WO2016013388A1 - 希釈生体試料成分の分析方法 - Google Patents

希釈生体試料成分の分析方法 Download PDF

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進 大澤
晋哉 杉本
功 米久保
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    • G01N2496/00—Reference solutions for assays of biological material
    • G01N2496/80—Multi-analyte reference solutions containing cholesterol, glucose and the like

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring a component to be analyzed in a biological sample such as blood, wherein the biological sample is diluted with a buffer solution having a specific composition, and the plasma sample component and enzyme activity are analyzed from the mixed solution in the diluted sample. It relates to a measurement method.
  • the present invention further provides a method for analyzing a trace biological sample component, wherein a biological sample such as an undetermined trace blood is diluted with a predetermined buffer solution, and a plasma sample component is quantified and enzyme activity is analyzed from the diluted sample mixed solution. And related to blood cell counting.
  • glycerol-3-phosphate is used as an internal standard substance.
  • a method using glycerol is known (for example, see Patent Document 2).
  • glycerol-3-phosphate is used as a diluted internal standard substance for plasma, but it is hydrolyzed by alkaline phosphatase, an enzyme present in the living body, to produce glycerol. . Therefore, an accurate blood dilution rate cannot be obtained if the storage time after adding blood is long or the temperature is high. For this reason, the reliability to the measured value of the biological component and enzyme activity in raw plasma falls. In order to solve such a situation, in the conventional method, it was necessary to add EDTA which is an enzyme inhibitor.
  • a substance charged with a cation such as choline can be used as an internal standard, but there is a problem that adsorption is observed in a plastic container and it is not suitable for long-term storage.
  • Patent Document 2 these substances have been filed as [Patent Document 2], they are highly hydrophobic because they have an aromatic ring in the molecule, and when stored in a plastic container for a long period of time, adsorption occurs, and the dilution factor of blood is accurately determined. There is a problem that it cannot be requested.
  • compounds such as ethanolamine are effective as substances that do not have an aromatic ring in the molecule and penetrate into blood cells. These substances are hardly present in blood and are stable compounds. Moreover, it can be dissolved in the buffer solution of the internal standard solution and will not be adsorbed to the plastic container by long-term storage.
  • the present invention has been made to solve the above-mentioned problems, and it is simple and accurate to quantify the components of a small and unknown amount of whole blood sample collected and diluted from the body surface of the subject's finger or the like. It is an object of the present invention to provide a dilution rate calculation method that can be used.
  • the biological component in the biological sample is stored in a buffer solution with physiological conditions of pH 7.4 and is excellent in stability during transportation.
  • the dilution rate of the internal standard substance is small, and measurement errors are likely to occur when a small amount of sample is added.
  • the present invention relates to a method for quantitatively analyzing a component to be analyzed in a biological sample by diluting the biological sample with a buffer solution, and the concentration of the biological component in the sample obtained by reagenting the biological component with the buffer solution in the sample as an external standard. It is an object of the present invention to provide a method for quantitatively analyzing a component to be analyzed in a biological sample by accurately obtaining the dilution factor of the biological sample from the dilution ratio of the constant component.
  • the present invention relates to a method for quantitatively analyzing a component to be analyzed in a biological sample by diluting the biological sample with a buffer solution, a method for determining the dilution factor of the biological sample using the internal standard material, and an external standard material. It is an object of the present invention to provide a method for quantitatively analyzing a component to be analyzed in a biological sample by compensating for the disadvantages of both of the methods for obtaining the dilution factor of the biological sample and accurately obtaining the dilution factor of the biological sample.
  • the present invention can be used when analyzing a biological component in a biological sample such as blood. 1. Analyze using an internal standard or 2. 2. Use an external standard or 3. It is characterized by using internal standard substance and external standard substance.
  • the present invention is a method for analyzing a biological component in a biological sample such as blood, comprising analyzing a dilution buffer to which the biological sample such as blood is added, and an internal standard substance contained in the dilution buffer, A dilution rate is calculated, a dilution rate of biological components of plasma, serum and blood cells is calculated, and plasma, serum or biological components in the biological sample such as blood are analyzed.
  • the internal standard substance in the buffer solution is stable for a long period of time and is a component that does not adsorb to the container containing the buffer solution, and the internal standard substance is the blood or the like. It is a substance that is hardly contained in a biological sample, and is preferably a substance that can be easily and accurately analyzed by a biochemical automatic analyzer or the like.
  • the internal standard substance in the buffer solution is a component that does not penetrate into the blood cells, and is a substance that can accurately reflect the dilution rate of the plasma or the serum. Preferably there is.
  • the internal standard substance in the buffer solution is a component that penetrates into the blood cells, and is a substance that can accurately reflect the dilution rate of the whole blood (plasma and blood cells). preferable.
  • the buffer solution has an osmotic pressure with respect to a blood cell membrane of 250 to 500 mOsm / kg, and has a reagent composition that does not cause hemolysis of the blood cells even when blood is mixed. Is preferred.
  • the buffer solution has a composition that can be stably maintained without denaturing the biological sample component in the blood.
  • the plasma internal standard substance preferably contains lithium or maltose.
  • the plasma concentration can be determined from the plasma dilution rate, the blood cell volume cannot be determined. If whole blood (plasma and blood cells) can be obtained, anemia can be tested.
  • ethanolamine that is hydrophobic and does not adsorb plastic as an internal standard substance that penetrates into blood cells. By measuring this internal standard, the dilution rate of the entire blood volume can be determined.
  • the present invention is as follows. [1-1] Using a dilution buffer for containing sample blood, analyzing an internal standard substance contained in the dilution buffer, calculating a dilution rate of plasma or serum, and plasma or serum in the sample blood
  • the internal standard substance contained in the dilution buffer has a property of not penetrating into blood cells, and includes disaccharides including maltose, glutamic acid, leucine,
  • the dilution buffer is The internal standard having the property of not penetrating into blood cells, from disaccharides including lithium and maltose, glutamic acid, leucine, valine, isoleucine, 4-hydroxyxenebenzene, hydroxybutyric acid, creatine, malic acid, and Trinder reagent
  • the internal standard substance contained in the dilution buffer is a chemical substance having a molecular weight of 500 or less, and sulfate ions (—SO 3 ⁇ ), carboxyl ions (—COO ⁇ ), thiol groups (—SH), The method for analyzing a biological sample component of [1-1], which is an internal standard substance selected from a compound having a substituent selected from the group consisting of quaternary amines (—NH 3+ ).
  • Internal standards contained in the dilution buffer are ADOS (N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3-methoxyaniline), ADPS (N-ethyl-N-sulfo).
  • the dilution buffer has a reagent composition that does not cause hemolysis of the blood cells even when blood is mixed.
  • Chelating agents such as ethylenediaminetetraacetate, citrate and oxalate, amikacin sulfate so that the dilution buffer can be stably maintained without denaturing the biological sample components in the blood From the group consisting of antibacterial and preservatives such as kanamycin sulfate, thiabendazole and sodium azide, coenzymes such as pyridoxal phosphate, magnesium and zinc, saccharides such as mannitol, dextrose and oligosaccharides, sodium dodecyl sulfate, mercury and heparin
  • the present inventors first examined the use of sodium, chlor, or protein having high in vivo homeostasis as an external standard substance.
  • HEPESGood (2- [4- (2-Hydoxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic acid) is a Good's buffer with excellent performance for biochemical research.
  • TES N-Tris (hydroxymethyl) methyl-2-aminoethanesulfonic acid
  • MOPS 3-Morpholinopropanesulfonic acid
  • BES N, N-Bis (2-hydroxyethyl) -2-aminoethanesulfonic acid
  • pH can be adjusted to 7.4. It was also found that these buffers do not contain sodium or chlor, which are examples of external standard substances, and do not interfere with the measurement system for sodium or chlor to be measured.
  • a buffer adjusted to pH 7.4 by mixing 2-amino-2-methyl-1-propanol (AMP) and HEPES does not denature the biological components and is stable. Measurement of these biological components It was found that it does not interfere with the reagent.
  • plasma sodium or the like that maintains a constant concentration in a biological sample is used as an external standard substance.
  • These substances are elements and are stable biological components.
  • a large number of samples can be efficiently analyzed with an automatic immune analyzer.
  • a method for diluting a trace blood sample with a dilution buffer and quantitatively analyzing a component to be analyzed in blood comprising calculating the dilution factor of the blood sample using an external standard substance
  • the external standard substance is a component that is constantly contained in a blood sample at a predetermined concentration
  • the dilution buffer contains a component that interferes with the quantification of the external standard substance.
  • An analyte component in a blood sample that does not contain includes measuring the concentration of an external standard substance in a blood sample diluted with a dilution buffer, and calculating the dilution factor of the blood sample based on these measured values Quantitative analysis method.
  • [2-2] Analyte component in blood sample, comprising measuring external standard substance concentration in blood sample diluted with dilution buffer and calculating dilution factor of blood sample based on these measured values Quantitative analysis method.
  • [2-3] The quantitative analysis method according to [2-1] or [2-2], wherein the external standard material is selected from the group consisting of sodium, chlor, albumin, and total protein.
  • [2-4] The quantitative analysis method according to [2-3], wherein the external standard substance is selected from the group consisting of sodium, chlor, and total protein.
  • the buffer solution for dilution is composed of 2-amino-2-methyl-1-propanol, 2-ethylaminoethanol, N-methyl-D-glucamine, diethanolamine and triethanolamine as a buffer component.
  • Aminoalcohol compounds selected from HEPES (2- [4- (2-Hydoxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic acid), TES (N-Tris (hydroxymethyl) methyl-2-aminoethanesulfonic acid), MOPS (3- Morpholinopropanesulfonic acid) and BES (N, N-Bis (2-hydroxyethyl) -2-aminoethanesulfonic acid) are selected from the group consisting of buffering agents having a buffering action at pH 7.4, [2- The quantitative analysis method according to any one of 1] to [2-4].
  • Quantitative analysis method Dilute the biological sample with dilution buffer, further dilute with purified water, Substrate containing o-Nitrophenyl- ⁇ -D-Galactpyranoside by adding the first reagent, which is a buffer solution containing ⁇ -galactosidase, 10 to 30 times the volume of the sample and warming at 30 to 45 ° C for 2 to 20 minutes Half the amount of the first reagent is added to the second reagent, which is a liquid, and the absorbance of the reaction rate is measured at a main wavelength of 410 nm and a subwavelength of 658 nm.
  • the first reagent which is a buffer solution containing ⁇ -galactosidase
  • a dilution buffer used for diluting a trace blood sample wherein 2-amino-2 is used as a buffer component.
  • Amino alcohol compounds selected from the group consisting of 2-methyl-1-propanol, 2-ethylaminoethanol, N-methyl-D-glucamine, diethanolamine and triethanolamine, and HEPES (2- [4- (2-Hydoxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic acid), TES (N-Tris (hydroxymethyl) methyl-2-aminoethanesulfonic acid), MOPS (3-Morpholinopropanesulfonic acid) and BES (N, N-Bis (2-hydroxyethyl) -2-aminoethanesulfonic acid)
  • Analytical method using internal standard substance and external standard substance As described above, an analysis method using an internal standard substance alone and an analysis method using an external standard substance alone can accurately measure a biological component to be analyzed in a small amount of biological sample.
  • the inventors of the present invention have both the advantages of the method using an internal standard and the method using an external standard aiming at more accurate measurement, and the disadvantages of the method using an internal standard and the external standard. We have intensively studied how to make up for the shortcomings of the methods using substances.
  • the internal standard substance in the buffer for dilution can be set at a high concentration, it can be measured with high accuracy. However, when the amount of the biological sample is small, the dilution of the internal standard substance becomes small, and the reliability of the dilution factor is lowered. Further, glycerol-3-phosphate can be used as a stable substance as an internal standard substance of an organic compound, and lithium can be suitably used as an internal standard substance of an inorganic substance.
  • the present inventors diligently investigated the development of a method that can eliminate the drawbacks of the method of using an external standard substance alone and the method of using an internal standard substance alone.
  • the present invention uses a highly stable element belonging to alkali metals or alkaline earth metals to eliminate the drawbacks of conventional internal standard substances, and sodium, chlor, or protein having high homeostasis in vivo as an external standard substance The use of was considered.
  • the present invention has the following features.
  • an internal standard that does not pass through the blood cell membrane it is a component that is not or hardly contained in plasma, such as plasma sodium that maintains a constant concentration in a biological sample.
  • An element belonging to alkali metals or alkaline earth metals such as lithium or a stable glycerol-3-phosphate is used and added to the buffer.
  • a conventional organic compound is used as an internal standard substance, a problem remains in storage stability due to the action of a biological enzyme.
  • This internal standard is stable in the buffer for a long time and can be easily quantified.
  • sodium, which is an external standard substance in the biological sample to be measured is stable because it is an element. As a result, it is possible to analyze a large number of samples efficiently with a commercially available biochemical / immunological automatic analyzer for quantitative determination of enzyme components of diluted plasma biological samples with unknown concentrations in the collected blood.
  • the present invention is as follows.
  • [3-1] A method of diluting a sample with a dilution buffer and quantitatively analyzing a component to be analyzed in blood, comprising calculating a dilution factor of the blood sample using an internal standard substance and an external standard substance.
  • a method for quantitative analysis of a component to be analyzed in a blood sample wherein the internal standard is added to the dilution buffer at a predetermined concentration, and the external standard is a component that is constantly contained in the blood sample at a predetermined concentration,
  • the dilution buffer does not contain any components that interfere with the quantification of the internal standard substance and external standard substance, and the internal standard substance concentration and external standard substance concentration in the blood sample diluted with the dilution buffer solution are measured.
  • a method for quantitative analysis of a component to be analyzed in a blood sample comprising calculating a dilution factor of the blood sample based on the measured value.
  • Quantitative analysis of the analyte in the blood sample by correcting the dilution factor of the blood sample obtained from the measured value of the internal standard substance concentration using the measured value of the external standard substance concentration Quantitative analysis method.
  • the internal standard substance is selected from the group consisting of alkali metals or alkaline earth metals
  • the external standard substance is selected from the group consisting of sodium, chlor, albumin, and total protein, [3-1] or [3 -2].
  • the quantitative analysis method according to any one of [3-1] to [3-4] which is a buffer solution having a buffering action of pH 6.5 to pH 8.0, comprising a buffer selected from the group consisting of: [3-6]
  • the dilution factor of the micro blood sample is calculated by any one of the following calculation formulas (1) to (4), and the analysis target component in the diluted plasma is quantified.
  • the quantitative analysis method according to any one of [3-1] to [3-6], wherein the analysis target component in the original plasma is quantified by multiplying by the dilution factor obtained in any of (4):
  • Formula (2) ⁇ (A 2 + C 2 ) X ------- (2) ⁇ (B 2 + D 2 ) ;
  • Formula (3) X a ⁇ (B + D) ⁇ b (3)
  • ⁇ -galactosidase utilizes the fact that the enzyme activity changes according to the sodium ion concentration, and the sodium ion concentration can be determined from the change in absorbance.
  • Amino alcohol compounds selected from the group consisting of -1-propanol, 2-ethylaminoethanol, N-methyl-D-glucamine, diethanolamine and triethanolamine, and HEPES (2- [4- (2-Hydoxyethyl) -1 -piperazinyl] ethanesulfonic acid), TES (N-Tris (hydroxymethyl) methyl-2-aminoethanesulfonic acid), MOPS (3-Morpholinopropanesulfonic acid) and BES (N, N-Bis (2-hydroxyethyl) -2-aminoethanesulfonic acid)
  • a buffer solution comprising a buffer selected from the group and having a buffering action at pH 7.4.
  • the internal standard substance or external standard substance is used to determine the dilution factor of the biological sample, and the quantitative analysis of the component enables the biological sample specimen amount of a small amount of biological sample component to be determined.
  • a biological sample component can be accurately analyzed and measured without measurement.
  • a plastic container is used for plasma and biological components of a biological sample such as a trace amount and an unknown amount of whole blood sample collected from the body via a finger or the like, Simple and accurate quantification is possible.
  • the blood cell volume ratio (hematocrit value), which is the degree of blood anemia, can be obtained by calculation from the plasma dilution rate and the whole blood dilution rate.
  • blood cell components white blood cell count: WBC, red blood cell count: RBC, hemoglobin content: Hgb, hematocrit: Hct
  • the accuracy and accuracy of quantification may be lacking.
  • the dilution factor determined by the internal standard substance is corrected by the dilution factor determined by the external standard substance, and more accurately.
  • the analysis target component can be quantified with higher accuracy.
  • the method of the present invention can be used for many tests such as 13 biochemical tests, tumor markers, and hepatitis tests using a very small amount of blood (65 ⁇ L). Because this test method does not choose the time and place, it can detect the non-disease that cannot receive the medical examination. In addition, since it can be easily tested, health management can be performed easily, so changes in the body can be captured before the disease becomes serious, contributing to a reduction in national medical expenses.
  • FIG. 2 shows an explanatory diagram in the case of using an internal standard substance that does not permeate the blood cell membrane of blood but permeates only into plasma.
  • FIG. 3 is an explanatory diagram when the internal standard substance has a property of penetrating into both blood plasma and blood cells.
  • FIG. 1 It is a correlation diagram of the biochemical test of venous blood plasma and hand blood sampling diluted plasma.
  • Venous blood EDTA-2Na-added whole blood and diluted whole blood obtained by diluting this whole blood with blood dilution buffer were used as samples for white blood cells (WBC), red blood cells (RBC), hemoglobin concentration (Hgb), hematocrit value (Hct), It is the correlation figure which calculated platelet count (Plt).
  • the hematocrit value indicating the blood cell volume in the blood obtained from the calculation formula using the plasma dilution rate obtained from the maltose internal standard and the whole blood dilution rate obtained from ethanolamine, and the hematocrit value obtained by measuring the whole blood with a hemocytometer It is a correlation diagram. It is a figure which shows the linearity of the enzymatic measuring method of sodium. It is a figure which shows the linearity of a crawl measuring method. It is a figure which shows the linearity of lithium concentration and a light absorbency. It is a correlation diagram of the diluted plasma measured value by a hybrid method, and a raw plasma measured value (total protein and albumin).
  • FIG. 5 is a correlation diagram of diluted plasma measurement values and raw plasma measurement values by the hybrid method (HDL-cholesterol and ⁇ GTP). It is a correlation diagram of the diluted plasma measured value by a hybrid method, and a raw plasma measured value (total cholesterol and neutral fat). It is a correlation diagram of the diluted plasma measured value by a hybrid method, and a raw plasma measured value (urea nitrogen and creatinine). It is a correlation diagram of the diluted plasma measured value by a hybrid method, and an original plasma measured value (uric acid and blood glucose).
  • the present invention has the following features. That is, according to one aspect of the present invention, there is provided a method for quantifying and analyzing enzyme activity of a biological sample containing blood cells of an unknown concentration collected, wherein the component is not or hardly contained in the biological sample.
  • An internal standard that does not pass through the blood cell membrane is prepared and added to the buffer.
  • Analyze the internal standard concentration in the buffer before adding blood and measure the absorbance and the concentration of the internal standard in the diluted buffer after adding blood.
  • the plasma dilution rate is determined, and the biological components and enzyme activities in the raw plasma are determined.
  • the osmotic pressure of the buffer solution is adjusted so as to be approximately the blood osmotic pressure.
  • a method using an internal standard substance is called an internal standard method, and for example, a method using lithium as an internal standard substance is called a lithium (Li) internal standard method.
  • the biological sample of unknown concentration may be a biological sample that does not contain blood cells (saliva, urine, etc.).
  • the internal standard substance used in this case may be a substance that permeates the blood cell membrane.
  • hydrogen peroxide is generated by adding an oxidase using the internal standard substance or a substance derived from the internal standard substance as a substrate, and peroxidase
  • an enzymatic measurement method in which the color development of a quinone dye, NAD (P) H, or tetrazonium salt obtained by oxidative condensation of a Trinder reagent and 4-aminoantipyrine in the presence is measured and quantified as absorbance.
  • the internal standard substance to be put in the buffer solution is a component that does not exist in the living body or is present in a very small amount, and the blood cell membrane It must be non-permeable, stable in buffer solution, and not adsorbed on the container. It is also necessary not to interfere with other biological components.
  • blood 1 is composed of plasma or serum 2 as a liquid component, and blood cell 3 as a solid component, and blood cell 3 further includes a solid component such as a blood cell membrane and a liquid component inside thereof. It is known to have.
  • EDTA-2 sodium an anticoagulant, to blood 1, clotting of blood cell 3 can be prevented.
  • blood cells 3 having a heavy specific gravity are settled to the bottom and plasma is separated into the supernatant.
  • an internal standard substance 5 that does not permeate the blood cell membrane is stored in the buffer 4 in advance in the container (FIG. 2 (a)), and the collected blood 1 is placed in the buffer 4 from the top of the container. And introduced into the upper side of the mixed layer of the internal standard substance 5 (FIG. 2B).
  • the blood 1 is diluted with a predetermined buffer 4
  • components that do not permeate the blood cell membrane originally present in the plasma or serum 2 are distributed in the buffer 4 and plasma or serum 2, and diluted.
  • the blood diluted solution 6 is obtained (FIG. 2 (c)).
  • the internal standard substance 5 includes an internal standard substance 5 such as maltose that penetrates only into the plasma 2. Since maltose is dissolved as an anion in the buffer 4, it is dissolved in the plasma 2 and does not penetrate into the blood cell 3.
  • FIG. 3 shows an explanatory diagram of the distribution of the internal standard substance 5 to whole blood (plasma 2 + blood cells 3).
  • the internal standard substance 5 for example, ethanolamine
  • the internal standard substance 5 that permeates the blood cell membrane is stored in the buffer 4 in advance in the container (FIG. 3 (a)), and the collected blood 1 is mixed with the buffer 4 and the internal standard substance 5 from the upper part of the container. It introduce
  • the blood diluted solution 6 is constituted by being uniformly dispersed in the serum 2 (FIG. 3C). That is, since the internal standard substance 5 used in the case shown in FIG. 3 is distributed in both the plasma 2 and the blood cell 3, the dilution factor by the buffer solution 4 can be obtained.
  • Internal standards that permeate the blood cell membrane include chemical groups with a molecular weight of 500 or less, amino groups (-NH 2 ), alkyl groups (-CH 3 , -C 6 H 6 ), ester groups (-COOR), alkoxy groups ( -OR), halogen (-Cl, -Br, -I) and other hydrophobic substituents such as ethanolamine, hexylamine, phenylethylamine, amyramine, histamine, putrescine, hypoxanthine, tryptophan, pregrenolone, ⁇ -Sitosterol and the like. Corresponding to these internal standards can be analyzed by enzymatic measurement using oxidase.
  • the buffer 4 for diluting the biological component must be miscible with the biological sample in an arbitrary amount, and it is necessary to be able to stably store the component to be measured in the biological sample.
  • the component of buffer 4 is not limited, but HEPES ⁇ 2- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic acid ⁇ buffer having buffering capacity, ACES [N- (2-acetamido) -2 -Aminoethanesulfonic acid] buffer, ADA [N- (2-acetamido) iminodiacetic acid] buffer, BES [N, N-bis (2-hydroxyethyl) -2-aminosulfonic acid] buffer, Bicine [N , N-bis (2-hydroxyethyl) glycine] buffer, Bis-Tris [bis (2-hydroxyethyl) iminotris (hydroxymethyl) methane] buffer, CAPS (N-cyclohexyl-3-aminopropa
  • the dilution buffer may contain a chelating agent, antibacterial agent, preservative, coenzyme, saccharide, inhibitor, etc. for the purpose of keeping the component to be measured stable.
  • Examples of chelating agents include ethylenediaminetetraacetate, citrate, and oxalate.
  • antibacterial agents and preservatives include amikacin sulfate, kanamycin sulfate, thiabendazole, sodium azide and the like.
  • Examples of coenzymes include pyridoxal phosphate, magnesium, zinc and the like.
  • Examples of the saccharide include mannitol, dextrose, oligosaccharide and the like.
  • Examples of inhibitors include sodium dodecyl sulfate, mercury, heparin and the like.
  • Stabilizers may be added in combination of a plurality of types depending on the component to be measured.
  • AST aspartate aminotransferase
  • ALT aslanine aminotransferase
  • the buffer preferably contains 0.1 to 5.0 mmol / L of ethylenediaminetetraacetic acid salt and 0.01 to 0.20 mmol / L of pyridoxalphosphate, particularly 0.5 to 3.0 mmol / L of ethylenediaminetetraacetic acid and pyridoxalphosphate. It is preferable that 0.02 to 0.10 mmol / L is contained.
  • the internal standard added to the buffer solution is not in the living body or is extremely small, does not interfere with biological components, is stable in the buffer solution, does not adsorb to the storage container, and can be detected with high accuracy.
  • the system must be available. When diluting blood, an osmotic pressure is required so that blood cells do not hemolyze, and an osmotic pressure of 250 to 500 mOsm / kg is preferable.
  • Table 1 shows the composition of a buffer containing, as an example of a buffer, sarcosine, which is one of internal standards that do not permeate the blood cell membrane, and ethanolamine, which is one of the internal standards that permeate the blood cell membrane. ing.
  • HEPES is N-2-hydroxyethylpiperazine-N′-2-ethanesulfonic acid.
  • Table 2 shows a measurement reagent for sarcosine, which is one of internal standard substances that do not pass through the blood cell membrane.
  • TOOS is N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3-methylaniline sodium dihydrate.
  • R1 and R2 are used for maltose measurement.
  • --A1 (absorbance) 3.
  • Table 3 shows the measurement reagent for ethanolamine, which is one of the internal standard substances that pass through the blood cell membrane.
  • DAOS is N-ethyl-N (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethylaniline sodium salt.
  • R1 and R2 are used for ethanolamine measurement.
  • blood 1 is composed of plasma 2 which is a liquid component, or blood cells 3 which are serum and solid components, and further, blood cells have a solid component such as a blood cell membrane and a liquid component inside thereof. It is known. Blood can be blocked from clotting by adding EDTA-2 sodium, an anticoagulant. When this whole blood is centrifuged, blood cells with heavy specific gravity settle to the bottom, and plasma is separated into the supernatant.
  • buffer solution 4 when blood 1 is diluted with a predetermined buffer solution 4, components that do not permeate the blood cell membrane originally present in plasma 2 or serum are contained in buffer solution 4 and plasma 2 or serum. Will be distributed and diluted.
  • the internal standard substance 5 that does not permeate the blood cell membrane is dissolved in the buffer solution 4
  • the internal standard substance originally present in the buffer solution should be distributed in the buffer solution and plasma or serum. And diluted.
  • This internal standard indicates an internal standard such as maltose that penetrates only into plasma. Since maltose is dissolved in the buffer as an anion, it dissolves in plasma and does not penetrate into blood cells.
  • the initial concentration (C0) of the internal standard substance 5 that does not permeate the blood cell membrane in the buffer 4 changes to the concentration (C1) when blood is added.
  • the dilution ratio (r1) of plasma or serum C0 / (C0 ⁇ C1) is calculated from C0 and C1.
  • the amount of the buffer solution is VO, and the total amount V1 of plasma or serum added to the buffer solution is defined as V1.
  • the components that permeate the blood cell membrane are distributed in the buffer and plasma or serum and blood cells and diluted.
  • the internal standard substance that is originally present in the buffer solution must be distributed in the buffer solution and plasma, or serum and blood cells. And diluted.
  • the blood cell membrane volume (V2) and blood cell inner volume (V3) are used, that is, the initial concentration (C2) of the internal standard substance that permeates the blood cell membrane in the buffer solution is changed to the concentration (C3) by adding blood. Change.
  • the volume (V0) of the solution containing the internal standard is the specified amount, the internal standard that does not permeate the blood cell membrane From the calculated dilution ratio (r1) of the biological sample component that does not permeate the blood cell membrane, the volume (V1) of the biological sample that does not permeate the blood cell membrane can be calculated.
  • V1 V0 / (r1-1) It can be calculated by
  • the biological sample is diluted with a solution containing the internal standard substance 5 that permeates the blood cell membrane
  • the volume (V0) of the solution containing the internal standard substance is quantitative, the internal standard substance that permeates the blood cell membrane is used. From the calculated blood dilution rate (r2), the blood volume (V1 + V2 + V3) can be calculated.
  • V1 + V2 + V3 V0 / (r2-1) It can be calculated by
  • V1 obtained from V0 and r1
  • V1, V2, and V3 can be calculated from V0, r1, and r2.
  • V1 Dilution rate of plasma or serum
  • V1 + V2 Whole blood dilution rate
  • V1 + V2 + V3 Blood dilution rate ⁇ (V0 + V1 + V2 + V3) / (V1 + V2 + V3) ⁇ Blood cell volume (V2 + V3) Blood cell dilution rate ⁇ (V0 + V2 + V3) / (V2 + V3) ⁇ Blood cell volume (V2) Dilution rate of blood cell liquid ⁇ (V0 + V2) / V2 ⁇
  • Amount of blood cell solids V3 Blood cell solid dilution rate ⁇ (V0 + V3) / V3 ⁇ Hematocrit value (%) ⁇ (V2 + V3) / (V1 + V2 + V3) ⁇ 100 (%) ⁇ or 1- (blood dilution rate-1) / (plasma dilution rate-1) Buffer
  • the present invention is a method for quantifying an analyte to be quantified in a biological sample after diluting the biological sample such as blood with a buffer solution, and a dilution factor of the biological sample using an external standard substance that is the biological sample component And the component to be analyzed in the biological sample is quantified from the dilution factor.
  • the method using an external standard substance is called an external standard method, for example, the method using sodium as an external standard substance is called a sodium (Na) external standard method.
  • the dilution factor is obtained using an external standard substance which is a constant component contained in the biological component.
  • biological samples to be analyzed include biological samples such as blood, serum, plasma, urine, saliva, lymph, spinal fluid, interstitial fluid, sweat, etc.
  • biological samples such as blood, serum, plasma, urine, saliva, lymph, spinal fluid, interstitial fluid, sweat, etc.
  • blood, serum, plasma are examples. preferable.
  • a small amount of blood is collected from a test subject, diluted with a buffer solution, blood cells are separated by a filter or centrifugation, and the analysis target component is measured using the obtained plasma or serum.
  • the present invention dilutes the biological sample with the buffer for dilution, a small amount of the biological sample is sufficient.
  • the analysis target component can be measured using a trace blood sample of 200 ⁇ L or less.
  • the origin of the biological sample is not limited to humans, and it may be animals, fish, birds and the like.
  • animals include horses, cows, pigs, sheep, goats, dogs, cats, mice, bears, pandas and the like.
  • the biological sample component to be analyzed is not limited, and any substance contained in the biological sample is targeted. Examples include biochemical test items in blood used for clinical diagnosis, markers for various diseases such as tumor markers and hepatitis markers, and include proteins, sugars, lipids, low molecular weight compounds, and the like. Further, the measurement includes not only the concentration of the substance but also the activity of a substance having an activity such as an enzyme. Each component to be analyzed can be measured by a known method.
  • An external standard substance is contained in a biological sample and has high homeostasis, that is, a substance with a small physiological variation in the concentration in the biological sample, and a substance with a small difference in the concentration in the biological sample between human individuals.
  • examples of such substances include sodium (Na + ), chlor (Cl ⁇ ), and protein.
  • examples of the protein include albumin that is contained in blood and has high homeostasis, total serum protein, and the like. Among these, sodium is particularly preferable since it has high homeostasis and little variation between individuals.
  • the normal value of sodium concentration in human plasma that is, the sodium concentration in healthy human plasma is about 135 to 145 mmol / L (mEq / L), and the median is about 142 mmol / L.
  • plasma sodium concentrations fall within the normal range. In 2.5% of subjects, the concentration is lower than this, and in 2.5% of subjects, the concentration is higher.
  • the dilution factor of the biological sample used as the specimen can be determined from the concentration of the external standard substance diluted with the buffer solution and the average value of the sodium concentration in the plasma of a healthy person. When a biological sample other than blood, serum, or plasma is used as the biological sample, the dilution factor can be determined from the median sodium concentration in each biological sample.
  • the buffer solution for diluting the biological sample does not contain the external standard substance or even if it is contained, after the biological sample is diluted It is necessary to use a buffer solution contained at a very small concentration that does not affect the measurement of the external standard substance in the mixture.
  • a substance that interferes with the measurement of the external standard substance is not included, or even if it is included, a trace amount that does not affect the measurement of the external standard substance in the diluted solution after the biological sample is diluted. It is necessary to use a buffer that is included in the concentration.
  • the buffer is substantially free of the substance.
  • the sodium concentration in the dilution buffer used in the method of the present invention is 100 nmol / L or less.
  • the biological sample dilution buffer does not contain sodium or chlor, or even if it is contained, it needs to be extremely small. Further, since sodium affects the determination of elements belonging to alkali metals or elements belonging to alkaline earth metals, even if sodium is not included in the dilution buffer for biological samples, It needs to be a trace amount.
  • the dilution buffer for the biological sample is close to the pH of the biological sample, pH 6.5 to pH 8.0.
  • the buffer solution should preferably be pH 7.0 to pH 7.5, more preferably pH 7.4.
  • the buffer component since biological components in blood diluted with a buffer solution are measured, the buffer component must not affect the denaturation and stability of these biological components to be measured.
  • Conventionally there has been no buffer solution that has a buffer capacity around pH 7.4 and does not contain sodium or chlor, so it has been impossible to use sodium or chlor as an external standard.
  • a buffer solution having a buffer capacity around pH 7.4 and not containing sodium or chlor was newly developed, and sodium or chlor can be used as an external standard substance.
  • alkaline substances that do not contain sodium, chlor, alkali metal elements and alkaline earth metal elements include 2-amino-2-methyl-1-propanol (AMP), 2-ethylaminoethanol, N- Good's buffer (good buffer) is a compound that shows acidity with amino alcohol compounds such as methyl-D-glucamine, diethanolamine, and triethanolamine.
  • AMP 2-amino-2-methyl-1-propanol
  • 2-ethylaminoethanol 2-ethylaminoethanol
  • N- Good's buffer (good buffer) is a compound that shows acidity with amino alcohol compounds such as methyl-D-glucamine, diethanolamine, and triethanolamine.
  • AMP 2-amino-2-methyl-1-propanol
  • HEPES TES, MOPS or BES
  • AMP 2-amino-2-methyl-1-propanol
  • HEPES 2-amino-2-methyl-1-propanol
  • amino alcohol and Good's buffer are mixed at a concentration ratio of 1: 2 to 2: 1, preferably 1: 1.5 to 1.5: 1, more preferably 1: 1. do it.
  • concentration of the buffer is not limited, but the concentration of amino alcohol or Good's buffer is 0.1 to 1000 ⁇ mM / L, preferably 1 to 500 ⁇ mM / L, more preferably 10 to 100 ⁇ mM / L.
  • the buffer solution may contain a chelating agent, a surfactant, an antibacterial agent, a preservative, a coenzyme, a saccharide, an inhibitor and the like for the purpose of keeping the analysis target component stable.
  • chelating agent include ethylenediaminetetraacetate (EDTA), citrate, and oxalate.
  • the surfactant include a cationic surfactant, an anionic surfactant, an amphoteric surfactant, and a nonionic surfactant.
  • the preservative include sodium azide and antibiotics.
  • the coenzyme include pyridoxal phosphate, magnesium, zinc and the like.
  • saccharide examples include mannitol, dextrose, oligosaccharide and the like.
  • inhibitor examples include sodium dodecyl sulfate, mercury, heparin and the like.
  • the addition of mannitol and pyridoxal phosphate can stabilize blood cell membranes and enzymes, and the addition of 3 to 4 types of antibiotics and antibacterial agents suppresses the growth of bacteria partially contaminated from the surface of the hand when blood is collected. It is possible to stabilize the degradation of biological components by bacteria.
  • the osmotic pressure of the buffer solution should be equivalent to that of blood (285 mOsm / kg) or higher. Can prevent hemolysis of blood cells.
  • the osmotic pressure can be adjusted to be isotonic with salts, sugars, buffers, etc. that do not affect the determination of the biological component to be measured.
  • the present invention also includes the above-mentioned buffer solution used for using the dilution factor of the biological sample by the method of the present invention.
  • External standard substances such as chlor (Cl ⁇ ) and protein can also be measured by known methods.
  • there is a method for measuring the absorbance of chlor which can be measured from its reaction rate because amylase is activated by chlor ions.
  • Protein can be measured by the Burette method, the Bradford method, the Raleigh method, and the like.
  • Albumin can be measured by the bromcresol green method which is a dye method.
  • a flame photometer an atomic absorption method, an ion selective electrode method and the like as a method for measuring sodium in a biological sample used as an external standard diluted with a buffer solution.
  • a sample obtained by collecting a small amount of blood from a finger and diluting with a buffer is only about 150 ⁇ L, and measures 10 or more biochemical components and immunological test items. It is necessary to measure sodium which is an external standard substance using a small amount of sample of several ⁇ L.
  • biochemical / immunological automatic analyzer since it is necessary to analyze a large amount of sample, it is necessary to be adaptable to a commercially available biochemical / immunological automatic analyzer.
  • an enzymatic measurement method was developed as a sodium measurement method, in which several ⁇ L of a very low concentration sodium (24 mmol / L or less) sample diluted with a buffer was used.
  • the measurement of trace sodium in a diluted biological sample utilizes the fact that ⁇ -galactosidase is activated by sodium, and the sodium concentration and galactosidase activity of the sample diluted with a buffer solution are proportional to each other. Measure using This method can be applied to biochemical / immunological automatic analyzers and is highly efficient and economical in that it does not require a separate measuring instrument for sodium measurement.
  • a biological sample such as blood is diluted with a buffer for dilution, further diluted with purified water, and the first reagent, which is a buffer containing ⁇ -galactosidase, is 10 to 30 times the volume of the diluted sample.
  • the second reagent which is a substrate solution containing o-Nitrophenyl- ⁇ -D-Galactpyranoside, about half the amount of the first reagent, The absorbance is measured at a sub wavelength of 658 nm.
  • a biological sample such as blood is diluted with a buffer for dilution, and further diluted about 5 times with purified water, and the diluted biological sample and buffer mixture is 1 to 10 ⁇ L, preferably 3 ⁇ L of the first reagent.
  • a buffer solution containing ⁇ -galactosidase 30-100 ⁇ L, preferably 52 ⁇ L, so that the volume ratio of the buffer solution containing ⁇ -galactosidase and the diluted biological sample to the buffer solution mixture is 10-30, preferably 15-25.
  • the mixture is heated at 30 to 45 ° C., preferably 37 ° C.
  • the sodium concentration can be measured by measuring the absorbance at a main wavelength of 410 nm and a sub wavelength of 658 nm.
  • the method for obtaining the dilution factor of the biological sample of the present invention is preferably as follows.
  • the volume of the buffer solution is preferably 3 to 4 times or more the volume of the biological sample.
  • the biological sample is blood
  • 65 ⁇ L of a micro blood sample is added to 280 ⁇ L of buffer solution and mixed.
  • blood cells such as red blood cells and white blood cells are removed after dilution.
  • the blood cells may be removed using a filter, or the diluted blood sample may be removed by centrifugation.
  • the analyte component is measured using the diluted plasma sample from which the blood cells have been removed.
  • the plasma is diluted about 10 times.
  • blood is used as a biological sample, it is converted into plasma so that the plasma is diluted to 5 to 20 times, preferably 5 to 16 times, more preferably 5 to 10 times, particularly preferably about 8 to 10 times. What is necessary is just to mix the blood and the buffer for dilution.
  • the concentration of the analyte in the blood can be calculated by obtaining the dilution factor of blood from the external standard substance concentration and multiplying the measured value of the analyte component of the diluted plasma sample by the dilution factor.
  • the blood sample When blood is used as a biological sample, the blood sample is removed after the blood is diluted with a dilution buffer, so that the remaining sample is plasma, which is called diluted plasma. Therefore, in this case, it means obtaining the dilution factor of plasma.
  • the dilution factor of plasma can be determined by the following calculation method using the calculation formula (I) using an external standard substance.
  • the absorbance of sodium When using sodium as an external standard substance, the absorbance of sodium may be obtained. As the absorbance of the normal median sodium concentration in plasma, an absorbance of 142 mmol / L of sodium may be used.
  • the present invention is a method for quantifying a component to be analyzed in a biological sample after diluting the biological sample such as blood with a buffer solution, wherein the dilution factor of the biological sample is determined using an internal standard substance and an external standard substance. And determining the component to be analyzed in the biological sample from the dilution factor.
  • the internal standard substance and external standard substance are used in combination to determine the dilution factor.
  • the external standard substance is used to correct the dilution factor by the internal standard substance and accurately determine the dilution factor.
  • the method for obtaining the dilution factor of the biological sample of the present invention is sometimes referred to as a hybrid method because it uses both an internal standard substance and an external standard substance.
  • the dilution factor When calculating the dilution factor of a biological sample using only the internal standard substance, the dilution factor is too large when the amount of the biological sample is small because the dilution is performed with a dilution buffer containing the internal standard substance added to the biological sample. The reliability of the dilution factor obtained from the standard substance concentration will be low.
  • the disadvantage of the method using the internal standard substance can be compensated by using the external standard substance. Further, as will be described later, a substance used as an internal standard substance may be contained in a biological sample, or the concentration of an external standard substance originally in the biological sample may be out of a normal value. Even in such a case, the hybrid method can compensate for the drawbacks of the respective methods and obtain an accurate dilution factor.
  • the biological sample to be analyzed in the present invention the biological sample described in “2. Analysis method using external standard substance (external standard method)” can be used, and the origin of the biological sample is 2 (external). Standard method).
  • the biological sample component to be analyzed is also the biological sample component to be analyzed described in 2 (External standard method).
  • the internal standard substance is used by adding it to a buffer solution used for diluting the biological sample so as to have a predetermined concentration.
  • Internal standards include substances that are not contained in a biological sample at all, or that are contained in trace amounts, substances that do not interfere with the measurement of analytes in biological samples, Substances that do not decompose under the action of biological enzymes, substances that are stable in buffer solutions, substances that do not permeate the blood cell membrane and are not contained in blood cells, substances that do not adsorb in the buffer storage container, and detection systems that can measure accurately Use available materials. Examples of such substances include those described in “1. Analytical method using internal standard substance (internal standard method)”. Among these substances, alkaline substances that are stable even if stored for a long time in a state where they are added to a buffer solution Elements that belong to metals or alkaline earth metals that are not naturally contained in biological samples are preferred.
  • Examples of elements belonging to alkali metals include Li (lithium), Rb (rubidium), Cs (cesium), and Fr (francium).
  • Elements belonging to alkaline earth metals include Sr (strontium), Ba (barium), and Ra. (Radium), and Li is preferable among them.
  • glycerol-3-phosphate described in JP-A-2003-161729 can be used.
  • the concentration of the internal standard substance added to the buffer used for diluting the biological sample is not limited as long as the concentration of the internal standard substance can be measured after dilution. For example, it may be added at a concentration of 0.1 to 1000 mM / L, preferably 0.1 to 100 mM / L, more preferably 0.5 to 10 mM / L.
  • lithium when lithium is used as the internal standard substance, lithium may be added at the above concentration to a buffer used for dilution of the biological sample.
  • the range of the dilution factor of the sample when the sample is added to the buffer containing the internal standard substance is not limited, but it is 5 to 20 times, preferably 5 to 15 times.
  • An external standard substance is contained in a biological sample and has high homeostasis, that is, a substance with a small physiological variation in the concentration in the biological sample, and a substance with a small difference in the concentration in the biological sample between human individuals.
  • examples of such substances include sodium (Na + ), chlor (Cl ⁇ ), and protein.
  • examples of the protein include albumin that is contained in blood and has high homeostasis, total serum protein, and the like. Among these, sodium is particularly preferable since it has high homeostasis and little variation between individuals.
  • the normal value of sodium concentration in human plasma that is, the sodium concentration in healthy human plasma is about 135 to 145 mmol / L (mEq / L), and the median normal value is about 142 mmol / L.
  • plasma sodium concentrations fall within the normal range. In 2.5% of subjects, the concentration is lower than this, and in 2.5% of subjects, the concentration is higher.
  • the dilution factor of the biological sample used as the specimen can be determined from the concentration of the external standard substance diluted with the buffer solution and the average value of the sodium concentration in the plasma of a healthy person. When a biological sample other than blood, serum, or plasma is used as the biological sample, the dilution factor can be determined from the median sodium concentration in each biological sample.
  • the dilution factor of the biological sample to be used as the specimen from the concentration of the internal standard substance in the biological sample after dilution with the buffer and the concentration of the internal standard substance added to the buffer used for dilution.
  • the dilution factor calculated from the internal standard substance concentration is corrected to obtain a more accurate dilution factor. be able to.
  • the buffer solution for diluting the biological sample does not contain the external standard substance or even if it is contained, after the biological sample is diluted It is necessary to use a buffer solution contained at a very small concentration that does not affect the measurement of the external standard substance in the mixture.
  • external standard substances and substances that interfere with the measurement of internal standard substances are not included, or even if they are included, the measurement of internal standard substances or external standard substances in diluted solutions after dilution of biological samples is affected.
  • the buffer solution is referred to as a buffer solution substantially free of the substance.
  • the sodium concentration in the dilution buffer used in the method of the present invention is 100 nmol / L or less.
  • the biological sample dilution buffer does not contain sodium or chlor, or even if it is contained, it needs to be extremely small.
  • the dilution buffer for the biological sample is used as an element belonging to the alkali metal used as the internal standard substance and an alkaline earth. The elements belonging to the metals and the substances similar to these elements are not included, or even if they are included, they need to be extremely small.
  • the dilution buffer for the biological sample is close to the pH of the biological sample, pH 6.5 to pH 8.0.
  • the buffer solution should preferably be pH 7.0 to pH 7.5, more preferably pH 7.4.
  • the buffer component since biological components in blood diluted with a buffer solution are measured, the buffer component must not affect the denaturation and stability of these biological components to be measured.
  • alkaline compounds that do not contain sodium, chlor, alkali metal elements and alkaline earth metal elements include 2-amino-2-methyl-1-propanol (AMP), 2-ethylaminoethanol, N- HEPES (2- [4- (2) which is a good's buffer (good buffer) that shows acidity with amino alcohol compounds such as methyl-D-glucamine, diethanolamine, and triethanolamine, and has a pKa of around pH7.4.
  • AMP 2-amino-2-methyl-1-propanol
  • 2-ethylaminoethanol 2-ethylaminoethanol
  • N- HEPES (2- [4- (2) which is a good's buffer (good buffer) that shows acidity with amino alcohol compounds such as methyl-D-glucamine, diethanolamine, and triethanolamine, and has a pKa of around pH7.4.
  • AMP 2-amino-2-methyl-1-propanol
  • HEPES TES, MOPS or BES
  • AMP 2-amino-2-methyl-1-propanol
  • HEPES 2-amino-2-methyl-1-propanol
  • amino alcohol and Good's buffer are mixed at a concentration ratio of 1: 2 to 2: 1, preferably 1: 1.5 to 1.5: 1, more preferably 1: 1. do it.
  • concentration of the buffer is not limited, but the concentration of amino alcohol or Good's buffer is 0.1 to 1000 ⁇ mM / L, preferably 1 to 500 ⁇ mM / L, more preferably 10 to 100 ⁇ mM / L.
  • the buffer solution may contain a chelating agent, a surfactant, an antibacterial agent, a preservative, a coenzyme, a saccharide, an inhibitor and the like for the purpose of keeping the analysis target component stable.
  • chelating agent include ethylenediaminetetraacetate (EDTA), citrate, and oxalate.
  • the surfactant include a cationic surfactant, an anionic surfactant, an amphoteric surfactant, and a nonionic surfactant.
  • the preservative include sodium azide and antibiotics.
  • the coenzyme include pyridoxal phosphate, magnesium, zinc and the like.
  • saccharide examples include mannitol, dextrose, oligosaccharide and the like.
  • inhibitor examples include sodium dodecyl sulfate, mercury, heparin and the like.
  • the addition of mannitol and pyridoxal phosphate can stabilize blood cell membranes and enzymes, and the addition of 3 to 4 types of antibiotics and antibacterial agents suppresses the growth of bacteria partially contaminated from the surface of the hand when blood is collected. It is possible to stabilize the degradation of biological components by bacteria.
  • the osmotic pressure of the buffer solution should be equivalent to that of blood (285 mOsm / kg) or higher. Can prevent hemolysis of blood cells.
  • the osmotic pressure can be adjusted to be isotonic with salts, sugars, buffers, etc. that do not affect the determination of the biological component to be measured.
  • the present invention also includes the above-described buffer solution used for using a dilution factor of a biological sample by the hybrid method of the present invention.
  • the buffer can be used not only for the hybrid method of the present invention, but also for a quantitative analysis method using an external standard (external standard method) and a quantitative analysis method using an internal standard (internal standard method).
  • the element of alkali metal or alkaline earth metal that is an internal standard substance can be measured by a known method.
  • a substance that forms a chelate complex with an element belonging to an alkali metal or an element belonging to an alkaline earth metal may be added, and the absorbance of the formed chelate complex may be measured.
  • the substance that forms a chelate complex with an alkali metal element or an alkaline earth metal element include porphyrin derivatives such as polyvalent halogen-substituted porphyrin compounds (for example, polyfluoroporphyrin).
  • the absorbance of the element itself can be measured by an atomic absorbance method.
  • the chelate colorimetric method (halogenated porphyrin chelate method: perfluoro-5,10,15,20-tetraphenyl-21H, 23H -porphyrin) is used to measure lithium added to the buffer as an internal standard. Then, it can be performed by a biochemical automatic analyzer. By this method, a large number of specimens can be easily measured with a small amount of sample.
  • Chlor (Cl ⁇ ) and protein, which are external standard substances, can also be measured by a known method described in 2 (external standard method).
  • an alkali metal element such as lithium or an alkaline earth metal element is used as the internal standard substance
  • a biological substance such as sodium (Na + ), chlor (Cl ⁇ ), or protein is used as the external standard substance.
  • Lithium carbonate is used as a medicine for the improvement of manic and manic depression. For those who need treatment, lithium carbonate is administered in the hundreds to thousands of mg per day. Therefore, the biological sample of the subject receiving lithium carbonate contains lithium, and when only lithium is used as an internal standard, an accurate dilution factor cannot be obtained.
  • sodium has a normal blood concentration range of about 135 to 145 mmol / L (mEq / L) in healthy subjects as described above, but about 5% of subjects have normal values even in healthy subjects. In about 2.5% of subjects, even a healthy person has a lower concentration than the normal value, and in about 2.5% of subjects, a healthy person has a higher concentration than the normal value. In such examinees, when only sodium is used as an external standard, the dilution factor cannot be determined accurately.
  • the method for obtaining the dilution factor of the biological sample of the present invention is preferably as follows.
  • the volume of the buffer solution is preferably 3 to 4 times or more the volume of the biological sample.
  • the biological sample is blood
  • 65 ⁇ L of a micro blood sample is added to 280 ⁇ L of internal standard addition buffer and mixed.
  • blood cells such as red blood cells and white blood cells are removed after dilution.
  • the blood cells may be removed using a filter, or the diluted blood sample may be removed by centrifugation.
  • the analyte component is measured using the diluted plasma sample from which the blood cells have been removed.
  • the plasma is diluted about 10 times.
  • blood is used as a biological sample, it is converted into plasma so that the plasma is diluted to 5 to 20 times, preferably 5 to 16 times, more preferably 5 to 10 times, particularly preferably about 8 to 10 times. What is necessary is just to mix the blood and the buffer for dilution.
  • the concentration of the analyte in the blood can be calculated by obtaining the dilution factor of blood from the internal standard substance concentration and the external standard substance concentration and multiplying the measured value of the analyte component of the diluted plasma sample by the dilution factor.
  • the blood sample When blood is used as a biological sample, the blood sample is removed after the blood is diluted with a dilution buffer, and the remaining sample is plasma. This is called diluted plasma. Therefore, in this case, it means obtaining the dilution factor of plasma.
  • the dilution factor of plasma can be determined by the following three types of calculation methods using an internal standard substance and an external standard substance.
  • a plasma sample obtained by diluting blood with a buffer solution for dilution to which an internal standard substance is added and filtering using a filter is used.
  • Lithium is used as an internal standard substance and sodium is used as an external standard substance.
  • diluted plasma refers to plasma obtained by diluting a blood sample with a dilution buffer and removing blood cells.
  • the lithium concentration can be represented by, for example, the absorbance obtained when the lithium concentration is measured by a chelate colorimetric method or the like.
  • the concentration of sodium can be expressed by absorbance when measured by an enzymatic measurement method or the like.
  • the normal median value of plasma sodium concentration is the median value of healthy subjects, and the absorbance of sodium normal concentration of plasma sodium concentration may be an absorbance of 142 mmol / L sodium. This value is a known value. The same applies to the calculation methods 2 and 3 below.
  • the dilution factor X of plasma with a buffer solution can be determined by the following calculation formula (1) or calculation formula (2).
  • the analysis target component can be quantified.
  • Quantify the measured concentration and enzyme activity of the biochemical component, which is the analyte in the diluted plasma, and multiply the quantitative value by the dilution factor determined by the calculation formula (3) to quantify the analyte in the original plasma. can do.
  • the absorbance change amount correction value B ′ of the internal standard substance (for example, lithium) is determined by the following formula using the dilution factor of the external standard substance (for example, sodium).
  • B ') (A x D) / C
  • Quantify the measured concentration and enzyme activity of the biochemical component, which is the analyte in the diluted plasma, and multiply the quantitative value by the dilution factor determined by the calculation formula (4) to quantify the analyte in the original plasma. can do.
  • Example 1-1 60 ⁇ L of whole blood sample added with EDTA-2Na and 200 ⁇ L of blood dilution buffer were added to blood dilution buffer added to dilution buffer with maltose as internal standard, and 50 venous blood samples were examined.
  • the enzyme activity transaminase; ALT, ⁇ -glutamyltransferase; GGT
  • lipid test neutral fat; TG, LDL-cholesterol, glucose, hemoglobin A1c.
  • Example 1-2 About 50 venous blood samples, 60 ⁇ L of whole blood sample added with EDTA-2Na and 200 ⁇ L of blood dilution buffer to dilution buffer obtained by adding ethanolamine, an internal standard distributed in blood cells and plasma, to blood dilution buffer investigated.
  • FIG. 5 shows a correlation diagram for calculating the platelet count (Plt). According to this, good correlation is recognized except for the platelet count.
  • Example 1-3 Correlation between the hematocrit value indicating the blood cell volume in the blood obtained from the calculation formula using the plasma dilution rate obtained from the maltose internal standard and the whole blood dilution rate obtained from ethanolamine, and the value obtained from the whole blood with a hemocytometer I investigated. The result is shown in FIG. Practical with good correlation.
  • Table 5 shows the composition of the buffer solution used.
  • the measurement of trace sodium in diluted plasma is based on the fact that ⁇ -galactosidase is activated by sodium, and an enzymatic measurement method has been developed that utilizes the proportional relationship between sodium concentration and galactosidase activity in samples diluted with buffer. .
  • Table 6 shows the composition of the sodium measurement reagent.
  • FIG. 1 shows a calibration curve showing the sodium concentration and the amount of change in absorbance. Linearity passing through the origin was obtained up to 24 mmol / L, and sodium quantitativeness was confirmed.
  • 150 ⁇ L of the first reagent was added to 5 ⁇ L of the sample, heated at 37 ° C. for 5 minutes, 50 ⁇ L of the second reagent was added, and the change in absorbance at 405 nm for 2 minutes after 1 minute was determined.
  • FIG. 8 shows a calibration curve showing the crawl concentration and the amount of change in absorbance.
  • Table 7 shows the correlation statistics between the plasma measurement value and the diluted plasma measurement value obtained from the dilution factor of the external standard substance (sodium). The measurement was performed using JEOL Ltd. JCA-BM 6050 type automatic analyzer. Biochemical examination of diluted plasma obtained by measuring the sodium absorbance (A) measured for 142 mmol / L and the sodium absorbance (B) of diluted plasma using the dilution factor (X: 8 times dilution) determined by the following formula (I) The correlation between data (diluted plasma measurements) and plasma data (plasma measurements) is shown. Plasma measurement for each test item was performed by a conventional method. The diluted plasma was measured under the optimized conditions by increasing the volume of the sample compared to the conventional method. As shown in Table 7, the correlation of 13 items of biochemical examination is good, and it is possible to obtain biochemical examination data in the original plasma from a very small amount of blood.
  • Example 3-1 Quantitative analysis using micro blood sample (1) Measurement of internal standard substances (lithium, glycerol-3-phosphate) and external standard substance (sodium) and calculation of dilution factor 65 microliters of micro blood sample The mixture was added to 280 ⁇ L of internal standard substance addition buffer, mixed, blood cells were filtered with a filter, and each concentration of internal standard substance, external standard substance and biological component was measured with a biochemical automatic analyzer using diluted plasma as a sample.
  • internal standard substances lithium, glycerol-3-phosphate
  • sodium sodium
  • Table 8 shows the composition of the buffer solution to which the internal standard substance used was added.
  • ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ Lithium was used as the internal standard substance, and 1 mM / L lithium chloride was added to the dilution buffer.
  • an external standard substance sodium contained in a blood sample was used.
  • the lithium added as an internal standard substance to the buffer was measured by a chelate colorimetric method (halogenated porphyrin chelate method: perfluoro-5,10,15,20-tetraphenyl-21H, 23H -porphyrin).
  • the measurement of trace sodium in diluted plasma is based on the fact that ⁇ -galactosidase is activated by sodium, and an enzymatic measurement method has been developed that utilizes the proportional relationship between sodium concentration and galactosidase activity in samples diluted with buffer. .
  • Table 9 shows the composition of the sodium measurement reagent.
  • FIG. 7 shows a calibration curve showing the sodium concentration and the amount of change in absorbance. Linearity passing through the origin was obtained up to 24 mmol / L, and sodium quantitativeness was confirmed.
  • lithium was measured by the following method.
  • FIG. 9 shows a calibration curve showing the lithium concentration and absorbance. Linearity passing through the origin up to 1 mmol / L was obtained, and the quantitativeness of lithium was confirmed.
  • glycerol-3-phosphate When glycerol-3-phosphate is used as an internal standard substance, when 65 ⁇ L of whole blood is added to 280 ⁇ L of dilution buffer, plasma (about 30 ⁇ L) in whole blood is diluted by about 10. Using JCA JBM-BM-6050 biochemical automatic analyzer, add 50 ⁇ L of the first reagent (peroxidase) to 9 ⁇ L of this diluted plasma diluted 4.5-fold with purified water, and add at 37 ° C for 5 minutes. After warming, 25 ⁇ L of the second reagent (glycerol-3-phosphate oxidase) was added, and 5 minutes later, the absorbance was measured at a main wavelength of 596 nm and a subwavelength of 884 nm. Linearity passing through the origin up to 4 mmol / L was obtained, and quantitativeness of glycerol-3-phosphate was confirmed.
  • the first reagent peroxidase
  • the reagent composition shown in Table 11 was used for the glycerol-3-phosphate measurement method.
  • FIG. 10- shows a correlation diagram of measured values of biochemical test items of plasma and diluted plasma measured using JCA JCA-BM 6050 automatic analyzer Shown in 1-10-6.
  • the biochemical test data (diluted plasma measurement value) of the diluted plasma obtained by using the dilution factor (X: 8-fold dilution) in the hybrid obtained by the following calculation formula (1) is the y-axis, plasma data ( Plasma measurements) were displayed on the x-axis.
  • Plasma measurement for each test item was performed by a conventional method.
  • the diluted plasma was measured under the optimized conditions by increasing the volume of the sample compared to the conventional method.
  • FIGS. 10-1 to 10-6 the correlation between the 13 items of the biochemical test is good, and the biochemical test data in the original plasma can be obtained from a very small amount of blood.
  • Example 3-2 Correlation of measured values of biochemical test items of plasma and diluted plasma Measurement of biochemical test items of plasma and diluted plasma measured using JCA-BM 6050 automatic analyzer The correlation of values is shown in Table 13. Measured absorbance (A) of internal standard substance (glycerol-3-phosphate) in dilution buffer (A), measured absorbance (B) of internal standard substance after plasma addition, and sodium measured absorbance (C) of 142 mmol / L and dilution Biochemical test data of diluted plasma (diluted plasma measurement) obtained by calculating the sodium absorbance (D) of plasma using the dilution factor (X: 8-fold dilution) of the hybrid obtained by the calculation formula (1) of Example 3-1 Value) on the y-axis and plasma data (plasma measurements) on the x-axis.
  • A internal standard substance
  • B measured absorbance
  • C sodium measured absorbance
  • D sodium absorbance
  • X 8-fold dilution
  • Plasma measurement for each test item was performed by a conventional method.
  • the diluted plasma was measured under the optimized conditions by increasing the volume of the sample compared to the conventional method.
  • Table 13 the correlation between the 13 items of the biochemical test is good, and it is possible to obtain biochemical test data in the original plasma from a very small amount of blood.
  • Table 13 shows correlation statistics between plasma measurement values and diluted plasma measurement values in a hybrid method in which an internal standard substance (glycerol-3-phosphate) and an external standard substance (sodium) are used in combination.
  • an internal standard substance glycerol-3-phosphate
  • an external standard substance sodium
  • samples with 135 mmol / L and 145 mmol / L at the upper and lower limits of the reference range can be measured within an error range of ⁇ 2% even when the dilution factor is corrected based on 142 mmol / L.
  • the dilution factor determined based on both the concentration of sodium which is and the concentration of lithium which is an internal standard substance is shown.
  • the dilution factor in “Hybrid method correction” was calculated using the calculation formula (1) in Example 3-1.
  • Table 14 shows the error given to the measured value in plasma cholesterol by two methods, ie, dilution with sodium alone and dilution with hybrid. It can be seen that the error is halved by using the hybrid method.
  • the dilution factor from 12 times to 16 times by the hybrid method correction was about 3%, and accurate data was obtained even for test subjects who were difficult to collect blood.
  • the dilution factor is calculated using only the internal standard substance lithium as the internal standard substance, and when the measured value is corrected, fluctuations of 199 to 221 mg / dl Is given to subjects with hyperlipidemia (220 mg / dl or higher).
  • “Li internal standard” indicates the dilution factor obtained based only on the concentration of lithium as an internal standard substance
  • “Na external standard” is obtained based only on the concentration of sodium as an external standard substance.
  • Hybrid method correction indicates the dilution factor determined based on both the concentration of sodium as an external standard substance and the concentration of lithium as an internal standard substance.
  • the dilution factor in “Hybrid method correction” was calculated using the calculation formula (1) in Example 3-1.
  • the dilution factor is calculated by using lithium as the internal standard substance and sodium as the external standard substance and corrected by the measured value, it becomes 204 to 216 mg / dl, and is judged as a healthy person.
  • Table 15 shows the effect on reproducibility (CV%) on the dilution factor of lithium and external standard sodium and the hybrid method as internal standard substances when the plasma dilution factor is 6 to 16 times.
  • the hybrid method showed better reproducibility than the single standard reproducibility of the internal standard method.
  • the present invention is simple and accurate for any component in the plasma and biological samples of biological samples such as trace amounts and unknown amounts of whole blood samples collected from the body through the fingers of the subject as described above. It can be quantified.
  • the blood cell volume ratio (hematocrit value), which is the degree of blood anemia, can be obtained.
  • hematocrit value which is the degree of blood anemia
  • the method for collecting micro blood according to the present invention since the method for collecting micro blood according to the present invention has no restriction on the time and place of blood collection, it can be applied to cases where there is no time to go to a medical institution, disaster, telemedicine, health care, etc. It can contribute to the reduction of medical expenses.
  • a large amount of sample can be efficiently measured with a commercially available biochemical automatic analyzer. The measured test data can be sent to a smartphone for daily health management and early detection of disease.

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Abstract

　手指等から採取した微量かつ未知量の全血試料の血漿成分及び血球成分のいずれの成分に対しても簡便かつ正確に定量及び算定することのできる生体試料成分の分析方法を提供する。本発明は、微量の血液中の生体試料成分を分析する方法であって、前記血液を入れる希釈緩衝液と、該希釈緩衝液中に含まれる内部標準物質及び／又は外部標準物質を分析し、希釈率を算出し、前記血液中の血漿又は血清成分中の生体成分を分析することを特徴とする。

Description

希釈生体試料成分の分析方法
　本発明は、血液等の生体試料中の分析対象成分を測定する方法において、生体試料を特定組成を有する緩衝液で希釈し、希釈した試料中の混合溶液から血漿試料成分や酵素活性を分析する測定方法に関する。
　本発明は、さらに、未定量の微量血液などの生体試料を所定の緩衝液で希釈し、希釈された試料混合溶液から、血漿試料成分の定量及び酵素活性を分析する微量生体試料成分の分析方法と血球の計数測定に関する。
　患者や受検者は各種病気の診断、治療効果の判定及び健康管理のために、医療機関や検診場所に出向き、血液を静脈から採取して検査する必要がある。しかし、検査結果を知るためには長時間待つ必要があった。また、検査の為に仕事を休み半日以上の時間を必要とする問題があった。
　いつどこでも、血液の検査を行える方法として、微量の血液を内部標準物質入り緩衝液で希釈し、内部標準物質の希釈倍数から希釈血漿中の未知量の存在する成分量を定量する方法が報告されていた（例えば、特許文献１参照）。
　具体的には、微量の血液を所定の緩衝液で希釈し、希釈された試料混合溶液から、血漿試料成分の定量及び酵素活性を分析する方法としては、内部標準物質としてグリセロール-3-リン酸やグリセロールを使用する方法が知られている（例えば、特許文献２参照）。
　また血球成分の計数測定にはその希釈内部標準物質としてチラミンを使用する方法が知られている（例えば、特許文献３参照）。
　一方、微量の血液から検査をする方法として、血液を採取する方法として濾紙を用いる方法が報告されていた（例えば、特許文献４参照）。
　微量の血液を用いることにより、時と場所を選ばす、検査できることにより、未病の発見や健康維持に貢献できることが期待されている。
特開2003-161729号公報 特開2006-322829号公報 特開2011-112451号公報 特開平10-104226号公報
　しかしながら、上記した従来の希釈率算出法では、血漿の希釈内部標準物質としてはグリセロール-3-リン酸が利用されているが、生体に存在する酵素であるアルカリホスファターゼにより水解され、グリセロールを生成する。従って、血液を添加した後の保存時間が長くなるか、あるいは温度が高くなると正確な血液希釈率が得られなくなる。このため、原血漿中の生体成分や酵素活性の測定値への信頼性が低下する。このような状況を解消するため従来の方法では酵素の阻害剤であるEDTAを添加する必要があった。しかしながら、この阻害剤の添加では完全に酵素を阻害できないため、生成物阻害剤としてリン酸を更に添加する必要があり、これら２つの物質の添加によりアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼやアラニンアミノトランスフェラーゼの活性が低下することとなる。その結果、これらの酵素の活性化剤であるピリドキサルリン酸を過剰に添加する必要があった。
　これらの問題点を解決する内部標準物質としては、コリンなどの陽イオンに荷電した物質を内部標準として利用できるが、プラスチック容器に吸着が認められ、長期間の保存には適さないという課題がある。これらの物質については、〔特許文献２〕として申請されているが、分子内に芳香環を持つために疎水性が高く、プラスチックの容器に長期保存すると吸着を起こし、血液の希釈倍数を正確に求めることが出来ないという問題がある。分子内に芳香環を持たず、血球内に浸透する物質としてエタノールアミンなどの化合物が有効であることを見いだした。これらの物質は血液中にほとんど存在せず、しかも安定な化合物である。また、内部標準液の緩衝液に溶けることが可能で、長期保存によりプラスチック容器に吸着することがない。
　本発明は、上記した課題を解決すべくなされたものであり、対象者の手指等の体表面から採取され、希釈された少量かつ未知量の全血試料の成分に対し、簡便かつ正確に定量することのできる希釈率算出法を提供することを目的とする。
　また、特許文献３に記載された方法では、内部標準物質としてはグリセロール-3-リン酸は安定な化合物として利用されているが試料が少ない場合は内部標準物質の希釈率は小さく、その希釈倍数の信頼性は低下することが問題であった。
　また、特許文献４に記載されているように、濾紙や多孔質材に血液を吸収させた後、乾燥させて郵送し、血液成分を抽出する方法は乾燥させる過程や郵送時に成分が変性することがある。また、乾燥した試料から生体成分を抽出する緩衝液はpH調整や生体成分安定化のためにNaOHやNaCl、HClを添加した緩衝液を利用する必要がある。このため、試料の成分で最も恒常性があり、個体間差が少ないナトリウムやクロールの濃度を外部標準物質として、希釈された元の他の生体成分濃度の補正をすることに利用できない。
　一方、緩衝液で希釈する方法は生体試料中の生体成分がpH7.4の生理的条件の緩衝液で保存され、輸送中の安定性にも優れているが、内部標準物質添加緩衝液による試料中の内部標準物質の希釈率が小さく、少ない試料添加では測定誤差が生じ易い。
　本発明は、緩衝液で生体試料を希釈して生体試料中の分析対象成分を定量分析する方法において、生体成分を緩衝液で試薬した試料中の生体成分濃度を、外部標準である試料中の恒常的成分の希釈率から正確に生体試料の希釈倍数を求めて、生体試料中の分析対象成分を定量分析する方法の提供を目的とする。
　さらに、本発明は、緩衝液で生体試料を希釈して生体試料中の分析対象成分を定量分析する方法において、内部標準物質を用いて生体試料の希釈倍数を求める方法、外部標準物質を用いて生体試料の希釈倍数を求める方法について両者の欠点を補い、正確に生体試料の希釈倍数を求めて、生体試料中分析対象成分を定量分析する方法の提供を目的とする。
　上記した目的を達成するため、本発明は、血液などの生体試料中の生体成分を分析する際に、１．内部標準物質を利用して分析するか、２．外部標準物質を利用するか、あるいは３．内部標準物質及び外部標準物質を利用することを特徴とする。
１．内部標準物質を利用する分析方法（内部標準法）
　本発明は、血液などの生体試料中の生体成分を分析する方法であって、前記血液などの生体試料を添加する希釈緩衝液と、該希釈緩衝液中に含まれる内部標準物質を分析し、希釈率を算出し、血漿、血清や血球の生体成分の希釈率を算出し、前記血液などの生体試料中の血漿、血清又は生体試料中の生体成分を分析することを特徴とする。
　本発明の血漿試料生体試料成分の分析方法において、前記緩衝液中の内部標準物質は長期間安定であり、前記緩衝液を入れる容器に吸着しない成分であり、前記内部標準物質は前記血液などの生体試料中にほとんど含まれていない物質であり、生化学自動分析装置などで容易且つ精度よく分析可能な物質であるのが好ましい。
　また、本発明の血漿試料生体試料成分の分析方法において、前記緩衝液中の内部標準物質は前記血球内に浸透しない成分であり、前記血漿や前記血清の希釈率を正確に反映可能な物質であるのが好ましい。同様に血球数の算定方法において、前記緩衝液中の内部標準物質は前記血球内に浸透する成分であり、前記全血（血漿と血球）の希釈率を正確に反映可能な物質であるのが好ましい。
　さらに、本発明の生体試料成分の分析方法において、前記緩衝液は血球膜に対する浸透圧が250～500mOsm/kgで、血液が混合されても前記血球の溶血が生じない試薬組成を有しているのが好ましい。
　さらにまた、本発明の生体試料成分の分析方法において、前記緩衝液は前記血液中の生体試料成分を変性させることなく、安定に維持できる組成を有しているのが好ましい。
　さらに、本発明の生体試料成分の分析方法において、血漿内部標準物質はリチウム又はマルトースを含んでいるのが好ましい。
　血漿の希釈率からは血漿濃度を求めることが可能であるが、血球の体積を求めることはできない。血液の全血（血漿と血球）を求めることができれば貧血の検査が可能になる。
　そこで血球内に浸透する内部標準物質として疎水性でプラスチックの吸着がないエタノールアミンを含んでいるのが好ましい。この内部標準を測定することで血液量全体の希釈率を求めることができる。
　血液の血漿の希釈率と血液量全体の希釈率から血球の容積比率（ヘマトクリット値）を求めることが可能となる。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１－１]　試料血液を入れるための希釈緩衝液を用い、該希釈緩衝液中に含まれる内部標準物質を分析し、血漿又は血清の希釈率を算出し、前記試料血液中の血漿又は血清成分中の生体成分を分析する生体試料成分の分析方法において、前記希釈緩衝液に含まれる内部標準物質が血球内に浸透しない性質を有しており、マルトースを含む２単糖類、グルタミン酸、ロイシン、バリン、イソロイシン、4-ハイドロキシンベンゼン、ハイドロキシ酪酸、クレアチン、リンゴ酸、トリンダー試薬、リチウムからなる群から選ばれる物質である内部標準物質を用いた生体試料成分の分析方法。
[１－２]　希釈緩衝液に含まれる内部標準物質がリチウムである、[１－１]の生体試料成分の分析方法。
[１－３]　試料血液を入れるための希釈緩衝液を用い、該希釈緩衝液中に含まれる内部標準物質を分析し、血液の希釈率を算出し、前記試料血液中の血球算定数や血漿の生体成分を分析する生体試料成分の分析方法において、前記希釈緩衝液に含まれる内部標準物質が血球内に浸透する性質を有しており、エタノールアミン、ヘキシルアミン、フェニールエチルアミン、アミールアミン、ヒスタミン、プトレシン、ヒポキサンチン、トリプトファン、プレグレノロン、β-シトステロールからなる群から選ばれる物質である内部標準物質を用いた生体試料成分の分析方法。
[１－４]　試料血液を入れるための希釈緩衝液を用い、該希釈緩衝液中に含まれる内部標準物質を分析し、血液又は血漿又は血清の希釈率を算出し、前記試料血液中の血球算定数や血漿の生体成分又は前記試料血液中の血漿又は血清成分中の生体成分を分析する生体試料成分の分析方法において、
　前記希釈緩衝液は、
　血球内に浸透しない性質を有する前記内部標準物質であって、リチウム、マルトースを含む２単糖類、グルタミン酸、ロイシン、バリン、イソロイシン、4-ハイドロキシンベンゼン、ハイドロキシ酪酸、クレアチン、リンゴ酸、トリンダー試薬からなる群から選ばれる物質と、
　血球内に浸透する性質を有する前記内部標準物質であって、エタノールアミン、ヘキシルアミン、フェニールエチルアミン、アミールアミン、ヒスタミン、プトレシン、ヒポキサンチン、トリプトファン、プレグレノロン、β-シトステロールからなる群から選ばれる物質とを含む生体試料成分の分析方法。
[１－５]　前記希釈緩衝液に含まれる内部標準物質が分子量500以下の化学物質で分子内に硫酸イオン（-SO3-）、カルボキシルイオン（-COO-）、チオール基（-SH）、第4級アミン（-NH3+）からなる群から選ばれる置換基を持つ化合物から選ばれる内部標準物質である、[１－１]の生体試料成分の分析方法。
[１－６]　 前記希釈緩衝液に含まれる内部標準物質がADOS(N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3-メトキシアニリン)、ADPS(N-エチル-N-スルホプロピル-3-メトキシアニリン)、ALPS(N-エチル-N-スルホプロピルアニリン)、DAOS(N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3,5-ジメトキシアニリン)、HDAOS(N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3,5-ジメトキシアニリン)、MAOS(N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3,5-ジメチルアニリン)、TOOS(N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3-メトキシアニリン)、TOPS(N-エチル-N-スルホプロピル-3-メチルアニリン)から成る群から選ばれる化合物であるトリンダー試薬である、[１－１]の生体試料成分の分析方法。
[１－７]　前記希釈緩衝液は、血液が混合されても前記血球の溶血が生じない試薬組成を有している[１－１]～[１－６]のいずれかの生体試料成分の分析方法。
[１－８]　前記希釈緩衝液が前記血液中の生体試料成分を変性させることなく、安定に維持できるように、エチレンジアミン四酢酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩などのキレート剤、アミカシン硫酸塩、カナマイシン硫酸塩、チアベンダゾール、アジ化ナトリウムなどの抗菌剤や防腐剤、ピリドキサルリン酸、マグネシウム、亜鉛などの補酵素、マンニトール、デキストロース、オリゴ糖などの糖類、ドデシル硫酸ナトリウム、水銀、ヘパリンからなる群から選択される阻害剤を被測定成分に応じて単独若しくは複数組み合わされた組成の添加物を含む[１－１]～[１－７]のいずれかの生体試料成分の分析方法。
[１－９]　前記内部標準物質の希釈率から血液の血球容積率（ヘマトクリット値）を算出することを特徴とする[１－４]の生体試料成分の分析方法。
２．　外部標準物質を利用する分析方法（外部標準法）
　血液中のナトリウムやクロールは非常に高い恒常性があり、個体間の変動も小さいことが知られている。そのナトリウムの中央値濃度も142 mmol/Lと生体濃度としては濃いため、緩衝液で希釈しても、高希釈倍数の試料濃度を精度良く測定できる。しかしながら、ナトリウムやクロールを外部標準として用いる場合、ナトリウムやクロールが含まれる緩衝液を希釈用緩衝液として用いることはできなかった。
　本発明者らは、まず、外部標準物質として生体内の恒常性が高いナトリウム、クロール又はタンパク質を用いることを検討した。
　これらの外部標準物質を用いるためには、生体試料を希釈する緩衝液にナトリウムやクロールの存在は避ける必要があった。従来はpH7.4付近で緩衝能を有し、かつアルカリ（NaOHなど）を含まない緩衝液は存在しなかった。本発明者らは、新たな緩衝液の開発を試み、アルカリ金属類（NaOHなど）やクロールイオンを含まないアルカリ性を示す化合物としては、2-アミノ-2-メチル-1-プロパノール、2-エチルアミノエタノール、N-メチル-D-グルカミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミンなどのアミノアルコール化合物を利用した。これらの化合物に生化学研究用として優れた性能を持つGood’s緩衝液でpKaがpH7.4付近の緩衝液である、HEPES (2-[4-(2-Hydoxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid), TES（N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid）, MOPS（3-Morpholinopropanesulfonic acid）, BES（N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid）を酸として混合することでpH7.4に調整できること新たに見出した。また、これらの緩衝液が外部標準物質の一例であるナトリウムやクロールを含まず、測定対象のナトリウムやクロールの測定系に干渉を与えないことを見出した。さらに、これらの緩衝液で希釈された成分は生化学・免疫自動分析装置での種々の測定法でも干渉しないこと、さらに血球が溶血をしないことや生体成分が37℃でも安定に保存できることを見出した。また、緩衝液で希釈された血漿中の生体成分を測定するため、緩衝液成分がこれら生体成分を変性させたり、安定性に影響を与えてはならない。この一例として2-アミノ-2-メチル-1-プロパノール（AMP）とHEPESを混合してpH7.4に調整した緩衝液は生体成分に変性を与えず、安定しており、これら生体成分の測定試薬にも干渉しないことを見出した。
　さらに、希釈用緩衝液で希釈した生体試料中の低濃度のナトリウムを正確に定量する方法を見出した。
　本発明は、生体試料中に一定の濃度を維持している血漿中ナトリウム等を外部標準物質として用いるが、これらの物質は元素であり、安定した生体成分である。緩衝液で希釈された外部標準物質としてのナトリウム等を正確に測定することで血漿の希釈倍数を求め、採取した血液中の未知濃度の希釈血漿生体試料成分の定量及び酵素活性を市販の生化学・免疫自動分析装置で効率的に多数の試料を分析することができる。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
[２－１]　希釈用緩衝液で微量血液試料を希釈し、血液中の分析対象成分を定量分析する方法において、外部標準物質を用いて血液試料の希釈倍数を算出することを含む、血液試料中の分析対象成分の定量分析方法であって、外部標準物質は血液試料中に恒常的に所定の濃度で含まれる成分であり、前記希釈用緩衝液は外部標準物質の定量に干渉する成分を含んでおらず、希釈用緩衝液で希釈した血液試料中の外部標準物質濃度を測定し、これらの測定値に基づいて血液試料の希釈倍数を算出することを含む、血液試料中の分析対象成分の定量分析方法。
[２－２]希釈用緩衝液で希釈した血液試料中の外部標準物質濃度を測定し、これらの測定値に基づいて血液試料の希釈倍数を算出することを含む、血液試料中の分析対象成分の定量分析方法。
[２－３]　外部標準物資がナトリウム、クロール、アルブミン及び総タンパク質からなる群から選択される、[２－１]又は[２－２]の定量分析方法。
[２－４]　外部標準物質がナトリウム、クロール、及び総タンパク質からなる群から選択される、[２－３]の定量分析方法。
[２－５]　希釈用緩衝液が、緩衝剤成分として、2-アミノ-2-メチル-1-プロパノール、2-エチルアミノエタノール、N-メチル-D-グルカミン、ジエタノールアミン及びトリエタノールアミンからなる群から選択されるアミノアルコール化合物、並びにHEPES (2- [4- (2-Hydoxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid)、TES （N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2- aminoethanesulfonic  acid）、MOPS（3-Morpholinopropanesulfonic acid）及び BES（N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid）からなる群から選択される緩衝剤を含み、pH7.4で緩衝作用を有する緩衝液である、[２－１]～[２－４]のいずれかの定量分析方法。
[２－６]　希釈用緩衝液が、ナトリウム及びクロールを実質的に含まない、[２－１]～[２－４]のいずれかの定量分析方法。
[２－７]　微量血液試料の希釈倍数が以下の算出式（Ｉ）の算出式により算出され、希釈血漿中の分析対象成分を定量し、算出式（I）で求めた希釈倍数を乗じて、元の血漿中の分析対象成分を定量する、[２－１]～[２－６]のいずれかの定量分析法：
        A
X = ---------　　　　（I)
        B
A：血漿中外部標準物質濃度の健常者中央値の吸光度、
B：希釈血漿中の外部標準物質の吸光度、
X：血漿希釈倍数
[ここで、希釈血漿とは、血液試料を希釈用緩衝液で希釈し、血球を除去して得られた血漿をいう]。
[２－８]　β-ガラクトシダーゼはナトリウムイオン濃度に応じて酵素活性が変化し、その吸光度変化量からナトリウムイオン濃度を定量できることを利用し、希釈用緩衝液を用いて希釈した血液試料中のナトリウムを以下の方法で測定する[２－３]～[２－７]のいずれかの定量分析方法：
生体試料を希釈用緩衝液で希釈し、さらに精製水で希釈し、
β-ガラクトシダーゼを含む緩衝液である第１試薬を試料量の10～30倍容積量添加し、30～45℃で２～20分加温し、o-Nitrophenyl-β-D-Galactpyranosideを含む基質液である第２試薬を第１試薬量の半量を添加し、主波長410nm、副波長658nmで反応速度の吸光度を測定する。
[２－９]　[２－１]～[２－８]のいずれかの定量分析方法において、微量血液試料の希釈に用いる希釈用緩衝液であって、緩衝剤成分として、2-アミノ-2-メチル-1-プロパノール、2-エチルアミノエタノール、N-メチル-D-グルカミン、ジエタノールアミン及びトリエタノールアミンからなる群から選択されるアミノアルコール化合物、並びにHEPES (2- [4- (2-Hydoxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid)、TES （N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2- aminoethanesulfonic  acid）、MOPS（3-Morpholinopropanesulfonic acid）及び BES（N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid）からなる群から選択される緩衝剤を含み、pH7.4で緩衝作用を有する緩衝液。
[２－１０]　ナトリウム及びクロールを実質的に含まない、[２－９]の緩衝液。
３．　内部標準物質と外部標準物質を利用する分析方法（ハイブリッド法）
　上記のように、内部標準物質を単独で利用する分析方法、及び外部標準物質を単独で利用する分析方法により、微量の生体試料中の分析対象生体成分を正確に測定できるようになった。
　本発明者らは、さらに正確な測定を目指し、内部標準物質を利用する方法の利点と外部標準物質を利用する方法の利点の両方を併せ持ち、かつ内部標準物質を利用する方法の欠点と外部標準物質を利用する方法の欠点を補う方法について鋭意検討を行った。
　上記のように、外部標準物質として生体内の恒常性が高いナトリウム、クロール、タンパク質を用い、かつ外部標準物質として利用する物質を含まない緩衝液を用いることにより、正確な測定が可能になった。しかしながら、健常人において高い恒常性を有する物質でも受検者によっては、健常人の濃度範囲を外れることがあり、この場合、正確な測定が損なわれることがあった。
　一方、希釈用の緩衝液中の内部標準物質は高い濃度に設定できるため、精度良く測定できる。しかしながら、生体試料の量が少ない場合内部標準物質の希釈が小さくなり、希釈倍数の信頼性は低下してしまう。また、有機化合物の内部標準物質としてはグリセロール-3-リン酸が安定な物質として利用でき、無機物の内部標準物質としてはリチウムが好適に利用できる。
　本発明者らは、外部標準物質を単独で用いる方法の欠点と内部標準物質を単独で用いる方法の欠点を解消し得る方法の開発について鋭意検討を行った。
　本発明らは従来の内部標準物質の欠点を解消するため安定性が高いアルカリ金属類又はアルカリ土類金属類に属する元素を用い、外部標準物質として生体内の恒常性が高いナトリウム、クロール又はタンパク質を用いることを検討した。
　内部標準物質と生体試料中の恒常性の高い成分である外部標準物質を組み合わせて併用することで、測定精度の高い定量法として、内部標準物質を用いる方法及び外部標準物質を用いる２つの定量法の欠点を補完して信頼性の高い希釈成分定量法とすることができ、本発明を完成させるに至った。
　本発明は以下の特徴を有する。生体試料中に一定の濃度を維持している血漿中ナトリウム等を外部標準物質として用い、また血漿中に全く含まれない若しくはほとんど含まれない成分であって、血球膜を通過しない内部標準物質としてリチウム等のアルカリ金属類又はアルカリ土類金属類に属する元素や安定なグリセロール-3-リン酸を用い、これを緩衝液中に添加する。従来の有機化合物を内部標準物質として用いた場合は生体酵素の作用を受けて保存安定性に課題が残されていた。この内部標準物質は緩衝液中で長期間安定であり、容易に定量することができる。また測定する生体試料中の外部標準物質であるナトリウムも元素であるため安定である。この結果、採取した血液中の未知濃度の希釈血漿生体試料成分の定量及び酵素活性を市販の生化学・免疫自動分析装置で効率的に多数の試料を分析することができる。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
[３－１]　希釈用緩衝液で試料を希釈し、血液中の分析対象成分を定量分析する方法において、内部標準物質及び外部標準物質を用いて血液試料の希釈倍数を算出することを含む、血液試料中の分析対象成分の定量分析方法であって、内部標準物質は希釈用緩衝液に所定濃度添加され、外部標準物質は血液試料中に恒常的に所定の濃度で含まれる成分であり、前記希釈用緩衝液は内部標準物質及び外部標準物質の定量に干渉する成分を含んでおらず、希釈用緩衝液で希釈した血液試料中の内部標準物質濃度と外部標準物質濃度を測定し、これらの測定値に基づいて血液試料の希釈倍数を算出することを含む、血液試料中の分析対象成分の定量分析方法。
[３－２]　前記外部標準物質濃度の測定値を用いて、前記内部標準物質濃度の測定値から求めた血液試料の希釈倍数を補正することにより、前記血液試料中の分析対象成分を定量分析する定量分析方法。
[３－３]　内部標準物質がアルカリ金属類又はアルカリ土類金属類に属する元素、外部標準物資がナトリウム、クロール、アルブミン及び総タンパク質からなる群から選択される、[３－１]又は[３－２]の定量分析方法。
[３－４]　内部標準物質がリチウム、又はグリセロール-3-リン酸であり、外部標準物質がナトリウムである、[３－３]の定量分析方法。
[３－５]　希釈用緩衝液が、緩衝剤成分として、2-アミノ-2-メチル-1-プロパノール、2-エチルアミノエタノール、N-メチル-D-グルカミン、ジエタノールアミン及びトリエタノールアミンからなる群から選択されるアミノアルコール化合物、
並びにHEPES (2- [4- (2-Hydoxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid)、
TES （N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2- aminoethanesulfonic  acid）、
MOPS（3-Morpholinopropanesulfonic acid）及び 
BES（N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid）
からなる群から選択される緩衝剤を含み、pH6.5～pH8.0の緩衝作用を有する緩衝液である、[３－１]～[３－４]のいずれかの定量分析方法。
[３－６]　希釈用緩衝液が、ナトリウム及びクロールを実質的に含まない、[３－５]のいずれかの定量分析方法。
[３－７]　微量血液試料の希釈倍数が以下の算出式（１）～（４）のいずれかの算出式により算出され、希釈血漿中の分析対象成分を定量し、算出式（１）～（４）のいずれかで求めた希釈倍数を乗じて、元の血漿中の分析対象成分を定量する、[３－１]～[３－６]のいずれかの定量分析法：
算出式（１）


　　　A ＋ C
X =　  -----  　　（１）
      B ＋ D
；
算出式（２）
　　　√（A2 ＋ C２）
X =　-------  　　　　（２）
      √（B2 ＋ D2）
；
算出式（３）
X= a × （B＋D） ± b　　（３）
[ここで、a及びbは係数であり、あらかじめB+Dと希釈倍数のデータを取得し、X= a × （B＋D） ± bで表される標準曲線を作成しておく]
；
並びに
算出式（４）
X＝A/B'　　　　　　　　（４）
[ここで、B'=(A×D)/Cである]、
[上記式において、A、B、C、D、B'及びXは以下のように定義される；
A：内部標準物質を添加した緩衝液中の内部標準物質の吸光度
B：希釈血漿中の内部標準物質の吸光度
C：血漿中外部標準物質濃度の正常中央値の吸光度、
D：希釈血漿中の外部標準物質の吸光度、
B'：外部標準物質吸光度から算出した希釈倍数による、希釈血漿中の内部標準物質の吸光度の補正値、及び
X：血漿希釈倍数
[ここで、希釈血漿とは、血液試料を希釈用緩衝液で希釈し、血球を除去して得られた血漿をいう]。
[３－８]　β-ガラクトシダーゼはナトリウムイオン濃度に応じて酵素活性が変化し、その吸光度変化量からナトリウムイオン濃度を定量できることを利用し、希釈用緩衝液を用いて希釈した血液試料中の外部標準の一つであるナトリウムを以下の方法で測定する[３－１]～[３－７]のの定量分析方法：
生体試料を希釈用緩衝液で希釈し、さらに精製水で希釈し、β-ガラクトシダーゼを含む緩衝液である第１試薬を試料量の10～30倍容積量添加し、30～45℃で２～20分加温し、o-Nitrophenyl-β-D-Galactpyranosideを含む基質液である第２試薬を第１試薬の半量を添加し、生成するo-Nitrophenolを主波長410nm、副波長658nmで吸光度を測定する。
[３－９]　[３－１]～[３－８]の定量分析する方法において、微量血液試料の希釈に用いる希釈用緩衝液であって、緩衝剤成分として、2-アミノ-2-メチル-1-プロパノール、2-エチルアミノエタノール、N-メチル-D-グルカミン、ジエタノールアミン及びトリエタノールアミンからなる群から選択されるアミノアルコール化合物、並びにHEPES (2- [4- (2-Hydoxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid)、TES （N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2- aminoethanesulfonic  acid）、MOPS（3-Morpholinopropanesulfonic acid）及び BES（N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid）からなる群から選択される緩衝剤を含み、pH7.4で緩衝作用を有する緩衝液。
[３－１０]　ナトリウム及びクロールを実質的に含まない、[３－９]の緩衝液。
[３－１１]　外部標準物質を用いた定量分析方法に用いられる、[３－９]又は[３－１０]の緩衝液。
[３－１２]　内部標準物質を用いた定量分析方法に用いられる、[３－９]又は[３－１０]の緩衝液。
　生体試料中の分析対象生体試料成分の分析において、内部標準物質又は外部標準物質を利用し生体試料の希釈倍数を求め、成分を定量分析することで、微量の生体試料成分の生体試料検体量を測定することなく、生体試料成分を正確に分析測定することができる。
　また、本発明によれば、手指等を介して体内から採取した微量かつ未知量の全血試料などの生体試料の血漿及び生体試料中のいずれの成分に対してもプラスチック容器を使用して、簡便かつ正確に定量することができる。また血漿希釈率と全血希釈率から計算により血液の貧血の程度である血球容積比率（ヘマトクリット値）を求めることができる。さらに全血の内部標準標準物質を用いることで、血球成分（白血球数:WBC、赤血球数:RBC、ヘモグロビン量:Hgb、ヘマトクリット:Hct）の算定が可能となる。
　さらに、内部標準物質単独又は外部標準物質単独で用いる場合、定量の精度や正確性に欠けることがあった。本発明においては、内部標準物質と外部標準物質の両方を併用して生体試料の希釈倍数を求めるため、内部標準物質により求めた希釈倍数が外部標準物質により求めた希釈倍数により補正され、より正確な値となり、より高い精度で分析対象成分を定量することができる。
　また、従来、pH7.4の中性付近で緩衝能を有し、ナトリウムやクロールを含まない緩衝液が存在しなかったため、生体中の恒常性の高い物質であるナトリウムやクロールを外部標準物質として用いることはできなかった。本発明の方法では新たに開発したpH7.4の中性付近で緩衝能を有し、ナトリウムやクロールを含まない緩衝液を用いることにより、恒常性の高いナトリウムやクロールを外部標準物質として用いることが可能になり、より高い精度と正確性の高い分析が可能になった。
　本発明の方法により、微量の血液（65μL）を用いて生化学検査13項目、腫瘍マーカー、肝炎検査など多くの検査ができる。この検査法は時間と場所を選ばないことから健診を受けられない未病を発見できる。また、気軽に検査ができることから健康管理が容易にできるため、疾患の重篤化になる前に体内の変化を捉えることができ、国民医療費の節減にも貢献する。
本発明の生体試料成分の分析方法において使用する血液の組成を示す模式図である。 本発明の生体試料成分の分析方法において血液を所定の緩衝液で希釈した状態を示す模式図である。この場合、図２においては血液の血球膜を透過することはなく血漿中にのみ浸透する内部標準物質を使用した場合の説明図を示す。 本発明の生体試料成分の分析方法において血液を所定の緩衝液で希釈した状態を示す模式図である。図３は、内部標準物質が血液の血漿及び血球内部の両方に浸透する性質を有する場合の説明図である。 静脈血血漿と手指採血希釈血漿の生化学検査の相関図である。 静脈採血のEDTA-2Na添加全血とこの全血を血液希釈緩衝液で希釈した希釈全血をそれぞれ試料として白血球（WBC）、赤血球(RBC)、ヘモグロビン濃度(Hgb)、ヘマトクリット値(Hct)、血小板数（Plt）を算定した相関図である。 マルトース内部標準から求めた血漿希釈率とエタノールアミンから求めた全血希釈率を用いて計算式から求めた血液中の血球体積を示すヘマトクリット値と全血を血球計数機で求めたヘマトクリット値との相関図である。 ナトリウムの酵素的測定法の直線性を示す図である。 クロール測定法の直線性を示す図である。 リチウム濃度と吸光度の直線性を示す図である。 ハイブリッド法による希釈血漿測定値と原血漿測定値の相関図である（総蛋白及びアルブミン）。 ハイブリッド法による希釈血漿測定値と原血漿測定値の相関図である（AST及びALT)。 ハイブリッド法による希釈血漿測定値と原血漿測定値の相関図である（HDL-コレステロール及びγGTP)。 ハイブリッド法による希釈血漿測定値と原血漿測定値の相関図である（総コレステロール及び中性脂肪）。 ハイブリッド法による希釈血漿測定値と原血漿測定値の相関図である（尿素窒素及びクレアチニン）。 ハイブリッド法による希釈血漿測定値と原血漿測定値の相関図である（尿酸及び血糖）。
１．　内部標準物質を利用する分析法（内部標準法）
　本発明は以下の特徴を有する。すなわち、本発明の１つの特徴によれば、採取した未知濃度の血球を含む生体試料の成分を定量及び酵素活性分析する方法であって、生体試料に全く含まれない若しくはほとんど含まれない成分であって、血球膜を通過しない内部標準物質を用意し、これを緩衝液中に添加する。血液を添加する前の緩衝液中の内部標準物質濃度を分析し、その吸光度と血液添加後の希釈された緩衝液中の内部標準物質の濃度を測定することで、その吸光度の比率から血液中の血漿希釈率を求め、原血漿中の生体成分や酵素活性を求める。この場合、前記緩衝液の浸透圧がほぼ血液浸透圧となるように調製されるのが好ましい。
　本発明の方法では、血漿の希釈倍率を求めるときに、生体試料の検体量を求める必要はない。
　内部標準物質を用いる方法を内部標準法と呼び、例えば、リチウムを内部標準物質として用いる方法をリチウム（Li)内部標準法と呼ぶ。
　上記未知濃度の生体試料は、血球を含まない生体試料（唾液、尿など）であっても構わない。この場合に用いる内部標準物質は、血球膜を透過する物質であっても構わない。
　緩衝液中の内部標準物質の濃度を測定する代表的な方法としては、その内部標準物質又は内部標準物質から誘導された物質を基質とする酸化酵素を加えることによって過酸化水素を生成させ、ペルオキシダーゼ存在下でトリンダー試薬と4-アミノアンチピリンが酸化縮合して得られるキノン色素やNAD(P)H、テトラゾニウム塩の発色を吸光度として測定、定量する酵素的測定法方法がある。
　他にも内部標準物質の定量方法として、内部標準物質自身の吸光度を直接測定する方法、内部標準物質に対する抗体及び標識抗体を用いて吸光度若しくは化学発光によって測定する方法、クロマトグラフィーなどがあり、用いる内部標準物質に応じた定量方法をとり得る事が出来る。
　血液を緩衝液で希釈したときの、血漿成分の正確な希釈率を求めるためには、緩衝液に入れる内部標準物質は生体内に存在しないか、極微量に存在する成分であり、血球膜を透過しないこと、緩衝液中で安定なこと、容器に吸着しないことが必要である。また、他の生体成分に干渉しないことが必要である。
　図１に示すように、血液１は、液体成分である血漿又は血清２、と固体成分である血球３によって構成されており、更に血球３は血球膜などの固体成分とその内側に液体成分を有することが知られている。血液１には抗凝固剤であるEDTA-２ナトリウムを加えることにより血球３の凝固を阻止できる。この全血を遠心すると比重の重い血球３が最下段に沈降し、上清に血漿が分離される。
　また、図２に示すように、予め容器に緩衝液４に血球膜を透過しない内部標準物質５を収容しておき（図２（ａ））、採取した血液１を容器の上部から緩衝液４と内部標準物質５の混合層の上側に導入する（図２（ｂ））。そして血液１を所定の緩衝液４で希釈した場合、本来、血漿又は血清２に存在する血球膜を透過しない成分は、緩衝液４及び血漿又は血清２中に分布することになり、希釈されて血液希釈溶液６となる（図２（ｃ））。
　この際、緩衝液４に血球膜を透過しない内部標準物質５が規定量溶解している場合、本来緩衝液中に存在するこの内部標準物質５は、緩衝液４及び血漿又は血清２中に分布することになり、希釈される。この内部標準物質５としては血漿２中にのみ浸透するマルトースなどの内部標準物質５を含む。マルトースは陰イオンとして緩衝液４に溶解しているため、血漿２中に溶存して、血球３内には浸透しない。
　血漿成分の希釈率を求めるために緩衝液に添加される内部標準物質としては、分子量500以下の化学物質で分子内に硫酸イオン（-SO3-）、カルボキシルイオン（-COO-）、チオール基（-SH）、第4級アミン（-NH3+）などの置換基を持つ化合物で、マルトースなどの２単糖類、グルタミン酸、ロイシン、バリン、イソロイシン、4-ハイドロキシンベンゼン、ハイドロキシ酪酸、クレアチン、リンゴ酸、金属類（リチウム、ナトリウム、カリウム、クロール）、硫酸基を分子内に持つトリンダー試薬である(N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3-メトキシアニリン)、ADPS(N-エチル-N-スルホプロピル-3-メトキシアニリン)、ALPS(N-エチル-N-スルホプロピルアニリン)、DAOS(N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3,5-ジメトキシアニリン)、HDAOS(N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3,5-ジメトキシアニリン)、MAOS(N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3,5-ジメチルアニリン)、TOOS(N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3-メトキシアニリン)、TOPS(N-エチル-N-スルホプロピル-3-メチルアニリン)から成る群から選ばれる。この中でもリチウムが好ましい。
　図３に内部標準物質５の全血（血漿２+血球３）への分布の説明図を示す。図３に示す場合の内部標準物質５（たとえば、エタノールアミン）は血漿２と血球３内の両者に浸透する。予め容器に緩衝液４に血球膜を透過する内部標準物質５を収容しておき（図３（ａ））、採取した血液１を容器の上部から緩衝液４と内部標準物質５の混合層の上側に導入する（図３（ｂ））。そして、血液１を所定の緩衝液４で希釈した場合、本来、血漿又は血清２に存在する血球膜を透過する内部標準物質は、血球３及び血漿又は血清２中の両方に存在するが、血漿又は血清２中に均一に分散して血液希釈溶液６を構成する（図３（ｃ））。すなわち、図３に示す場合に使用する内部標準物質５は血漿２と血球３内の両者に分布するので緩衝液４による希釈倍数を求めることができる。
　血球膜を透過する内部標準物質としては、分子量500以下の化学物質でアミノ基（-NH2）、アルキル基（-CH3、-C6H6）、エステル基（-COOR）、アルコキシ基（-OR）、ハロゲン（-Cl, -Br, -I）などの疎水性置換基を持つ化合物で、エタノールアミン、ヘキシルアミン、フェニールエチルアミン、アミールアミン、ヒスタミン、プトレシン、ヒポキサンチン、トリプトファン、プレグレノロン、β-シトステロールなどが挙げられる。これらの内部標準に対応するは酸化酵素を用いた酵素的測定法で分析することができる。
　これらの内部標準物質は血球内と血漿内に分布するため、全血（血漿＋血球）の希釈倍数を求めることに利用できる。
　生体成分を希釈する緩衝液４は、生体試料と任意の分量で混和可能であり、生体試料中の被測定成分を安定に保存できることが必要である。緩衝液４の成分は限定されないが、緩衝能を有するHEPES｛2-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]エタンスルホン酸｝緩衝液、ACES［N-(2-アセトアミド)-2-アミノエタンスルホン酸］緩衝液、ADA［N-(2-アセトアミド)イミノジ酢酸］緩衝液、BES［N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)-2-アミノスルホン酸］緩衝液、Bicine［N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)グリシン］緩衝液、Bis-Tris［ビス(2-ヒドロキシエチル)イミノトリス(ヒドロキシメチル)メタン］緩衝液、CAPS（N-シクロヘキシル-3-アミノプロパンスルホン酸）緩衝液、CAPSO（N-シクロヘキシル-2-ヒドロキシ-3-アミノプロパンスルホン酸）緩衝液、CHES（N-シクロヘキシル-2-アミノエタンスルホン酸）緩衝液、DIPSO｛3-[N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)アミノ]-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸｝緩衝液、EPPS｛3-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]プロパンスルホン酸｝緩衝液、HEPPSO｛2-ヒドロキシ-3-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]プロパンスルホン酸一水和物｝緩衝液、MES（2-モルホリノエタンスルホン酸一水和物）緩衝液、MOPS（3-モルホリノプロパンスルホン酸）緩衝液、MOPSO（2-ヒドロキシ-3-モルホリノプロパンスルホン酸）緩衝液、PIPES［ピペラジン-1,4-ビス(2-エタンスルホン酸)］緩衝液、POPSO［ピペラジン-1,4-ビス(2-ヒドロキシ-3-プロパンスルホン酸)二水和物］緩衝液、TAPS［N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-3-アミノプロパンスルホン酸］緩衝液、TAPSO［2-ヒドロキシ-N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-3-アミノスルホン酸］緩衝液、TES［N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-2-アミノエタンスルホン酸］緩衝液、Tricine｛N-[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]グリシン｝緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酒石酸緩衝液、リン酸緩衝液生理食塩水などが挙げられ、その濃度は特に限定されないが、0.1～1000mmol/Lが好ましく、特に10～500mmol/Lが好ましい。緩衝液のpHは特に限定されないが、希釈する生体試料の安定性の面から生体試料の元来のpH付近が望ましく、血液、血漿又は血清の場合、pH6～8が好ましい。
　希釈緩衝液には被測定成分を安定に保つことを目的にキレート剤、抗菌剤、防腐剤、補酵素、糖類、阻害剤などを含んでもよい。
　キレート剤の一例としては、エチレンジアミン四酢酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩などが挙げられる。抗菌剤や防腐剤の一例としては、アミカシン硫酸塩、カナマイシン硫酸塩、チアベンダゾール、アジ化ナトリウムなどが挙げられる。補酵素の一例としては、ピリドキサルリン酸、マグネシウム、亜鉛などが挙げられる。糖類の一例としては、マンニトール、デキストロース、オリゴ糖などが挙げられる。阻害剤の一例としては、ドデシル硫酸ナトリウム、水銀、ヘパリンなどが挙げられる。
　安定化剤は、被測定成分に応じて複数の種類を組み合わせて添加しても構わない。血液、血漿又は血清を緩衝液で希釈し、AST（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）及びALT（アラニンアミノトランスフェラーゼ）を被測定成分とする場合、緩衝液中にエチレンジアミン四酢酸塩及びピリドキサルリン酸が含まれていることが好ましい。この場合の緩衝液にはエチレンジアミン四酢酸塩は0.1～5.0mmol/L、ピリドキサルリン酸は0.01～0.20mmol/Lが含まれていることが望ましく、特にエチレンジアミン四酢酸0.5～3.0mmol/L、ピリドキサルリン酸0.02～0.10mmol/Lが含まれていることが好ましい。
　緩衝液に加える内部標準物質は、生体内に無いか極微量であること、生体成分に干渉を与えないこと、緩衝液内で安定であること、保存容器に吸着しないこと、精度よく測定できる検出系が利用できることなどが求められる。また、血液を希釈する場合には、血球が溶血しないような浸透圧が必要であり、250～500mOsm/kgの浸透圧が好ましい。
　表１には緩衝液の一例として、血球膜を透過しない内部標準物質の１つであるサルコシン及び血球膜を透過する内部標準物質の１つであるエタノールアミンを含有する緩衝液の組成が示されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　ここで、HEPESはN-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N’-2-エタンスルホン酸である。
　表２には、血球膜を通過しない内部標準物質の１つであるサルコシンの測定試薬が示されている。
　ここで、TOOSはN-エチル-N-（2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル）-3-メチルアニリンナトリウム二水和物である。
　以下に、マルトースの測定手順を示す。
　マルトース測定にあたっては、上記R1及びR2を使用する。
１．7.0μlの混合生体試料と90μlのR1を混合し、37℃で5分間放置する。
２．545/658nm波長で吸光度を測定する。――A1（吸光度）
３．30μlのR2を混合し、37℃で5分間放置する。
４．545/658nm波長で吸光度を測定する。――A2（吸光度）
　吸光度は測定値の差として表すことができる。従って、一般に吸光度はΔA=A2-A1として得られる。
　表３には、血球膜を通過する内部標準物質の1つであるエタノールアミンの測定試薬が示されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　ここで、DAOSはN-エチル-Ｎ（2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル）-3,5-ジメチルアニリンナトリウム塩である。
　以下に、エタノールアミンの測定手順を示す。
　エタノールアミン測定にあたって、上記R1及びR2を使用する。
１．11μlの混合生体試料と90μlのR1を混合し、37℃で5分間放置する。
２．596/805nm波長で吸光度を測定する。――A3（吸光度）
３．45μlのR2を混合し、37℃で5分間放置する。
４．546/884nm波長で吸光度を測定する。――A4（吸光度）
　吸光度は測定値の差として表すことができる。従って、一般に吸光度はΔA=A4-A3として得られる。
　吸光度と濃度の関係はLambert-Beerの法則によりA=ε×c×lであることが知られている。ここで、A（吸光度）、ε（モル吸光係数）、c（溶質のモル濃度）、l（光路長）である。吸光度（A）と溶質のモル濃度（c）は比例関係にあり、既知濃度の溶質が溶けた溶液を測定し得られた検量線を用いることによって、一般に未知試料中の溶質の濃度が算出される。
　図１に示すように、血液１は、液体成分である血漿２又は、血清と固体成分である血球３によって構成されており、更に血球は血球膜などの固体成分とその内側に液体成分を有することが知られている。血液は抗凝固剤であるEDTA-２ナトリウムを加えることで血球の凝固を阻止できる。この全血を遠心すると比重の重い血球が最下段に沈降し、上清に血漿が分離される。
　また、図２に示すように、血液１を所定の緩衝液４で希釈した場合、本来、血漿２又は血清に存在する血球膜を透過しない成分は、緩衝液４及び血漿２又は、血清中に分布することになり、希釈される。
　この際、緩衝液４に血球膜を透過しない内部標準物質５が規定量溶解している場合、本来緩衝液中に存在するこの内部標準物質は、緩衝液及び血漿又は、血清中に分布することになり、希釈される。この内部標準は血漿中にのみ浸透するマルトースなどの内部標準を示す。マルトースは陰イオンとして緩衝液に溶解しているため、血漿中に溶存して、血球内には浸透しない。
　つまり、緩衝液４中の血球膜を透過しない内部標準物質５の初期濃度（C0）は、血液が添加されることによって濃度（C1）へ変化する。このC0及びC1によって、血漿又は、血清の希釈率（r1）=C0/（C0-C1）が算出される。緩衝液量をVO、血漿又は血清を緩衝液に添加した総量V1とする。ここで、本来血漿又は、血清に存在する血球膜を透過しない成分の希釈率は、血漿２又は、血清の希釈率と等しいので、r1=（V0+V1）/V1=C0/（C0-C1）によって算出される。
　血液１を所定の緩衝液４で希釈した場合、血球膜を透過する成分は、緩衝液及び血漿又は血清及び血球中に分布することになり、希釈される。この際、緩衝液に血球膜を透過する内部標準物質が規定量溶解している場合、本来緩衝液中に存在するこの内部標準物質は、緩衝液及び血漿又は、血清及び血球中に分布することになり、希釈される。血球膜体積（V2）、血球内体積（V3）とすると、つまり、緩衝液中の血球膜を透過する内部標準物質の初期濃度（C2）は、血液が添加されることによって濃度（C3）へ変化する。このC2及びC3によって、血液全体の希釈率（r2）=（V0+V1+V2+V3）/（V1+V2+V3）=C2/（C2-C3）が算出される。ここで、本来血漿又は、血清及び血球液体に存在する血球膜を透過する成分の希釈率は、血液全体の希釈率と等しいので、r2=（V0+V1+V2+V3）/（V1+V2+V3）=C2/（C2-C3）によって算出される。
　これらは、以下の表４に示すいずれの場合でも利用可能である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　さらに、血球膜を透過しない内部標準物質が含まれる溶液で生体試料を希釈する際、内部標準物質が含まれる溶液の容量（V0）が規定量であれば、血球膜を透過しない内部標準物質から算出される血球膜を透過しない生体試料成分の希釈率（r1）より、血球膜を透過しない生体試料の容量（V1）が算出できる。
　すなわち、
V1=V0/（r1-1）
で算出できる。
　また、血球膜を透過する内部標準物質５が含まれる溶液で生体試料を希釈する際、内部標準物質が含まれる溶液の容量（V0）が定量であれば、血球膜を透過する内部標準物質から算出される血液の希釈率（r2）より、血液の容量（V1+V2+V3）が算出できる。
　すなわち、
V1+V2+V3 =V0/（r2-1）
で算出できる。
　血球膜を透過しない内部標準物質と血球膜を透過する内部標準物質が含まれる溶液で生体試料を希釈する際、V0とr1から求められるV1と、V0とr2から求められるV1+V2+V3の両式より、
V2+V3 =（V1+V2+V3）- V1 = V0 / (r2 - 1) - V0 / (r1 - 1)が算出できる。
　また、血球は65%の液体と35%の固体から成ることが知られている。
V2/（V2+V3）= 0.65より
V2 = 0.65×{V0 / (r2 - 1) - V0 / (r1 - 1)}
V3 = 0.35×V2/0.65
V3 = 0.35×{V0 / (r2 - 1) - V0 / (r1 - 1)}
　従って、血球膜を透過しない内部標準物質を含む溶液、血球膜を透過する内部標準物質を含む溶液又は、血球膜を透過しない内部標準物質と血球膜を透過する内部標準物質が含まれる溶液で生体試料を希釈する際、V0、r1、r2によってV1、V2、V3が算出可能である。
　さらに、V0、r1、r2、V1、V2、V3を組み合わせることによって、
血漿又は、血清の量（V1）
血漿又は、血清の希釈率（r1）
血漿又は、血清及び血球液体の量（V1+V2）
血液全体の希釈率（r2）
血液量（V1+V2+V3）
血液の希釈率{（V0+V1+V2+V3）/（V1+V2+V3）}
血球量（V2+V3）
血球の希釈率{（V0+V2+V3）/（V2+V3）}
血球液体の量（V2）
血球液体の希釈率{（V0+V2）/V2}
血球固体の量（V3）
血球固体の希釈率{（V0+V3）/V3}
ヘマトクリット値（％）{（V2+V3）/（V1+V2+V3）×100(%)}又は1-（血液希釈率-1）/（血漿希釈率-1）
緩衝液の量（V0）
緩衝液の血漿又は、血清に対する希釈率{（V0+V1）/V0}
緩衝液の血漿又は、血清及び血球液体に対する希釈率{（V0+V1+V2）/V0}
緩衝液の血液に対する希釈率{（V0+V1+V2+V3）/V0}
緩衝液の血球液体に対する希釈率{（V0+V2）/V0}
緩衝液の血球固体に対する希釈率{（V0+V3）/V0}
緩衝液の血球に対する希釈率{（V0+V2+V3）/V0}
　などが算出可能である。V0、r1、r2、V1、V2、V3を単独又は組み合わせることによって算出できるものは、上記の例に限定されるものではない。
２．　外部標準物質を利用する分析法（外部標準法）
　本発明は、血液等の生体試料を緩衝液で希釈した後に生体試料中の定量すべき分析対象成分を定量する方法であって、生体試料成分である外部標準物質を用いて生体試料の希釈倍数を求め、該希釈倍数から生体試料中の分析対象成分を定量することを特徴とする。
　本発明の方法では、生体試料の希釈倍率を求めるときに、生体試料の検体量を求める必要はない。
　外部標準物質を用いる方法を外部標準法と呼び、例えば、ナトリウムを外部標準物質として用いる方法をナトリウム（Na)外部標準法と呼ぶ。
　生体成分に含まれる恒常成分である外部標準物質を用いて希釈倍数を求める。
　本発明において、分析対象とする生体試料としては、血液、血清、血漿、尿、唾液、リンパ液、髄液、間質液、汗等の生体試料が挙げられるが、この中でも血液、血清、血漿が好ましい。特に、本発明の好ましい態様では、受検者より微量の血液を採取し、緩衝液で希釈した後、フィルターや遠心分離により血球を分離し、得られた血漿又は血清を用いて分析対象成分を測定する。また、本発明は生体試料を希釈用緩衝液を用いて希釈するため生体試料は微量で足りる。特に、生体試料が血液である場合、200μL以下の微量血液試料を用いて分析対象成分を測定することができる。
　生体試料の起源もヒトに限定されず、動物類、魚類、鳥類等であってもよい。例えば、動物類としては、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、クマ、パンダ等が挙げられる。
　分析対象となる生体試料成分は限定されず、生体試料中に含まれるあらゆる物質が対象となる。例えば、臨床診断に用いられる血液中の生化学検査項目、腫瘍マーカーや肝炎のマーカー等各種疾患のマーカー等が挙げられ、タンパク質、糖、脂質、低分子化合物等が挙げられる。また、測定は物質の濃度だけでなく、酵素等の活性を有する物質の活性も対象となる。各分析対象成分の測定は、公知の方法で行うことができる。
　外部標準物質は、生体試料中に含まれており、恒常性が高い物質、すなわち、生体試料中濃度の生理的変動が少ない物質であり、さらにヒト個体間で生体試料中濃度の差が少ない物質が好ましい。このような物質として、ナトリウム(Na+)、クロール(Cl-)、タンパク質が挙げられる。タンパク質としては、例えば血液中に含まれ恒常性が高いアルブミンや血清中総タンパク質等が挙げられる。この中でも、特に恒常性が高く、また、個体間の変動が少ないナトリウムが好ましい。
　ヒト血漿中のナトリウム濃度の正常値、すなわち健常人の血漿中のナトリウム濃度は、約135～145mmol/L(mEq/L)であり、中央値は約142mmol/Lである。95％の受検者において、血漿中ナトリウム濃度は正常範囲に含まれる。2.5％の受検者においては、これよりも低濃度となり、2.5％の受検者においては、これよりも高濃度となる。緩衝液を用いて希釈した後の外部標準物質の濃度と健常人の血漿中ナトリウム濃度の平均値から、検体として用いる生体試料の希釈倍数を求めることができる。また、生体試料として、血液、血清、血漿以外の生体試料を用いる場合、各生体試料中のナトリウム濃度の中央値から希釈倍数を求めることができる。
　外部標準物質として、生体試料中に含まれる物質を用いるため、生体試料を希釈する緩衝液としては、外部標準物質が含まれていないか、あるいは含まれていたとしても生体試料を希釈した後の混合物中の外部標準物質の測定に影響を及ぼさない程度の極微量の濃度で含まれる緩衝液を用いる必要がある。また、外部標準物質の測定を妨げる物質が含まれていないか、あるいは含まれていたとしても生体試料を希釈した後の希釈溶液中の外部標準物質の測定に影響を及ぼさない程度の極微量の濃度で含まれる緩衝液を用いる必要がある。これらの物質が含まれていないか、あるいは含まれていたとしても生体試料を希釈した後の混合物中の外部標準物質の測定に影響を及ぼさない程度の極微量の濃度で含まれる緩衝液を、前記物質を実質的に含まない緩衝液という。例えば、本発明の方法で用いる希釈用緩衝液中のナトリウム濃度は、100 nmol/L以下である。
　例えば、外部標準物質として、ナトリウム又はクロールを用いる場合、生体試料の希釈用緩衝液にナトリウム又はクロールが含まれていないか、含まれていたとしても極微量である必要がある。さらに、ナトリウムはアルカリ金属類に属する元素又はアルカリ土類金属類に属する元素の定量に影響を及ぼすため、生体試料の希釈用緩衝液にナトリウムは含まれていないか、含まれていたとしても極微量である必要がある。また、生体試料中の目的分析対象物を測定するため、目的分析対象物の分解や変性を防ぐために、生体試料の希釈用緩衝液は、生体試料のpHに近い、pH6.5～pH8.0、好ましくはpH7.0～pH7.5、さらに好ましくはpH7.4の緩衝液である必要がある。さらに、本発明においては、緩衝液で希釈された血液中の生体成分を測定するため、緩衝液成分がこれら測定しようとする生体成分の変性や安定性に影響を及ぼしてはならない。従来は、pH7.4前後で緩衝能を有し、ナトリウムやクロールを含まない緩衝液は存在しなかったため、ナトリウムやクロールを外部標準物質として用いることは不可能であった。本発明においては、pH7.4前後で緩衝能を有し、ナトリウムやクロールを含まない緩衝液を新たに開発し、ナトリウムやクロールを外部標準物質として用いることを可能にした。
　このようなナトリウム、クロール、アルカリ金属類の元素及びアルカリ土類金属類の元素を含まないアルカリ性物質として、2-アミノ-2-メチル-1-プロパノール(AMP)、2-エチルアミノエタノール、N-メチル-D-グルカミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン等のアミノアルコール化合物類と酸性を示す化合物としてGood’s緩衝剤（グッドバッファー）があり、pKaがpH7.4付近の緩衝剤である、HEPES (2- [4- (2-Hydoxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid)（pKa=7.55）、TES （N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2- aminoethanesulfonic  acid）（pKa=7.50）、MOPS（3-Morpholinopropanesulfonic acid）（pKa=7.20）又はBES（N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid）（pKa=7.15）を組合せて混合した緩衝液が挙げられる。この中でも、2-アミノ-2-メチル-1-プロパノール(AMP)とHEPES、TES、MOPS又はBESの組合せが好ましく、さらに、2-アミノ-2-メチル-1-プロパノール(AMP)とHEPESの組合せが好ましい。
　上記緩衝液を作製するためには、アミノアルコールとGood's緩衝剤を１：２～２：１、好ましくは１：１．５～１．５：１、さらに好ましくは１：１の濃度比で混合すればよい。緩衝液の濃度は限定されないが、アミノアルコール又はGood's緩衝剤の濃度は、0.1～1000 mM/L、好ましくは１～500 mM/L、さらに好ましくは10～100 mM/Lである。
　緩衝液中には、分析対象成分を安定に保つことを目的にキレート剤、界面活性剤、抗菌剤、防腐剤、補酵素、糖類、阻害剤等が含有されてもよい。キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸塩（EDTA）、クエン酸塩、シュウ酸塩等が挙げられる。界面活性剤としては、例えば、陽イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤、両性界面活性剤又は非イオン界面活性剤が挙げられる。防腐剤としては、例えば、アジ化ナトリウムや抗生物質等が挙げられる。補酵素としては、ピリドキサールリン酸、マグネシウム、亜鉛等が挙げられる。糖類としては、マンニトール、デキストロース、オリゴ糖等が挙げられる。阻害剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム、水銀、ヘパリン等が挙げられる。特に、マンニトールとピリドキサールリン酸の添加により血球膜や酵素を安定することができ、３～４種類の抗生物質や抗菌剤の添加により、手指採血時に手指表面から一部混入する細菌の増殖を抑えることができ、生体成分の細菌による分解の安定化を図ることができる。
　生体試料に全血を使用する場合には、希釈した血液中の血球成分をフィルター濾過する必要から、緩衝液の浸透圧は血液と同等（285 mOsm/kg）又はそれ以上の浸透圧を用いることで血球の溶血を防ぐことができる。浸透圧は、測定しようとする生体成分の定量に影響しない塩類、糖類等、緩衝剤等により等張に調整することができる。
　本発明は、本発明の方法により生体試料の希釈倍数を用いるために用いる上記緩衝液も包含する。
　外部標準物質である、クロール(Cl-)、タンパク質も公知の方法で測定することができる。例えば、クロールは吸光度を測定する方法があり、それは、アミラーゼがクロールイオンで活性化するため、その反応速度から測定することができる。タンパク質は、ビューレット法、ブラッドフォード法、ローリー法等により測定することができる。アルブミンの測定には、色素法であるブロムクレゾールグリーン法により測定することができる。
　緩衝液で希釈された、外部標準として用いる生体試料中ナトリウムを測定する方法には炎光光度計、原子吸光法、イオン選択電極法等がある。本発明において、生体試料として血液を用いる場合、微量な血液を手指から採取して緩衝液で希釈した試料は僅か150μL程度であり、生化学成分や免疫検査項目を10項目以上測定することから、数μLの微量の試料を用いて外部標準物質であるナトリウムを測定する必要がある。また、大量の試料を分析する必要から、市販の生化学・免疫自動分析装置に適応できる必要がある。
　ナトリウム測定においては、ナトリウムイオンにより酵素ガラクトシダーゼの酵素活性が活性化する。このため、本発明においては、ナトリウム測定法として、緩衝液で希釈された非常に低濃度ナトリウム（24 mmol/L以下）試料を数μL用いて測定する酵素的測定法を開発した。該酵素的測定法においては、希釈した生体試料の微量ナトリウム測定はβ-ガラクトシダーゼがナトリウムで活性化することを利用し、緩衝液で希釈された試料のナトリウム濃度とガラクトシダーゼ活性が比例関係にあることを利用して測定する。この方法は生化学・免疫自動分析装置に適応でき、ナトリウム測定のために別の測定機器を必要としない点で効率性が高く経済的である。
　前記ナトリウム測定法においては、血液等の生体試料を希釈用緩衝液で希釈し、さらに精製水で希釈し、β-ガラクトシダーゼを含む緩衝液である第１試薬を希釈試料の10～30倍容積量添加し、30～45℃で２～20分加温し、o-Nitrophenyl-β-D-Galactpyranosideを含む基質液である第２試薬を第１試薬の量の半量ほど添加し、主波長410nm、副波長658nmで吸光度を測定する。より詳細には、血液等の生体試料を希釈用緩衝液で希釈し、さらに精製水で５倍程度に希釈し、希釈した生体試料と緩衝液混合物を１～10μL、好ましくは３μLに第１試薬としてβ-ガラクトシダーゼを含む緩衝液30～100μL、好ましくは52μLを、β-ガラクトシダーゼを含む緩衝液と希釈した生体試料と緩衝液混合物の容積比が10～30、好ましくは15～25になるように添加する。次いで、30～45℃、好ましくは37℃で２～20分、好ましくは５分加温し、次いで第２試薬としてo-Nitrophenyl-β-D-Galactpyranosideを含む基質液25μＬを添加する。その後、主波長410nm、副波長658nmで吸光度を測定することによりナトリウム濃度を測定することができる。
　本発明の生体試料の希釈倍数を求める方法は以下のようにして行う態様が望ましい。
　生体試料10～200μLを、緩衝液50～500μLに添加して混合する。この際、緩衝液の容積は生体試料の容積の３～４倍以上であることが好ましい。例えば、生体試料が血液である場合、微量血液試料65μLを緩衝液280μLに添加して混合する。生体試料が血液である場合、希釈後に、赤血球、白血球等の血球を除去する。血球はフィルターを利用して除去してもよいし、希釈血液試料を遠心分離にかけ除去してもよい。血球を除去した希釈血漿試料を用いて、分析対象成分を測定する。微量血液試料65μLを緩衝液280μLに添加する場合、血液試料65μLに約30μLの血漿が含まれるため、血漿は約10倍に希釈される。生体試料として血液を用いる場合、血漿に換算し、血漿が５～20倍、好ましくは５～16倍、さらに好ましくは５～10倍、特に好ましくは８～10倍程度に希釈されるように、血液と希釈用緩衝液を混合すればよい。
　また、同時に希釈血漿試料中の外部標準物質濃度を測定する。外部標準物質濃度から血液の希釈倍数を求め、希釈血漿試料の分析対象成分の測定値に希釈倍数を乗じることにより血液中の分析対象成分濃度を算出することができる。
　生体試料として血液を用いる場合、血液を希釈用緩衝液で希釈後、血球を除去するため、残った試料は血漿であり、これを希釈血漿と呼ぶ。従って、この場合、血漿の希釈倍数を求めることをいう。
　血漿の希釈倍数は、外部標準物質を用いて算出式（Ｉ）を用いた以下の算出方法により求めることができる。
　以下に説明する方法においては、血液を希釈用緩衝液で希釈し、フィルターを用いてろ過し得られた血漿試料を用いる。
算出方法１
        A
X = ---------   (Ｉ)
        B
A：血漿中外部標準物質濃度の正常中央値の吸光度、
B：希釈血漿中の外部標準物質の吸光度、
X：血漿希釈倍数
　外部標準物質としてナトリウムを用いる場合、ナトリウムの吸光度を求めればよい。血漿中ナトリウム濃度の正常中央値の吸光度としては、ナトリウム142 mmol/Lの吸光度を用いればよい。
３．　内部標準物質及び外部標準物質を利用する測定法（ハイブリッド法）
　本発明は、血液等の生体試料を緩衝液で希釈した後に生体試料中の定量すべき分析対象成分を定量する方法であって、内部標準物質及び外部標準物質を用いて生体試料の希釈倍数を求め、該希釈倍数から生体試料中の分析対象成分を定量することを特徴とする。
　本発明の方法では、生体試料の希釈倍率を求めるときに、生体試料の検体量を求める必要はない。
　内部標準物質と外部標準物質を併用して希釈倍数を求めるが、外部標準物質は内部標準物質による希釈倍数を補正し、希釈倍数を正確に求めるために用いられる。本発明の生体試料の希釈倍数を求める方法を内部標準物質と外部標準物質の両方を用いるため、ハイブリッド法と呼ぶことがある。
　内部標準物質のみを用いて生体試料の希釈倍数を求める場合、生体試料に内部標準物質を添加した希釈用緩衝液で希釈するため、生体試料の量が少ない場合、希釈倍数が大きくなり過ぎ、内部標準物質濃度から求めた希釈倍数の信頼性は低くなってしまう。本発明のハイブリッド法においては、このような内部標準物質を用いる方法の欠点について外部標準物質を用いることにより補えることができる。また、後述のように、生体試料中に内部標準物質として用いる物質が含まれていたり、元々生体試料中にある外部標準物質の濃度が正常値を外れている場合がある。このような場合でも、ハイブリッド法では、それぞれの方法の欠点を補い、正確な希釈倍数を求めることができる。
　本発明の分析対象とする生体試料としては、上記「２．　外部標準物質を利用する分析法（外部標準法）」に記載の生体試料を用いることができ、生体試料の起源も上記２（外部標準法）のとおりである。
　分析対象生体試料成分も上記２（外部標準法）に記載の分析対象生体試料成分が対象となる。
　内部標準物質は、生体試料の希釈に用いる緩衝液に所定の濃度になるように添加して用いる。内部標準物質としては、生体試料中に全く含まれないか、若しくは、含まれていたとしても極微量である物質、生体試料中の分析対象成分の測定に干渉を与えない物質、生体試料中の生体酵素の作用を受けて分解しない物質、緩衝液中で安定な物質、血球膜を透過せず血球中に含まれない物質、緩衝液の保存容器に吸着しない物質、精度よく測定できる検出系が利用できる物質を用いる。このような物質として、上記「１．　内部標準物質を利用する分析法（内部標準法）」に記載した物質が挙げられ、この中でも緩衝液に添加した状態で長期間保存しても安定なアルカリ金属又はアルカリ土類金属に属する元素であって、天然において生体試料中に含まれないものが好ましい。
　アルカリ金属に属する元素として、Li（リチウム）、Rb（ルビジウム）、Cs（セシウム）、Fr（フランシウム）が挙げられ、アルカリ土類金属に属する元素として、Sr（ストロンチウム）、Ba（バリウム）、Ra（ラジウム）が挙げられ、この中でもLiが好ましい。
　また、特開2003-161729号公報に記載のグリセロール-3-リン酸を用いることもできる。
　内部標準物質の生体試料の希釈に用いる緩衝液への添加濃度は、希釈後に内部標準物質の濃度が測定できる濃度であれば、限定されない。例えば、0.1～1000mM/L、好ましくは0.1～100mM/L、さらに好ましくは0.5～10mM/Lの濃度で添加すればよい。例えば、リチウムを内部標準物質として用いる場合、生体試料の希釈に用いる緩衝液にリチウムを上記濃度で添加すればよい。
　緩衝液を用いて希釈した後の生体試料の希釈液中の内部標準物質の濃度と希釈に用いた緩衝液中に添加した内部標準物質の濃度から、検体として用いる生体試料の希釈倍数を求めることができる。
　内部標準物質が含有された緩衝液に試料を添加した時の試料の希釈倍数の範囲に限定はないが、5～20倍、好ましくは5～15倍である。
　外部標準物質は、生体試料中に含まれており、恒常性が高い物質、すなわち、生体試料中濃度の生理的変動が少ない物質であり、さらにヒト個体間で生体試料中濃度の差が少ない物質が好ましい。このような物質として、ナトリウム(Na+)、クロール(Cl-)、タンパク質が挙げられる。タンパク質としては、例えば血液中に含まれ恒常性が高いアルブミンや血清中総タンパク質等が挙げられる。この中でも、特に恒常性が高く、また、個体間の変動が少ないナトリウムが好ましい。
　ヒト血漿中のナトリウム濃度の正常値、すなわち健常人の血漿中のナトリウム濃度は、約135～145mmol/L(mEq/L)であり、正常中央値は約142mmol/Lである。95％の受検者において、血漿中ナトリウム濃度は正常範囲に含まれる。2.5％の受検者においては、これよりも低濃度となり、2.5％の受検者においては、これよりも高濃度となる。緩衝液を用いて希釈した後の外部標準物質の濃度と健常人の血漿中ナトリウム濃度の平均値から、検体として用いる生体試料の希釈倍数を求めることができる。また、生体試料として、血液、血清、血漿以外の生体試料を用いる場合、各生体試料中のナトリウム濃度の中央値から希釈倍数を求めることができる。
　緩衝液を用いて希釈した後の生体試料中の内部標準物質の濃度と希釈に用いた緩衝液中に添加した内部標準物質の濃度から、検体として用いる生体試料の希釈倍数を求め、さらに、希釈した後の生体試料中の外部標準物質の濃度と生体試料中に含まれる外部標準物質の濃度を用いて、内部標準物質濃度から算出した希釈倍数を補正することにより、より正確な希釈倍数を求めることができる。
　外部標準物質として、生体試料中に含まれる物質を用いるため、生体試料を希釈する緩衝液としては、外部標準物質が含まれていないか、あるいは含まれていたとしても生体試料を希釈した後の混合物中の外部標準物質の測定に影響を及ぼさない程度の極微量の濃度で含まれる緩衝液を用いる必要がある。また、外部標準物質及び内部標準物質の測定を妨げる物質が含まれていないか、あるいは含まれていたとしても生体試料を希釈した後の希釈溶液中の内部標準物質又は外部標準物質の測定に影響を及ぼさない程度の極微量の濃度で含まれる緩衝液を用いる必要がある。これらの物質が含まれていないか、あるいは含まれていたとしても生体試料を希釈した後の混合物中の内部標準物質又は外部標準物質の測定に影響を及ぼさない程度の極微量の濃度で含まれる緩衝液を、前記物質を実質的に含まない緩衝液という。例えば、本発明の方法で用いる希釈用緩衝液中のナトリウム濃度は、100 nmol/L以下である。
　例えば、外部標準物質として、ナトリウム又はクロールを用いる場合、生体試料の希釈用緩衝液にナトリウム又はクロールが含まれていないか、含まれていたとしても極微量である必要がある。また、内部標準物質としては、アルカリ金属類に属する元素又はアルカリ土類金属類に属する元素を用いるので、生体試料の希釈用緩衝液は、内部標準物質として用いるアルカリ金属類に属する元素及びアルカリ土類金属類に属する元素、並びにこれらに近似した物質が含まれていないか、含まれていたとしても極微量である必要がある。さらに、ナトリウムはアルカリ金属類に属する元素又はアルカリ土類金属類に属する元素の定量に影響を及ぼすため、生体試料の希釈用緩衝液にナトリウムは含まれていないか、含まれていたとしても極微量である必要がある。また、生体試料中の目的分析対象物を測定するため、目的分析対象物の分解や変性を防ぐために、生体試料の希釈用緩衝液は、生体試料のpHに近い、pH6.5～pH8.0、好ましくはpH7.0～pH7.5、さらに好ましくはpH7.4の緩衝液である必要がある。さらに、本発明においては、緩衝液で希釈された血液中の生体成分を測定するため、緩衝液成分がこれら測定しようとする生体成分の変性や安定性に影響を及ぼしてはならない。従来は、pH7.4前後で緩衝能を有し、ナトリウムやクロールを含まない緩衝液は存在しなかったため、ナトリウムやクロールを外部標準物質として用いることは不可能であった。本発明においては、pH7.4前後で緩衝能を有し、ナトリウムやクロールを含まない緩衝液を新たに開発し、ナトリウムやクロールを外部標準物質として用いることを可能にした。
　このようなナトリウム、クロール、アルカリ金属類の元素及びアルカリ土類金属類の元素を含まないアルカリ性化合物として、2-アミノ-2-メチル-1-プロパノール(AMP)、2-エチルアミノエタノール、N-メチル-D-グルカミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン等のアミノアルコール化合物類と酸性を示すGood’s緩衝剤（グッドバッファー）でpKaがpH7.4付近の緩衝剤である、HEPES (2- [4- (2-Hydoxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid)（pKa=7.55）、TES （N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2- aminoethanesulfonic  acid）（pKa=7.50）、MOPS（3-Morpholinopropanesulfonic acid）（pKa=7.20）又はBES（N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid）（pKa=7.15）を組合せて混合した緩衝液が挙げられる。この中でも、2-アミノ-2-メチル-1-プロパノール(AMP)とHEPES、TES、MOPS又はBESの組合せが好ましく、さらに、2-アミノ-2-メチル-1-プロパノール(AMP)とHEPESの組合せが好ましい。
　上記緩衝液を作製するためには、アミノアルコールとGood's緩衝剤を１：２～２：１、好ましくは１：１．５～１．５：１、さらに好ましくは１：１の濃度比で混合すればよい。緩衝液の濃度は限定されないが、アミノアルコール又はGood's緩衝剤の濃度は、0.1～1000 mM/L、好ましくは１～500 mM/L、さらに好ましくは10～100 mM/Lである。
　緩衝液中には、分析対象成分を安定に保つことを目的にキレート剤、界面活性剤、抗菌剤、防腐剤、補酵素、糖類、阻害剤等が含有されてもよい。キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸塩（EDTA）、クエン酸塩、シュウ酸塩等が挙げられる。界面活性剤としては、例えば、陽イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤、両性界面活性剤又は非イオン界面活性剤が挙げられる。防腐剤としては、例えば、アジ化ナトリウムや抗生物質等が挙げられる。補酵素としては、ピリドキサールリン酸、マグネシウム、亜鉛等が挙げられる。糖類としては、マンニトール、デキストロース、オリゴ糖等が挙げられる。阻害剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム、水銀、ヘパリン等が挙げられる。特に、マンニトールとピリドキサールリン酸の添加により血球膜や酵素を安定することができ、３～４種類の抗生物質や抗菌剤の添加により、手指採血時に手指表面から一部混入する細菌の増殖を抑えることができ、生体成分の細菌による分解の安定化を図ることができる。
　生体試料に全血を使用する場合には、希釈した血液中の血球成分をフィルター濾過する必要から、緩衝液の浸透圧は血液と同等（285 mOsm/kg）又はそれ以上の浸透圧を用いることで血球の溶血を防ぐことができる。浸透圧は、測定しようとする生体成分の定量に影響しない塩類、糖類等、緩衝剤等により等張に調整することができる。
　本発明は、本発明のハイブリッド法により生体試料の希釈倍数を用いるために用いる上記緩衝液も包含する。該緩衝液は、本発明のハブリッド法のみならず、外部標準を用いた定量分析方法（外部標準法）にも、内部標準を用いた定量分析方法（内部標準法）にも用いることができる。
　内部標準物質である、アルカリ金属類の元素又はアルカリ土類金属類の元素は、公知の方法で測定することができる。例えば、アルカリ金属類に属する元素又はアルカリ土類金属類に属する元素とキレート錯体を形成する物質を添加し、形成されたキレート錯体の吸光度を測定すればよい。アルカリ金属類の元素又はアルカリ土類金属類の元素とキレート錯体を形成する物質として、例えば、多価ハロゲン置換ポルフィリン化合物（例えば、ポリフルオロポルフィリン）等のポルフィリン誘導体が挙げられる。また、元素自体の吸光度を原子吸光度法により測定することもできる。具体的には、内部標準物質として緩衝液に添加したリチウムの測定は、キレート比色法（ハロゲン化ポルフィリンキレート法：perfluoro-5,10,15,20-tetraphenyl-21H,23H -porphyrin）を利用して生化学自動分析装置で行うことができる。この方法により、多数検体を微量の試料で容易に測定できる。
　外部標準物質である、クロール(Cl-)、タンパク質も上記２（外部標準法）に記載の公知の方法で測定することができる。
　本発明の方法においては、内部標準物質としてリチウム等のアルカリ金属類の元素やアルカリ土類金属の元素を用い、かつ外部標準物質としてナトリウム(Na+)、クロール(Cl-)又はタンパク質等の生体試料中に含まれる物質の２つの標準物質を用いるハイブリッド法で希釈倍数を求め、内部標準物質を用いて求めた希釈倍数について外部標準物質を用いて補正して、正確な希釈倍数を求めることができる。
　躁病及び躁うつ病の躁状態の改善のための医薬として、炭酸リチウムが用いられる。治療を必要とする受検者に対して、炭酸リチウムは１日当たり数百mg～千数百mg投与される。従って、炭酸リチウムの投与を受けている被験体の生体試料中にはリチウムが含まれ、リチウムのみを内部標準として用いた場合に、正確な希釈倍数を求めることができなくなる。
　一方、ナトリウムは前述のように健常者における血液中濃度の正常範囲は約135～145mmol/L(mEq/L)であるが、約５％の受検者においては、健常者であっても正常値を外れ、約2.5％の被験体においては健常者であっても上記正常値より低濃度となり、約2.5％の被験体においては健常者であっても上記正常値より高濃度となる。このような受検者において、ナトリウムのみを外部標準として用いた場合、正確に希釈倍数を求めることができなくなる。
　上記のように、受検者がリチウム等のアルカリ金属類の元素やアルカリ土類金属の元素を医薬として投与されている場合や、血液中のナトリウム(Na+)、クロール(Cl-)又はタンパク質の濃度が正常値を外れている場合でも、内部標準物質を用いて求める希釈倍数を外部標準物質により補正するため、両者の欠点を補完することができ、正確に生体試料の希釈倍数を求めることができる。
　本発明の生体試料の希釈倍数を求める方法は以下のようにして行う態様が望ましい。
　生体試料10～200μLを、あらかじめ内部標準物質を所定の濃度で添加した緩衝液50～500μLに添加して混合する。この際、緩衝液の容積は生体試料の容積の３～４倍以上であることが好ましい。例えば、生体試料が血液である場合、微量血液試料65μLを内部標準添加緩衝液280μLに添加して混合する。生体試料が血液である場合、希釈後に、赤血球、白血球等の血球を除去する。血球はフィルターを利用して除去してもよいし、希釈血液試料を遠心分離にかけ除去してもよい。血球を除去した希釈血漿試料を用いて、分析対象成分を測定する。微量血液試料65μLを内部標準添加緩衝液280μLに添加する場合、血液試料65μLに約30μLの血漿が含まれるため、血漿は約10倍に希釈される。生体試料として血液を用いる場合、血漿に換算し、血漿が５～20倍、好ましくは５～16倍、さらに好ましくは５～10倍、特に好ましくは８～10倍程度に希釈されるように、血液と希釈用緩衝液を混合すればよい。
　また、同時に希釈血漿試料中の内部標準物質濃度と外部標準物質濃度を測定する。内部標準物質濃度及び外部標準物質濃度から血液の希釈倍数を求め、希釈血漿試料の分析対象成分の測定値に希釈倍数を乗じることにより血液中の分析対象成分濃度を算出することができる。
　生体試料をして血液を用いる場合、血液を希釈用緩衝液で希釈後、血球を除去するため、残った試料は血漿であり、これを希釈血漿と呼ぶ。従って、この場合、血漿の希釈倍数を求めることをいう。
　血漿の希釈倍数は、内部標準物質及び外部標準物質を用いて以下の３種類の算出方法により求めることができる。
　以下に説明する方法においては、血液を内部標準物質が添加された希釈用緩衝液で希釈し、フィルターを用いてろ過し得られた血漿試料を用いる。内部標準物質としてリチウムを用い、外部標準物質としてナトリウムを用いる。
算出方法１
A：内部標準物質を添加した緩衝液中の内部標準物質の吸光度
B：希釈血漿中の内部標準物質の吸光度
C：血漿中外部標準物質濃度の正常中央値の吸光度
D：希釈血漿中の外部標準物質の吸光度
X：血漿希釈倍数
　ここで、希釈血漿とは、血液試料を希釈用緩衝液で希釈し、血球を除去して得られた血漿をいう。内部標準物質としてリチウムを用い、外部標準物質としてナトリウムを用いる場合、リチウムの濃度は、例えば、キレート比色法等でリチウム濃度を測定した場合に得られる吸光度で表すことができる。また、ナトリウムの濃度は、酵素的測定法等で測定した場合の吸光度で表すことができる。血漿中ナトリウム濃度の正常中央値は健常者の中央値であり、血漿中ナトリウム濃度の正常中央値の吸光度としては、ナトリウム142 mmol/Lの吸光度を用いればよい。該値は、既知の値である。以下の算出方法２及び３においても同様である。
　緩衝液による血漿の希釈倍数Xは下の算出式（１）又は算出式（２）で求めることができる。
　　　A ＋ C
X =　-----  　　　　　　　（１）
      B ＋ D
 
　　　√（A2 ＋ C２）
X =　-------  　　　　（２）
      √（B2 ＋ D2）
　希釈血漿中の分析対象成分である生化学成分の測定濃度や酵素活性を定量し、該定量値に算出式（１）又は算出式（２）で求めた希釈倍数を乗じて、元の血漿中の分析対象成分を定量することができる。
算出方法２
B：希釈血漿中の内部標準物質の吸光度
D：希釈血漿中の外部標準物質の吸光度
X：血漿希釈倍数
血漿の希釈倍数は下の算出式（３）で求めることができる。
X= a × （B＋D） ± b　　　　　（３）
(a及びbは係数)
　算出方法２においては、あらかじめB+Dと希釈倍数のデータを取得し、X = a × （B＋D） ± bで表される回帰直線を作成しておく。
　希釈血漿中の分析対象成分である生化学成分の測定濃度や酵素活性を定量し、該定量値に算出式（３）で求めた希釈倍数を乗じて、元の血漿中の分析対象成分を定量することができる。
算出方法３
A：内部標準物質を添加した緩衝液中の内部標準物質の吸光度
B：希釈血漿中の内部標準物質の吸光度
C：血漿中外部標準物質濃度の正常中央値の吸光度、
D：希釈血漿中の外部標準物質の吸光度
B'：外部標準物質の吸光度から算出した希釈倍数による、希釈血漿中の内部標準物質の吸光度の補正値
X：血漿希釈倍数
　内部標準物質（例えば、リチウム）と外部標準物質（例えば、ナトリウム）の希釈倍数Xは同じと仮定すると、下記の式が得られる。
X ＝ A/B = C/D
　外部標準物質（例えば、ナトリウム）の希釈倍数により内部標準物質（例えば、リチウム）の吸光度変化量補正値B'を下の式で求める。
（B'）=（A×D）/C
　内部標準物質（例えば、リチウム）の吸光度変化量補正値B'でAを除することで外部標準物質（例えば、ナトリウム）補正による内部標準物質（例えば、リチウム）希釈倍数を求める。
X＝A/B'　　　　　　　　　　　　（４）
　希釈血漿中の分析対象成分である生化学成分の測定濃度や酵素活性を定量し、該定量値に算出式（４）で求めた希釈倍数を乗じて、元の血漿中の分析対象成分を定量することができる。
　以下、本発明の実施例について説明する。
１．　内部標準を利用する分析法（内部標準法）
[実施例１－１]
　マルトースを内部標準物質として希釈緩衝液に添加した血液希釈緩衝液にEDTA-2Na添加した全血試料を60μLと血液希釈緩衝液を200 μL加え、50例の静脈血液試料について検討した。希釈なしの全血を遠心して得られた血漿の測定値と希釈した血漿の測定値に内部標準で希釈倍数を乗じて求めた希釈血漿測定値について相関を調べた結果、図１に示すように酵素活性（トランスアミナーゼ;ALT,γ-グルタミルトランスフェラーゼ;GGT）、脂質検査（中性脂肪；TG、LDL-コレステロール、グルコース、ヘモグロビンA1c）の検査で良好な相関性が得られた。
[実施例１－２]
　血球及び血漿に分布する内部標準であるエタノールアミンを血液希釈緩衝液に添加した希釈緩衝液にEDTA-2Na添加した全血試料を60μLと血液希釈緩衝液を200μL加え、50例の静脈血液試料について検討した。
　静脈採血のEDTA-2Na添加全血とこの全血を血液希釈緩衝液で希釈した希釈全血をそれぞれ試料として白血球（WBC）、赤血球(RBC)、ヘモグロビン濃度(Hgb)、ヘマトクリット値(Hct)、血小板数（Plt）を算定した相関図を図５に示す。これによれば血小板数を除き、良好な相関性が認められる。
[実施例１－３]
　マルトース内部標準から求めた血漿希釈率とエタノールアミンから求めた全血希釈率を用いて計算式から求めた血液中の血球体積を示すヘマトクリット値と全血を血球計数機で求めた値との相関を調べた。その結果を図６に示す。良好な相関性で実用性がある。
２．　外部標準物質を利用する分析法（外部標準法）
[実施例２－１]　微量血液試料を用いた定量分析
（１）外部標準物質（ナトリウム）の測定及び希釈倍数の算出
　微量血液試料65μLを緩衝液280μLに添加して混合し、フィルターで血球を濾過して、希釈血漿を試料として生化学自動分析装置で外部標準物質及び生体成分の各濃度を測定した。
　血液試料の希釈用緩衝液としては、2-アミノ-2-メチル-1-プロパノールとHEPES(2-[4-(2-Hydoxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid)を組合わせて混合したpH7.4の緩衝液を用いた。
　用いた緩衝液の組成を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　外部標準物質としては、血液試料に含まれているナトリウムを用いた。
　希釈血漿の微量ナトリウム測定はβ-ガラクトシダーゼがナトリウムで活性化することを利用し、緩衝液で希釈された試料のナトリウム濃度とガラクトシダーゼ活性が比例関係にあることを利用した酵素的測定法を開発した。
　表６にナトリウム測定試薬の組成を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表６に示したナトリウム測定試薬を用いて、以下の測定を行った。
　希釈緩衝液280μLに全血65μLを添加すると全血中の血漿（約30μL）は約10希釈される。この希釈血漿を精製水で4.5倍希釈後の3μLにβ-ガラクトシダーゼ緩衝液（第１試薬）を52μL加えて、37℃で5分加温し、基質液o-Nitrophenyl-β-D-Galactpyranoside（第２試薬）を26μL加えて、1分間の吸光度速度変化を、日本電子（株）JCA-BM 6050型生化学自動分析装置を用いて、主波長410nm、副波長658nmで吸光度を測定することにより求めた。図１にナトリウム濃度と吸光度変化量を示した検量線を示す。24mmol/Lまで原点を通る直線性が得られナトリウムの定量性が認められた。
（２）　外部標準物質（クロール）の測定
　以下の試薬を用いた
1）第一試薬：
pH6.0, 0.1 mol/L MES・NaOH緩衝液に膵由来アミラーゼ2 U/ml及び10 mmol/L EDTAを含む溶液
２）第二試薬：5 mmol/L 2-クロロ-4-ニトロフェニルマルトース溶液
　クロール測定法は以下のとおりであった。
　試料５μLに第一試薬150μL加え、37℃で５分間加温して後、第二試薬を50μL加えた後、１分後から２分間の405nmにおける吸光度変化を求めた。
　図８にクロール濃度と吸光度変化量を示した検量線を示す。
（３）微量血液試料と静脈血漿との相関性
　表７には血漿測定値と外部標準物質（ナトリウム）の希釈倍率から求めた希釈血漿測定値との相関統計値を示した。測定は、日本電子（株）JCA-BM 6050型自動分析装置を用いて行った。142mmol/Lのナトリウム測定吸光度（A）と希釈血漿のナトリウム吸光度（B）を下記の式（Ｉ）により求めた希釈倍数（X：８倍希釈）を利用して求めた希釈血漿の生化学検査データ（希釈血漿測定値）と血漿データ（血漿測定値）の相関を示す。各検査項目の血漿測定は常法で行った。また、希釈血漿の測定は常法より試料の容量を増やして最適化した条件で測定を行った。表７に示すように生化学検査13項目の相関性は良好であり、微量の血液から元の血漿中の生化学検査データを得ることが可能である。
        A
X = ---------   (Ｉ)
        B
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
３．　内部標準物質及び外部標準物質を利用する分析法（ハイブリッド法）
[実施例３－１]　微量血液試料を用いた定量分析
（１）内部標準物質（リチウム、グリセロール-3-リン酸）及び外部標準物質（ナトリウム）の測定及び希釈倍数の算出
　微量血液試料65μLを内部標準物質添加緩衝液280μLに添加して混合し、フィルターで血球を濾過して、希釈血漿を試料として生化学自動分析装置で内部標準物質と外部標準物質及び生体成分の各濃度を測定した。
　血液試料の希釈用緩衝液としては、2-アミノ-2-メチル-1-プロパノールとHEPES(2-[4-(2-Hydoxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid)を組合わせて混合したpH7.4の緩衝液を用いた。
　用いた内部標準物質を添加した緩衝液の組成を表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　内部標準物質としてはリチウムを用い、希釈用緩衝液に１ mM/Lの塩化リチウムを添加した。外部標準物質としては、血液試料に含まれているナトリウムを用いた。
　緩衝液に内部標準物質として添加したリチウムの測定は、キレート比色法（ハロゲン化ポルフィリンキレート法：perfluoro-5,10,15,20-tetraphenyl-21H,23H -porphyrin）により行った。
　希釈血漿の微量ナトリウム測定はβ-ガラクトシダーゼがナトリウムで活性化することを利用し、緩衝液で希釈された試料のナトリウム濃度とガラクトシダーゼ活性が比例関係にあることを利用した酵素的測定法を開発した。
　表９にナトリウム測定試薬の組成を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　表９に示したナトリウム測定試薬を用いて、以下の測定を行った。
　希釈緩衝液280μLに全血65μLを添加すると全血中の血漿（約30μL）は約10希釈される。この希釈血漿を精製水で4.5倍希釈後の3μLにβ-ガラクトシダーゼ緩衝液（第１試薬）を52μL加えて、37℃で5分加温し、基質液o-Nitrophenyl-β-D-Galactpyranoside（第２試薬）を26μL加えて、1分間の吸光度速度変化を、日本電子（株）JCA-BM 6050型生化学自動分析装置を用いて、主波長410nm、副波長658nmで吸光度を測定することにより求めた。図７にナトリウム濃度と吸光度変化量を示した検量線を示す。24mmol/Lまで原点を通る直線性が得られナトリウムの定量性が認められた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　表１０の測定試薬を用いて以下方法でリチウムの測定を行った。
　希釈緩衝液280μLに全血65μLを添加すると全血中の血漿（約30μL）は約10希釈される。日本電子（株）JCA-BM 6050型生化学自動分析装置を用いて、この希釈血漿を精製水で4.5倍希釈後の5μLにキレート試薬（第１試薬）を55μL加えて、37℃で10分加温し、主波長545nm、副波長596nmで吸光度を測定することにより求めた。
　図９にリチウム濃度と吸光度を示した検量線を示す。1 mmol/Lまで原点を通る直線性が得られリチウムの定量性が認められた。
　グリセロール-3-リン酸を内部標準物質とした時の測定法は、希釈緩衝液280μLに全血65μLを添加すると全血中の血漿（約30μL）は約10希釈される。日本電子（株）JCA-BM 6050型生化学自動分析装置を用いて、この希釈血漿を精製水で4.5倍希釈後の9μLに第１試薬（ペルオキシダーゼ）を50μL加えて、37℃で5分加温し、第二試薬（グリセロール-3-リン酸オキシダーゼ）25μL加えて５分後に、主波長596nm、副波長884nmで吸光度を測定することにより求めた。4 mmol/Lまで原点を通る直線性が得られグリセロール-3-リン酸の定量性が認められた。
　グリセロール-3-リン酸測定法は表１１に示した試薬組成を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
（２）微量血液試料と静脈血漿との相関性
　日本電子（株）JCA-BM 6050型自動分析装置を用いて測定した血漿と希釈血漿の生化学検査項目の測定値の相関図を図１０－１～１０－６に示す。希釈用緩衝液中の内部標準物質（リチウム）の測定吸光度（A）と血漿添加後の内部標準物質の測定吸光度（B）及び142mmol/Lのナトリウム測定吸光度（C）と希釈血漿のナトリウム吸光度（D）を下記の算出式（１）により求めたハイブリッドで希釈倍数（X：８倍希釈）を利用して求めた希釈血漿の生化学検査データ（希釈血漿測定値）をy軸、血漿データ（血漿測定値）をx軸に表示した。各検査項目の血漿測定は常法で行った。また、希釈血漿の測定は常法より試料の容量を増やして最適化した条件で測定を行った。図１０－１～１０－６に示すように生化学検査13項目の相関性は良好であり、微量の血液から元の血漿中の生化学検査データを得ることが可能である。
　　　A ＋ C
X =　-----  　　　　　　　（１）
      B ＋ D
　表１２には内部標準物質（リチウム）及び外部標準物質（ナトリウム）を併用するハイブリッド法での血漿測定値と希釈血漿測定値との相関統計値を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
[実施例３－２]　血漿と希釈血漿の生化学検査項目の測定値の相関
　日本電子（株）JCA-BM 6050型自動分析装置を用いて測定した血漿と希釈血漿の生化学検査項目の測定値の相関を表１３に示す。希釈用緩衝液中の内部標準物質（グリセロール-3-リン酸）の測定吸光度（A）と血漿添加後の内部標準物質の測定吸光度（B）及び142mmol/Lのナトリウム測定吸光度（C）と希釈血漿のナトリウム吸光度（D）を実施例３－１の算出式（１）により求めたハイブリッドで希釈倍数（X：８倍希釈）を利用して求めた希釈血漿の生化学検査データ（希釈血漿測定値）をy軸、血漿データ（血漿測定値）をx軸に表示した。各検査項目の血漿測定は常法で行った。また、希釈血漿の測定は常法より試料の容量を増やして最適化した条件で測定を行った。表１３に示すように生化学検査13項目の相関性は良好であり、微量の血液から元の血漿中の生化学検査データを得ることが可能である。
　表１３には内部標準物質（グリセロール-3-リン酸）及び外部標準物質（ナトリウム）を併用するハイブリッド法での血漿測定値と希釈血漿測定値との相関統計値を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
 [実施例３－３]　内部標準物質（Li)と外部標準物質（Na)の併用による検査データの測定誤差と精度に与える影響
（１）　外部標準物質として血漿ナトリウムを用いる場合の希釈倍数に与える影響
　健常者の血漿ナトリウム濃度は個体内及び個体間の生理的変動は非常に小さく、その基準範囲（正常範囲）は135～145 mmol/Lである。この健常者の中央値である142mmol/Lという値を利用して、血液試料を希釈用緩衝液で希釈し血球を除去して得た希釈血漿中のナトリウム濃度を高感度な酵素法で測定すると0～30 mmol/Lまで精度良く測定ができる。また、基準範囲上下限の135mmol/Lと145 mmol/Lの試料を142 mmol/Lを基準として希釈倍数を補正しても±2％の誤差範囲内で測定ができる。
　しかし、表１４に示すように基準範囲上下限値を超える健常者はそれぞれ全体の2.5％存在するため、136 mmol/Lと148 mmol/Lの血漿ではそれぞれ±4％以上の誤差が生じる問題点がある。リチウムを内部標準物質とする希釈倍数を求める方法とナトリウムを外部標準物質として希釈倍数を求める方法を併用するハイブリッド法においては、表１４に示すように±4％以上の誤差は半分に低減できる。表１４において、希釈倍数の欄の「Na外部標準」は、外部標準物質であるナトリウムの濃度のみに基づいて求めた希釈倍数を示し、「Na-Li補正：ハイブリッド法補正」は、外部標準物質であるナトリウムの濃度及び内部標準物質であるリチウムの濃度の両方に基づいて求めた希釈倍数を示す。「ハイブリッド法補正」における希釈倍数は、実施例３－１の算出式（１）を用いて算出した。ナトリウムのみによる希釈倍数とハイブリッドによる希釈倍数の２つの方法で血漿コレステロールでの測定値に与える誤差を表１４に示した。ハイブリッド法を用いることで誤差が半減することが分かる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
（２）　内部標準物質としてリチウムを用いる場合の希釈倍数に与える影響
　血液を希釈する緩衝液にリチウムを内部標準物質として添加した場合、血液中の血漿量に応じてリチウム濃度が希釈されて、血漿希釈倍数を求める方法は8～10倍程度までは血漿添加量が多いため、添加前と添加後の濃度差が大きく希釈倍数の再現性は変動係数2％以下である。しかし、12～16倍では血漿の添加量が減少するため希釈倍数は変動係数4～5％に上昇する。
　表１５に示すようにハイブリッド法補正による12倍から16倍までの希釈倍数は約3％となり血液が採取しにくい受検者であっても精度の良いデータが得られた。血漿コレステロール210 mg/dlの受検者が16倍希釈の場合、内部標準物質として内部標準物質であるリチウムのみを用いて希釈倍数を算出し、測定値を補正した場合は199～221mg/dlの変動を与えることから高脂血症（220 mg/dl以上）の対象者に判定される。表１５において、「Li内部標準」は、内部標準物質であるリチウムの濃度のみに基づいて求めた希釈倍数を示し、「Na外部標準」は、外部標準物質であるナトリウムの濃度のみに基づいて求めた希釈倍数を示し、「ハイブリッド法補正」は、外部標準物質であるナトリウムの濃度及び内部標準物質であるリチウムの濃度の両方に基づいて求めた希釈倍数を示す。「ハイブリッド法補正」における希釈倍数は、実施例３－１の算出式（１）を用いて算出した。
　一方、内部標準物質としてのリチウムと外部標準物質としてのナトリウムを併用して希釈倍数を算出し測定値による補正した場合では204～216 mg/dlとなり、健常者として判定される。
　従って、ハイブリッド法を用いた補正により、精度の高い測定値を得ることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　血漿希釈倍数を6～16倍における内部標準物質としてリチウムと外部標準ナトリウム及びハイブリット法での希釈倍数に与える再現性（CV%）への影響を表１５に示した。
　ハイブリット法は内部標準法の単独の再現性に比べ良好な再現性を示した。
　本発明は、上記したように対象者の手指等を介して体内から採取した微量かつ未知量の全血試料などの生体試料の血漿及び生体試料中のいずれの成分に対しても簡便かつ正確に定量することができる。また血液の貧血の程度である血球容積比率（ヘマトクリット値）を求めることができる。これにより、対象者自身でも行うことができる、血液等の微量採取にもかかわらず、かつ採取から長時間経過後においても対象者の血液等の採取された生体試料の分析を正確に行うことができる。したがって、対象者の健康診断に有効に利用することができ、産業上の利用性が高い。
　さらに、本発明の微量血液採取方法は血液採取の時間と場所に制限がないため、医療機関に出向く時間がない事例、災害時、遠隔医療、健康管理などに応用でき、未病の人を早期発見できるなど、医療費の節減にも貢献できる。また大量の試料を効率的に市販の生化学自動分析装置で測定できる。測定した検査データはスマートフォンに送信することで日常的に健康管理や疾病の早期発見へのシステムに利用できる。
　１：血液
　２：血漿（血清）
　３：血球
　４：緩衝液
　５：内部標準物
　６：血液希釈溶液

Claims (31)

  1. 　希釈用緩衝液で試料を希釈し、血液中の分析対象成分を定量分析する方法において、内部標準物質及び外部標準物質を用いて血液試料の希釈倍数を算出することを含む、血液試料中の分析対象成分の定量分析方法であって、内部標準物質は希釈用緩衝液に所定濃度添加され、外部標準物質は血液試料中に恒常的に所定の濃度で含まれる成分であり、前記希釈用緩衝液は内部標準物質及び外部標準物質の定量に干渉する成分を含んでおらず、希釈用緩衝液で希釈した血液試料中の内部標準物質濃度と外部標準物質濃度を測定し、これらの測定値に基づいて血液試料の希釈倍数を算出することを含む、血液試料中の分析対象成分の定量分析方法。
  2. 　前記外部標準物質濃度の測定値を用いて、前記内部標準物質濃度の測定値から求めた血液試料の希釈倍数を補正することにより、前記血液試料中の分析対象成分を定量分析する定量分析方法。
  3. 　内部標準物質がアルカリ金属類又はアルカリ土類金属類に属する元素、外部標準物資がナトリウム、クロール、アルブミン及び総タンパク質からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の定量分析方法。
  4. 　内部標準物質がリチウム、又はグリセロール-3-リン酸であり、外部標準物質がナトリウムである、請求項３記載の定量分析方法。
  5. 　希釈用緩衝液が、緩衝剤成分として、2-アミノ-2-メチル-1-プロパノール、2-エチルアミノエタノール、N-メチル-D-グルカミン、ジエタノールアミン及びトリエタノールアミンからなる群から選択されるアミノアルコール化合物、並びにHEPES (2- [4- (2-Hydoxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid)、TES （N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2- aminoethanesulfonic  acid）、MOPS（3-Morpholinopropanesulfonic acid）及び BES（N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid）からなる群から選択される緩衝剤を含み、pH6.5～pH8.0の緩衝作用を有する緩衝液である、請求項１～４のいずれか１項に記載の定量分析方法。
  6. 　希釈用緩衝液が、ナトリウム及びクロールを実質的に含まない、請求項５に記載の定量分析方法。
  7. 　微量血液試料の希釈倍数が以下の算出式（１）～（４）のいずれかの算出式により算出され、希釈血漿中の分析対象成分を定量し、算出式（１）～（４）のいずれかで求めた希釈倍数を乗じて、元の血漿中の分析対象成分を定量する、請求項１～６のいずれか１項に記載の定量分析法：
    算出式（１）
    　　　A ＋ C
    X =　-----  　　　　（１）
          B ＋ D
    ；
    算出式（２）
    　　　√（A2 ＋ C２）
    X =　-------  　　　　（２）
          √（B2 ＋ D2）
    ；
    算出式（３）
    X= a × （B＋D） ± b　　（３）
    [ここで、a及びbは係数であり、あらかじめB+Dと希釈倍数のデータを取得し、X= a × （B＋D） ± bで表される標準曲線を作成しておく]
    ；
    並びに
    算出式（４）
    X＝A/B'　　　　　　　　（４）
    [ここで、B'=(A×D)/Cである]、
    [上記式において、A、B、C、D、B'及びXは以下のように定義される；
    A：内部標準物質を添加した緩衝液中の内部標準物質の吸光度
    B：希釈血漿中の内部標準物質の吸光度
    C：血漿中外部標準物質濃度の正常中央値の吸光度、
    D：希釈血漿中の外部標準物質の吸光度、
    B'：外部標準物質の吸光度から算出した希釈倍数による、希釈血漿中の内部標準物質の吸光度の補正値、及び
    X：血漿希釈倍数
    [ここで、希釈血漿とは、血液試料を希釈用緩衝液で希釈し、血球を除去して得られた血漿をいう]。
  8. 　β-ガラクトシダーゼはナトリウムイオン濃度に応じて酵素活性が変化し、その吸光度変化量からナトリウムイオン濃度を定量できることを利用し、希釈用緩衝液を用いて希釈した血液試料中の外部標準の一つであるナトリウムを以下の方法で測定する請求項１～７のいずれか１項に記載の定量分析方法：
    生体試料を希釈用緩衝液で希釈し、さらに精製水で希釈し、β-ガラクトシダーゼを含む緩衝液である第１試薬を希釈試料量の10～30倍容積量添加し、30～45℃で２～20分加温し、o-Nitrophenyl-β-D-Galactpyranosideを含む基質液である第２試薬を第1試薬量の半量を添加し、生成するo-Nitrophenolを主波長410nm、副波長658nmで吸光度を測定する。
  9. 　請求項１～８に記載の定量分析方法において、微量血液試料の希釈に用いる希釈用緩衝液であって、緩衝剤成分として、2-アミノ-2-メチル-1-プロパノール、2-エチルアミノエタノール、N-メチル-D-グルカミン、ジエタノールアミン及びトリエタノールアミンからなる群から選択されるアミノアルコール化合物、並びにHEPES (2- [4- (2-Hydoxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid)、TES （N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2- aminoethanesulfonic  acid）、MOPS（3-Morpholinopropanesulfonic acid）及び BES（N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid）からなる群から選択される緩衝剤を含み、pH7.4で緩衝作用を有する緩衝液。
  10. 　ナトリウム及びクロールを実質的に含まない、請求項９記載の緩衝液。
  11. 　外部標準物質を用いた定量分析方法に用いられる、請求項９又は１０に記載の緩衝液。
  12. 　内部標準物質を用いた定量分析方法に用いられる、請求項９又は１０に記載の緩衝液。
  13. 　試料血液を入れるための希釈緩衝液を用い、該希釈緩衝液中に含まれる内部標準物質を分析し、血漿又は血清の希釈率を算出し、前記試料血液中の血漿又は血清成分中の生体成分を分析する生体試料成分の分析方法において、前記希釈緩衝液に含まれる内部標準物質が血球内に浸透しない性質を有しており、マルトースを含む２単糖類、グルタミン酸、ロイシン、バリン、イソロイシン、4-ハイドロキシンベンゼン、ハイドロキシ酪酸、クレアチン、リンゴ酸、トリンダー試薬、リチウム、からなる群から選ばれる物質である内部標準物質を用いた生体試料成分の分析方法。
  14. 　希釈緩衝液に含まれる内部標準物質がリチウムである、請求項１３に記載の生体試料成分の分析方法。
  15. 　試料血液を入れるための希釈緩衝液を用い、該希釈緩衝液中に含まれる内部標準物質を分析し、血液の希釈率を算出し、前記試料血液中の血球算定数や血漿の生体成分を分析する生体試料成分の分析方法において、前記希釈緩衝液に含まれる内部標準物質が血球内に浸透する性質を有しており、エタノールアミン、ヘキシルアミン、フェニールエチルアミン、アミールアミン、ヒスタミン、プトレシン、ヒポキサンチン、トリプトファン、プレグレノロン、β-シトステロールからなる群から選ばれる物質である内部標準物質を用いた生体試料成分の分析方法。
  16. 　試料血液を入れるための希釈緩衝液を用い、該希釈緩衝液中に含まれる内部標準物質を分析し、血液又は血漿又は血清の希釈率を算出し、前記試料血液中の血球算定数や血漿の生体成分又は前記試料血液中の血漿又は血清成分中の生体成分を分析する生体試料成分の分析方法において、
    　前記希釈緩衝液は、
    　血球内に浸透しない性質を有する前記内部標準物質であって、リチウム、マルトースを含む２単糖類、グルタミン酸、ロイシン、バリン、イソロイシン、4-ハイドロキシンベンゼン、ハイドロキシ酪酸、クレアチン、リンゴ酸、トリンダー試薬からなる群から選ばれる物質と、
    　血球内に浸透する性質を有する前記内部標準物質であって、エタノールアミン、ヘキシルアミン、フェニールエチルアミン、アミールアミン、ヒスタミン、プトレシン、ヒポキサンチン、トリプトファン、プレグレノロン、β-シトステロールからなる群から選ばれる物質とを含む生体試料成分の分析方法。
  17. 　前記希釈緩衝液に含まれる内部標準物質が分子量500以下の化学物質で分子内に硫酸イオン（-SO3-）、カルボキシルイオン（-COO-）、チオール基（-SH）、第4級アミン（-NH3+）からなる群から選ばれる置換基を持つ化合物から選ばれる内部標準物質である、請求項１３に記載の生体試料成分の分析方法。
  18. 　前記希釈緩衝液に含まれる内部標準物質がADOS(N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3-メトキシアニリン)、ADPS(N-エチル-N-スルホプロピル-3-メトキシアニリン)、ALPS(N-エチル-N-スルホプロピルアニリン)、DAOS(N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3,5-ジメトキシアニリン)、HDAOS(N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3,5-ジメトキシアニリン)、MAOS(N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3,5-ジメチルアニリン)、TOOS(N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3-メトキシアニリン)、TOPS(N-エチル-N-スルホプロピル-3-メチルアニリン)から成る群から選ばれる化合物であるトリンダー試薬である、請求項１３に記載の生体試料成分の分析方法。
  19. 　前記希釈緩衝液は、血液が混合されても前記血球の溶血が生じない試薬組成を有している請求項１３～１８のいずれか１項に記載の生体試料成分の分析方法。
  20. 　前記希釈緩衝液が前記血液中の生体試料成分を変性させることなく、安定に維持できるように、エチレンジアミン四酢酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩などのキレート剤、アミカシン硫酸塩、カナマイシン硫酸塩、チアベンダゾール、アジ化ナトリウムなどの抗菌剤や防腐剤、ピリドキサルリン酸、マグネシウム、亜鉛などの補酵素、マンニトール、デキストロース、オリゴ糖などの糖類、ドデシル硫酸ナトリウム、水銀、ヘパリンからなる群から選択される阻害剤を被測定成分に応じて単独若しくは複数組み合わされた組成の添加物を含む請求項１３～１９のいずれか１項に記載の生体試料成分の分析方法。
  21. 　前記内部標準物質の希釈率から血液の血球容積率（ヘマトクリット値）を算出することを特徴とする請求項１６に記載の生体試料成分の分析方法。
  22. 希釈用緩衝液で微量血液試料を希釈し、血液中の分析対象成分を定量分析する方法において、外部標準物質を用いて血液試料の希釈倍数を算出することを含む、血液試料中の分析対象成分の定量分析方法であって、外部標準物質は血液試料中に恒常的に所定の濃度で含まれる成分であり、前記希釈用緩衝液は外部標準物質の定量に干渉する成分を含んでおらず、希釈用緩衝液で希釈した血液試料中の外部標準物質濃度を測定し、これらの測定値に基づいて血液試料の希釈倍数を算出することを含む、血液試料中の分析対象成分の定量分析方法。
  23. 希釈用緩衝液で希釈した血液試料中の外部標準物質濃度を測定し、これらの測定値に基づいて血液試料の希釈倍数を算出することを含む、血液試料中の分析対象成分の定量分析方法。
  24. 外部標準物資がナトリウム、クロール、アルブミン及び総タンパク質からなる群から選択される、請求項２２又は２３に記載の定量分析方法。
  25. 外部標準物質がナトリウム、クロール、及び総タンパク質からなる群から選択される、、請求項２４記載の定量分析方法。
  26. 希釈用緩衝液が、緩衝剤成分として、2-アミノ-2-メチル-1-プロパノール、2-エチルアミノエタノール、N-メチル-D-グルカミン、ジエタノールアミン及びトリエタノールアミンからなる群から選択されるアミノアルコール化合物、並びにHEPES (2- [4- (2-Hydoxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid)、TES （N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2- aminoethanesulfonic  acid）、MOPS（3-Morpholinopropanesulfonic acid）及び BES（N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid）からなる群から選択される緩衝剤を含み、pH7.4で緩衝作用を有する緩衝液である、請求項２２～２５のいずれか１項に記載の定量分析方法。
  27. 希釈用緩衝液が、ナトリウム及びクロールを実質的に含まない、請求項２２～２６のいずれか１項に記載の定量分析方法。
  28. 微量血液試料の希釈倍数が以下の算出式（Ｉ）の算出式により算出され、希釈血漿中の分析対象成分を定量し、算出式（I）で求めた希釈倍数を乗じて、元の血漿中の分析対象成分を定量する、請求項２２～２７のいずれか１項に記載の定量分析法：
            A
    X = ---------　　　　（I)
            B
    A：血漿中外部標準物質濃度の健常者中央値の吸光度、
    B：希釈血漿中の外部標準物質の吸光度、
    X：血漿希釈倍数
    [ここで、希釈血漿とは、血液試料を希釈用緩衝液で希釈し、血球を除去して得られた血漿をいう]。
  29. β-ガラクトシダーゼはナトリウムイオン濃度に応じて酵素活性が変化し、その吸光度変化量からナトリウムイオン濃度を定量できることを利用し、希釈用緩衝液を用いて希釈した血液試料中のナトリウムを以下の方法で測定する請求項２４～２８のいずれか１項に記載の定量分析方法：
    生体試料を希釈用緩衝液で希釈し、さらに精製水で希釈し、
    β-ガラクトシダーゼを含む緩衝液である第１試薬を試料量の10～30倍容積量添加し、30～45℃で２～20分加温し、o-Nitrophenyl-β-D-Galactpyranosideを含む基質液である第２試薬を第１試薬量の半量を添加し、主波長410nm、副波長658nmで反応速度の吸光度を測定する。
  30. 請求項２２～２９のいずれか１項に記載の定量分析方法において、微量血液試料の希釈に用いる希釈用緩衝液であって、緩衝剤成分として、2-アミノ-2-メチル-1-プロパノール、2-エチルアミノエタノール、N-メチル-D-グルカミン、ジエタノールアミン及びトリエタノールアミンからなる群から選択されるアミノアルコール化合物、並びにHEPES (2- [4- (2-Hydoxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid)、TES （N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2- aminoethanesulfonic  acid）、MOPS（3-Morpholinopropanesulfonic acid）及び BES（N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid）からなる群から選択される緩衝剤を含み、pH7.4で緩衝作用を有する緩衝液。
  31. ナトリウム及びクロールを実質的に含まない、請求項３０記載の緩衝液。
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TW107142776A TWI734053B (zh) 2014-07-25 2016-01-22 經稀釋之活體樣品成分之分析方法
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016118565A (ja) * 2014-07-25 2016-06-30 株式会社リージャー 希釈生体試料成分の分析方法（外部標準法）
EP3564667A4 (en) * 2016-12-28 2019-12-25 Fujifilm Corporation BLOOD ANALYSIS KIT AND BLOOD ANALYSIS METHOD
US11442070B2 (en) * 2016-12-28 2022-09-13 Fujifilm Corporation Blood analysis method and blood test kit

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6495768B2 (ja) * 2015-07-06 2019-04-03 富士フイルム株式会社 血液分析方法及び血液検査キット
JP6789106B2 (ja) * 2016-12-28 2020-11-25 富士フイルム株式会社 血液分析方法及び血液検査キット
JP6789108B2 (ja) * 2016-12-28 2020-11-25 富士フイルム株式会社 血液分析方法及び血液検査キット
US20220065845A1 (en) * 2019-01-07 2022-03-03 1866402 Ontario Limited Blood separation and analysis device and methods
CN110488004A (zh) * 2019-09-26 2019-11-22 北京华科泰生物技术股份有限公司 一种用于检测末梢血的25-羟基维生素d试剂盒及其制备方法和应用
CN110488008A (zh) * 2019-09-26 2019-11-22 北京华科泰生物技术股份有限公司 一种用于检测末梢血的25-羟基维生素d3试剂盒及其制备方法和应用
CN110488003A (zh) * 2019-09-26 2019-11-22 北京华科泰生物技术股份有限公司 一种用于检测末梢血的甲状旁腺激素试剂盒及其制备方法和应用
CN111239120A (zh) * 2020-02-26 2020-06-05 绍兴市人民医院 一种血液钙离子检测试纸
CN113466148A (zh) * 2021-06-18 2021-10-01 铜陵有色金属集团股份有限公司 铜电解液中有效明胶的测试方法
CN115825173A (zh) * 2021-09-18 2023-03-21 艾康生物技术(杭州)有限公司 一种质控液及其应用
CN115078737B (zh) * 2022-06-30 2023-04-28 山东帝俊生物技术有限公司 一种检测狂犬免疫血浆效价的试剂盒及其制备方法、应用
CN116223813A (zh) * 2023-02-23 2023-06-06 深圳市雷诺华科技实业有限公司 一种电化学发光层析法测定心肌肌钙蛋白i的试剂盒及其测定方法
CN116625772A (zh) * 2023-05-25 2023-08-22 安徽九陆生物科技有限公司 一种微量血液过滤的方法及应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006322829A (ja) * 2005-05-19 2006-11-30 Leisure Inc 未定量の生体試料の定量分析方法
JP2011112451A (ja) * 2009-11-25 2011-06-09 Physical Screening Inc 生体試料成分の分析方法

Family Cites Families (60)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3137759A (en) * 1959-09-01 1964-06-16 Technicon Instr Spectral-flame burner apparatus and spectral-flame burners therefor
US4378430A (en) * 1979-09-11 1983-03-29 Modrovich Ivan Endre Method of forming stabilized urease solutions
JPS5920150A (ja) 1982-07-24 1984-02-01 株式会社東芝 血球カウンタ
JPH0233360B2 (ja) * 1982-09-17 1990-07-26 Sekisui Chemical Co Ltd Tanjusannoteiryoho
GR851646B (ja) * 1984-07-05 1985-11-26 Jerald C Nelson
JPS61110058A (ja) * 1984-11-02 1986-05-28 Fuji Photo Film Co Ltd アルカリ性ホスフアタ−ゼ活性測定用一体型多層分析要素
US5252333A (en) * 1987-04-27 1993-10-12 Scotia Holdings Plc Lithium salt-containing pharmaceutical compositions
DE3739284A1 (de) * 1987-11-20 1989-06-01 Boehringer Mannheim Gmbh 1-naphtholphthaleinmonophosphate, verfahren zu deren herstellung sowie deren verwendung zur bestimmung der alkalischen phosphatase
JPH03140844A (ja) 1989-10-26 1991-06-14 Shimadzu Corp 微小試料による多項目分析方法
JPH06148193A (ja) 1992-11-02 1994-05-27 Igaku Seibutsugaku Kenkyusho:Kk 抗リン脂質抗体結合用担体及び該担体を用いた免疫学的測定法
JP3206999B2 (ja) * 1992-12-18 2001-09-10 オリンパス光学工業株式会社 サンプル希釈誤差の検出方法およびそれを用いるサンプル希釈誤差の検出装置
JPH10104226A (ja) 1996-09-30 1998-04-24 Masaki Kobayashi 血液検体採集カード
CN1178701C (zh) * 1997-02-04 2004-12-08 法诺斯技术公司 检测异常上皮细胞脱落的方法
US5998224A (en) * 1997-05-16 1999-12-07 Abbott Laboratories Magnetically assisted binding assays utilizing a magnetically responsive reagent
IL124099A (en) * 1998-04-15 2001-03-19 Univ Ben Gurion Method for diagnosing bipolar disorder and predicting the response of bipolar disorder patients to lithium therapy
KR100608276B1 (ko) * 1998-08-24 2006-08-02 무라마쯔 다카시 동맥경화 및 ｐｔｃａ술후의 혈관 재협착에 대한예방·치료제
JP4194158B2 (ja) 1998-12-25 2008-12-10 株式会社三菱化学ヤトロン 尿素窒素測定方法および尿素窒素測定用試薬
US7011977B2 (en) * 1999-01-30 2006-03-14 Sigma-Tau Pharmaceuticals, Inc. Quantification of carnitine levels in dialysis patients
US6936473B2 (en) 2000-01-05 2005-08-30 Leisure, Inc. Method of preparing a biological sample for quantification
ATE335838T1 (de) * 2000-01-19 2006-09-15 Univ York Methode zur beurteilung der lebensfähigkeit einer zelle
JP3643011B2 (ja) 2000-05-18 2005-04-27 アークレイ株式会社 定量分析法
AU2002224336B2 (en) 2000-09-25 2007-01-04 Picoliter Inc. Acoustic ejection of fluids from a plurality of reservoirs
EP1270041A1 (en) * 2001-06-22 2003-01-02 Universite De Geneve Device for non-invasively determining the relative levels of two substances present in a biological system
TWI247615B (en) * 2003-09-22 2006-01-21 Leisure Inc Apparatus for separating biological sample and separating method of the same
CN100456028C (zh) * 2003-11-28 2009-01-28 宝山钢铁股份有限公司 测量铁矿石总铁含量用的氧化钴内标试剂的制造方法
CN1786186A (zh) * 2004-12-10 2006-06-14 苏州艾杰生物科技有限公司 酶法测定钠离子含量的方法及钠离子诊断试剂盒
CN1786187A (zh) * 2004-12-10 2006-06-14 苏州艾杰生物科技有限公司 酶法测定钾离子含量的方法及钾离子诊断试剂盒
CN1693881A (zh) * 2005-02-06 2005-11-09 浙江亚克药业有限公司 偶联酶促反应测定腺苷脱氨酶的方法和试剂盒
US7541190B2 (en) * 2005-02-07 2009-06-02 Beckman Coulter, Inc. Method of measurement of cellular hemoglobin
GB2430437A (en) * 2005-09-27 2007-03-28 3M Innovative Properties Co Method of making a fluoropolymer
ATE433675T1 (de) * 2006-10-13 2009-07-15 Gervais Danone Sa Neue zusammensetzung zur verbesserung des hautzustandes und verfahren zu ihrer herstellung
CN101169427A (zh) * 2006-10-24 2008-04-30 苏州艾杰生物科技有限公司 钾诊断/测定试剂盒及钾浓度测定方法
CN101173929A (zh) * 2006-10-30 2008-05-07 苏州艾杰生物科技有限公司 钠诊断/测定试剂盒及钠的浓度测定方法
CN101173930A (zh) * 2006-10-30 2008-05-07 苏州艾杰生物科技有限公司 钠诊断/测定试剂盒及钠的浓度测定方法
CN101210930A (zh) * 2006-12-27 2008-07-02 中国科学院沈阳应用生态研究所 一种测定血清中镁含量的方法
US7955867B2 (en) * 2007-01-31 2011-06-07 Millipore Corporation High throughput cell-based assays, methods of use and kits
JP4940430B2 (ja) * 2007-02-19 2012-05-30 国立大学法人 千葉大学 グルタミン酸の定量方法及びグルタミン酸定量装置。
CN101464299A (zh) * 2007-12-19 2009-06-24 苏州艾杰生物科技有限公司 钾(离子)诊断/测定试剂盒及钾(离子)的浓度测定方法
CN101464355A (zh) * 2007-12-19 2009-06-24 苏州艾杰生物科技有限公司 钠(离子)诊断/测定试剂盒及钠(离子)浓度测定方法
JP5630750B2 (ja) 2008-03-18 2014-11-26 国立大学法人 岡山大学 興奮性化学伝達調節剤およびそのスクリーニング法
US8283165B2 (en) 2008-09-12 2012-10-09 Genvault Corporation Matrices and media for storage and stabilization of biomolecules
CN101475988A (zh) * 2009-02-03 2009-07-08 戴立忠 一种实时荧光定量pcr实验内标的设计方法
ES2578479T3 (es) * 2009-04-28 2016-07-27 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Método de medición que usa sustancia de patrón interno
CN101813675B (zh) * 2010-04-13 2012-11-14 上海市公安局刑事侦查总队 检测全血、尿中吗啡类生物碱的lc-ms/ms分析方法
CN102234333A (zh) * 2010-05-08 2011-11-09 国家海洋环境监测中心 滴滴涕代谢物dda的多抗血清制备及快速检测方法建立
US20120277999A1 (en) * 2010-10-29 2012-11-01 Pbd Biodiagnostics, Llc Methods, kits and arrays for screening for, predicting and identifying donors for hematopoietic cell transplantation, and predicting risk of hematopoietic cell transplant (hct) to induce graft vs. host disease (gvhd)
CN106226527B (zh) 2011-07-21 2018-05-04 和光纯药工业株式会社 血浆中氨基酸分析用内标液、内标物质及血浆中氨基酸的定量方法
US20140234988A1 (en) * 2011-08-18 2014-08-21 Medizinische Universitaet Graz Methods for Diagnosing and Treating Medical Conditions Associated With Oxidative Stress
CN102424852B (zh) * 2011-12-27 2014-04-02 戴立忠 实时荧光定量pcr检测方法
US20130186450A1 (en) * 2012-01-23 2013-07-25 Seldon Energy Partners, LLC Solar Power System
JP5100903B1 (ja) * 2012-04-06 2012-12-19 Ａｋｊグローバルテクノロジー株式会社 リチウム試薬組成物、それを用いたリチウムイオン測定方法及び測定装置
CN102621267B (zh) * 2012-04-09 2014-08-06 江苏省中医院 一种测定血浆或尿液中d-山梨醇浓度的方法
CN102706815B (zh) * 2012-05-25 2014-07-02 中国航空工业集团公司北京航空材料研究院 一种测定纯Hf中痕量元素钠的方法
CN102735664B (zh) * 2012-06-18 2014-12-10 中国科学院化学研究所 钾离子浓度检测方法
CN102866148B (zh) 2012-06-18 2015-07-08 中国科学院化学研究所 钾离子浓度检测方法
JP5920150B2 (ja) 2012-09-28 2016-05-18 ブラザー工業株式会社 画像形成装置
JP5222432B1 (ja) 2012-11-07 2013-06-26 Ａｋｊグローバルテクノロジー株式会社 リチウム測定方法
US9169509B2 (en) * 2013-01-15 2015-10-27 Board Of Regents, The University Of Texas System Topoisomerase 2b as a predictor of susceptibility to anthracycline-induced cardiotoxicity
CN103323308B (zh) 2013-05-23 2016-01-06 北京博晖创新光电技术股份有限公司 一种处理微量全血的试剂及其应用
WO2016013115A1 (ja) 2014-07-25 2016-01-28 株式会社 リージャー 希釈生体試料成分の分析方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006322829A (ja) * 2005-05-19 2006-11-30 Leisure Inc 未定量の生体試料の定量分析方法
JP2011112451A (ja) * 2009-11-25 2011-06-09 Physical Screening Inc 生体試料成分の分析方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MISATO MOMII ET AL.: "Teyubi Saiketsu ni yoru Kishaku Shiryochu no Seitai Seibun Sokutei ni Okeru Naibu Hyojun Busshitsu no Sokuteiho Kaihatsu", JOURNAL OF ANALYTICAL BIO- SCIENCE, vol. 35, no. 1, 10 February 2012 (2012-02-10), pages 84, XP008185550 *
SHIN'YA SUGIMOTO ET AL.: "2 tsu no Naibu Hyojun Kishakuho o Mochiita Seikagaku Komoku to Hematocrit no Sokutei", JOURNAL OF ANALYTICAL BIO- SCIENCE, vol. 35, no. 1, 10 February 2012 (2012-02-10), pages 85 *
SHIN'YA SUGIMOTO ET AL.: "Development of the Fingertip Blood Dilution Method for Blood Cell Counting", THE JAPANESE JOURNAL OF CLINICAL PATHOLOGY, vol. 62, no. 3, 25 March 2014 (2014-03-25), pages 235 - 240, XP008185401 *
SHIN'YA SUGIMOTO ET AL.: "Teyubi Saiketsu ni yoru Naibu Hyojun Tenka Kishaku Kessho o Mochiita Seikagaku Kensa to Hematocrit-chi no Sokutei", RINSHO KAGAKU, vol. 40, no. issue 1, 31 July 2011 (2011-07-31), pages 222, XP008185400 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016118565A (ja) * 2014-07-25 2016-06-30 株式会社リージャー 希釈生体試料成分の分析方法（外部標準法）
US10712354B2 (en) 2014-07-25 2020-07-14 Leisure, Inc. Method of analyzing diluted biological sample component
US11808777B2 (en) 2014-07-25 2023-11-07 Leisure, Inc. Method of analyzing diluted biological sample component
US11808776B2 (en) 2014-07-25 2023-11-07 Leisure, Inc. Method of analyzing diluted biological sample component
EP3564667A4 (en) * 2016-12-28 2019-12-25 Fujifilm Corporation BLOOD ANALYSIS KIT AND BLOOD ANALYSIS METHOD
US11166659B2 (en) 2016-12-28 2021-11-09 Fujifilm Corporation Blood test kit and blood analysis method
US11442070B2 (en) * 2016-12-28 2022-09-13 Fujifilm Corporation Blood analysis method and blood test kit

Also Published As

Publication number Publication date
EP3309548A1 (en) 2018-04-18
TWI734053B (zh) 2021-07-21
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