TW201908732A

TW201908732A - 經稀釋之活體樣品成分之分析方法

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Publication number: TW201908732A
Application number: TW107142776A
Authority: TW
Inventors: 大澤進; 杉本晋哉; 米久保功
Original assignee: 日商立佳有限公司
Priority date: 2014-07-25
Filing date: 2016-01-22
Publication date: 2019-03-01
Also published as: US20200319215A1; US20200319216A1; WO2016013115A1; TWI734053B; TW201908733A; EP3173786A4; CN109799127A; JP2016118565A; TWI713488B; JP6152179B2; EP3282261B1; JP6139012B2; JP2016191709A; CN107076728B; JPWO2016013388A1; US10712354B2; CN107076728A; US11808777B2; TWI742321B; EP3173786B1

Abstract

本發明提供一種活體樣品成分之分析方法，其能夠簡便且準確地對自手指等所採集之微量且未知量之全血樣品之血漿成分及血球成分之任一成分進行定量及計算。本發明係一種對微量血液中之活體樣品成分進行分析之方法，其特徵在於：對添加上述血液之稀釋緩衝液、與該稀釋緩衝液中所含之內部標準物質及/或外部標準物質進行分析，算出稀釋率，而對上述血液中之血漿或血清成分中之活體成分進行分析。

Description

經稀釋之活體樣品成分之分析方法

本發明關於一種對血液等活體樣品中之分析對象成分進行測定之方法，其係利用具有特定組成之緩衝液稀釋活體樣品，根據經稀釋之樣品之混合溶液對血漿樣品成分或酶活性進行分析。本發明進而關於一種微量活體樣品成分之分析方法與血球之計數測定，其係利用特定緩衝液稀釋未定量之微量血液等活體樣品，根據經稀釋之樣品混合溶液而進行血漿樣品成分之定量及酶活性之分析。

患者或受檢者為了診斷各種病症、判定治療效果及健康管理，必須前往醫療機構或診查場所，採集靜脈血液進行檢查。但是，得知檢查結果需要等待較長時間。又，存在為了進行檢查需要請假半天以上時間之問題。作為無論何時何地均能夠進行血液檢查之方法，報告有如下方法：利用含內部標準物質之緩衝液稀釋微量血液，根據內部標準物質之稀釋倍數而對稀釋血漿中以未知量存在之成分量進行定量(例如參照專利文獻1)。具體而言，作為利用特定緩衝液稀釋微量血液，根據經稀釋之樣品混合溶液而定量血漿樣品成分及分析酶活性之方法，已知有使用甘油-3-磷酸或甘油作為內部標準物質之方法(例如參照專利文獻2)。又，已知於血球成分之計數測定時使用酪胺作為該稀釋內部標準物質之方法(例如參照專利文獻3)。另一方面，關於根據微量之血液進行檢查之方法，報告有作為採集血液之方法而使用濾紙之方法(例如參照專利文獻4)。藉由使用微量之血液而能夠隨時隨地進行檢查，由此期待可對發現亞疾病或保持健康作出貢獻。 [先前技術文獻] [專利文獻] [專利文獻1]日本專利特開2003-161729號公報 [專利文獻2]日本專利特開2006-322829號公報 [專利文獻3]日本專利特開2011-112451號公報 [專利文獻4]日本專利特開平10-104226號公報

[發明所欲解決之問題] 然而，上述先前之稀釋率算出法中，使用甘油-3-磷酸作為血漿之稀釋內部標準物質，其經活體內所存在之酶即鹼性磷酸酶水解而生成甘油。因此，若添加血液後之保存時間變長或溫度變高，則無法獲得準確之血液稀釋率。因此，有關原血漿中之活體成分或酶活性之測定值之可靠性降低。若為先前之方法，為了解決上述情況而必須添加作為酶抑制劑之EDTA。然而，該抑制劑之添加並不能完全地抑制酶，因此必須進而添加磷酸作為產物抑制劑，該等2種物質之添加導致天冬胺酸胺基轉移酶或丙胺酸胺基轉移酶之活性降低。其結果必須過量地添加作為該等酶之活化劑的磷酸吡哆醛。作為解決該等問題之內部標準物質，可採用膽鹼等帶陽離子電荷之物質作為內部標準，但存在於塑膠容器上吸附明顯、不適於長期保存之課題。關於該等物質，已作為[專利文獻2]提出過申請，但由於分子內具有芳香環，故而疏水性較高，若長期保存於塑膠容器內則會發生吸附，從而存在無法準確求出血液之稀釋倍數之問題。發現作為分子內不具有芳香環而浸透至血球內之物質，乙醇胺等化合物較為有效。該等物質於血液中基本不存在，且為穩定之化合物。又，能夠溶解於內部標準液之緩衝液，不會因長期保存而吸附於塑膠容器。本發明之目的在於解決上述課題，提供一種能夠簡便且準確地對自對象者之手指等身體表面所採集之經稀釋之少量且未知量之全血樣品之成分進行定量的稀釋率算出法。又，專利文獻3所記載之方法中，用作內部標準物質之甘油-3-磷酸為穩定之化合物，但於樣品較少之情形時，內部標準物質之稀釋率較小，而存在該稀釋倍數之可靠性降低之問題。又，如專利文獻4記載之方法，即利用濾紙或多孔質材料吸收血液後，使之乾燥，寄往相關機構，萃取血液成分之方法存在於乾燥過程或郵寄時成分發生改性之情況。又，關於自乾燥樣品中萃取活體成分之緩衝液，為了pH值調整或活體成分穩定化，必須採用添加有NaOH或NaCl、HCl之緩衝液。因此，無法將於樣品之成分中最具恆常性且個體間差異較少之鈉或氯之濃度作為外部標準物質而用於被稀釋之其他活體成分之原濃度之修正。另一方面，關於利用緩衝液進行稀釋之方法，活體樣品中之活體成分被保存於pH值7.4之生理條件之緩衝液中，輸送過程中之穩定性亦優異，但利用添加有內部標準物質之緩衝液進行稀釋之樣品中之內部標準物質之稀釋率較小，於添加較少樣品之情形時易產生測定誤差。本發明之目的在於提供一種利用緩衝液稀釋活體樣品後對活體樣品中之分析對象成分進行定量分析之方法，其求出利用緩衝液試藥活體成分所獲得之樣品中之活體成分濃度，根據作為外部標準之樣品中恆常成分之稀釋率而準確地求出活體樣品之稀釋倍數，對活體樣品中之分析對象成分進行定量分析。進而，本發明之目的在於提供一種利用緩衝液稀釋活體樣品後對活體樣品中之分析對象成分進行定量分析之方法，其針對使用內部標準物質而求出活體樣品之稀釋倍數之方法、使用外部標準物質而求出活體樣品之稀釋倍數之方法兩者之缺點進行修正，準確地求出活體樣品之稀釋倍數，對活體樣品中之分析對象成分進行定量分析。 [解決問題之技術手段] 為了達成上述目的，本發明具有如下特徵：於對血液等活體樣品中之活體成分進行分析時，1.利用內部標準物質進行分析，或者2.利用外部標準物質，或者3.利用內部標準物質及外部標準物質。 1.利用內部標準物質之分析方法(內部標準法) 本發明係一種對血液等活體樣品中之活體成分進行分析之方法，其特徵在於：對添加上述血液等活體樣品之稀釋緩衝液、與該稀釋緩衝液中所含之內部標準物質進行分析，算出稀釋率，算出血漿、血清或血球之活體成分之稀釋率，對上述血液等活體樣品中之血漿、血清或者活體樣品中之活體成分進行分析。本發明之血漿樣品活體樣品成分之分析方法中，上述緩衝液中之內部標準物質較佳為長期穩定、不會吸附於裝有上述緩衝液之容器之成分，且上述內部標準物質為上述血液等活體樣品中幾乎不含有之物質，能夠利用生物化學自動分析裝置等容易且高精度地進行分析。又，本發明之血漿樣品活體樣品成分之分析方法中，上述緩衝液中之內部標準物質較佳為不會浸透至上述血球內之成分，而能夠準確地反映上述血漿或上述血清之稀釋率之物質。同様地，於血球數之計算方法中，上述緩衝液中之內部標準物質較佳為不會浸透至上述血球內之成分，而能夠準確地反映上述全血(血漿與血球)之稀釋率之物質。進而，本發明之活體樣品成分之分析方法中，上述緩衝液較佳為具有如下試劑組成，其對血球膜之浸透壓為250～500 mOsm/kg，即便與血液混合而亦不會導致上述血球發生溶血。進而，本發明之活體樣品成分之分析方法中，上述緩衝液較佳為具有能夠穩定地維持上述血液中之活體樣品成分而不會使之發生改性的組成。進而，本發明之活體樣品成分之分析方法中，血漿內部標準物質較佳為包含鋰或麥芽糖。根據血漿之稀釋率而能夠求出血漿濃度，但無法求出血球之體積。若可求出血液之全血(血漿與血球)，則能夠進行貧血檢查。因此，較佳為包含疏水性且不會吸附於塑膠之乙醇胺作為浸透至血球內之內部標準物質。藉由測定該內部標準，可求出血液量整體之稀釋率。根據血液之血漿之稀釋率與血液量整體之稀釋率，可求出血球之體積比率(血容比)。即，本發明如下所述。 [1-1]一種活體樣品成分之分析方法，其係使用用以添加樣品血液之稀釋緩衝液，對該稀釋緩衝液中所含之內部標準物質進行分析，算出血漿或血清之稀釋率，對上述樣品血液中之血漿或血清成分中之活體成分進行分析，且上述稀釋緩衝液所含之內部標準物質係使用具有不會浸透至血球內之性質的選自由含麥芽糖之二糖類、麩胺酸、白胺酸、纈胺酸、異白胺酸、4-羥基苯、羥基丁酸、肌酸、蘋果酸、Trinder試劑、鋰所組成之群中之物質。 [1-2]如[1-1]之活體樣品成分之分析方法，其中稀釋緩衝液所含之內部標準物質為鋰。 [1-3]一種活體樣品成分之分析方法，其係使用用以添加樣品血液之稀釋緩衝液，對該稀釋緩衝液中所含之內部標準物質進行分析，算出血液之稀釋率，對上述樣品血液中之血球計算數或血漿之活體成分進行分析，且上述稀釋緩衝液所含之內部標準物質係使用具有會浸透至血球內之性質的選自由乙醇胺、己胺、苯基乙基胺、戊胺、組織胺、腐胺、次黃嘌呤、色胺酸、孕烯醇酮、β-植固醇所組成之群中之物質。 [1-4]一種活體樣品成分之分析方法，其係使用用以添加樣品血液之稀釋緩衝液，對該稀釋緩衝液中所含之內部標準物質進行分析，算出血液或血漿或血清之稀釋率，對上述樣品血液中之血球計算數或血漿之活體成分或者上述樣品血液中之血漿或血清成分中之活體成分進行分析，且上述稀釋緩衝液包含作為具有不會浸透至血球內之性質之上述內部標準物質的選自由鋰、含麥芽糖之二糖類、麩胺酸、白胺酸、纈胺酸、異白胺酸、4-羥基苯、羥基丁酸、肌酸、蘋果酸、Trinder試劑所組成之群中之物質，與作為具有會浸透至血球內之性質之上述內部標準物質的選自由乙醇胺、己胺、苯基乙基胺、戊胺、組織胺、腐胺、次黃嘌呤、色胺酸、孕烯醇酮、β-植固醇所組成之群中之物質。 [1-5]如[1-1]之活體樣品成分之分析方法，其中上述稀釋緩衝液所含之內部標準物質係選自分子量500以下之化學物質且分子內具有選自由硫酸根離子(-SO^3- )、羧酸根離子(-COO^- )、硫醇基(-SH)、四級胺(-NH³⁺ )所組成之群中之取代基的化合物之中。 [1-6]如[1-1]之活體樣品成分之分析方法，其中上述稀釋緩衝液所含之內部標準物質係Trinder試劑，即選自由ADOS(N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺)、ADPS(N-乙基-N-磺丙基-3-甲氧基苯胺)、ALPS(N-乙基-N-磺丙基苯胺)、DAOS(N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺)、HDAOS(N-(2-羥基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺)、MAOS(N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3,5-二甲基苯胺)、TOOS(N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺)、TOPS(N-乙基-N-磺丙基-3-甲基苯胺)所組成之群中之化合物。 [1-7]如[1-1]至[1-6]中任一項之活體樣品成分之分析方法，其中上述稀釋緩衝液具有即便與血液混合而亦不會導致上述血球發生溶血之試劑組成。 [1-8]如[1-1]至[1-7]中任一項之活體樣品成分之分析方法，其中上述稀釋緩衝液為了能夠穩定地維持上述血液中之活體樣品成分而不會使之發生改性而包含將乙二胺四乙酸鹽、檸檬酸鹽、草酸鹽等螯合劑、硫酸阿米卡星(amikacin)、硫酸卡那黴素(kanamycin)、噻苯咪唑(thiabendazole)、迭氮化鈉等抗菌劑或防腐劑、磷酸吡哆醛、鎂、鋅等輔酶、甘露醇、右旋糖(dextrose)、寡糖等糖類、選自由十二烷基硫酸鈉、水銀、肝素所組成之群中之抑制劑根據被測定成分而單獨使用或組合複數種之組成的添加物。 [1-9]如[1-4]之活體樣品成分之分析方法，其特徵在於：根據上述內部標準物質之稀釋率而算出血液之血球體積率(血容比)。 2.利用外部標準物質之分析方法(外部標準法) 已知血液中之鈉或氯具有非常高之恆常性，個體間之變動亦較小。該鈉之中央值濃度亦達到142 mmol/L，作為活體濃度而言較高，即便經緩衝液稀釋，亦能夠高精度地測定高稀釋倍數之樣品濃度。然而，於將鈉或氯用於外部標準之情形時，無法使用含鈉或氯之緩衝液作為稀釋用緩衝液。本發明者等人首先研究使用於活體內之恆常性較高之鈉、氯或蛋白質作為外部標準物質。為了使用該等外部標準物質，必須避免於稀釋活體樣品之緩衝液中存在鈉或氯。於先前並不存在於pH值7.4附近具有緩衝能力、且不含鹼(NaOH等)之緩衝液。本發明者等人嘗試開發新穎之緩衝液，作為不含鹼金屬類(NaOH等)或氯離子且呈鹼性之化合物，利用2-胺基-2-甲基-1-丙醇、2-乙基胺基乙醇、N-甲基-D-葡糖胺、二乙醇胺、三乙醇胺等胺基醇化合物。本發明者等人有如下新發現：於該等化合物中混合作為生物化學研究用而具有優異性能之Good's緩衝液(兩性離子緩衝液)、即pKa(酸度係數)為pH值7.4附近之緩衝液，即HEPES(2-[4-(2-Hydoxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid，2-[4-(2-羥基乙基)-1-哌基]乙磺酸)、TES(N-Tris(hydroxymethyl) methyl-2-aminoethanesulfonic acid，N-三(羥甲基)甲基-2-胺基乙磺酸)、MOPS(3-Morpholinopropanesulfonic acid，3-嗎啉-4-基丙磺酸)、BES(N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid，N,N-雙(2-羥基乙基)-2-胺基乙磺酸)作為酸，藉此能夠將pH值調整為7.4。又，發現該等緩衝液不含作為外部標準物質之一例之鈉或氯，不會對測定對象之鈉或氯之測定系統產生干擾。進而，發現經該等緩衝液稀釋之成分亦不會對利用生物化學、免疫自動分析裝置之各種測定法產生干擾，進而血球不會發生溶血或活體成分即便於37℃下亦能夠獲得穩定保存。又，由於要對經緩衝液稀釋之血漿中之活體成分進行測定，緩衝液成分不能使該等活體成分發生改性或不能影響其穩定性。發現作為該一例，混合2-胺基-2-甲基-1-丙醇(AMP)與HEPES而將pH值調整為7.4之緩衝液維持活體成分之穩定而不會使之發生改性，亦不會干擾該等活體成分之測定試劑。進而，發現了準確地定量經稀釋用緩衝液稀釋之活體樣品中之低濃度之鈉的方法。本發明使用於活體樣品中維持一定濃度之血漿中鈉等作為外部標準物質，該等物質為元素且為穩定之活體成分。藉由準確地測定作為經緩衝液稀釋之外部標準物質的鈉等，能夠求出血漿之稀釋倍數，利用市售之生物化學、免疫自動分析裝置，能夠高效地對多個樣品進行所採集之血液中之未知濃度之稀釋血漿活體樣品成分之定量及酶活性分析。即，本發明如下所述。 [2-1]一種血液樣品中之分析對象成分之定量分析方法，其係於利用稀釋用緩衝液稀釋微量血液樣品後對血液中之分析對象成分進行定量分析之方法中，包括使用外部標準物質而算出血液樣品之稀釋倍數者，並且外部標準物質係恆常地以特定濃度包含於血液樣品中之成分，上述稀釋用緩衝液不含會對外部標準物質之定量產生干擾之成分，該方法包括：測定經稀釋用緩衝液稀釋之血液樣品中之外部標準物質濃度，基於該等測定值而算出血液樣品之稀釋倍數。 [2-2]一種血液樣品中之分析對象成分之定量分析方法，其包括：測定經稀釋用緩衝液稀釋之血液樣品中之外部標準物質濃度，基於該等測定值而算出血液樣品之稀釋倍數。 [2-3]如[2-1]或[2-2]之定量分析方法，其中外部標準物質係選自由鈉、氯、白蛋白及總蛋白所組成之群中。 [2-4]如[2-3]之定量分析方法，其中外部標準物質係選自由鈉、氯及總蛋白所組成之群中。 [2-5]如[2-1]至[2-4]中任一項之定量分析方法，其中稀釋用緩衝液係包含選自由2-胺基-2-甲基-1-丙醇、2-乙基胺基乙醇、N-甲基-D-葡糖胺、二乙醇胺及三乙醇胺所組成之群中之胺基醇化合物以及選自由HEPES(2-[4-(2-Hydoxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid)、TES(N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid)、MOPS(3-Morpholinopropanesulfonic acid)及BES(N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid)所組成之群中之緩衝劑作為緩衝劑成分、且於pH值7.4下具有緩衝作用的緩衝液。 [2-6]如[2-1]至[2-4]中任一項之定量分析方法，其中稀釋用緩衝液實質上不含鈉及氯。 [2-7]如[2-1]至[2-6]中任一項之定量分析法，其中微量血液樣品之稀釋倍數係根據以下計算式(I)之計算式而算出，定量稀釋血漿中之分析對象成分，乘以根據計算式(I)所求出之稀釋倍數，而定量原血漿中之分析對象成分： A X＝--------- (I) B A：血漿中外部標準物質濃度之健康者中央值之吸光度 B：稀釋血漿中之外部標準物質之吸光度 X：血漿稀釋倍數 [此處，所謂稀釋血漿係指利用稀釋用緩衝液稀釋血液樣品後去除血球所獲得之血漿]。 [2-8]如[2-3]至[2-7]中任一項之定量分析方法，其係利用β-半乳糖苷酶之酶活性會根據鈉離子濃度而發生變化，從而能夠根據其吸光度變化量來定量鈉離子濃度的情況，藉由以下方法對使用稀釋用緩衝液進行稀釋之血液樣品中之鈉進行測定：利用稀釋用緩衝液稀釋活體樣品，進而利用純化水進行稀釋；添加樣品量之10～30倍體積量之作為含β-半乳糖苷酶之緩衝液的第1試劑，於30～45℃下加熱2～20分鐘，添加第1試劑量之一半量之作為含鄰硝基苯-β-D-哌喃半乳糖苷(o-Nitrophenyl-β-D-Galactpyranoside)之基質液的第2試劑，於主波長410 nm、副波長658 nm下測定反應速度之吸光度。 [2-9]一種緩衝液，其係於如[2-1]至[2-8]中任一項之定量分析方法中用於稀釋微量血液樣品之稀釋用者，包含選自由2-胺基-2-甲基-1-丙醇、2-乙基胺基乙醇、N-甲基-D-葡糖胺、二乙醇胺及三乙醇胺所組成之群中之胺基醇化合物以及選自由HEPES(2-[4-(2-Hydoxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid)、TES(N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid)、MOPS(3-Morpholinopropanesulfonic acid)及BES(N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid)所組成之群中之緩衝劑作為緩衝劑成分，且於pH值7.4下具有緩衝作用。 [2-10]如[2-9]之緩衝液，其實質上不含鈉及氯。 3.利用內部標準物質與外部標準物質之分析方法(混合法) 如上所述，藉由單獨利用內部標準物質之分析方法及單獨利用外部標準物質之分析方法，能夠準確地測定微量活體樣品中之分析對象活體成分。本發明者等人為了進行更準確之測定，對兼具利用內部標準物質之方法之優點與利用外部標準物質之方法之優點、且修正利用內部標準物質之方法之缺點與利用外部標準物質之方法之缺點的方法展開銳意研究。如上所述，使用於活體內之恆常性較高之鈉、氯、蛋白質作為外部標準物質，且使用不含用作外部標準物質之物質之緩衝液，藉此能夠進行準確之測定。然而，即便為於正常健康人群中具有較高恆常性之物質，根據受檢者之不同，有時亦會偏離正常健康人之濃度範圍，於該情形時，存在不利於進行準確測定之情況。另一方面，稀釋用緩衝液中之內部標準物質可設定為較高濃度，因此能夠高精度地測定。然而，於活體樣品之量較少之情形時，內部標準物質之稀釋程度變小，稀釋倍數之可靠性降低。又，作為有機化合物之內部標準物質，甘油-3-磷酸為穩定之物質而可加以利用，作為無機物之內部標準物質，可較佳地利用鋰。本發明者等人針對能夠消除單獨使用外部標準物質之方法之缺點與單獨使用內部標準物質之方法之缺點的方法之開發，進行了銳意研究。本發明者等人為了消除先前之內部標準物質之缺點，研究使用屬於穩定性較高之鹼金屬類或鹼土金屬類之元素，使用於活體內之恆常性較高之鈉、氯或蛋白質作為外部標準物質。藉由將內部標準物質與作為於活體樣品中之恆常性較高之成分的外部標準物質加以組合而併用，能夠對使用內部標準物質之方法及使用外部標準物質之方法該兩種定量法之缺點進行修正完善，而形成一種高可靠性之稀釋成分定量法、即高測定精度之定量法，從而完成本發明。本發明具有以下特徵。使用於活體樣品中維持一定濃度之血漿中鈉等作為外部標準物質，又，關於作為血漿中完全不含或幾乎不含之成分且不會通過血球膜的內部標準物質，使用鋰等屬於鹼金屬類或鹼土金屬類之元素或穩定之甘油-3-磷酸，將其添加至緩衝液中。於使用先前之有機化合物作為內部標準物質之情形時，受到活體酶之作用而於保存穩定性方面存在問題。該內部標準物質於緩衝液中長期保持穩定，能夠容易地定量。又，待測定之活體樣品中之作為外部標準物質之鈉亦為元素，故較穩定。其結果，能夠利用市售之生物化學、免疫自動分析裝置，高效地對多個樣品定量所採集之血液中之未知濃度之稀釋血漿活體樣品成分及分析酶活性。即，本發明如下所述。 [3-1]一種血液樣品中之分析對象成分之定量分析方法，其係於利用稀釋用緩衝液稀釋樣品後對血液中之分析對象成分進行定量分析之方法中，包括使用內部標準物質及外部標準物質而算出血液樣品之稀釋倍數者，並且內部標準物質係以特定濃度添加於稀釋用緩衝液中，外部標準物質係恆常地以特定濃度包含於血液樣品中之成分，上述稀釋用緩衝液不含會對內部標準物質及外部標準物質之定量產生干擾之成分，該方法包括：測定經稀釋用緩衝液稀釋之血液樣品中之內部標準物質濃度與外部標準物質濃度，基於該等測定值而算出血液樣品之稀釋倍數。 [3-2]一種定量分析方法，其係藉由使用上述外部標準物質濃度之測定值，對根據上述內部標準物質濃度之測定值所求出之血液樣品之稀釋倍數進行修正，而對上述血液樣品中之分析對象成分進行定量分析。 [3-3]如[3-1]或[3-2]之定量分析方法，其中內部標準物質係屬於鹼金屬類或鹼土金屬類之元素，外部標準物質係選自由鈉、氯、白蛋白及總蛋白所組成之群中。 [3-4]如[3-3]之定量分析方法，其中內部標準物質為鋰或甘油-3-磷酸，外部標準物質為鈉。 [3-5]如[3-1]至[3-4]中任一項之定量分析方法，其中稀釋用緩衝液係包含選自由2-胺基-2-甲基-1-丙醇、2-乙基胺基乙醇、N-甲基-D-葡糖胺、二乙醇胺及三乙醇胺所組成之群中之胺基醇化合物以及選自由HEPES(2-[4-(2-Hydoxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid)、TES(N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid)、MOPS(3-Morpholinopropanesulfonic acid)及BES(N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid)所組成之群中之緩衝劑作為緩衝劑成分，且具有pH值6.5～pH值8.0之緩衝作用的緩衝液。 [3-6]如[3-1]至[3-5]中任一項之定量分析方法，其中稀釋用緩衝液實質上不含鈉及氯。 [3-7]如[3-1]至[3-6]中任一項之定量分析法，其中微量血液樣品之稀釋倍數係根據以下之計算式(1)～(4)中之任一計算式而算出，定量稀釋血漿中之分析對象成分，乘以根據計算式(1)～(4)中之任一式所求出之稀釋倍數，而定量原血漿中之分析對象成分：計算式(1) A＋C X＝-------- (1) B＋D ；計算式(2) √(A² ＋C² ) X＝-------------- (2) √(B² ＋D² ) ；計算式(3) X＝a×(B＋D)±b (3) [此處，a及b為係數，預先取得B＋D與稀釋倍數之資料，製作X＝a×(B＋D)±b所表示之標準曲線]；以及計算式(4) X＝A/B' (4) [此處，B'＝(A×D)/C]； [上述式中，A、B、C、D、B'及X之定義如下： A：添加有內部標準物質之緩衝液中之內部標準物質之吸光度、 B：稀釋血漿中之內部標準物質之吸光度、 C：血漿中外部標準物質濃度之正常中央值之吸光度、 D：稀釋血漿中之外部標準物質之吸光度、 B'：基於根據外部標準物質之吸光度所算出之稀釋倍數的稀釋血漿中之內部標準物質之吸光度之修正值、及 X：血漿稀釋倍數] [此處，所謂稀釋血漿係指利用稀釋用緩衝液稀釋血液樣品後去除血球所獲得之血漿]。 [3-8]如[3-1]至[3-7]中任一項之定量分析方法，其係利用β-半乳糖苷酶之酶活性會根據鈉離子濃度而發生變化，從而能夠根據其吸光度變化量來定量鈉離子濃度的情況，藉由以下方法對作為使用稀釋用緩衝液進行稀釋之血液樣品中之外部標準之一的鈉進行測定：利用稀釋用緩衝液稀釋活體樣品，進而利用純化水進行稀釋，添加樣品量之10～30倍體積量之作為含β-半乳糖苷酶之緩衝液的第1試劑，於30～45℃下加熱2～20分鐘，添加第1試劑量之一半量之作為含鄰硝基苯-β-D-哌喃半乳糖苷(o-Nitrophenyl-β-D-Galactpyranoside)之基質液的第2試劑，對所生成之鄰硝基苯酚(o-Nitrophenol)於主波長410 nm、副波長658 nm下測定吸光度。 [3-9]一種緩衝液，其係於如[3-1]至[3-8]中任一項之定量分析方法中用於稀釋微量血液樣品之稀釋用者，包含選自由2-胺基-2-甲基-1-丙醇、2-乙基胺基乙醇、N-甲基-D-葡糖胺、二乙醇胺及三乙醇胺所組成之群中之胺基醇化合物以及選自由HEPES(2-[4-(2-Hydoxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid)、TES(N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid)、MOPS(3-Morpholinopropanesulfonic acid)及BES(N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid)所組成之群中之緩衝劑作為緩衝劑成分，且於pH值7.4下具有緩衝作用。 [3-10]如[3-9]之緩衝液，其實質上不含鈉及氯。 [3-11]如[3-9]或[3-10]之緩衝液，其用於使用外部標準物質之定量分析方法。 [3-12]如[3-9]或[3-10]之緩衝液，其用於使用內部標準物質之定量分析方法。 [發明之效果] 於活體樣品中之分析對象活體樣品成分之分析中，利用內部標準物質或外部標準物質而求出活體樣品之稀釋倍數，對成分進行定量分析，藉此不測定微量活體樣品成分之活體樣品檢體量而能夠準確地對活體樣品成分進行分析測定。又，根據本發明，對於經由手指等自體內所採集之微量且未知量之全血樣品等活體樣品之血漿及活體樣品中之任一成分，均可使用塑膠容器，簡便且準確地進行定量。又，根據血漿稀釋率與全血稀釋率，通過計算而能夠求出作為血液之貧血程度的血球體積比率(血容比)。進而，藉由使用全血之內部標準標準物質，能夠算出血球成分(白血球數：WBC、紅血球數：RBC、血紅蛋白量：Hgb、血容比：Hct)。進而，於單獨使用內部標準物質或外部標準物質之情形時，存在定量之精度或準確性欠缺之情況。本發明中，將內部標準物質與外部標準物質兩者加以併用而求出活體樣品之稀釋倍數，因此利用由外部標準物質所求出之稀釋倍數對由內部標準物質所求出之稀釋倍數進行修正而使之成為更準確之值，從而能夠以更高精度對分析對象成分進行定量。又，先前並不存在於pH值7.4之中性附近具有緩衝能力且不含鈉或氯之緩衝液，因此無法將作為於活體中之恆常性較高之物質的鈉或氯用作外部標準物質。根據本發明之方法，藉由使用新開發出之於pH值7.4之中性附近具有緩衝能力且不含鈉或氯之緩衝液，能夠使用恆常性較高之鈉或氯作為外部標準物質，能夠實現精度更高與準確性更高之分析。根據本發明之方法，使用微量血液(65 μL)即可進行13項生物化學檢查、腫瘤標記、肝炎檢查等多項檢查。該檢查法由於對時間與場所無限定，故而即便無法接受體檢，亦能夠發現亞疾病。又，由於能夠愉悅地進行檢查，故而易於實現健康管理，因此能夠於病情嚴重化之前注意到體內之變化，亦有助於縮減國民醫療費用。

1.利用內部標準物質之分析法(內部標準法) 本發明具有以下特徵。即，根據本發明之一特徵，本發明係對所採集之未知濃度之含血球之活體樣品之成分進行定量及酶活性分析之方法，準備作為於活體樣品完全不含或幾乎不含之成分且不會通過血球膜的內部標準物質，將其添加至緩衝液中。對添加血液前之緩衝液中之內部標準物質濃度進行分析，測定其吸光度與血液添加後之經稀釋之緩衝液中之內部標準物質之濃度，藉此根據該吸光度之比率而求出血液中之血漿稀釋率，求出原血漿中之活體成分或酶活性。於該情形時，較佳為對上述緩衝液之浸透壓進行調整，以使之大致成為血液浸透壓。根據本發明之方法，於求解血漿之稀釋倍率時，無需求出活體樣品之檢體量。將使用內部標準物質之方法稱為內部標準法，例如將使用鋰作為內部標準物質之方法稱為鋰(Li)內部標準法。上述未知濃度之活體樣品亦可為不含血球之活體樣品(唾液、尿液等)。於該情形時所使用之內部標準物質可為透過血球膜之物質。作為測定緩衝液中之內部標準物質之濃度的代表性方法，存在酶測定法，即，藉由添加以該內部標準物質或由內部標準物質所衍生之物質作為受質之氧化酶而生成過氧化氫，於存在過氧化酶之條件下使Trinder試劑與4-胺基安替比林(antipyrine)進行氧化縮合，而獲得醌色素或NAD(P)H、雙偶氮鹽，測定、定量其顯色作為吸光度。作為其他之內部標準物質之定量方法，存在直接測定內部標準物質本身之吸光度之方法、使用對應於內部標準物質之抗體及標記抗體而藉由吸光度或化學發光進行測定之方法、層析法等，可根據所使用之內部標準物質而採用定量方法。為了求出血液經緩衝液稀釋後之血漿成分之準確之稀釋率，添加於緩衝液中之內部標準物質必須為於活體內不存在或以極少量存在之成分，必須不會透過血球膜，必須於緩衝液中保持穩定，必須不會吸附於容器。又，必須不會對其他活體成分產生干擾。如圖1所示，已知血液1係由作為液體成分之血漿或血清2與作為固體成分之血球3所構成，進而，血球3具有血球膜等固體成分並於其內側具有液體成分。藉由對血液1添加作為抗凝固劑之EDTA-2鈉，可抑制血球3之凝固。若對該全血進行離心分離，則比重較重之血球3沈澱至最下部，與成為上清液之血漿分離。又，如圖2所示，預先於容器內之緩衝液4中收容不會透過血球膜之內部標準物質5(圖2(a))，將所採集之血液1自容器之上部導入至緩衝液4與內部標準物質5之混合層之上側(圖2(b))。進而，於利用特定緩衝液4稀釋血液1之情形時，原本存在於血漿或血清2中之不會透過血球膜之成分分佈於緩衝液4及血漿或血清2中，得到稀釋而成為血液稀釋溶液6(圖2(c))。此時，於緩衝液4中溶解有規定量之不會透過血球膜之內部標準物質5之情形時，原本存在於緩衝液中之內部標準物質5分佈於緩衝液4及血漿或血清2中而得到稀釋。作為該內部標準物質5，包含僅會浸透至血漿2中之麥芽糖等內部標準物質5。麥芽糖以陰離子之形式溶解於緩衝液4，因此溶存於血漿2中，且不會浸透至血球3內。為了求出血漿成分之稀釋率而添加至緩衝液中之內部標準物質係分子量500以下之化學物質且分子內具有硫酸根離子(-SO^3- )、羧酸根離子(-COO^- )、硫醇基(-SH)、四級胺(-NH³⁺ )等取代基之化合物，選自由麥芽糖等二糖類、麩胺酸、白胺酸、纈胺酸、異白胺酸、4-羥基苯、羥基丁酸、肌酸、蘋果酸、金屬類(鋰、鈉、鉀、氯)、作為分子內具有硫酸基之Trinder試劑之(N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺)、ADPS(N-乙基-N-磺丙基-3-甲氧基苯胺)、ALPS(N-乙基-N-磺丙基苯胺)、DAOS(N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺)、HDAOS(N-(2-羥基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺)、MAOS(N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3,5-二甲基苯胺)、TOOS(N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺)、TOPS(N-乙基-N-磺丙基-3-甲基苯胺)所組成之群中。其中，較佳為鋰。圖3中顯示內部標準物質5於全血(血漿2＋血球3)中之分佈之說明圖。圖3所示之情形時之內部標準物質5(例如乙醇胺)浸透至血漿2與血球3兩者中。預先於容器內之緩衝液4中收容會透過血球膜之內部標準物質5(圖3(a))，將所採集之血液1自容器之上部導入至緩衝液4與內部標準物質5之混合層之上側(圖3(b))。進而，於利用特定緩衝液4稀釋血液1之情形時，原本存在於血漿或血清2中之會透過血球膜之內部標準物質存在於血球3及血漿或血清2兩者中，均勻地分散於血漿或血清2中而構成血液稀釋溶液6(圖3(c))。即，圖3所示之情形時所使用之內部標準物質5分佈於血漿2與血球3兩者中，故而可求出因緩衝液4而產生之稀釋倍數。會透過血球膜之內部標準物質係分子量500以下之化學物質且具有胺基(-NH₂ )、烷基(-CH₃ 、-C₆ H₆ )、酯基(-COOR)、烷氧基(-OR)、鹵素(-Cl、-Br、-I)等疏水性取代基之化合物，可列舉：乙醇胺、己胺、苯基乙基胺、戊胺、組織胺、腐胺、次黃嘌呤、色胺酸、孕烯醇酮、β-植固醇等。對應於該等內部標準，可藉由使用氧化酶之酶測定法進行分析。該等內部標準物質分佈於血球內與血漿內，故而可用於求解全血(血漿＋血球)之稀釋倍數。稀釋活體成分之緩衝液4必須能夠與活體樣品以任意分量進行混和，且能夠穩定地保存活體樣品中之被測定成分。緩衝液4之成分無限定，可列舉具有緩衝能力之HEPES{2-[4-(2-羥基乙基)-1-哌基]乙磺酸}緩衝液、ACES[N-(2-乙醯胺)-2-胺基乙磺酸]緩衝液、ADA[N-(2-乙醯胺)亞胺基二乙酸]緩衝液、BES[N,N-雙(2-羥基乙基)-2-胺基磺酸]緩衝液、Bicine[N,N-雙(2-羥基乙基)甘胺酸]緩衝液、Bis-Tris[雙(2-羥基乙基)亞胺基三(羥甲基)甲烷]緩衝液、CAPS(N-環己基-3-胺基丙磺酸)緩衝液、CAPSO(N-環己基-2-羥基-3-胺基丙磺酸)緩衝液、CHES(N-環己基-2-胺基乙磺酸)緩衝液、DIPSO{3-[N,N-雙(2-羥基乙基)胺基]-2-羥基丙磺酸}緩衝液、EPPS{3-[4-(2-羥基乙基)-1-哌基]丙磺酸}緩衝液、HEPPSO{2-羥基-3-[4-(2-羥基乙基)-1-哌基]丙磺酸一水合物}緩衝液、MES(2-嗎啉基乙磺酸一水合物)緩衝液、MOPS(3-嗎啉-4-基丙磺酸)緩衝液、MOPSO(2-羥基-3-嗎啉-4-基丙磺酸)緩衝液、PIPES[哌-1,4-雙(2-乙磺酸)]緩衝液、POPSO[哌-1,4-雙(2-羥基-3-丙磺酸)二水合物]緩衝液、TAPS[N-三(羥甲基)甲基-3-胺基丙磺酸]緩衝液、TAPSO[2-羥基-N-三(羥甲基)甲基-3-胺基磺酸]緩衝液、TES[N-三(羥甲基)甲基-2-胺基乙磺酸]緩衝液、Tricine{N-[三(羥甲基)甲基]甘胺酸}緩衝液、乙酸緩衝液、磷酸緩衝液、檸檬酸緩衝液、硼酸緩衝液、酒石酸緩衝液、磷酸緩衝液生理食鹽水等，其濃度無特別限定，較佳為0.1～1000 mmol/L，尤佳為10～500 mmol/L。緩衝液之pH值無特別限定，就待稀釋之活體樣品之穩定性之方面而言，較理想為活體樣品原本之pH值附近，於血液、血漿或血清之情形時，較佳為pH值6～8。為了穩定地保存被測定成分，稀釋緩衝液中亦可包含螯合劑、抗菌劑、防腐劑、輔酶、糖類、抑制劑等。作為螯合劑之一例，可列舉：乙二胺四乙酸鹽、檸檬酸鹽、草酸鹽等。作為抗菌劑或防腐劑之一例，可列舉：硫酸阿米卡星、硫酸卡那黴素、噻苯咪唑、迭氮化鈉等。作為輔酶之一例，可列舉：磷酸吡哆醛、鎂、鋅等。作為糖類之一例，可列舉：甘露醇、右旋糖、寡糖等。作為抑制劑之一例，可列舉：十二烷基硫酸鈉、水銀、肝素等。根據被測定成分，可將複數種穩定化劑以組合之形式添加。於利用緩衝液稀釋血液、血漿或血清，將AST(天冬胺酸胺基轉移酶)及ALT(丙胺酸胺基轉移酶)設為被測定成分之情形時，較佳為緩衝液中包含乙二胺四乙酸鹽及磷酸吡哆醛。於該情形時，緩衝液較理想為包含乙二胺四乙酸鹽0.1～5.0 mmol/L、磷酸吡哆醛0.01～0.20 mmol/L，尤佳為包含乙二胺四乙酸0.5～3.0 mmol/L、磷酸吡哆醛0.02～0.10 mmol/L。關於添加至緩衝液中之內部標準物質，要求其於活體內不存在或為極微量，不會干擾活體成分，於緩衝液內保持穩定，不會吸附於保存容器，可用於能夠進行高精度測定之檢測系統。又，於稀釋血液之情形時，必須為如不會使血球發生溶血之浸透壓，較佳為250～500 mOsm/kg之浸透壓。表1中，作為緩衝液之一例，顯示含有作為不會透過血球膜之一內部標準物質之肌胺酸及作為會透過血球膜之一內部標準物質之乙醇胺的緩衝液之組成。 [表1] 含麥芽糖、乙醇胺之緩衝液組成此處，HEPES為N-2-羥基乙基哌-N'-2-乙磺酸。表2中顯示作為不會通過血球膜之一內部標準物質的肌胺酸之測定試劑。 [表2] 麥芽糖測定試劑此處，TOOS為N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺鈉二水合物。以下揭示麥芽糖之測定程序。於麥芽糖測定時，使用上述R1及R2。 1.將7.0 μl之混合活體樣品與90 μl之R1加以混合，於37℃下放置5分鐘。 2.於545/658 nm波長下測定吸光度。――A1(吸光度) 3.混合30 μl之R2，於37℃下放置5分鐘。 4.於545/658 nm波長下測定吸光度。――A2(吸光度) 吸光度可以測定值之差的形式表示。因此，一般而言，吸光度係以ΔA＝A2－A1之形式獲得。表3中顯示作為會通過血球膜之一內部標準物質的乙醇胺之測定試劑。 [表3] 乙醇胺測定試劑此處，DAOS為N-乙基-N(2-羥基-3-磺丙基)-3,5-二甲基苯胺鈉鹽。以下揭示乙醇胺之測定程序。於乙醇胺測定時，使用上述R1及R2。 1.將11 μl之混合活體樣品與90 μl之R1加以混合，於37℃下放置5分鐘。 2.於596/805 nm波長下測定吸光度。――A3(吸光度) 3.混合45 μl之R2，於37℃下放置5分鐘。 4.於546/884 nm波長下測定吸光度。――A4(吸光度) 吸光度可以測定值之差的形式表示。因此，一般而言，吸光度係以ΔA＝A4－A3之形式獲得。關於吸光度與濃度之關係，根據Lambert-Beer定律，已知A＝ε×c×l。此處，A(吸光度)、ε(莫耳吸光係數)、c(溶質之莫耳濃度)、l(光路長)。吸光度(A)與溶質之莫耳濃度(c)呈現比例關係，對溶解有既知濃度之溶質之溶液進行測定而獲得校準曲線，使用所獲得之校準曲線，藉此一般可算出未知樣品中之溶質之濃度。如圖1所示，已知血液1係由作為液體成分之血漿或血清2與作為固體成分之血球3所構成，進而，血球具有血球膜等固體成分並於其內側具有液體成分。藉由對血液添加作為抗凝固劑之EDTA-2鈉，可抑制血球之凝固。若對該全血進行離心分離，則比重較重之血球沈澱至最下部，與成為上清液之血漿分離。又，如圖2所示，於利用特定緩衝液4稀釋血液1之情形時，原本存在於血漿或血清2之不會透過血球膜之成分分佈於緩衝液4及血漿或血清2中而得到稀釋。此時，於緩衝液4中溶解有規定量之不會透過血球膜之內部標準物質5之情形時，原本存在於緩衝液中之內部標準物質分佈於緩衝液及血漿或血清中而得到稀釋。該內部標準表示僅會浸透至血漿中之麥芽糖等內部標準。麥芽糖以陰離子之形式溶解於緩衝液中，因此溶存於血漿中，且不會浸透至血球內。即，緩衝液4中之不會透過血球膜之內部標準物質5之初期濃度(C0)由於血液之添加而變為濃度(C1)。由C0及C1，算出血漿或血清之稀釋率(r1)＝C0/(C0－C1)。將緩衝液量設為V0、將向緩衝液中添加血漿或血清後之總量設為V1。此處，原本存在於血漿或血清之不會透過血球膜之成分之稀釋率等於血漿或血清2之稀釋率，因此藉由r1＝(V0＋V1)/V1＝C0/(C0－C1)而算出。於利用特定緩衝液4稀釋血液1之情形時，會透過血球膜之成分分佈於緩衝液、血漿或血清及血球中而得到稀釋。此時，於緩衝液中溶解有規定量之會透過血球膜之內部標準物質之情形時，原本存在於緩衝液中之該內部標準物質分佈於緩衝液、血漿或血清及血球中而得到稀釋。若將血球膜體積設為(V2)、血球內體積設為(V3)，即，緩衝液中之會透過血球膜之內部標準物質之初期濃度(C2)由於血液之添加而變為濃度(C3)。由該C2及C3，算出血液整體之稀釋率(r2)＝(V0＋V1＋V2＋V3)/(V1＋V2＋V3)＝C2/(C2－C3)。此處，原本存在於血漿或血清及血球液體中之會透過血球膜之成分之稀釋率等於血液整體之稀釋率，因此藉由r2＝(V0＋V1＋V2＋V3)/(V1＋V2＋V3)＝C2/(C2－C3)而算出。該等可用於以下表4所示之任一情形。 [表4] 進而，於利用包含不會透過血球膜之內部標準物質之溶液稀釋活體樣品時，若包含內部標準物質之溶液之體積(V0)為規定量，則根據由不會透過血球膜之內部標準物質所算出之不會透過血球膜之活體樣品成分之稀釋率(r1)，可算出不會透過血球膜之活體樣品之體積(V1)。即，可根據 V1＝V0/(r1－1) 而算出。又，於利用包含會透過血球膜之內部標準物質5之溶液稀釋活體樣品時，若包含內部標準物質之溶液之體積(V0)為定量，則根據由會透過血球膜之內部標準物質所算出之血液之稀釋率(r2)，可算出血液之體積(V1＋V2＋V3)。即，可根據 V1＋V2＋V3＝V0/(r2－1) 而算出。於利用包含不會透過血球膜之內部標準物質與會透過血球膜之內部標準物質之溶液稀釋活體樣品時，根據由V0與r1所求出之V1、及由V0與r2所求出之V1＋V2＋V3兩式，可算出V2＋V3＝(V1＋V2＋V3)－V1＝V0/(r2－1)－V0/(r1－1)。又，已知血球包含65%之液體與35%之固體。根據V2/(V2＋V3)＝0.65， V2＝0.65×{V0/(r2－1)－V0/(r1－1)} V3＝0.35×V2/0.65 V3＝0.35×{V0/(r2－1)－V0/(r1－1)} 因此，於利用包含不會透過血球膜之內部標準物質之溶液、包含會透過血球膜之內部標準物質之溶液、或包含不會透過血球膜之內部標準物質與會透過血球膜之內部標準物質之溶液稀釋活體樣品時，根據V0、r1、r2而可算出V1、V2、V3。進而，藉由將V0、r1、r2、V1、V2、V3加以組合，可算出血漿或血清之量(V1) 血漿或血清之稀釋率(r1) 血漿或血清及血球液體之量(V1＋V2) 血液整體之稀釋率(r2) 血液量(V1＋V2＋V3) 血液之稀釋率{(V0＋V1＋V2＋V3)/(V1＋V2＋V3)} 血球量(V2＋V3) 血球之稀釋率{(V0＋V2＋V3)/(V2＋V3)} 血球液體之量(V2) 血球液體之稀釋率{(V0＋V2)/V2} 血球固體之量(V3) 血球固體之稀釋率{(V0＋V3)/V3} 血容比(%){(V2＋V3)/(V1＋V2＋V3)×100(%)}或1－(血液稀釋率－1)/(血漿稀釋率－1) 緩衝液之量(V0) 緩衝液對血漿或血清之稀釋率{(V0＋V1)/V0} 緩衝液對血漿或血清及血球液體之稀釋率{(V0＋V1＋V2)/V0} 緩衝液對血液之稀釋率{(V0＋V1＋V2＋V3)/V0} 緩衝液對血球液體之稀釋率{(V0＋V2)/V0} 緩衝液對血球固體之稀釋率{(V0＋V3)/V0} 緩衝液對血球之稀釋率{(V0＋V2＋V3)/V0} 等。藉由單獨使用V0、r1、r2、V1、V2、V3或將該等加以組合所算出者並不限定於上述例。 2.利用外部標準物質之分析法(外部標準法) 本發明係一種利用緩衝液稀釋血液等活體樣品後對活體樣品中應定量之分析對象成分進行定量之方法，其特徵在於：使用作為活體樣品成分之外部標準物質而求出活體樣品之稀釋倍數，根據該稀釋倍數而對活體樣品中之分析對象成分進行定量。根據本發明之方法，於求解活體樣品之稀釋倍率時，無需求出活體樣品之檢體量。將使用外部標準物質之方法稱為外部標準法，例如將使用鈉作為外部標準物質之方法稱為鈉(Na)外部標準法。使用作為活體成分所含之恆常成分的外部標準物質而求出稀釋倍數。本發明中，作為設為分析對象之活體樣品，可列舉：血液、血清、血漿、尿液、唾液、淋巴液、髓液、間質液、汗液等活體樣品，其中，較佳為血液、血清、血漿。尤其於本發明之較佳態樣中，自受檢者採集微量血液，經緩衝液稀釋後，藉由過濾器或離心分離而分離血球，使用所獲得之血漿或血清而對分析對象成分進行測定。又，本發明由於使用稀釋用緩衝液稀釋活體樣品，故而活體樣品為微量即足夠。尤其於活體樣品為血液之情形時，使用200 μL以下之微量血液樣品即可對分析對象成分進行測定。活體樣品之來源不限定於人類，亦可為動物類、魚類、鳥類等。例如作為動物類，可列舉：馬、牛、豬、綿羊、山羊、狗、貓、小鼠、熊、熊貓等。成為分析對象之活體樣品成分無限定，活體樣品中所含之所有物質均為對象。例如可列舉臨床診斷中所使用之血液中之生物化學檢查項目、腫瘤標記或肝炎標記等各種疾病之標記等，可列舉蛋白質、糖、脂質、低分子化合物等。又，測定不僅針對物質之濃度，酶等具有活性之物質之活性亦為測定對象。各分析對象成分之測定可藉由公知方法進行。外部標準物質係包含於活體樣品中之恆常性較高之物質，即，於活體樣品中濃度之生理變動較少之物質，進而較佳為於人類個體間活體樣品中濃度之差異較小之物質。作為此種物質，可列舉鈉(Na⁺ )、氯(Cl^- )、蛋白質。作為蛋白質，例如可列舉血液中所包含之恆常性較高之白蛋白或血清中總蛋白等。其中，尤佳為恆常性較高、且個體間之變動較少之鈉。人類血漿中之鈉濃度之正常值、即正常健康人之血漿中之鈉濃度約為135～145 mmol/L(mEq/L)，中央值約為142 mmol/L。95%之受檢者其血漿中鈉濃度包含於正常範圍內。相較於該正常範圍，2.5%之受檢者其血漿中鈉濃度偏低，2.5%之受檢者其血漿中鈉濃度偏高。根據使用緩衝液稀釋後之外部標準物質之濃度與正常健康人之血漿中鈉濃度之平均值，可求出用作檢體之活體樣品之稀釋倍數。又，於使用血液、血清、血漿以外之活體樣品作為活體樣品之情形時，根據各活體樣品中之鈉濃度之中央值而可求出稀釋倍數。由於使用活體樣品中所含之物質作為外部標準物質，故而作為稀釋活體樣品之緩衝液，必須使用不含外部標準物質、或者即便含有而亦為不會對活體樣品經稀釋後之混合物中之外部標準物質之測定產生影響之程度之極微量濃度的緩衝液。又，必須使用不含會妨礙外部標準物質之測定之物質、或者即便含有而亦為不會對活體樣品經稀釋後之稀釋溶液中之外部標準物質之測定產生影響之程度之極微量濃度的緩衝液。將不含該等物質、或者即便含有而亦為不會對活體樣品經稀釋後之混合物中之外部標準物質之測定造成影響之程度之極微量濃度的緩衝液稱為實質上不含上述物質之緩衝液。例如本發明之方法中所使用之稀釋用緩衝液中之鈉濃度為100 nmol/L以下。例如於使用鈉或氯作為外部標準物質之情形時，活體樣品之稀釋用緩衝液必須不含鈉或氯、或者即便含有而亦為極微量。進而，鈉會影響屬於鹼金屬類之元素或屬於鹼土金屬類之元素之定量，因此活體樣品之稀釋用緩衝液必須不含鈉、或者即便含有而亦為極微量。又，由於要對活體樣品中之目標分析對象物進行測定，故而為了防止目標分析對象物發生分解或改性，活體樣品之稀釋用緩衝液必須為pH值接近活體樣品，即pH值6.5～pH值8.0、較佳為pH值7.0～pH值7.5、更佳為pH值7.4之緩衝液。進而，本發明中，由於要對經緩衝液稀釋之血液中之活體成分進行測定，故而緩衝液成分必須不能影響該等所欲測定之活體成分之改性或穩定性。先前並不存在於pH值7.4左右具有緩衝能力且不含鈉或氯之緩衝液，因此無法將鈉或氯用作外部標準物質。本發明中，新開發了一種於pH值7.4左右具有緩衝能力且不含鈉或氯之緩衝液，從而能夠將鈉或氯用作外部標準物質。可列舉將作為不含上述鈉、氯、鹼金屬類元素及鹼土金屬類元素之鹼性物質的2-胺基-2-甲基-1-丙醇(AMP)、2-乙基胺基乙醇、N-甲基-D-葡糖胺、二乙醇胺、三乙醇胺等胺基醇化合物類，與作為顯示酸性之化合物的Good's緩衝劑、即pKa為pH值7.4附近之緩衝劑{HEPES(2-[4-(2-Hydoxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid)(pKa＝7.55)、TES(N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-Aminoethanesulfonic acid)(pKa＝7.50)、MOPS(3-Morpholinopropanesulfonic acid)(pKa＝7.20)或BES(N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-Aminoethanesulfonic acid)(pKa＝7.15)}加以組合、混合而成之緩衝液。其中，較佳為2-胺基-2-甲基-1-丙醇(AMP)與HEPES、TES、MOPS或BES之組合，更佳為2-胺基-2-甲基-1-丙醇(AMP)與HEPES之組合。為了製作上述緩衝液，只要將胺基醇與Good's緩衝劑以1：2～2：1、較佳為1：1.5～1.5：1、更佳為1：1之濃度比進行混合即可。緩衝液之濃度無限定，胺基醇或Good's緩衝劑之濃度為0.1～1000 mM/L，較佳為1～500 mM/L，更佳為10～100 mM/L。為了穩定地保存分析對象成分，緩衝液中可含有螯合劑、界面活性劑、抗菌劑、防腐劑、輔酶、糖類、抑制劑等。作為螯合劑，可列舉：乙二胺四乙酸鹽(EDTA)、檸檬酸鹽、草酸鹽等。作為界面活性劑，例如可列舉：陽離子界面活性劑、陰離子界面活性劑、兩性界面活性劑或非離子界面活性劑。作為防腐劑，例如可列舉迭氮化鈉或抗生素等。作為輔酶，可列舉：磷酸吡哆醛、鎂、鋅等。作為糖類，可列舉：甘露醇、右旋糖、寡糖等。作為抑制劑，可列舉：十二烷基硫酸鈉、水銀、肝素等。尤其藉由添加甘露醇與磷酸吡哆醛，能夠使血球膜或酶保持穩定，藉由添加3～4種抗生素或抗菌劑，能夠抑制於手指採血時自手指表面混入之部分細菌之增殖，能夠抑制由細菌引起之活體成分之分解而實現活體成分之穩定化。於使用全血作為活體樣品之情形時，需要利用過濾器濾除經稀釋之血液中之血球成分，因此關於緩衝液之浸透壓，藉由採用與血液同等(285 mOsm/kg)或其以上之浸透壓，可防止血球發生溶血。浸透壓可藉由對所欲測定之活體成分之定量無影響的鹽類、糖類等、緩衝劑等而調整為等張。本發明亦包括為了藉由本發明之方法使用活體樣品之稀釋倍數而使用之上述緩衝液。作為外部標準物質之氯(Cl^- )、蛋白質亦可藉由公知方法進行測定。例如關於氯，存在測定吸光度之方法，其係由於澱粉酶會於氯離子作用下活化，故而根據其反應速度而可測定氯。關於蛋白質，可藉由雙縮脲法、布拉德福德(Bradford)法、洛利(Lowry)法等進行測定。於測定白蛋白時，可藉由作為色素法之溴甲酚綠法進行測定。關於對經緩衝液稀釋之用作外部標準之活體樣品中鈉進行測定之方法，存在火焰分光光度計、原子吸光法、離子選擇電極法等。本發明中，於使用血液作為活體樣品之情形時，自手指採集微量血液並利用緩衝液加以稀釋而獲得之樣品僅為150 μL左右，且待測定之生物化學成分或免疫檢查項目多達10項以上，因此必須使用數μL之微量樣品來測定作為外部標準物質之鈉。又，由於需要分析大量樣品，故而必須能夠適應市售之生物化學、免疫自動分析裝置。於鈉測定中，半乳糖苷酶之酶活性藉由鈉離子而得到活化。因此，本發明中，作為鈉測定法，開發出使用數μL之經緩衝液稀釋之鈉濃度非常低(24 mmol/L以下)之樣品進行測定的酶測定法。關於該酶測定法，經稀釋之活體樣品之微量鈉測定係利用β-半乳糖苷酶於鈉作用下之活化、並利用經緩衝液稀釋之樣品之鈉濃度與半乳糖苷酶活性的比例關係而進行。該方法能夠適應生物化學、免疫自動分析裝置，從而無需其他測定機器來進行鈉測定，就該方面而言，效率性較高且具有經濟性。上述鈉測定法中，利用稀釋用緩衝液稀釋血液等活體樣品，進而利用純化水進行稀釋，添加稀釋樣品之10～30倍體積量之作為含β-半乳糖苷酶之緩衝液的第1試劑，於30～45℃下加熱2～20分鐘後，添加第1試劑量之一半量左右之作為含鄰硝基苯-β-D-哌喃半乳糖苷(o-Nitrophenyl-β-D-Galactpyranoside)之基質液的第2試劑，於主波長410 nm、副波長658 nm下測定吸光度。更詳細而言，利用稀釋用緩衝液稀釋血液等活體樣品，進而利用純化水稀釋5倍左右，於1～10 μL、較佳為3 μL之經稀釋之活體樣品與緩衝液混合物中，以含β-半乳糖苷酶之緩衝液、與經稀釋之活體樣品與緩衝液混合物之體積比成為10～30、較佳為成為15～25的方式添加30～100 μL、較佳為52 μL之含β-半乳糖苷酶之緩衝液作為第1試劑。繼而，於30～45℃、較佳為37℃下加熱2～20分鐘、較佳為5分鐘，繼而，添加25 μL之含鄰硝基苯-β-D-哌喃半乳糖苷(o-Nitrophenyl-β-D-Galactpyranoside)之基質液作為第2試劑。其後，於主波長410 nm、副波長658 nm下測定吸光度，藉此可測定鈉濃度。本發明之求解活體樣品之稀釋倍數之方法較理想為如以下般進行之態樣。將活體樣品10～200 μL添加至緩衝液50～500 μL中進行混合。此時，較佳為緩衝液之體積為活體樣品之體積之3～4倍以上。例如於活體樣品為血液之情形時，將微量血液樣品65 μL添加至緩衝液280 μL中進行混合。於活體樣品為血液之情形時，稀釋後去除紅血球、白血球等血球。血球可利用過濾器而去除，亦可對稀釋血液樣品實施離心分離而去除。使用血球經去除之稀釋血漿樣品，對分析對象成分進行測定。於將微量血液樣品65 μL添加至緩衝液280 μL中之情形時，65 μL之血液樣品約包含30 μL之血漿，因此血漿約被稀釋了10倍。於使用血液作為活體樣品之情形時，只要以換算成血漿計，血漿被稀釋了5～20倍、較佳為5～16倍、更佳為5～10倍、尤佳為8～10倍左右之方式混合血液與稀釋用緩衝液即可。又，同時測定稀釋血漿樣品中之外部標準物質濃度。根據外部標準物質濃度而求出血液之稀釋倍數，用稀釋血漿樣品之分析對象成分之測定值乘以稀釋倍數，藉此可算出血液中之分析對象成分濃度。於使用血液作為活體樣品之情形時，利用稀釋用緩衝液稀釋血液後去除血球，故而所剩餘之樣品為血漿，將其稱為稀釋血漿。因此，該情形時可謂求出血漿之稀釋倍數。關於血漿之稀釋倍數，可使用外部標準物質，藉由採用計算式(I)之下述計算方法而求出。以下所說明之方法中，採用利用稀釋用緩衝液稀釋血液後使用過濾器進行過濾而獲得之血漿樣品。計算方法1 A X＝--------- (I) B A：血漿中外部標準物質濃度之正常中央值之吸光度 B：稀釋血漿中之外部標準物質之吸光度 X：血漿稀釋倍數於使用鈉作為外部標準物質之情形時，只要求出鈉之吸光度即可。作為血漿中鈉濃度之正常中央值之吸光度，只要採用鈉142 mmol/L之吸光度即可。 3.利用內部標準物質及外部標準物質之測定法(混合法) 本發明係一種利用緩衝液稀釋血液等活體樣品後對活體樣品中應定量之分析對象成分進行定量之方法，其特徵在於：使用內部標準物質及外部標準物質而求出活體樣品之稀釋倍數，根據該稀釋倍數而對活體樣品中之分析對象成分進行定量。根據本發明之方法，於求解活體樣品之稀釋倍率時，無需求出活體樣品之檢體量。併用內部標準物質與外部標準物質而求出稀釋倍數，外部標準物質係用於對根據內部標準物質所獲得之稀釋倍數進行修正，從而準確地求出稀釋倍數。由於使用內部標準物質與外部標準物質兩者，故而有時將本發明之求出活體樣品之稀釋倍數之方法稱為混合法。於僅使用內部標準物質而求出活體樣品之稀釋倍數之情形時，對活體樣品利用添加有內部標準物質之稀釋用緩衝液進行稀釋，因此於活體樣品之量較少之情形時，稀釋倍數變得過大，根據內部標準物質濃度所求出之稀釋倍數之可靠性降低。本發明之混合法中，可藉由使用外部標準物質而對上述使用內部標準物質之方法之缺點進行修正。又，如後所述，存在活體樣品中包含用作內部標準物質之物質、或原本活體樣品中存在之外部標準物質之濃度偏離正常值的情況。即便於此種情形時，藉由混合法亦能夠對各方法之缺點進行修正而求出準確之稀釋倍數。作為成為本發明之分析對象的活體樣品，可使用上述「2.利用外部標準物質之分析法(外部標準法)」中記載之活體樣品，活體樣品之來源亦如上述2(外部標準法)所示。分析對象活體樣品成分亦以上述2(外部標準法)中記載之分析對象活體樣品成分作為對象。內部標準物質係以成為特定濃度之方式被添加至用於稀釋活體樣品之緩衝液中。作為內部標準物質係使用如下者：活體樣品中完全不含或即便含有亦為極微量之物質、不會對活體樣品中之分析對象成分之測定產生干擾的物質、不會於活體樣品中之活體酶之作用下發生分解的物質、於緩衝液中保持穩定之物質、不會透過血球膜而不會包含於血球中之物質、不會吸附於緩衝液之保存容器上的物質、能夠進行高精度測定之檢測系統可利用之物質。作為上述物質，可列舉上述「1.利用內部標準物質之分析法(內部標準法)」中記載之物質，其中，較佳為即便於添加至緩衝液中之狀態下長期保存而亦保持穩定之屬於鹼金屬或鹼土金屬之元素、且於天然條件下活體樣品中所不含者。作為屬於鹼金屬之元素，可列舉：Li(鋰)、Rb(銣)、Cs(銫)、Fr(鈁)，作為屬於鹼土金屬之元素，可列舉：Sr(鍶)、Ba(鋇)、Ra(鐳)，其中較佳為Li。又，亦可使用日本專利特開2003-161729號公報中記載之甘油-3-磷酸。關於內部標準物質向用於稀釋活體樣品之緩衝液中之添加濃度，只要於稀釋後內部標準物質之濃度可被測定到，則無限定。例如只要以0.1～1000 mM/L、較佳為0.1～100 mM/L、更佳為0.5～10 mM/L之濃度添加即可。例如於使用鋰作為內部標準物質之情形時，只要向用於稀釋活體樣品之緩衝液中以上述濃度添加鋰即可。根據使用緩衝液稀釋後之活體樣品之稀釋液中之內部標準物質之濃度、與用於稀釋之緩衝液中所添加之內部標準物質之濃度，可求出用作檢體之活體樣品之稀釋倍數。於含有內部標準物質之緩衝液中添加有樣品時之樣品之稀釋倍數之範圍無限定，為5～20倍，較佳為5～15倍。外部標準物質較佳為活體樣品中所包含之恆常性較高之物質，即，活體樣品中濃度之生理變動較少之物質，進而於人類個體間活體樣品中濃度之差異較小之物質。作為上述物質，可列舉：鈉(Na⁺ )、氯(Cl^- )、蛋白質。作為蛋白質，例如可列舉血液中所包含之恆常性較高之白蛋白或血清中總蛋白等。其中，尤佳為恆常性較高、且個體間之變動較少之鈉。人類血漿中之鈉濃度之正常值、即正常健康人之血漿中之鈉濃度約為135～145 mmol/L(mEq/L)，正常中央值約為142 mmol/L。95%之受檢者其血漿中鈉濃度包含於正常範圍內。相較於該正常範圍，2.5%之受檢者其血漿中鈉濃度偏低，2.5%之受檢者其血漿中鈉濃度偏高。根據使用緩衝液稀釋後之外部標準物質之濃度與正常健康人之血漿中鈉濃度之平均值，可求出用作檢體之活體樣品之稀釋倍數。又，於使用血液、血清、血漿以外之活體樣品作為活體樣品之情形時，根據各活體樣品中之鈉濃度之中央值而可求出稀釋倍數。根據使用緩衝液稀釋後之活體樣品中之內部標準物質之濃度與用於稀釋之緩衝液中所添加之內部標準物質之濃度，可求出用作檢體之活體樣品之稀釋倍數，進而，使用經稀釋後之活體樣品中之外部標準物質之濃度與活體樣品中所含之外部標準物質之濃度，對根據內部標準物質濃度所算出之稀釋倍數進行修正，藉此可求出更準確之稀釋倍數。由於使用活體樣品中所含之物質作為外部標準物質，故而作為稀釋活體樣品之緩衝液，必須使用不含外部標準物質、或者即便含有而亦為不會對活體樣品經稀釋後之混合物中之外部標準物質之測定產生影響之程度之極微量濃度的緩衝液。又，必須使用不含會妨礙外部標準物質及內部標準物質之測定之物質、或者即便含有而亦為不會對活體樣品經稀釋後之稀釋溶液中之內部標準物質或外部標準物質之測定產生影響之程度之極微量濃度的緩衝液。將不含該等物質、或者即便含有而亦為不會對活體樣品經稀釋後之混合物中之內部標準物質或外部標準物質之測定產生影響之程度之極微量濃度的緩衝液稱為實質上不含上述物質之緩衝液。例如本發明之方法中所使用之稀釋用緩衝液中之鈉濃度為100 nmol/L以下。例如於使用鈉或氯作為外部標準物質之情形時，活體樣品之稀釋用緩衝液必須不含鈉或氯、或者即便含有而亦為極微量。又，由於使用屬於鹼金屬類之元素或屬於鹼土金屬類之元素作為內部標準物質，故而活體樣品之稀釋用緩衝液必須不含用作內部標準物質之屬於鹼金屬類之元素及屬於鹼土金屬類之元素、以及近似於該等之物質，或者即便含有該等物質而亦為極微量。進而，鈉會影響屬於鹼金屬類之元素或屬於鹼土金屬類之元素之定量，因此活體樣品之稀釋用緩衝液必須不含鈉、或者即便含有而亦為極微量。又，由於要對活體樣品中之目標分析對象物進行測定，故而為了防止目標分析對象物發生分解或改性，活體樣品之稀釋用緩衝液必須為pH值接近活體樣品，即pH值6.5～pH值8.0、較佳為pH值7.0～pH值7.5、更佳為pH值7.4之緩衝液。進而，本發明中，由於要對經緩衝液稀釋之血液中之活體成分進行測定，故而緩衝液成分必須不能影響該等所欲測定之活體成分之改性或穩定性。先前並不存在於pH值7.4左右具有緩衝能力且不含鈉或氯之緩衝液，因此無法將鈉或氯用作外部標準物質。本發明中，新開發了一種於pH值7.4左右具有緩衝能力且不含鈉或氯之緩衝液，從而能夠將鈉或氯用作外部標準物質。可列舉將作為不含上述鈉、氯、鹼金屬類元素及鹼土金屬類元素之鹼性化合物的2-胺基-2-甲基-1-丙醇(AMP)、2-乙基胺基乙醇、N-甲基-D-葡糖胺、二乙醇胺、三乙醇胺等胺基醇化合物類，與作為顯示酸性之Good's緩衝劑、即pKa為pH值7.4附近之緩衝劑的HEPES(2-[4-(2-Hydoxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid)(pKa＝7.55)、TES(N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-Aminoethanesulfonic acid)(pKa＝7.50)、MOPS(3-Morpholinopropanesulfonic acid)(pKa＝7.20)或BES(N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-Aminoethanesulfonic acid)(pKa＝7.15)加以組合、混合而成之緩衝液。其中，較佳為2-胺基-2-甲基-1-丙醇(AMP)與HEPES、TES、MOPS或BES之組合，更佳為2-胺基-2-甲基-1-丙醇(AMP)與HEPES之組合。為了製作上述緩衝液，只要將胺基醇與Good's緩衝劑以1：2～2：1、較佳為1：1.5～1.5：1、更佳為1：1之濃度比進行混合即可。緩衝液之濃度無限定，胺基醇或Good's緩衝劑之濃度為0.1～1000 mM/L，較佳為1～500 mM/L，更佳為10～100 mM/L。為了穩定地保存分析對象成分，緩衝液中可含有螯合劑、界面活性劑、抗菌劑、防腐劑、輔酶、糖類、抑制劑等。作為螯合劑，可列舉：乙二胺四乙酸鹽(EDTA)、檸檬酸鹽、草酸鹽等。作為界面活性劑，例如可列舉：陽離子界面活性劑、陰離子界面活性劑、兩性界面活性劑或非離子界面活性劑。作為防腐劑，例如可列舉迭氮化鈉或抗生素等。作為輔酶，可列舉：磷酸吡哆醛、鎂、鋅等。作為糖類，可列舉：甘露醇、右旋糖、寡糖等。作為抑制劑，可列舉：十二烷基硫酸鈉、水銀、肝素等。尤其藉由添加甘露醇與磷酸吡哆醛，能夠使血球膜或酶保持穩定，藉由添加3～4種抗生素或抗菌劑，能夠抑制於手指採血時自手指表面混入之部分細菌之增殖，能夠抑制由細菌引起之活體成分之分解而實現活體成分之穩定化。於使用全血作為活體樣品之情形時，需要利用過濾器濾除經稀釋之血液中之血球成分，因此關於緩衝液之浸透壓，藉由採用與血液同等(285 mOsm/kg)或其以上之浸透壓，可防止血球發生溶血。浸透壓可藉由對所欲測定之活體成分之定量無影響的鹽類、糖類等、緩衝劑等而調整為等張。本發明亦包括根據本發明之混合法，為了使用活體樣品之稀釋倍數而使用之上述緩衝液。該緩衝液不僅可用於本發明之混合法，亦可用於使用外部標準之定量分析方法(外部標準法)或使用內部標準之定量分析方法(內部標準法)。作為內部標準物質之鹼金屬類元素或鹼土金屬類元素可藉由公知方法進行測定。例如只要添加會與屬於鹼金屬類之元素或屬於鹼土金屬類之元素形成螯合錯合物的物質，測定所形成之螯合錯合物之吸光度即可。作為會與鹼金屬類元素或鹼土金屬類元素形成螯合錯合物之物質，例如可列舉多元經鹵素取代卟啉化合物(例如多氟卟啉)等卟啉衍生物。又，亦可藉由原子吸光度法測定元素本身之吸光度。具體而言，關於作為內部標準物質添加至緩衝液中鋰之測定，可藉由螯合比色法(鹵化卟啉螯合法：全氟-5,10,15,20-四苯基-21H,23H-卟啉(perfluoro-5,10,15,20-tetraphenyl-21H,23H-porphyrin))，利用生物化學自動分析裝置而進行。藉由該方法，能夠容易地利用微量樣品對多個檢體進行測定。作為外部標準物質之氯(Cl^- )、蛋白質亦可藉由上述2(外部標準法)中記載之公知方法進行測定。本發明之方法中，藉由使用兩種標準物質，即作為內部標準物質之鋰等鹼金屬類元素或鹼土金屬元素、與作為外部標準物質之鈉(Na⁺ )、氯(Cl^- )或蛋白質等活體樣品中所含之物質的混合法而求出稀釋倍數，使用外部標準物質對使用內部標準物質所求出之稀釋倍數進行修正，從而可求出準確之稀釋倍數。作為用於改善狂躁症及躁鬱症之狂躁狀態的醫藥而使用碳酸鋰。對於需要接受治療之受檢者，每天投予數百mg～千百mg之碳酸鋰。因此，已投予過碳酸鋰之被試驗者之活體樣品中包含鋰，於僅使用鋰作為內部標準之情形時，無法求出準確之稀釋倍數。另一方面，關於鈉，如上所述，健康者其血液中濃度之正常範圍約為135～145 mmol/L(mEq/L)，但約5%之受檢者即便其等為健康者，血液中鈉濃度亦偏離正常值，約2.5%之被試驗者即便其等為健康者，血液中鈉濃度亦低於上述正常值，約2.5%之被試驗者即便其等為健康者，血液中鈉濃度亦高於上述正常值。針對上述受檢者，於僅使用鈉作為外部標準之情形時，無法準確地求出稀釋倍數。即便於如上所述般受檢者被投予過作為醫藥之鋰等鹼金屬類元素或鹼土金屬元素之情形時、或者血液中之鈉(Na⁺ )、氯(Cl^- )或蛋白質之濃度偏離正常值之情形時，由於利用外部標準物質對使用內部標準物質所求出之稀釋倍數進行修正，故而能夠修正兩者之缺點，從而能夠準確地求出活體樣品之稀釋倍數。本發明之求解活體樣品之稀釋倍數之方法較理想為如以下般進行之態樣。將活體樣品10～200 μL添加至預先以特定濃度添加有內部標準物質之緩衝液50～500 μL中進行混合。此時，緩衝液之體積較佳為活體樣品之體積之3～4倍以上。例如於活體樣品為血液之情形時，將微量血液樣品65 μL添加至已添加有內部標準之緩衝液280 μL中進行混合。於活體樣品為血液之情形時，稀釋後去除紅血球、白血球等血球。血球可利用過濾器而去除，亦可對稀釋血液樣品實施離心分離而去除。使用血球經去除之稀釋血漿樣品，對分析對象成分進行測定。於將微量血液樣品65 μL添加至已添加有內部標準之緩衝液280 μL中之情形時，65 μL之血液樣品約包含30 μL之血漿，因此血漿約被稀釋了10倍。於使用血液作為活體樣品之情形時，只要以換算成血漿計，血漿被稀釋了5～20倍、較佳為5～16倍、更佳為5～10倍、尤佳為8～10倍左右之方式混合血液與稀釋用緩衝液即可。又，同時測定稀釋血漿樣品中之內部標準物質濃度與外部標準物質濃度。根據內部標準物質濃度及外部標準物質濃度而求出血液之稀釋倍數，用稀釋血漿樣品之分析對象成分之測定值乘以稀釋倍數，藉此可算出血液中之分析對象成分濃度。於使用血液作為活體樣品之情形時，利用稀釋用緩衝液稀釋血液後去除血球，故而所剩餘之樣品為血漿，將其稱為稀釋血漿。因此，該情形時可謂求出血漿之稀釋倍數。血漿之稀釋倍數可藉由使用內部標準物質及外部標準物質，藉由以下3種計算方法而求出。以下所說明之方法中，採用利用添加有內部標準物質之稀釋用緩衝液稀釋血液後使用過濾器進行過濾而獲得之血漿樣品。使用鋰作為內部標準物質，使用鈉作為外部標準物質。計算方法1 A：添加有內部標準物質之緩衝液中之內部標準物質之吸光度 B：稀釋血漿中之內部標準物質之吸光度 C：血漿中外部標準物質濃度之正常中央值之吸光度 D：稀釋血漿中之外部標準物質之吸光度 X：血漿稀釋倍數此處，所謂稀釋血漿係指利用稀釋用緩衝液稀釋血液樣品後去除血球而獲得之血漿。於使用鋰作為內部標準物質、使用鈉作為外部標準物質之情形時，鋰之濃度可以例如藉由螯合比色法等測定鋰濃度之情形時所獲得之吸光度之形式表示。又，鈉之濃度可以藉由酶測定法等測定之情形時之吸光度之形式表示。血漿中鈉濃度之正常中央值為健康者之中央值，作為血漿中鈉濃度之正常中央值之吸光度，只要採用鈉142 mmol/L之吸光度即可。該值為已知值。於以下之計算方法2及3中亦相同。緩衝液對血漿之稀釋倍數X可藉由下述計算式(1)或計算式(2)而求出。 A＋C X＝-------- (1) B＋D √(A² ＋C² ) X＝-------------- (2) √(B² ＋D² ) 對稀釋血漿中作為分析對象成分之生物化學成分之測定濃度或酶活性進行定量，用該定量值乘以藉由計算式(1)或計算式(2)所求出之稀釋倍數，而可定量原血漿中之分析對象成分。計算方法2 B：稀釋血漿中之內部標準物質之吸光度 D：稀釋血漿中之外部標準物質之吸光度 X：血漿稀釋倍數血漿之稀釋倍數可藉由下述計算式(3)而求出。 X＝a×(B＋D)±b (3) (a及b為係數) 計算方法2中，預先取得B＋D與稀釋倍數之資料，製作X＝a×(B＋D)±b所表示之回歸直線。對稀釋血漿中作為分析對象成分之生物化學成分之測定濃度或酶活性進行定量，用該定量值乘以藉由計算式(3)所求出之稀釋倍數，而可定量原血漿中之分析對象成分。計算方法3 A：添加有內部標準物質之緩衝液中之內部標準物質之吸光度 B：稀釋血漿中之內部標準物質之吸光度 C：血漿中外部標準物質濃度之正常中央值之吸光度 D：稀釋血漿中之外部標準物質之吸光度 B'：基於根據外部標準物質之吸光度所算出之稀釋倍數的稀釋血漿中之內部標準物質之吸光度之修正值 X：血漿稀釋倍數假設內部標準物質(例如鋰)與外部標準物質(例如鈉)之稀釋倍數X相同，而獲得下式。 X＝A/B＝C/D 根據外部標準物質(例如鈉)之稀釋倍數，藉由下式求出內部標準物質(例如鋰)之吸光度變化量修正值B'。 (B')＝(A×D)/C 用A除以內部標準物質(例如鋰)之吸光度變化量修正值B'，藉此求出經外部標準物質(例如鈉)修正後之內部標準物質(例如鋰)稀釋倍數。 X＝A/B' (4) 對稀釋血漿中作為分析對象成分之生物化學成分之測定濃度或酶活性進行定量，用該定量值乘以藉由計算式(4)所求出之稀釋倍數，而可定量原血漿中之分析對象成分。 [實施例] 以下對本發明之實施例進行說明。 1.利用內部標準之分析法(內部標準法) [實施例1-1] 於稀釋緩衝液中添加麥芽糖作為內部標準物質而獲得血液稀釋緩衝液，於該血液稀釋緩衝液200 μL中添加已添加有EDTA-2Na之全血樣品60 μL，對50例之靜脈血液樣品進行檢測。關於對未經稀釋之全血進行離心分離所獲得之血漿之測定值、與使經稀釋之血漿之測定值乘以基於內部標準之稀釋倍數所求出的稀釋血漿測定值，調查相關性，結果如圖1所示，於酶活性(胺基轉移酶：ALT，γ-穀胺醯轉移酶：GGT)、脂質檢查(中性脂肪：TG，LDL-膽固醇，葡萄糖，血紅蛋白A1c)之檢查中獲得良好之相關性。 [實施例1-2] 於血液稀釋緩衝液中添加會分佈於血球及血漿之作為內部標準之乙醇胺而獲得稀釋緩衝液，於該血液稀釋緩衝液200 μL中添加已添加有EDTA-2Na之全血樣品60 μL，對50例之靜脈血液樣品進行檢測。將靜脈採血之添加有EDTA-2Na之全血、與利用血液稀釋緩衝液稀釋該全血所獲得之稀釋全血分別作為樣品，計算白血球(WBC)、紅血球(RBC)、血紅蛋白濃度(Hgb)、血容比(Hct)、血小板數(Plt)，將所獲得之相關圖示於圖5。根據圖5，除血小板數以外，確認到良好之相關性。 [實施例1-3] 使用根據麥芽糖內部標準所求出之血漿稀釋率與根據乙醇胺所求出之全血稀釋率，通過計算式而求出表現血液中血球體積之血容比，調查該血容比與利用血球計數機對全血進行測定所求出之血容比的相關性。將其結果示於圖6。相關性良好且具有實用性。 2.利用外部標準物質之分析法(外部標準法) [實施例2-1]使用微量血液樣品之定量分析 (1)外部標準物質(鈉)之測定及稀釋倍數之計算於緩衝液280 μL中添加微量血液樣品65 μL進行混合，利用過濾器濾除血球而獲得稀釋血漿，將該稀釋血漿作為樣品，利用生物化學自動分析裝置測定外部標準物質及活體成分之各濃度。作為血液樣品之稀釋用緩衝液，使用將2-胺基-2-甲基-1-丙醇與HEPES(2-[4-(2-Hydoxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid)加以組合、混合而成之pH值7.4之緩衝液。將所使用之緩衝液之組成示於表5。 [表5] 鈉外部標準時之稀釋用緩衝液之組成作為外部標準物質，使用血液樣品中所含之鈉。關於稀釋血漿之微量鈉測定，開發出酶測定法，該酶測定法利用β-半乳糖苷酶於鈉作用下之活化、並利用經緩衝液稀釋之樣品之鈉濃度與半乳糖苷酶活性的比例關係。將鈉測定試劑之組成示於表6。 [表6] 鈉測定試劑之組成使用表6所示之鈉測定試劑，進行以下之測定。於稀釋緩衝液280 μL中添加全血65 μL，此時全血中之血漿(約30 μL)約被稀釋了10倍。利用純化水將該稀釋血漿稀釋4.5倍後，於其中(3 μL)添加β-半乳糖苷酶緩衝液(第1試劑)52 μL，於37℃下加熱5分鐘，添加基質液鄰硝基苯-β-D-哌喃半乳糖苷(o-Nitrophenyl-β-D-Galactpyranoside)(第2試劑)26 μL，使用日本電子(股)JCA-BM 6050型生物化學自動分析裝置，於主波長410 nm、副波長658 nm下測定吸光度，藉此求出1分鐘之吸光度速度變化。圖1中顯示表示鈉濃度與吸光度變化量之校準曲線。獲得至24 mmol/L為止均通過原點之直線性，鈉之定量性得到確認。 (2)外部標準物質(氯)之測定使用以下之試劑。 1)第一試劑：於pH值6.0、0.1 mol/L之MES-NaOH緩衝液中包含2 U/ml之源自胰臟之澱粉酶及10 mmol/L之EDTA的溶液 2)第二試劑：5 mmol/L之2-氯-4-硝基苯基麥芽糖溶液氯測定法如下所述。於樣品5 μL中添加第一試劑150 μL，於37℃下加熱5分鐘後，添加第二試劑50 μL後，求出自1分鐘後起至2分鐘間之於405 nm下之吸光度變化。圖8中顯示表示氯濃度與吸光度變化量之校準曲線。 (3)微量血液樣品與靜脈血漿之相關性表7中顯示血漿測定值與根據外部標準物質(鈉)之稀釋倍率所求出之稀釋血漿測定值的相關統計值。測定係使用日本電子(股)JCA-BM 6050型自動分析裝置而進行。根據下述式(I)由142 mmol/L之鈉測定吸光度(A)與稀釋血漿之鈉吸光度(B)而求出稀釋倍數(X：8倍稀釋)，揭示利用該稀釋倍數所求出之稀釋血漿之生物化學檢查資料(稀釋血漿測定值)與血漿資料(血漿測定值)之相關性。各檢查項目之血漿測定係藉由常規方法進行。又，稀釋血漿之測定係藉由常規方法，增加樣品之體積，於最佳化之條件下進行測定。如表7所示，13項生物化學檢查之相關性良好，由微量血液能夠獲得原血漿中之生物化學檢查資料。 A X＝--------- (I) B [表7] 鈉外部標準法之情形時與血漿之相關性 3.利用內部標準物質及外部標準物質之分析法(混合法) [實施例3-1]使用微量血液樣品之定量分析 (1)內部標準物質(鋰、甘油-3-磷酸)及外部標準物質(鈉)之測定及稀釋倍數之計算於添加有內部標準物質之緩衝液280 μL中添加微量血液樣品65 μL進行混合，利用過濾器濾除血球而獲得稀釋血漿，將該稀釋血漿作為樣品，利用生物化學自動分析裝置測定內部標準物質與外部標準物質及活體成分之各濃度。作為血液樣品之稀釋用緩衝液，使用將2-胺基-2-甲基-1-丙醇與HEPES(2-[4-(2-Hydoxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid)加以組合、混合而成之pH值7.4之緩衝液。將所使用之添加有內部標準物質之緩衝液之組成示於表8。 [表8] 添加有鋰內部標準物質之稀釋用緩衝液之組成使用鋰作為內部標準物質，於稀釋用緩衝液中添加1 mM/L之氯化鋰。使用血液樣品中所含之鈉作為外部標準物質。作為內部標準物質添加至緩衝液中之鋰之測定係藉由螯合比色法(鹵化卟啉螯合法：全氟-5,10,15,20-四苯基-21H,23H-卟啉)而進行。關於稀釋血漿之微量鈉測定，開發出酶測定法，該酶測定法利用β-半乳糖苷酶於鈉作用下之活化、並利用經緩衝液稀釋之樣品之鈉濃度與半乳糖苷酶活性的比例關係。於表9中顯示鈉測定試劑之組成。 [表9] 鈉測定試劑之組成使用表9所示之鈉測定試劑，進行以下之測定。於稀釋緩衝液280 μL中添加全血65 μL，此時全血中之血漿(約30 μL)約被稀釋了10倍。利用純化水將該稀釋血漿稀釋4.5倍後，於其中(3 μL)添加β-半乳糖苷酶緩衝液(第1試劑)52 μL，於37℃下加熱5分鐘，添加基質液鄰硝基苯-β-D-哌喃半乳糖苷(o-Nitrophenyl-β-D-Galactpyranoside)(第2試劑)26 μL，使用日本電子(股)JCA-BM 6050型生物化學自動分析裝置，於主波長410 nm、副波長658 nm下測定吸光度，藉此求出1分鐘之吸光度速度變化。於圖7中顯示表示鈉濃度與吸光度變化量之校準曲線。獲得直至24 mmol/L前均通過原點之直線性，鈉之定量性得到確認。 [表10] 鋰之測定法使用表10之測定試劑，藉由以下方法進行鋰之測定。於稀釋緩衝液280 μL中添加全血65 μL，此時全血中之血漿(約30 μL)約被稀釋了10倍。使用日本電子(股)JCA-BM 6050型生物化學自動分析裝置，利用純化水將該稀釋血漿稀釋4.5倍後，於其中(5 μL)添加螯合試劑(第1試劑)55 μL，於37℃下加熱10分鐘，於主波長545 nm、副波長596 nm下測定吸光度，藉此求出鋰濃度。圖9中顯示表示鋰濃度與吸光度之校準曲線。獲得直至1 mmol/L前均通過原點之直線性，鋰之定量性得到確認。關於以甘油-3-磷酸作為內部標準物質時之測定法，於稀釋緩衝液280 μL中添加全血65 μL，此時全血中之血漿(約30 μL)約被稀釋了10倍。使用日本電子(股)JCA-BM 6050型生物化學自動分析裝置，利用純化水將該稀釋血漿稀釋4.5倍後，於其中(9 μL)添加第1試劑(過氧化酶)50 μL，於37℃下加熱5分鐘，添加第二試劑(甘油-3-磷酸氧化酶)25 μL，經過5分鐘後，於主波長596 nm、副波長884 nm下測定吸光度，藉此求出甘油-3-磷酸之濃度。獲得直至4 mmol/L前均通過原點之直線性，甘油-3-磷酸之定量性得到確認。甘油-3-磷酸測定法係使用表11所示之試劑組成。 [表11] 甘油-3-磷酸之測定法 (2)微量血液樣品與靜脈血漿之相關性將使用日本電子(股)JCA-BM 6050型自動分析裝置所測得之血漿與稀釋血漿之生物化學檢查項目之測定值之相關圖示於圖10-1～10-6。藉由混合法，利用稀釋用緩衝液中之內部標準物質(鋰)之測定吸光度(A)與血漿添加後之內部標準物質之測定吸光度(B)、及142 mmol/L之鈉測定吸光度(C)與稀釋血漿之鈉吸光度(D)，根據下述計算式(1)而求出稀釋倍數(X：8倍稀釋)，將利用該稀釋倍數所求出之稀釋血漿之生物化學檢查資料(稀釋血漿測定值)表示為y軸，將血漿資料(血漿測定值)表示為x軸。各檢查項目之血漿測定係藉由常規方法進行。又，稀釋血漿之測定係藉由常規方法，增加樣品之體積，於最佳化之條件下進行測定。如圖10-1～10-6所示，13項生物化學檢查之相關性良好，由微量血液能夠獲得原血漿中之生物化學檢查資料。 A＋C X＝--------- (1) B＋D 表12中顯示併用內部標準物質(鋰)及外部標準物質(鈉)之混合法之情形時血漿測定值與稀釋血漿測定值之相關統計值。 [表12] 併用內部標準物質(鋰)及外部標準物質(鈉)之混合法之情形時之相關性 [實施例3-2]血漿與稀釋血漿之生物化學檢查項目之測定值之相關性將使用日本電子(股)JCA-BM 6050型自動分析裝置所測得之血漿與稀釋血漿之生物化學檢查項目之測定值之相關性示於表13。藉由混合法，利用稀釋用緩衝液中之內部標準物質(甘油-3-磷酸)之測定吸光度(A)與血漿添加後之內部標準物質之測定吸光度(B)、及142 mmol/L之鈉測定吸光度(C)與稀釋血漿之鈉吸光度(D)，根據實施例3-1之計算式(1)而求出稀釋倍數(X：8倍稀釋)，將利用該稀釋倍數所求出之稀釋血漿之生物化學檢查資料(稀釋血漿測定值)表示為y軸、將血漿資料(血漿測定值)表示為x軸。各檢查項目之血漿測定係藉由常規方法進行。又，稀釋血漿之測定係藉由常規方法，增加樣品之體積，於最佳化之條件下進行測定。如表13所示，13項生物化學檢查之相關性良好，由微量血液能夠獲得原血漿中之生物化學檢查資料。表13中顯示併用內部標準物質(甘油-3-磷酸)及外部標準物質(鈉)之混合法之情形時血漿測定值與稀釋血漿測定值之相關統計值。 [表13] 甘油-3-磷酸及鈉之混合法與血漿測定法之相關性 [實施例3-3]內部標準物質(Li)與外部標準物質(Na)之併用對檢查資料之測定誤差與精度產生之影響 (1)使用血漿鈉作為外部標準物質之情形時對稀釋倍數產生之影響健康者之血漿鈉濃度於個體內及個體間之生理變動非常小，其基準範圍(正常範圍)為135～145 mmol/L。利用該健康者之中央值即142 mmol/L，若藉由高感度之酶法對利用稀釋用緩衝液稀釋血液樣品後去除血球所獲得之稀釋血漿中之鈉濃度進行測定，則於0～30 mmol/L之範圍內測定可保持高精度。又，即便對基準範圍上下限之135 mmol/L與145 mmol/L之樣品，以142 mmol/L作為基準而修正稀釋倍數，測定誤差範圍亦處於±2%內。然而，如表14所示，超過基準範圍上下限值之健康者分別占全體之2.5%，因此136 mmol/L與148 mmol/L之血漿之情形時分別存在產生±4%以上之誤差之問題。關於將以鋰作為內部標準物質而求出稀釋倍數之方法與以鈉作為外部標準物質而求出稀釋倍數之方法加以併用的混合法，如表14所示，±4%以上之誤差可減小至一半。表14中，稀釋倍數之「Na外部標準」欄中顯示僅基於作為外部標準物質之鈉之濃度所求出之稀釋倍數，「Na-Li修正：混合法修正」欄中顯示基於作為外部標準物質之鈉之濃度及作為內部標準物質之鋰之濃度兩者所求出之稀釋倍數。「混合法修正」中之稀釋倍數係使用實施例3-1之計算式(1)而算出。將僅基於鈉之稀釋倍數與基於混合法之稀釋倍數該兩種方法中關於血漿膽固醇之測定值所產生之誤差示於表14。可知藉由使用混合法而誤差減半。 [表14] 使用血漿鈉作為外部標準物質之情形時對稀釋倍數產生之影響 (2)使用鋰作為內部標準物質之情形時對稀釋倍數所產生之影響於稀釋血液之緩衝液中添加有鋰作為內部標準物質之情形時，鋰濃度對應於血液中之血漿量而被稀釋，求出血漿稀釋倍數之方法於為8～10倍左右時，血漿添加量較多，因此添加前與添加後之濃度差較大，稀釋倍數之再現性之變動係數為2%以下。但是，於為12～16倍時，血漿之添加量減少，因此稀釋倍數之變動係數上升至4～5%。如表15所示，藉由混合法修正，12倍～16倍時之稀釋倍數之再現性之變動係數成為約3%，即便為不易採集血液之受檢者，亦可獲得高精度之資料。針對血漿膽固醇210 mg/dl之受檢者，於16倍稀釋之情形時，僅使用鋰作為內部標準物質而算出稀釋倍數，對測定值進行修正，此時出現199～221 mg/dl之變動，因此判定為高脂血症(220 mg/dl以上)患者。表15中，「Li內部標準」中顯示僅基於作為內部標準物質之鋰之濃度所求出之稀釋倍數，「Na外部標準」中顯示僅基於作為外部標準物質之鈉之濃度所求出之稀釋倍數，「混合法修正」中顯示基於作為外部標準物質之鈉之濃度及作為內部標準物質之鋰之濃度兩者所求出之稀釋倍數。「混合法修正」中之稀釋倍數係使用實施例3-1之計算式(1)而算出。另一方面，將作為內部標準物質之鋰與作為外部標準物質之鈉加以併用而算出稀釋倍數，對測定值進行修正，此時成為204～216 mg/dl，從而判定為健康者。因此，藉由使用混合法之修正，可獲得高精度之測定值。 [表15] 作為內部標準物質之鋰與外部標準鈉及混合法時之稀釋倍數對再現性(CV%)所產生之影響將血漿稀釋倍數6～16倍下之作為內部標準之鋰與外部標準鈉及混合法時之稀釋倍數對再現性(CV%)所產生之影響示於表15。混合法與單獨使用內部標準法之情形相比，顯示出更良好之再現性。 [產業上之可利用性] 如上所述，本發明能夠簡便且準確地對經由對象者之手指等自體內所採集之微量且未知量之全血樣品等活體樣品之血漿及活體樣品中之任一成分進行定量。又，能夠求出作為血液貧血程度之血球體積比率(血容比)。藉此，即便為對象者本人亦可進行之血液等之微量採集，且即便採集後經過長時間，亦能夠準確地進行對象者之血液等所採集之活體樣品之分析。因此，可有效地利用於對象者之健康診斷，產業上之利用性較高。進而，本發明之微量血液採集方法對血液採集之時間與場所並無限制，因此可應用於沒有時間前往醫療機構之事例、災害時、遠距醫療、健康管理等，能夠早期發現亞疾病患者，亦有助於縮減醫療費。又，能夠利用市售之生物化學自動分析裝置有效率地對大量樣品進行測定。藉由將所測得之檢查資料發送至智慧型手機，可利用於日常進行健康管理或疾病之早期發現之系統。

1‧‧‧血液

2‧‧‧血漿(血清)

3‧‧‧血球

4‧‧‧緩衝液

5‧‧‧內部標準物

6‧‧‧血液稀釋溶液

圖1係表示本發明之活體樣品成分之分析方法中所使用之血液之組成的模式圖。圖2(a)～(c)係表示於本發明之活體樣品成分之分析方法中血液經特定緩衝液稀釋後之狀態的模式圖。於該情形時，圖2中顯示使用不會透過血液之血球膜而僅浸透至血漿中之內部標準物質的情形時之說明圖。圖3(a)～(c)係表示於本發明之活體樣品成分之分析方法中血液經特定緩衝液稀釋後之狀態的模式圖。圖3係內部標準物質具有浸透至血液之血漿及血球內部兩者中之性質的情形時之說明圖。圖4係靜脈血血漿與手指採血稀釋血漿之生物化學檢查之相關圖。圖5係分別將靜脈採血之EDTA-2Na添加全血與利用血液稀釋緩衝液稀釋該全血所獲得之稀釋全血設為樣品，計算白血球(WBC)、紅血球(RBC)、血紅蛋白濃度(Hgb)、血容比(Hct)、血小板數(Plt)的相關圖。圖6係使用由麥芽糖內部標準所求出之血漿稀釋率及由乙醇胺所求出之全血稀釋率並根據計算式所求出之表示血液中血球體積之血容比、與利用血球計數機對全血進行測定所求出之血容比的相關圖。圖7係表示鈉之酶測定法之直線性的圖。圖8係表示氯測定法之直線性的圖。圖9係表示鋰濃度與吸光度之直線性的圖。圖10-1係藉由混合法所獲得之稀釋血漿測定值與原血漿測定值之相關圖(總蛋白及白蛋白)。圖10-2係藉由混合法所獲得之稀釋血漿測定值與原血漿測定值之相關圖(AST及ALT)。圖10-3係藉由混合法所獲得之稀釋血漿測定值與原血漿測定值之相關圖(HDL-膽固醇及γGTP)。圖10-4係藉由混合法所獲得之稀釋血漿測定值與原血漿測定值之相關圖(總膽固醇及中性脂肪)。圖10-5係藉由混合法所獲得之稀釋血漿測定值與原血漿測定值之相關圖(尿素氮及肌酸酐)。圖10-6係藉由混合法所獲得之稀釋血漿測定值與原血漿測定值之相關圖(尿酸及血糖)。

Claims

一種活體樣品成分之分析方法，其係使用用以添加樣品血液之稀釋緩衝液，對該稀釋緩衝液中所含之內部標準物質進行分析，算出血漿或血清之稀釋率，對上述樣品血液中之血漿或血清成分中之活體成分進行分析，且上述稀釋緩衝液所含之內部標準物質係使用具有不會浸透至血球內之性質的選自由麩胺酸、白胺酸、纈胺酸、異白胺酸、4-羥基苯、羥基丁酸、肌酸、蘋果酸、Trinder試劑、鋰所組成之群中之物質。
如請求項1之活體樣品成分之分析方法，其中稀釋緩衝液所含之內部標準物質為鋰。
一種活體樣品成分之分析方法，其係使用用以添加樣品血液之稀釋緩衝液，對該稀釋緩衝液中所含之內部標準物質進行分析，算出血液之稀釋率，對上述樣品血液中之血球計算數或血漿之活體成分進行分析，並且上述稀釋緩衝液所含之內部標準物質係使用具有會浸透至血球內之性質的選自由乙醇胺、己胺、苯基乙基胺、戊胺、組織胺、腐胺、次黃嘌呤、色胺酸、孕烯醇酮、β-植固醇所組成之群中之物質。
一種活體樣品成分之分析方法，其係使用用以添加樣品血液之稀釋緩衝液，對該稀釋緩衝液中所含之內部標準物質進行分析，算出血液或血漿或血清之稀釋率，對上述樣品血液中之血球計算數或血漿之活體成分或者上述樣品血液中之血漿或血清成分中之活體成分進行分析，並且上述稀釋緩衝液包含作為具有不會浸透至血球內之性質之上述內部標準物質的選自由鋰、含麥芽糖之二糖類、麩胺酸、白胺酸、纈胺酸、異白胺酸、4-羥基苯、羥基丁酸、肌酸、蘋果酸、Trinder試劑所組成之群中之物質、與作為具有會浸透至血球內之性質之上述內部標準物質的選自由乙醇胺、己胺、苯基乙基胺、戊胺、組織胺、腐胺、次黃嘌呤、色胺酸、孕烯醇酮、β-植固醇所組成之群中之物質。
如請求項1之活體樣品成分之分析方法，其中上述稀釋緩衝液所含之內部標準物質係選自分子量500以下之化學物質且分子內具有選自由硫酸根離子(-SO^3- )、羧酸根離子(-COO^- )、硫醇基(-SH)、四級胺(-NH³⁺ )所組成之群中之取代基的化合物之中。
如請求項1之活體樣品成分之分析方法，其中上述稀釋緩衝液所含之內部標準物質為Trinder試劑，即選自由ADOS(N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺)、ADPS(N-乙基-N-磺丙基-3-甲氧基苯胺)、ALPS(N-乙基-N-磺丙基苯胺)、DAOS(N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺)、HDAOS(N-(2-羥基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺)、MAOS(N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3,5-二甲基苯胺)、TOOS(N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺)、TOPS(N-乙基-N-磺丙基-3-甲基苯胺)所組成之群中之化合物。
如請求項1至6中任一項之活體樣品成分之分析方法，其中上述稀釋緩衝液具有即便與血液混合亦不會導致上述血球發生溶血之試劑組成。
如請求項1至7中任一項之活體樣品成分之分析方法，其中上述稀釋緩衝液為了能夠穩定地維持上述血液中之活體樣品成分而不會使之發生改性而包含將乙二胺四乙酸鹽、檸檬酸鹽、草酸鹽等螯合劑、硫酸阿米卡星、硫酸卡那黴素、噻苯咪唑、迭氮化鈉等抗菌劑或防腐劑、磷酸吡哆醛、鎂、鋅等輔酶、甘露醇、右旋糖、寡糖等糖類、選自由十二烷基硫酸鈉、水銀、肝素所組成之群中之抑制劑根據被測定成分而單獨使用或組合複數種之組成之添加物。
如請求項4之活體樣品成分之分析方法，其根據上述內部標準物質之稀釋率而算出血液之血球體積率(血容比)。