラスプレート上に密着させて用いるマスク(緩衝液保持構造体)は、厚さ2mmのシリコーン製で、配向が容易にわかるよう上下左右非対称でかつガラスプレート上に表記したサンプル名等を隠さない大きさとし、ガラスプレート上に気泡を生じずに容易に密着させることが可能で、また細胞に影響を与えずに容易に取り外すことが可能な構造とした(図1Aおよび1D)。マスクの装着および取り外し操作は、上部に設けた4mmほどの突出部を手で持って行う。シリコーンマスクの開口部は、細胞付着領域周囲にパップペンで施した囲みよりわずかに大きいサイズとしている。1mL程度のKRB溶液を滴下するためのものである。マスクは厚く、疎水性であるため、顕微鏡観察中の電動ステージ等による俊敏なXYZの動きによってもKRB溶液がこぼれない。また顕微鏡観察が長時間にわたる場合は、必要に応じてKRB溶液を随時補充することが可能な構造としており、細胞状態を良好に保ちながら観察することが可能である。マスク右端には段差が設けられている。この段差は、顕微鏡ステージ上にセットして用いるキーエンス社製スライドガラスホルダーに、スライドガラスの代わりにシリコーンマスクを密着させたガラスプレートを装着する際に、ホルダー側の突出部と厚いシリコーンマスクとが干渉しない構造としている。
蛍光観察にはオールインワン蛍光顕微鏡BZ−X700(キーエンス株式会社)を用いて専用スライドガラスホルダーにガラスプレートをセットして次のような手順で観察撮影を行った。まずガラスプレート上の細胞付着領域の全域をX20レンズ(下記)を用いて明視野下に検鏡した。本標本中にごく少数みられたがん細胞の可能性のある細胞を撮影した。対象細胞は、X40ないしはX100の高倍で明視野画像ならびに蛍光画像を取得した。蛍光検出には、BZ−X700用の市販フィルタを用い、2−NBDLG蛍光観察用にBZ−X用GFPフィルタ(緑チャネル、OP−87763、Ex 470/40 nm、Em 525/50 nm、DM 495 nm)を、また2−TRLG蛍光観察用にBZ−X TRITCフィルタ(赤チャネル、OP−87764、Ex 545/25 nm、Em 605/70 nm、DM 545 nm)を用いた。
このため、本実施例の2−NBDLG蛍光観察に用いたGFPフィルタは2−TRLGによる蛍光をほとんど透過せず2−NBDLGの取り込みを反映した評価が可能であるが、2−TRLG蛍光観察用に用いたTRITCフィルタは、励起光が2−TRLGのみならず2−NBDLGをもわずかに励起する。このため、2−NBDLG蛍光が強い場合には、赤チャネルに2−TRLGに起因する蛍光に加えて、2−NBDLGに起因する蛍光もわずかにみられ、結果の解釈においては注意が必要である。この問題は、2−TRLG専用に設計された565nm付近の励起光を用いる蛍光フィルタを利用することで大きく軽減することが可能である。なお実施例で用いた撮影条件は下記の通りである。
x20レンズ (CFI Plan Apo λ20X、#972032、NA 0.75、WD 1.00 mm)
明視野画像:モノクロ、高感度、透過照明光量25、開口絞り20%、露光時間1/2500 sec
x40レンズ(CFI Plan Apo λ40x、#972033、NA 0.95、WD 0.25−0.16mm)
明視野画像:高感度、透過照明光量25、開口絞り20%、露光時間1/300s
緑色蛍光画像:高感度、励起光量100%、露光時間1/1.5s
赤色蛍光画像:高感度、励起光量10%、露光時間1/4s
x100レンズ(CFI Plan Apo λ100x, #972037、NA 1.45、WD 0.13mm、油浸) 使用時
明視野画像:高感度、透過照明光量25、開口絞り20%、露光時間1/50s
緑色蛍光画像:高感度、励起光量100%、露光時間1/10s
赤色蛍光画像:高感度、励起光量10%、露光時間1/10s
得られたイメージング画像を図2に示す。図2Aは、卵巣がん(漿液性腺がん)患者の手術時に得られた腹水細胞を生かした状態で顕微鏡観察した明視野像(対物レンズの倍率は100倍)である。形態観察から、がん細胞の疑いのある細胞(画面中央の実線で囲まれた細胞)ならびに正常な腹膜中皮細胞とみられる細胞(画面右上にある破線で囲まれた細胞)を認める。図2Bは、100μMの2−NBDLGと20μMの2−TRLGを含有するKRB溶液適用後の緑色波長域における蛍光顕微鏡画像である。形態的にがん細胞の疑いのある画面中央の細胞(実線)は、2−NBDLGに由来する強い蛍光を発しているのに対し、画面右上の腹膜中皮細胞とみられる細胞(破線)は2−NBDLGの蛍光を発していない。図2Cは、上記したBと同様の画像である。ただし、赤色波長域における蛍光顕微鏡画像である。画面左側にある細胞の破片(Debris)が2−TRLGに由来する強い赤色蛍光を発しているのに対して、形態的にがん細胞の疑いのある画面中央の細胞(実線)も、画面右上の腹膜中皮細胞とみられる細胞(破線)もこのような赤色蛍光を発していないことから、Bでがん細胞の疑いのある細胞に認められた2−NBDLG蛍光が細胞膜損傷に起因する取り込みによってもたらされたものであるとは考えにくい。なお、がん細胞の疑いのある画面中央の細胞の示すわずかな赤色蛍光は、強い2−NBDLG蛍光の長波長側の裾野(非特許文献1参照)が、使用した市販オールインワン型蛍光顕微鏡の蛍光フィルタを通過した成分を反映したと考えられる。図2Dは、明視野像と蛍光像の重ね書き画像である。緑色蛍光を発する2−NBDLGががん細胞の疑いのある細胞に選択的に取り込まれ、正常細胞である腹膜中皮細胞には取り込まれていない様子、ならびに左側の細胞破片が赤色蛍光を発する2−TRLGで染色されている様子が明瞭である。
子宮体がん患者の手術時に得られた腹水細胞に蛍光標識L−グルコース誘導体を適用し、ライブセル蛍光イメージングを行い、次いで、同じ試料を用いて、細胞を固定後にパパニコロウ染色を行った。そして、両者の結果の対応を行った。
(1)腹水の調整
子宮体がん(類内膜腺がん)の開腹手術開始直後、実施例1と同様の方法で腹腔内を生理食塩水で洗浄して得られた洗浄腹水を、あらかじめHanks溶液5mLを入れておいた50mL遠沈管に加えた。得られた腹水浮遊液を1500G,2min室温で遠心後、上清をデカンテーションで除去した。次いで、溶血用市販塩化アンモニウム溶液30mLを加え、2分間静置した後、1500G,2min室温で遠心後、上清をデカンテーションで除去した。このペレットのうち、病院病理部で細胞診検査に使用する部分をとった余剰分を更に2分割して、それぞれKRB溶液40mLの入った50mL遠沈管に分散させ、翌日のfLGの適用まで暗所で室温保管した。
翌日(腹水細胞入手の約20時間後)、細胞浮遊液40mLの入った50mL遠沈管を600G,1min,室温で遠心後、上清をデカンテーションで廃棄し、ペレットにKRB溶液を1mL加えて再分散させた。
実施例1(2−1)と同様にして調整した x2 fLG溶液を1mL加えて混和し、37℃ウォーターバス中で5min間fLGを細胞に接触させた。その後、0℃の冷KRB溶液38mLを加えることで、細胞へのfLGの取り込みを停止させ、0℃にて600G,1min間の遠心を行い、上清をデカンテーションで除去することで溶液中のfLG濃度を低下させた。さらに冷KRB溶液40mLに細胞を再分散させ、再度600G,1min間遠心を行った後上清を除き、冷KRB溶液10mLに腹水細胞を分散させた。
実施例1と同様にして行った。ただしガラスプレート上での細胞位置同定をより容易にするため、細胞付着領域の裏面にあらかじめ耐水性のペンで印を3点つけたガラスプレートを用いた。なお、細胞位置をより簡単に知る目的で、ガラスプレートの細胞付着領域の裏面に、あらかじめ細胞位置同定用の印字を2mm間隔で施しておくことも可能である。これにより、細胞位置の同定ははるかに容易になる。
腹水細胞入手の約22時間後、実施例1と同一機器を用いて観察および撮影を行った。ガラスプレート上の細胞付着領域の全域を明視野下にX10レンズ(下記)を用いて検鏡し、目的細胞は、ガラスプレートの裏面につけたマーカーと同一視野で撮影しておき、パパニコロウ染色後の細胞位置の同定に利用できるようにした。次いで目的細胞の高倍レンズを用いた明視野画像ならびに蛍光画像を取得し、BZ−X700用専用ソフトウェアでステージ上での位置情報登録を行った。用いた撮影条件は下記の通りである。
x10レンズ(CFI Plan Apo λ10x、#972031、NA 0.45、WD 4.00 mm)
明視野画像:モノクロ、高感度、透過照明光25、開口絞り20%、露光時間1/4500s
x40レンズ使用時
明視野画像:高感度、透過照明光量25、開口絞り20%、露光時間1/300s
緑色蛍光画像:高感度、励起光量100%、露光時間1/4s
赤色蛍光画像:高感度、励起光量10%、露光時間1/10s
x100レンズ使用時
明視野画像:高感度、透過照明光量25、開口絞り20%、露光時間1/50s
緑色蛍光画像:高感度、励起光量100%、露光時間1/4s
赤色蛍光画像:高感度、励起光量10%、露光時間1/10s
蛍光観察後、99.5%エタノールを満たした容器中にガラスプレートを浸漬し、5min静置した後にシリコーンマスクを外した。エタノール固定後、常法によりパパニコロウ染色を行い、通常とは上下逆に、ガラスプレート上にスライドガラスを貼り合わせて封入し、永久標本とした。蛍光観察時に撮影した目的細胞を、ステージ上での登録位置情報を基に同一視野で明視野観察するため、ガラスプレートとスライドガラスを貼り合わせる際、両者の端を正確に揃えて封入した。染色後の観察は、通常の正立顕微鏡を用いてマーカーを目印に大まかに視野を調べた後、BZ−X700オールインワン蛍光顕微鏡に登録させた位置情報をもとに再度視野の同定を行い、x40レンズで観察し、撮影した。用いた撮影条件は、明視野カラー、高解像度、透過照明光量25、開口絞り20%、露光時間1/1.5sである。
子宮体がん(類内膜腺がん)患者の手術時に得られた腹水細胞のライブセルイメージング結果をその後のパパニコロウ染色結果と対応させた結果を図3及び図4に示す。図3Aは、形態観察からがん細胞の疑いのある二つの生きた細胞塊の明視野像(対物レンズの倍率は40倍)を示している。腹水入手翌日(約20時間後)にfLGを適用し、約22時間後に撮影したものである。画面右上の黒い部分は、ガラスプレート裏面に記された位置判別用の印の一部である。図3Bは、100μMの2−NBDLGと20μMの2−TRLGを含有するKRB溶液適用後の緑色波長域における蛍光顕微鏡画像である。画面左と右の二つのがん細胞塊のいずれも、2−NBDLGに由来する蛍光を発していることが判る。図3Cは、Bと同様であるが、赤色波長域における蛍光顕微鏡画像である。画面左側の細胞塊が2−TRLGに由来する赤色蛍光を発しており、Bでがん細胞の疑いのある細胞に認められた2−NBDG蛍光には細胞膜損傷に起因する取り込みによってもたらされたものが含まれることを示唆しているのに対して、画面右側の細胞塊(Cluster1)は2−TRLGに由来する赤色蛍光を発しておらず、2−NBDLG蛍光が細胞膜損傷に起因する取り込みによってもたらされたものであるとは考えられない。図3Dは、Cにおける画面右側の細胞塊(Cluster1)の明視野拡大像(対物レンズの倍率は100倍)である。図4Aは、図3Bにおける画面右側の細胞塊(Cluster1)の緑色波長域における拡大蛍光顕微鏡画像である。核を除いた細胞質部分に2−NBDLGが取り込まれている様子がわかる。図4Bは、図3Cにおける画面右側の細胞塊(Cluster1)の赤色波長域における拡大蛍光顕微鏡画像である。2−TRLGに由来する赤色蛍光は認められない。図4Cは、図3D,図4A,図4Bの細胞塊(Cluster1)の明視野像と蛍光像の重ね書き画像である。図4Dは、図3D,図4A,図4Bで示した細胞塊(Cluster1)、すなわち2−NBDLG陽性で2−TRLG陰性の細胞塊を、パパニコロウ染色した後の明視野像である。これは、細胞診断学上の分類では典型的な腺がん細胞の核様態ならびに細胞集合様態の特徴を示している細胞塊であると認められる。
子宮体がん患者の手術時に得られた腹水細胞に蛍光標識L−グルコース誘導体を適用したライブセル蛍光イメージングを行い、次いで、同じ試料を用いて、細胞を固定後にパパニコロウ染色を行った。そして、両者の結果の対応を行った。そこで、反応性中皮細胞と判定された細胞を認めた例である。
(1)腹水の調整
子宮体がんの開腹手術開始直後、実施例1と同様の方法で腹腔内を生理食塩水で洗浄して得られた洗浄腹水を、あらかじめHanks溶液5mLをいれておいた50mL遠沈管に加えた。得られた腹水浮遊液を1500G,2min室温で遠心後、上清をスポイトを用いて除去した。このペレットのうち、病院病理部で細胞診検査に使用する部分をとった余剰分をKRB溶液15mLの入った15mL遠沈管に分散させ、再度1500G,2min室温で遠心した後、上清をスポイトを用いて除去した。ペレットの大部分は赤血球であったが、多量の赤血球が目的細胞を覆い隠すため検鏡の妨げとなる。遠沈管の底には比重の大きい赤血球が沈殿し、その上に目的細胞や白血球、血小板などの成分を含む層(バフィーコート)を形成するため、赤血球量を抑える目的でバフィーコートを含むペレットの上部1/3程度をスポイトで採取し、KRB溶液15mLの入った50mL遠沈管に分散させ、fLGの適用まで暗所で室温保管した。
細胞浮遊液15mLの入った50mL遠沈管を600G,1min室温で遠心後、上清をデカンテーションで廃棄し、ペレットにKRB溶液を1mL加えて再分散させた。
実施例1(2−1)と同様にして調整した x2 fLG溶液を1mL加えて混和し、37℃ウォーターバス中で5min間fLGを細胞に接触させた。その後、0℃の冷KRB溶液38mLを加えることで、細胞へのfLGの取り込みを停止させ、0℃にて650G,1min間の遠心を行い、上清をデカンテーションで除去することで溶液中のfLG濃度を低下させた。さらに冷KRB溶液40mLに細胞を再分散させ、再度650G,1min間遠心を行った後上清を除き、冷KRB溶液10mLに腹水細胞を分散させた。
なお、遠心操作によるガラスプレートへの腹水細胞の付着ならびに生存維持方法、パパニコロウ染色ならびに観察は、実施例2と同様の方法で行った。
画像取得条件は、x40レンズを使用し、下記の通りとした。
明視野画像:高感度、透過照明光量25、開口絞り20%、露光時間1/500s
緑色蛍光画像:高感度、励起光量100%、露光時間1/4s
赤色蛍光画像:高感度、励起光量10%、露光時間1/10s
図5は、ライブセル蛍光イメージングとパパニコロウ染色の結果確認された反応性中皮細胞を含む領域を拡大して示したものである。図5Aは、100μMの2−NBDLGと20μMの2−TRLGを含有するKRB溶液適用後の緑色波長域における蛍光顕微鏡画像(対物レンズの倍率は40倍)である。白線で囲まれた関心領域に存在する細胞群が2−NBDLGに由来する蛍光を発している。関心領域の右にある強い蛍光は、緑色蛍光を持つ不溶性物体である。図5Bは、Aと同様であるが、赤色波長域における蛍光顕微鏡画像である。関心領域の細胞群は2−TRLGに由来する赤色蛍光を発しておらず、2−NBDLG蛍光が細胞膜損傷に起因する取り込みによってもたらされたものであるとは考えられない。図5Cは、AとBの蛍光像を明視野像に重ね合わせた画像である。図5Dは、蛍光染色後に実施したパパニコロウ染色の結果である。A−Cにおいて白線で囲まれた関心領域に存在する細胞群は、反応性中皮細胞と思われる核様態ならびに細胞集合様態の特徴を示している細胞群であると認められる。本例のような腹水由来の細胞診検体に、N/C比が大きい細胞群が認められた場合には、核の大小不同の有無や極性、核小体やクロマチンの様態、細胞自体の大きさ、あるいは細胞の集合形態等を総合して、反応性中皮細胞と判断するか、あるいはがんに移行する可能性が疑われる異常を呈している細胞と判断するか、あるいは判断が難しいケースとするか、診断に主観的要素が強く含まれる。言い換えると、どこまでが反応性中皮で、どこからががんに移行する可能性が疑われる異常を呈している細胞かの線引きが、検査士や細胞診専門医により幅があると言ってよい。本発明により、専ら細胞の形態的な異常情報のみに基づいて判定していた従来の細胞判定とは質的に異なる情報が得られ、がんの経過や予後を調べることで、このような細胞の良悪鑑別に役立つ情報を与えることができる。
実施例4:卵巣がん患者の原液腹水細胞に潅流法により蛍光標識L−グルコース誘導体を適用したライブセル蛍光イメージングと、固定後に行ったパパニコロウ染色結果の対応
卵巣がん患者の手術時に得られた腹水細胞に蛍光標識L−グルコース誘導体を適用し、ライブセル蛍光イメージングを行い、次いで、同じ試料を用いて、細胞を固定後にパパニコロウ染色を行った。そして、両者の結果の対応を行った。
(実験方法)
(1)腹水の調整
卵巣がん(漿液性腺がん)の開腹手術開始直後、腹腔内より採取された腹水原液の余剰分を、あらかじめHanks溶液5mLをいれておいた50mL遠沈管に加えた。得られた腹水浮遊液について竹串でフィブリンの有無を確認した後、メッシュに通して脂肪、不純物を取り除いた。次いで50mL遠沈管2本に半量ずつ分注し、1500G,2min室温で遠心後、2本の遠沈管それぞれの上清を、電動ピペットを用いて液面側から静かに7.5mLまで取り除き、さらにスポイトを用いて1mLを残して除去した。遠沈管底部には赤血球等を含む沈殿層が存在するが、その上表面から1mL分を沈殿層の赤血球を吸わないようにスポイトとマイクロピペットを用いて採取し、腹水細胞浮遊液とした。
(2)遠心操作によるガラスプレートへの腹水細胞の付着ならびに生存維持方法
市販の自動細胞収集装置CF−12D(サクラファインテックジャパン株式会社製)を用い、ガラスプレートへの腹水細胞の付着を行った。具体的には、本装置専用の1mLチャンバーセット(サクラファインテックジャパン株式会社製、プラスチック製チャンバー)に、25.7x75.0mmのサイズにカットされたガラスプレート(図14)に、潅流用シリコーンマスク(図15、アウターマスクとインナーマスクから構成される)を密着させたものを予めセットしておいた。次いで、(1)で調整した腹水細胞浮遊液1mLを上記CF−12D専用プラスチック製チャンバーに移し、室温にて1400rpm 1min間の遠心を行った。
遠心終了後、すばやくガラスプレートを取り出し、直ちに細胞付着領域にKRB溶液を加えることで乾燥を防いだ。次いで、細胞付着領域に相当する部分に開口部を設けたインナーマスクを取り除き、更にKRB溶液をアウターマスクの魚型開口部に加えることでライブセルイメージング中の細胞維持に十分な量の緩衝液を確保できるようにした。かん流をスムーズに行うため、魚型開口部を完全にふさがない程度の大きさのカバーガラス(MATSUNAMI MICRO COVER GLASS:22x22mm)を密着させた後、かん還流ステージへの装着までの間、湿潤箱に入れて保管した。
(2−1)かん流用ライブセルイメージング用特殊カバーガラス(ガラスプレート)
ガラスプレートには、松浪硝子工業株式会社製のNo.1S(厚み0.16−0.19mm)を図1A(要変更)および1C(要変更)に示すように25.7mmx75.0mmのサイズに切断したものを用いた。また、表裏上下左右の判別を容易にする目的で、ガラスプレートの左上の角を斜めにカットした。このガラスプレートの斜めの切欠きは、顕微鏡ステージ上にセットして用いるシステムインスツルメンツ社製の特注かん流ステージへ、薄く割れやすい本ガラスプレートを装着する際、位置の誤差によって細胞の同定が困難にならない程度のサイズとした。
緩衝液保持の目的でガラスプレート上に密着させて用いるマスクは、厚さ0.5mmのシリコーン製で、配向が容易にわかるよう上下左右非対称でかつガラスプレート上に表記したサンプル名等を隠さない大きさとし、ガラスプレート上に気泡を生じずに容易に密着させることが可能で、また細胞に影響を与えずに容易に取り外すことが可能な構造とした(図14および図15)。本シリコーンマスクは、細胞付着領域と同サイズの開口を持つインナーマスクと、インナーマスクを填め込むことが可能な魚型の開口を持つアウターマスクの、入れ子構造となっている。インナーマスクの開口部は細胞付着領域を囲む枠線と同じサイズとしており、遠心操作による細胞付着の際に、細胞付着領域以外への細胞の流出を防ぐものである。アウターマスクの魚型開口は、細胞付着後に開口を塞がないサイズのカバーガラスを貼りつけることで、魚の頭側をInlet、尾側をOutletとした時に、Inletから流入する溶液が自然とOutlet側に溢れ出し、Inlet側には溢れ出ない様な過不足のないかん流を可能とするものである。
腹水細胞浮遊液の調整が済むまでに、顕微鏡用培養装置(東海ヒットINUG2−KIW)をBZ−X700にセットした後、潅流ステージ(図16、図17)を装着したうえで、潅流ポンプ(ISMATEC)と潅流ラインを接続した。かん流にはKRB溶液を用い、供給元の溶液瓶を40℃のウォーターバス内で予め加温することで、溶液に溶け込んだ気泡がかん流ライン内に入らない様にした。また、ラインの始まりにタコ管トラップを設けることで、さらに気泡の流入を防いだ。潅流ステージの上にはダミーのガラスプレートを載せてKRB溶液の潅流を行い、流速が0.7mL/minにおいて細胞付着部分の温度が37.0±0.5℃になるように設定した。具体的には、顕微鏡用培養装置のトップヒータ、バスヒータの温度を設定することで装置内の温度を一定とし、さらに培養装置内の水路に40mL程度の水を注いで同時に加温し、この中に細いステンレスの管を這わせてKRB溶液を通すことで、予め細胞に到達する前のKRB溶液を温めた。
細胞の付着したガラスプレートを、かん流用シリコーンマスクの魚型開口部の頭にあたる部分が潅流装置のInlet側に、開口部の尾にあたる部分をOutlet側になるよう潅流ステージにセットし、潅流スタート時にはかん流の様子を明視野下に検鏡しながら、細胞の付着具合を確認しながら流速0.3mL/minで潅流を開始した。その後1分おきに流速を0.1mL/minずつ上げながら、0.7mL/minまで速度を上げ、潅流が安定していることを確認した。
画像取得は、数か所を手動で撮影する方法ではなく、視野を横にずらしながら指定した範囲内を順に撮影するタイリングの手法を用いた。具体的には、まず細胞観察用カバーガラスの細胞付着領域の全視野をx10レンズで取得した後、x40レンズに切り替え、3点を指定することで撮影範囲と焦点を設定した。具体的には、細胞付着領域を囲む枠線の左上をAとし、枠が画面上の左端に位置するよう配置した。さらに細胞付着ガラス面から6.3ミクロン上部を撮影面として定めた。視野を右にずらし、隣の枠角をBとして、さらにAの対角をCとして同様に設定し、A、Cの2点で撮影領域を、A、B、Cの3点において細胞付着ガラス面から6.3ミクロン上部を撮影面とした。細胞付着ガラス面から6.3ミクロン上部を撮影面とした理由は、がん細胞が概ね高さを持った一個あるいは複数個の立体構造をとっているため、ガラス面に焦点を合わせても、その核や細胞質を観察するために最適な高さではないためである(要検討)。以上の操作によって、撮影時にはx40レンズの視野で1036枚(28x37)の画像を取得することになり、撮影時間にして約3分30秒で細胞付着領域の全視野を撮影可能となる。画像解析の際、専用アプリケーションを用いて画像を貼り合わせ(イメージジョイント)、一枚の大きな画像として表現が可能である。蛍光標識L−グルコース誘導体の投与前の画像は緑色蛍光画像、次いで明視野画像を次の条件で撮影した。
緑色蛍光画像:高感度(Gain 6db,Binning 3x3)、励起光量100%、露光時間1/80s
明視野画像:高感度(Gain 6db,Binning 3x3)、透過照明光量25%、開口絞り20%、露光時間1/500s
(4−1)蛍光標識L−グルコース誘導体溶液の調製
2−NBDLGと2−TRLGの混合溶液(fLG溶液)は、それぞれ2−NBDLGが100μM、2−TRLGが20μMとなるように、KRB溶液に特許文献WO2012/133688に記載した方法で溶解して作製した。
fLG溶液は、KRB溶液とは枝分かれした異なるラインから供給し、KRB溶液と同様に予めウォーターバスで40℃に加温して液中の空気を軽く除去した後に、タコ管トラップを経、かん流ポンプ手前でKRB溶液のラインと合流させた。5分間投与した後、画像取得直前には(4)と同様の方法で撮影面の再設定を行い、KRB溶液に切り替えて10分後に投与後の画像を緑、赤、明視野の順で、次の条件で撮影した。
緑色蛍光画像:高感度、励起光量100%、露光時間1/80s
赤色蛍光画像:高感度、励起光量5%、露光時間1/120s
明視野画像:高感度、透過照明光量25%、開口絞り20%、露光時間1/500s
蛍光観察後、99.5%エタノールを満たした容器中に細胞観察用カバーガラスを浸漬し、5min静置した後に潅流用シリコーンマスクを外した。エタノール固定後、常法によりパパニコロウ染色を行い、スライドガラス上に細胞観察用カバーガラスを貼り合わせて封入し、永久標本とした。蛍光観察時に撮影取得した画像と、パパニコロウ染色後の撮影取得した画像を合わせるために、細胞観察用カバーガラスとスライドガラスを貼り合わせる際、両者の端を正確に揃えて封入した。染色後の観察は、潅流ステージに封入した細胞観察用カバーガラスをセットして、かん流中の画像取得時と同様の撮影範囲、撮影面の設定を行った。撮影条件は、明視野カラー、高解像度(Gain 6db, Binning 1x1)、透過照明光量100%、開口絞り20%、露光時間1/7.5sである。
卵巣がん(漿液性腺がん)患者の手術時に得られた腹水細胞のライブセルイメージング結果をその後のパパニコロウ染色結果と対応させた結果を図6、図7、図8及び図9に示す。図6AはfLG適用前の細胞付着領域全体の緑色波長域の蛍光画像、赤色波長域の蛍光画像図、明視野画像の重ね合わせ画像であり、図6BはfLG適用後の緑色波長域の蛍光画像、赤色波長域の蛍光画像図、明視野画像の重ね合わせ画像である。図8Dとその拡大図である図9のパパニコロウ染色画像の形態観察から、がん細胞の細胞塊の特徴を示していることがわかる。すなわち、1個の細胞体が大きい、核が大きく細胞質に対する割合N/Cが大きい、クロマチンも濃縮している等の特徴を有している。図7Aは図8Dで示された細胞塊のfLG適用前の緑色波長域における蛍光顕微鏡画像で、対して図7BはfLG適用後の緑色波長域における蛍光顕微鏡画像である。
この2つの画像を比較するとがん細胞塊が2−NBDLGに由来する蛍光を発していることが判る。図8Bは同様の細胞塊のfLG適用後の赤色波長域における蛍光顕微鏡画像であるが、2−TRLGに由来する赤色蛍光を発しておらず、この細胞塊の2−NBDLG蛍光が細胞膜損傷に起因する取り込みによってもたらされたものであるとは考えられない。すなわちパパニコロウ染色した後の細胞診断学でがん細胞の核様態ならびに細胞集合様態の特徴を示していると認められる細胞塊が、2−NBDLG陽性で2−TRLG陰性を示しており、本発明による生理的に見たがん細胞の検出法が形態学的な診断法と一致していることを示している。
子宮体がん患者の手術時に得られた洗浄腹水細胞に蛍光標識L−グルコース誘導体を適用し、ライブセル蛍光イメージングを行い、次いで、同じ試料を用いて、細胞を固定後にパパニコロウ染色を行った。そして、両者の結果の対応を行った。
(実験方法)
(1)洗浄腹水の調整
子宮体がん(子宮内膜類内膜腺がん)の開腹手術開始直後、実施例1と同様の方法で得られた洗浄腹水を、あらかじめHanks溶液5mLをいれておいた50mL遠沈管に加えた。腹水浮遊液を実施例4と同様の方法でフィブリン、脂肪、不純物を取り除いた。次いで50mL遠沈管に半量を分注し、1500G,2min室温で遠心後した。
上清を実施例4と同様の方法で処理し、腹水細胞浮遊液1mLを採取した。
(1)で採取した腹水細胞浮遊液1mLを実施例4と同様に、CF−12D専用プラスチック製チャンバーに移し、室温にて1400rpm 1min間の遠心を行うことで腹水細胞をガラスプレートに付着させ、実施例4と同様の処置をし、かん還流ステージへの装着までの間、湿潤箱に入れて保管した。
実施例4と同様にして行った。
実施例4と同様にして行った。蛍光標識L−グルコース誘導体の投与前の画像は緑色蛍光画像のみを撮影した。また、fLG溶液を5分間投与した後、KRB溶液に切り替えて10分後に投与後の画像を緑、赤、明視野の順で撮影した。エタノール固定後のパパニコロウ染色についても同様である。
子宮体がん(子宮内膜類内膜腺がん)患者の手術時に得られた洗浄腹水細胞のライブセルイメージング結果とその後のパパニコロウ染色結果と対応させた結果を図10、図11、図12及び図13に示す。図10AはfLG適用前の細胞付着領域全体の緑色波長域の蛍光画像、赤色波長域の蛍光画像図、明視野画像の重ね合わせ画像であり、図10BはfLG適用後の緑色波長域の蛍光画像、赤色波長域の蛍光画像図、明視野画像の重ね合わせ画像である。図11C、図11D及び図12D、図13a,bの形態観察から、中皮細胞とマクロファージ細胞とみられる細胞(画面のa及びbの細胞塊)を認める。図11Bは、100μMの2−NBDLGと20μMの2−TRLGを含有するKRB溶液適用後の緑色波長域における蛍光顕微鏡画像である。a、bどちらの細胞塊とも適用前の図11Aの画像と比較して、2−NBDLGに由来する蛍光を発していない。さらに図12Bの赤色波長域における蛍光画像においてもa、bどちらも赤色蛍光を発していない。このことから細胞膜損傷を来たしていない正常な中皮細胞およびマクロファージ細胞には2−NBDLGが取りこまれない様子がわかる。図12Dとその拡大図13a,bは蛍光染色後に実施したパパニコロウ染色の結果である。1個の細胞体の大きさが小さく、核は大きさが一様でN/Cも小さい特徴がわかる。また核の変性や凝集による細胞へのダメージが少なく、検査士や細胞診専門医による形態判定に何ら支障を来たさない染色結果であり、潅流法による有効性が示されている。
Claims (13)
- ヒトから採取した試料を用いたがん細胞の二重検出方法であって、
(a)蛍光の検出に基づくがんの検出方法
及び
(b)以下の工程からなるアルコール固定された細胞を用いた染色法からなるがんの検出方法、
前記プレートをアルコール固定液に浸して細胞を固定した後、パパニコロウ染色、ギムザ染色、PAS染色、グロコット染色、及び免疫細胞化学染色からなる群から選ばれるいずれか一つの染色方法によって染色して、がん細胞を検出する方法、
を含み、方法(a)と方法(b)で検出するがん細胞が同一のがん細胞であり、
方法(a)は、ヒトから採取した試料を用いたがん細胞の検出方法であって、
(a−1)採取した試料中に含まれる生きた細胞を、生きた細胞内に取り込まれる蛍光標識L−グルコース誘導体を含む緩衝液中にてインキュベートし、該蛍光標識L−グルコース誘導体を取り込ませる工程、
(a−2)緩衝液を前記蛍光標識L−グルコース誘導体を含まない緩衝液に交換して該蛍光標識L−グルコース誘導体の取り込みを停止する工程、
(a−3)前記細胞を薄いガラス又はプラスチックプレート上の細胞付着領域に付着させ、次いで、プレート上に設けられ、かつ前記細胞付着領域を含みかつ囲むように構成された緩衝液を保持するための緩衝液保持領域に緩衝液を入れ、細胞を生存状態に維持する工程、ここで、前記緩衝液保持領域は、細胞が付着したプレート面と、緩衝液保持領域を取り囲むように設計された緩衝液保持構造体とから構成される、
(a−4)前記付着した細胞内に存在する前記蛍光標識L−グルコース誘導体が発する蛍光を検出する工程、及び
(a−5)前記蛍光の検出に基づいてがん細胞を検出する工程、
を含む方法か、
又は、
(a−1)採取した試料中に含まれる生きた細胞を、薄いガラス又はプラスチックプレート上の細胞付着領域に付着させる工程、
(a−2)プレート上に設けられ、かつ前記細胞付着領域を含みかつ囲むように構成された緩衝液を保持するための緩衝液保持領域に緩衝液を入れ、細胞を生存状態に維持する工程、ここで、前記緩衝液保持領域は、細胞が付着したプレート面と、緩衝液保持領域を取り囲むように設計された緩衝液保持構造体とから構成される、
(a−3)緩衝液を、生きた細胞内に取り込まれる蛍光標識L−グルコース誘導体を含む緩衝液に交換し、次いで、プレートに付着させた細胞に、該蛍光標識L−グルコース誘導体を接触させることによりこれを取り込ませる工程、
(a−4)緩衝液を前記蛍光標識L−グルコース誘導体を含まない緩衝液に交換して該蛍光標識L−グルコース誘導体の取り込みを停止し、前記付着した細胞内に存在する前記蛍光標識L−グルコース誘導体が発する蛍光を検出する工程、及び
(a−5)前記蛍光の検出に基づいてがん細胞を検出する工程、
を含む方法である、
方法。 - 前記方法(b)がパパニコロウ染色である請求項1に記載の方法。
- 採取した試料中に含まれる生きた細胞が、浮遊細胞液に含まれる細胞塊、擦過剥離細胞に含まれる細胞塊、又は穿刺吸引細胞に含まれる細胞塊である請求項1または2に記載の方法。
- 前記細胞が、患者の喀痰、尿、腹水、胸水、心嚢液、脳脊髄液、胆汁、膵液、関節液又は血液から選ばれる浮遊細胞液から由来する細胞である、請求項1から3いずれか一つに記載の方法。
- 前記細胞が、卵巣がん患者又は子宮体がん患者の腹水由来の細胞である、請求項4に記載の方法。
- 前記蛍光標識L−グルコース誘導体が、蛍光分子団として7−ニトロベンズ−2−オキサ−1,3−ジアゾール基又はその誘導体を分子内に有する蛍光標識L−グルコース誘導体である請求項1から5いずれか一つに記載の方法。
- 前記蛍光標識L−グルコース誘導体が、2−[N−(7−ニトロベンズ−2−オキサ−1,3−ジアゾール−4−イル)アミノ]−2−デオキシ−L−グルコース(2−NBDLG)と、2位にスルホローダミン101をスルホンアミド結合した2−アミノ−2−デオキシ−L−グルコース(2−TRLG)との混合物である、請求項6に記載の方法。
- 前記工程(a−5)におけるがん細胞の検出において、蛍光イメージングされた細胞の蛍光色調を指標に該細胞の細胞膜損傷状態を判断することをさらに含む、請求項1から7のいずれか一つに記載の方法。
- 前記緩衝液保持構造体は、前記緩衝液保持領域に相当する開口部を有する板状又はリング形状の構造体であって、前記緩衝液を保持するのに十分な厚さを有する、請求項1から8のいずれか一つに記載の方法。
- 前記緩衝液保持構造体がシリコーンから作られた厚さ0.5〜10mmの構造体である、請求項9に記載の方法。
- 前記プレートの厚さが0.3mm以下である請求項1から10いずれか一つに記載の方法。
- 少なくとも蛍光顕微鏡を用いて細胞を観察するための、細胞観察用ガラス又はプラスチックプレートであって、
表面上に細胞を生存状態で維持するための緩衝液を保持するための緩衝液保持領域を有し、厚みが0.3mm以下であり、かつ細胞を付着させる面とは反対の面に細胞の位置情報を示すためのマーキングを有するプレート。 - 請求項12記載のプレートと緩衝液を保持するための緩衝液保持構造体とを含む細胞観察用構造体であって、
該緩衝液保持構造体は、緩衝液保持領域を取り囲むように設計された板状又はリング形状のシリコーンから作られた厚さ0.5〜10mmの緩衝液保持構造体である、
細胞観察用構造体。
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