JP5403052B2 - 内部標準物質を用いた測定方法 - Google Patents

Description

本発明は、内部標準物質を用いた測定対象物質の測定方法に関する。

キャピラリー電気泳動法において内部標準物質１種を用い、そのピークを先端マーカーとして、測定対象物質のおおよその位置を特定することは、従来なされていた(特許文献１)。しかし、内部標準物質１種のみを用いた場合、測定条件や試料中の夾雑物の影響により、内部標準物質と測定対象物質のピークの位置関係に変動が生じる。そのため、精度良く測定対象物質の位置を特定する場合、分子量マーカーが用いられてきた。

測定対象物質がDNAやRNAの場合、高分子量側と低分子量側の２種の分子量マーカーを用いて測定を行うことも知られている。この場合に用いられる分子量マーカーは、DNA又はRNAであり、その塩基数を基に設定される。即ち、DNAやRNAを電気泳動した場合、分子量マーカーの位置を正確に設定することで、２つの分子量マーカーとの位置関係により分子量を求めることができていた。しかしながら、ここで用いられる分子量マーカーは、インターカレーターにより標識されたDNA又はRNA等であり、安定性が悪い、血清試料を用いた場合に試料中の物質と反応する、バックグラウンドが上がる、分子量マーカーのピークがブロードになる等の問題を有していた。

一方、測定対象物質がタンパク質や化合物の場合、測定対象物質の分子量や電荷によりその移動度が異なるため、通常内部標準物質は１つしか用いられておらず、その目的も測定対象物質のおよその位置の特定のために用いているものであった。そのため、このようなタンパク質や化合物の測定する場合において、上記DNAやRNAの測定の際の問題を有さずに、タンパク質や化合物を精度良く特定できる測定方法の開発が現在望まれていた。

特に、マイクロチップ電気泳動のような微細なキャピラリーを用いて電気泳動を行う場合、微細であるが故に同じ条件で行ってもチップを代えると物質の移動時間も変化することがあった。その為、目的のピークを特定するのが困難な場合も多々見られていた。更に、このような測定法の場合、高感度測定が可能となるため、測定に影響を及ぼさず且つ感度よく測定し得る内部標準物質を用いることが必須であった。そのため、上記のような条件下で測定物質のピークを特定する測定方法の開発も望まれていた。

特開平２００７−２４６１０号公報

本発明は、測定対象物質がタンパク質や化合物である電気泳動法における、内部標準物質を用いた測定方法の提供を課題とする。

本発明者らは、上記状況に鑑み、測定対象物質をタンパク質や化合物とした場合の内部標準物質を用いたキャピラリー電気泳動法による測定方法の開発を鋭意研究した結果、内部標準物質として、アニオン基をその分子内に３個以上有する化合物と該化合物のアニオン基の１〜３個がカチオン基に置換された化合物の組み合わせ、或いは、カチオン基をその分子内に３個以上有する化合物と該化合物のカチオン基の１〜３個がアニオン基に置換された化合物の組み合わせを内部標準物質として用いることにより、測定対象物質がタンパク質や化合物であっても容易に測定対象物質のピークを特定し得るようになることを見出した。即ち、マイナスからプラス方向へ泳動させるキャピラリー電気泳動法においては、アニオン基をその分子内に３個以上有する化合物は早い時間にピークが検出され、カチオン基をその分子内に有する化合物は遅い時間にピークが検出されるため、この分子内にアニオン基を３個以上有する化合物と該化合物のアニオン基又はカチオン基の１〜３個を反対の荷電としたものを用いることにより、測定対象物質を２つの内部標準物質の間となるように調整することができ、これにより測定対象物質のピークを容易に同定し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は、
「(1)アニオン基をその分子内に３個以上有する化合物、及び、該化合物のアニオン基の１〜３個がカチオン基に置換された化合物の組合せ、或いは、(2)カチオン基をその分子内に３個以上有する化合物、及び、該化合物のカチオン基の１〜３個がアニオン基に置換された化合物の組合せを内部標準物質として用いて、測定対象物質のピークを同定することを特徴とする、キャピラリー電気泳動法による測定対象物質の測定方法」に関する。

本発明によれば、隣接する複数のピークがあっても測定対象物質を容易に且つ精度よく特定することを可能とする。また、ここで用いられる標識物質は、試料中の物質と反応することがなく、バックグラウンドを上げる等の影響を及ぼすことがないため、微量成分の分析においても精度よく測定することを可能とする。

実施例１におけるDNA標識抗体の調製方法を示した図である。 実施例１におけるキャピラリーチップのレイアウトを示した図である。 実施例１におけるキャピラリーチップの泳動用試料と試液の配置関係を模式的に示した図である。 実施例１において、本発明の方法により、ＡＦＰを測定した時のエレクトロフェログラムである。 実施例１において、本発明の方法により、PIVKA IIを測定した時のエレクトロフェログラムである。

［本発明に係るアニオン基をその分子内に３個以上有する化合物（以下、本発明に係るアニオン基含有化合物と略記する場合がある。）］
本発明に係るアニオン基含有化合物としては、その分子内にアニオン基を通常３〜１０個有するものであり、５〜８個を有するものが好ましく、５〜６個を有するものがより好ましく、５個を有するものが特に好ましい。上記のような化合物は、マイナスからプラス方向に電気泳動させた場合、泳動速度が速くなるため、通常何れの測定対象物質よりも早い時間にピークが検出され、有用な内部標準物質として用いることができる。上記アニオン基としては、例えば、−ＨＰＯ₄ ^-、−ＮＯ₃ ^-、−ＣｌＯ₄ ^-、−ＣＯＯ^-、−ＳＯ₃ ^-が挙げられるが、中でも−ＣＯＯ^-、−ＳＯ₃ ^-が好ましい。−ＣＯＯ^-は、反応性が高いため、カチオン基を導入するのに適しており、−ＳＯ₃ ^-は、蛍光強度を高めることができるので、上記本発明に係るアニオン基含有化合物を蛍光検出する際には該基を有していることが好ましい。なお、上記アニオン基の具体例は、電気泳動時（泳動溶液に溶解されている時）にアニオン基になるものであればよく、水素イオンと結合した酸や、アルカリ金属塩（例えばリチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、ルビジウム塩）、アンモニウム塩、有機アンモニウム塩（例えばトリメチルアンモニウム塩、トリエチルアンモニウム塩、トリプロピルアンモニウム塩）等の塩であってもよい。

本発明に係るアニオン基含有化合物の具体例としては、例えば一般式［１］で示される化合物又はその塩

［式中、Ｒ^１〜Ｒ^６は夫々独立して、アミド結合を有していてもよい、−ＣＯＯ^-又は−ＳＯ₃ ^-を置換基として有する又は無置換のアルキル基を表し、
Ｒ^７〜Ｒ¹⁰は夫々独立して、アルキル基、アルキニル基、アリール基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、置換アミノ基、−ＣＯＯ^-、−ＳＯ₃ ^-、ハロゲン原子、水素原子、水酸基、シアノ基若しくはニトロ基を表し、
Ｒ¹¹は、水素原子、アルキル基、アルキニル基若しくはアリール基を表し、
ｎは０〜３の整数を表す。
但し、Ｒ^１〜Ｒ¹¹のうち３個の基は−ＣＯＯ^-、−ＳＯ₃ ^-であるか、或いはこれらを置換基として有する基である。］
が挙げられる。上記一般式［１］で示される化合物又はその塩は、635nm付近に励起波長を有する蛍光物質であり、また、キャピラリー電気泳動で泳動した場合ピーク形状がシャープとなるものであり、蛍光検出によるキャピラリー電気泳動測定において特に有用な内部標準物質となる。

一般式［１］中の、Ｒ^１〜Ｒ⁶で示されるアルキル基の置換基としての−ＣＯＯ^-又は−ＳＯ₃ ^-及びＲ⁷〜Ｒ¹⁰で示される−ＣＯＯ^-又は−ＳＯ₃ ^-は、電気泳動時（泳動溶液に溶解されている時）にアニオン基になるものであればよく、水素イオンと結合したカルボン酸（−ＣＯＯＨ）やスルホン酸（−ＳＯ₃Ｈ）等の酸や、アルカリ金属塩（例えばリチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、ルビジウム塩）、アンモニウム塩、有機アンモニウム塩（例えばトリメチルアンモニウム塩、トリエチルアンモニウム塩、トリプロピルアンモニウム塩）等の塩であってもよい。

一般式［１］中のＲ^１〜Ｒ^６で示される、アミド結合を有していてもよい、−ＣＯＯ^-又は−ＳＯ₃ ^-を置換基として有する又は無置換のアルキル基のアルキル基としては、直鎖状、分枝状或いは環状の何れでもよいが、直鎖状が好ましく、通常炭素数１〜１０、好ましくは１〜６、より好ましくは１〜５のものが挙げられ、具体的には、例えばメチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、n-ペンチル基、イソペンチル基、sec-ペンチル基、tert-ペンチル基、ネオペンチル基、n-ヘキシル基、イソヘキシル基、sec-ヘキシル基、tert-ヘキシル基、ネオヘキシル基、n-ヘプチル基、イソヘプチル基、sec-ヘプチル基、tert-ヘプチル基、ネオヘプチル基、n-オクチル基、イソオクチル基、sec-オクチル基、tert-オクチル基、ネオオクチル基、n-ノニル基、イソノニル基、sec-ノニル基、tert-ノニル基、ネオノニル基、n-デシル基、イソデシル基、sec-デシル基、tert-デシル基、ネオデシル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基、シクロノニル基、シクロデシル基等が挙げられ、中でも、例えばメチル基、エチル基、n-プロピル基、n-ペンチル基等の直鎖状のアルキル基が好ましい。

Ｒ^１〜Ｒ^６で示される、アミド結合を有していてもよい、−ＣＯＯ^-又は−ＳＯ₃ ^-を置換基として有する又は無置換のアルキル基のアルキル基としては、アミド結合を有さない、置換又は無置換アルキル基、或いは置換又は無置換アルキル基のアルキル鎖中にアミド結合を通常１〜１０個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１個含有しているものが挙げられる。

アミド結合を有していてもよい無置換アルキル基の好ましい具体例としては、例えば下記一般式［５９］

（式中、Ｒ²¹は水素原子又はアルキル基を表し、Ｔ_１及びｋ個のＴ_２はアルキレン基を表し、ｋは０〜１０の整数を表す。）で示される基が挙げられる。

一般式［５９］中のＲ²¹で示されるアルキル基としては、直鎖状、分枝状或いは環状の何れでもよく、通常炭素数１〜１０、好ましくは１〜６のものが挙げられ、具体的には、例えばメチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、ネオブチル基、n-ペンチル基、イソペンチル基、sec-ペンチル基、tert-ペンチル基、ネオペンチル基、n-ヘキシル基、イソヘキシル基、sec-ヘキシル基、tert-ヘキシル基、ネオヘキシル基、n-ヘプチル基、イソヘプチル基、sec-ヘプチル基、tert-ヘプチル基、ネオヘプチル基、n-オクチル基、イソオクチル基、sec-オクチル基、tert-オクチル基、ネオオクチル基、n-ノニル基、イソノニル基、sec-ノニル基、tert-ノニル基、ネオノニル基、n-デシル基、イソデシル基、sec-デシル基、tert-デシル基、ネオデシル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基、シクロノニル基、シクロデシル基等が挙げられる。

Ｔ_１及びｋ個のＴ_２で示されるアルキレン基としては、直鎖状、分枝状或いは環状の何れでもよく、通常炭素数２〜１０、好ましくは２〜８のものが挙げられ、具体的には、例えばメチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、ペンタメチレン基、ヘキサメチレン基、ヘプタメチレン基、オクタメチレン基、ノナメチレン基、デカメチレン基等の直鎖状アルキレン基、例えばエチリデン基、プロピレン基、イソプロピリデン基、1-メチルトリメチレン基、2-メチルトリメチレン基、1,1-ジメチルエチレン基、1,2-ジメチルエチレン基、エチルエチレン基、1-メチルテトラメチレン基、1,1-ジメチルトリメチレン基、2,2-ジメチルトリメチレン基、2-エチルトリメチレン基、1-メチルペンタメチレン基、2-メチルペンタメチレン、1,3-ジメチルテトラメチレン、3-エチルテトラメチレン、1-メチルヘキサメチレン基、1-メチルヘプタメチレン基、1,4-ジエチルテトラメチレン基、2,4-ジメチルヘプタメチレン基、1-メチルオクタメチレン基、1-メチルノナメチレン基等の分枝状アルキレン基、例えばシクロプロピレン基，1,3-シクロブチレン基、1,3-シクロペンチレン基、1,4-シクロへキシレン基、1,5-シクロヘプチレン基、1,5-シクロオクチレン基、1,5-シクロノニレン基、1,6-シクロデシレン基等の環状アルキレン基等が挙げられる。

ｋは、通常０〜１０の整数、好ましくは０〜３の整数、より好ましくは０又は１である。

上記一般式［１］中のＲ¹〜Ｒ⁶の具体例の中でも−ＣＯＯ^-又は−ＳＯ₃ ^-を置換基として有する又は無置換のアルキル基が特に好ましい。より好ましい具体例としては、Ｒ^１及びＲ^２は、夫々独立して、−ＣＯＯ^-又は−ＳＯ₃ ^-を置換基として有するアルキル基であり、より好ましくは、−ＣＯＯ^-又は−ＳＯ₃ ^-を置換基として有する炭素数１〜５のアルキル基である。Ｒ^３及びＲ^４は、その何れか一方が、−ＣＯＯ^-又は−ＳＯ₃ ^-を置換基として有するアルキル基、好ましくは、−ＣＯＯ^-又は−ＳＯ₃ ^-を置換基として有する炭素する１〜５のアルキル基であり、他方が、無置換のアルキル基、好ましくは無置換の炭素する１〜５のアルキル基である。Ｒ^５及びＲ^６は、その何れか一方が、−ＣＯＯ^-又は−ＳＯ₃ ^-を置換基として有するアルキル基、好ましくは、−ＣＯＯ^-又は−ＳＯ₃ ^-を置換基として有する炭素数１〜５のアルキル基であり、他方が、無置換のアルキル基、好ましくは無置換の炭素する１〜５のアルキル基である。

一般式［１］中のＲ^７〜Ｒ¹⁰で示されるアルキル基としては、直鎖状、分枝状或いは環状の何れでもよく、通常炭素数１〜６、好ましくは１〜３のものが挙げられ、具体的には、例えばメチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、n-ペンチル基、イソペンチル基、sec-ペンチル基、tert-ペンチル基、ネオペンチル基、n-ヘキシル基、イソヘキシル基、sec-ヘキシル基、tert-ヘキシル基、ネオヘキシル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等が挙げられる。

Ｒ^７〜Ｒ¹⁰で示されるアルキニル基としては、通常炭素数２〜６、好ましくは２〜４のものが挙げられ、具体的には、例えばエチニル基、2-プロピニル基、3-ブチニル基、1-メチル-2-プロピニル基、4-ペンチニル基、2-メチル-4-ペンチニル基、5-ヘキシニル基等が挙げられる。

Ｒ^７〜Ｒ¹⁰で示されるアリール基としては、通常炭素数６〜１０のものが挙げられ、具体的には、例えばフェニル基、ナフチル基等が挙げられる。

Ｒ^７〜Ｒ¹⁰で示されるアルコキシ基としては、直鎖状、分枝状或いは環状の何れでもよく、通常炭素数１〜６、好ましくは１〜３のものが挙げられ、具体的には、例えばメトキシ基、エトキシ基、n-プロポキシ基、イソプロポキシ基、n-ブトキシ基、イソブトキシ基、sec-ブトキシ基、tert-ブトキシ基、n-ペンチルオキシ基、イソペンチルオキシ基、sec-ペンチルオキシ基、tert-ペンチルオキシ基、ネオペンチルオキシ基、n-ヘキシルオキシ基、イソヘキシルオキシ基、sec-ヘキシルオキシ基、tert-ヘキシルオキシ基、ネオヘキシルオキシ基、シクロプロポキシ基、シクロペンチルオキシ基、シクロヘキシルオキシ基等が挙げられる。

Ｒ^７〜Ｒ¹⁰で示されるアリールオキシ基としては、通常炭素数６〜１０のものが挙げられ、具体的には、例えばフェニルオキシ基、ナフトキシ基等が挙げられる。

Ｒ^７〜Ｒ¹⁰で示されるアルキルスルホニル基のアルキルスルホニル基としては、スルホ基（−ＳＯ₂ＯＨ）の−ＯＨ基がアルキル基で置換されたものが挙げられ、直鎖状、分枝状或いは環状の何れでもよく、通常炭素数１〜６のものが挙げられ、具体的には、例えばメチルスルホニル基、エチルスルホニル基、n-プロピルスルホニル基、イソプロピルスルホニル基、n-ブチルスルホニル基、イソブチルスルホニル基、sec-ブチルスルホニル基、tert-ブチルスルホニル基、n-ペンチルスルホニル基、イソペンチルスルホニル基、sec-ペンチルスルホニル基、tert-ペンチルスルホニル基、ネオペンチルスルホニル基、n-ヘキシルスルホニル基、イソヘキシルスルホニル基、sec-ヘキシルスルホニル基、tert-ヘキシルスルホニル基、ネオヘキシルスルホニル基、シクロプロピルスルホニル基、シクロブチルスルホニル基、シクロペンチルスルホニル基、シクロヘキシルスルホニル基等が挙げられる。

Ｒ^７〜Ｒ¹⁰で示されるアリールスルホニル基としては、スルホ基（−ＳＯ₂ＯＨ）の−ＯＨ基がアリール基で置換されたものが挙げられ、直鎖状、分枝状或いは環状の何れでもよく、通常炭素数６〜１０のものが挙げられ、具体的には、例えばフェニルスルホニル基、ナフチルスルホニル基等が挙げられる。

Ｒ^７〜Ｒ¹⁰で示されるハロゲン原子としては、例えばフッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。

Ｒ^７〜Ｒ¹⁰で示される置換アミノ基としては、アミノ基の水素原子１〜２個が置換基で置換されたものが挙げられ、これら置換基としては、例えばアルキル基、アルコキシカルボニル基、アシル基、スルホ基等が挙げられる。

Ｒ^７〜Ｒ¹⁰で示される置換アミノ基の置換基として挙げられるアルキル基としては、直鎖状、分枝状或いは環状の何れでもよく、通常炭素数１〜１０、好ましくは１〜６のものが挙げられ、具体的には、例えばメチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、n-ペンチル基、イソペンチル基、sec-ペンチル基、tert-ペンチル基、ネオペンチル基、n-へキシル基、イソヘキシル基、sec-ヘキシル基、tert-ヘキシル基、ネオヘキシル基、n-ヘプチル基、イソヘプチル基、sec-ヘプチル基、tert-ヘプチル基、ネオヘプチル基、n-オクチル基、イソオクチル基、sec-オクチル基、tert-オクチル基、ネオオクチル基、n-ノニル基、イソノニル基、sec-ノニル基、tert-ノニル基、イソノニル基、n-デシル基、イソデシル基、sec-デシル基、tert-デシル基、ネオデシル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基、シクロノニル基、シクロデシル基等が挙げられる。

Ｒ^７〜Ｒ¹⁰で示される置換アミノ基の置換基として挙げられるアルコキシカルボニル基としては、直鎖状、分枝状或いは環状の何れでもよく、通常炭素数１〜１０、好ましくは１〜６のものが挙げられ、具体的には、例えばメトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、n-プロポキシカルボニル基、イソプロポキシカルボニル基、n-ブトキシカルボニル基、イソブトキシカルボニル基、sec-ブトキシカルボニル基、tert-ブトキシカルボニル基、n-ペンチルオキシカルボニル基、イソペンチルオキシカルボニル基、sec-ペンチルオキシカルボニル基、tert-ペンチルオキシカルボニル基、ネオペンチルオキシカルボニル基、n-ヘキシルオキシカルボニル基、イソヘキシルカルボニル基、sec-ヘキシルオキシカルボニル基、tert-ヘキシルオキシカルボニル基、ネオヘキシルオキシカルボニル基、n-ヘプチルオキシカルボニル基、イソヘプチルオキシカルボニル基、sec-ヘプチルオキシカルボニル基、tert-ヘプチルオキシカルボニル基、ネオヘプチルオキシカルボニル基、n-オクチルオキシカルボニル基、イソオクチルオキシカルボニル基、sec-オクチルオキシカルボニル基、tert-オクチルオキシカルボニル基、ネオオクチルオキシカルボニル基、n-ノニルオキシカルボニル基、イソノニルオキシカルボニル基、sec-ノニルオキシカルボニル基、tert-ノニルオキシカルボニル基、ネオノニルオキシカルボニル基、n-デシルオキシカルボニル基、イソデシルオキシカルボニル基、sec-デシルオキシカルボニル基、tert-デシルオキシカルボニル基、ネオデシルオキシカルボニル基、シクロプロポキシカルボニル基、シクロブトキシカルボニル基、シクロペンチルオキシカルボニル基、シクロヘキシルオキシカルボニル基、シクロヘプチルオキシカルボニル基、シクロオクチルオキシカルボニル基、シクロノニルオキシカルボニル基、シクロデシルオキシカルボニル基等が挙げられる。

Ｒ^７〜Ｒ¹⁰で示される置換アミノ基の置換基として挙げられるアシル基としては、例えば脂肪族カルボン酸由来のもの、芳香族カルボン酸由来のもの等が挙げられる。

当該脂肪族カルボン酸由来のアシル基としては、直鎖状、分枝状或いは環状でもよく、また更に鎖中に二重結合を有していてもよく、通常炭素数２〜２０、好ましくは炭素数２〜１５、より好ましくは２〜１０、更に好ましくは２〜６のものが挙げられ、具体的には、例えばアセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、バレリル基、イソバレリル基、ピバロイル基、ヘキサノイル基、ヘプタノイル基、オクタノイル基、デカノイル基、ラウロイル基、ミリストイル基、パルミトイル基、ステアロイル基、イコサノイル基、アクリロイル基、メタクリロイル基、クロトノイル基、オレオイル基等が挙げられる。

当該芳香族カルボン酸由来のアシル基としては、通常炭素数７〜１５、好ましくは７〜１１のものが挙げられ、具体的には、例えばベンゾイル基、ナフトイル基、アントイル基等が挙げられる。

上記一般式［１］中のＲ^７〜Ｒ¹⁰の具体例の中でも−ＣＯＯ^-又は−ＳＯ₃ ^-又は水素原子が特に好ましい。より好ましい具体例としては、Ｒ^７〜Ｒ¹⁰の中の３つが水素原子であり、残りの一つが−ＣＯＯ^-又は−ＳＯ₃ ^-、好ましくは−ＳＯ₃ ^-のものである。

一般式［１］中のＲ¹¹で示されるアルキル基としては、直鎖状、分枝状或いは環状の何れでもよいが、直鎖状が好ましく、通常炭素数１〜１０、好ましくは１〜６、より好ましくは１〜３のものが挙げられ、具体的には、例えばメチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、n-ペンチル基、イソペンチル基、sec-ペンチル基、tert-ペンチル基、ネオペンチル基、n-へキシル基、イソヘキシル基、sec-ヘキシル基、tert-ヘキシル基、ネオヘキシル基、n-ヘプチル基、イソヘプチル基、sec-ヘプチル基、tert-ヘプチル基、ネオヘプチル基、n-オクチル基、イソオクチル基、sec-オクチル基、tert-オクチル基、ネオオクチル基、n-ノニル基、イソノニル基、sec-ノニル基、tert-ノニル基、イソノニル基、n-デシル基、イソデシル基、sec-デシル基、tert-デシル基、ネオデシル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基、シクロノニル基、シクロデシル基等が挙げられる。

Ｒ¹¹で示されるアルキニル基としては、通常炭素数２〜６、好ましくは２〜４のものが挙げられ、具体的には、例えばエチニル基、2-プロピニル基、3-ブチニル基、1-メチル-2-プロピニル基、4-ペンチニル基、2-メチル-4-ペンチニル基、5-ヘキシニル基等が挙げられる。

Ｒ¹¹で示されるアリール基としては、通常炭素数６〜１０のものが挙げられ、具体的には、例えばフェニル基、ナフチル基等が挙げられる。

上記一般式［１］中のＲ¹¹の具体例の中でもアルキル基が特に好ましい。

一般式［１］中のｎは、通常０〜３の整数、好ましくは１又は２、より好ましくは２である。

一般式［１］に於けるＲ^１〜Ｒ¹¹のうち少なくとも３個の基は、−ＣＯＯ^-、−ＳＯ₃ ^-であるか、或いは−ＣＯＯ^-、−ＳＯ₃ ^-を置換基として有するものであるが、−ＣＯＯ^-又は−ＣＯＯ^-を置換基として有する基が少なくとも１個あり、−ＳＯ₃ ^-又は−ＳＯ₃ ^-を置換基として有する基が少なくとも２個あることが好ましく、−ＣＯＯ^-又は−ＣＯＯ^-を置換基として有する基が１個、−ＳＯ₃ ^-又は−ＳＯ₃ ^-を置換基として有する基が４個が特に好ましい。

本発明の化合物［１］の中でも、例えば下記一般式［１ａ］

（式中、Ｒ^1a〜Ｒ^6aは夫々独立して−ＣＯＯ^-又は−ＳＯ₃ ^-を置換基として有する又は無置換のアルキル基を表し、Ｒ^8aは、−ＳＯ₃ ^-を表し、Ｒ^11aはアルキル基を表し、ｎは前記に同じ。但し、Ｒ^1a〜Ｒ^6aのうち２個の基は−ＣＯＯ^-、−ＳＯ₃ ^-であるか、或いはこれらを置換基として有する基である。）で示されるものが好ましい。

一般式［１ａ］に於いて、Ｒ^1a〜Ｒ^6aで示される−ＣＯＯ^-又は−ＳＯ₃ ^-を置換基として有する又は無置換のアルキル基のアルキル基としては、前記一般式［１］に於けるＲ^１〜Ｒ^６で示される、アミド結合を有していてもよい、置換又は無置換アルキル基のアルキル基の例示と同様のものが挙げられ、好ましいものも同じである。

Ｒ^1a及びＲ^2aは、夫々独立して、−ＣＯＯ^-又は−ＳＯ₃ ^-を置換基として有するアルキル基が好ましく、−ＣＯＯ^-又は−ＳＯ₃ ^-を置換基として有する炭素数１〜５のアルキル基がより好ましい。

Ｒ^3a及びＲ^4aは夫々独立して−ＣＯＯ^-又は−ＳＯ₃ ^-を置換基として有する又は無置換のアルキル基であるが、中でもその一方が−ＣＯＯ^-又は−ＳＯ₃ ^-を置換基として有するアルキル基であり、他方がアルキル基であるものが好ましく、一方が−ＣＯＯ^-又は−ＳＯ₃ ^-を置換基として有する炭素数１〜５のアルキル基であり、他方が炭素数１〜５のアルキル基であるものがより好ましい。

Ｒ^5a及びＲ^6aは夫々独立して−ＣＯＯ^-又は−ＳＯ₃ ^-を置換基として有する又は無置換のアルキル基であるが、中でもその一方が−ＣＯＯ^-又は−ＳＯ₃ ^-を置換基として有するアルキル基であり、他方がアルキル基であるものが好ましく、一方が−ＣＯＯ^-又は−ＳＯ₃ ^-を置換基として有する炭素数１〜５のアルキル基であり、他方が炭素数１〜５のアルキル基であるものがより好ましい。

Ｒ^11aで示されるアルキル基としては、前記一般式［１］に於けるＲ¹¹で示されるアルキル基の例示と同様のものが挙げられ、好ましいものも同じである。

一般式［１a］に於けるＲ^1a〜Ｒ^6aのうち少なくとも２個の基は、−ＣＯＯ^-、−ＳＯ₃ ^-であるか、或いは−ＣＯＯ^-、−ＳＯ₃ ^-を置換基として有するものであるが、−ＣＯＯ^-又は−ＣＯＯ^-を置換基として有する基が少なくとも１個あり、−ＳＯ₃ ^-又は−ＳＯ₃ ^-を置換基として有する基が少なくとも１個あることが好ましく、−ＣＯＯ^-又は−ＣＯＯ^-を置換基として有する基が１個、−ＳＯ₃ ^-又は−ＳＯ₃ ^-を置換基として有する基が３個が特に好ましい。

一般式［１］の好ましい具体例としては、例えば

が挙げられ、中でも

が好ましい。

［本発明に係るアニオン基含有化合物の合成方法］
上記一般式［１］は、例えば国際公開公報ＷＯ２００７／１１４３９８号公報記載の方法に準じて適宜合成される。

［本発明に係るアニオン基含有化合物のアニオン基の１〜３個がカチオン基に置換された化合物（以下、本発明に係るカチオン基導入化合物と略記する場合がある。）]
本発明に係るカチオン基導入化合物は、本発明に係るアニオン基含有化合物と骨格は同じでそのアニオン基の１〜３個、好ましくは１〜２個をカチオン基に置換したものであり、これにより、マイナスからプラス方向に電気泳動させた場合、本発明に係るアニオン基含有化合物より泳動時間を遅らせることが可能となる。即ち、測定対象物質の泳動時間に応じてアニオン基１〜３個をカチオン基に置換した化合物と本発明に係るアニオン基含有化合物と本発明に係るカチオン基導入化合物とを適宜組み合わせて内部標準物質として用いた場合、測定対象物質のピークを２つの内部標準物質のピークの間に位置させることが可能となる。

上記カチオン基の具体例としては、例えば、下記一般式［103］

（式中、Ｒ¹⁰²〜Ｒ¹⁰⁴は夫々独立して水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基を表し、Ｒ¹⁰²〜Ｒ¹⁰⁴のうちの２〜３個の基とそれらが結合する窒素原子とでヘテロ環状アンモニウムカチオン基を形成していてもよい。）で示される基が挙げられる。

一般式［103］で示される基中のＲ¹⁰²〜Ｒ¹⁰⁴で示される炭素数１〜３のアルキル基としては、直鎖状又は分枝状の何れでもよいが、直鎖状が好ましく、具体的には、例えばメチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基等が挙げられるが、メチル基、エチル基が好ましく、メチル基がより好ましい。

Ｒ¹⁰²〜Ｒ¹⁰⁴のうちの２〜３個の基とそれらが結合する窒素原子とで形成されるヘテロ環状アンモニウムカチオン基としては、例えばピリジニオ基、ピペリジニオ基、炭素数１〜３のアルキル置換ピリジニオ基が挙げられる。

一般式［103］で示される基の具体例としては、ジエチルアンモニウム基、ジメチルアンモニウム基、メチルエチルアンモニウム基、トリメチルアンモニウム基、トリエチルアンモニウム基、ジエチルメチルアンモニウム基、エチルジメチルアンモニウム基、
ピリジニオ基、ピペリジニオ基、N-メチルピペリジニウム基、N-エチルピペリジニウム基、N-n-プロピルピペリジニウム基、N-イソプロピペルピリジニウム基等が挙げられるが、中でもジエチルアンモニウム基、ジメチルアンモニウム基が好ましく、ジメチルアンモニウム基が好ましい。

一般式［103］を末端に含む基の具体例としては例えば、下記一般式［101］

（式中、Ｒ¹⁰¹〜Ｒ¹⁰⁴は上記と同じ）で示される基が挙げられる。一般式［101］で示される基は、例えば−ＣＯＯ^-に下記一般式［102］

（式中、Ｒ¹⁰¹〜Ｒ¹⁰⁴は上記と同じ。ｍは２〜６の整数を表す。）で示される化合物を反応させることにより得られ、このように反応させることで、アニオン基をカチオン基に置換することができる。

一般式［101］及び[102]中の、Ｒ¹⁰¹〜Ｒ¹⁰⁴で示される炭素数１〜３のアルキル基のアルキル基は、上記一般式［103］で示される基におけるＲ¹⁰²〜Ｒ¹⁰⁴で示される炭素数１〜３のアルキル基と同じであり、その好ましいものも同じである。

Ｒ¹⁰²〜Ｒ¹⁰⁴のうちの２〜３個の基とそれらが結合する窒素原子とで形成されるヘテロ環状アンモニウムカチオン基としては、例えばピリジニオ基、ピペリジニオ基、例えばN-メチルピペリジニオ基、N-エチルピペリジニオ基、N-n-プロピルピペリジニオ基、N-イソプロピペルピリジニオ基等の炭素数１〜３のアルキル置換ピリジニオ基が挙げられる。

一般式［101］及び[102]中のｍは通常２〜６であり、２〜４が好ましく、２が特に好ましい。

一般式［101］で示される基の好ましい具体例としては、例えばジメチルアンモニオエチルカルバモイル基、トリメチルアンモニオエチルカルバモイル基、ジエチルアンモニオエチルカルバモイル基、トリエチルアンモニオエチルカルバモイル基、ジメチルアンモニオプロピルカルバモイル基、トリメチルアンモニオプロピルカルバモイル基、ジイソプロピルアンモニオプロピルカルバモイル基、トリイソプロピルアンモニオプロピルカルバモイル基、ピリジニオエチルカルバモイル基、ピリジニオプロピルカルバモイル基、メチルピペリジニオエチルカルバモイル基、メチルピペリジニオプロピルカルバモイル基、エチルピペリジニオエチルカルバモイル基、エチルピペリジニオプロピルカルバモイル基等が挙げられ、中でもジメチルアンモニオエチルカルバモイル基、ジエチルアンモニオエチルカルバモイル基が好ましく、更にジメチルアンモニオエチルカルバモイル基がより好ましい。

本発明に係るカチオン基導入化合物としては、例えば一般式［１’］で示される化合物又はその塩

〔式中、Ｒ^1’〜Ｒ^6’は夫々独立して、一般式［101］

（式中、Ｒ¹⁰¹〜Ｒ¹⁰⁴は夫々独立して水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基を表し、ｍは２〜６の整数を表す。）で示される基を置換基として有するアルキル基、或いは、アミド結合を有していてもよい、−ＣＯＯ^-又は−ＳＯ₃ ^-を置換基として有する若しくは無置換アルキル基を表し、
Ｒ^7’〜Ｒ^10’は夫々独立して、アルキル基、アルキニル基、アリール基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、置換アミノ基、−ＣＯＯ^-、−ＳＯ₃ ^-、ハロゲン原子、水素原子、水酸基、シアノ基若しくはニトロ基を表し、
Ｒ^11’は、水素原子、アルキル基、アルキニル基若しくはアリール基を表し、ｎは０〜３の整数を表す。
但し、Ｒ^１’〜Ｒ^６’のうち少なくとも１つは一般式［101］で示される基を置換基として有するアルキル基である。〕が挙げられる。

上記一般式［１’］で示される化合物又はその塩は、635nm付近に励起波長を有する蛍光物質であり、また、キャピラリー電気泳動で泳動した場合ピーク形状がシャープとなるものであり、蛍光検出によるキャピラリー電気泳動測定において特に有用な内部標準物質となる。

一般式［１’］中の、Ｒ^１’〜Ｒ^6’で示されるアルキル基の置換基としての−ＣＯＯ^-又は−ＳＯ₃ ^-及びＲ^7’〜Ｒ^10’で示される−ＣＯＯ^-又は−ＳＯ₃ ^-は、電気泳動時（泳動溶液に溶解されている時）にアニオン基になるものであればよく、水素イオンと結合したカルボン酸（−ＣＯＯＨ）やスルホン酸（−ＳＯ₃Ｈ）等の酸や、アルカリ金属塩（例えばリチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、ルビジウム塩）、アンモニウム塩、有機アンモニウム塩（例えばトリメチルアンモニウム塩、トリエチルアンモニウム塩、トリプロピルアンモニウム塩）等の塩であってもよい。

一般式［１’］中のＲ^1’〜Ｒ^6’で示される、一般式［101］で示される基を置換基として有するアルキル基、及び、アミド結合を有していてもよい、−ＣＯＯ^-又は−ＳＯ₃ ^-を置換基として有する若しくは無置換アルキル基のアルキル基としては、一般式［１］中のＲ^１〜Ｒ^６で示される、アミド結合を有していてもよい、−ＣＯＯ^-又は−ＳＯ₃ ^-を置換基として有する又は無置換のアルキル基のアルキル基と同じものが挙げられ、好ましいものも同じである。

一般式［１’］中のＲ^1’〜Ｒ^6’の好ましい具体例は、一般式［101］で示される基を置換基として有するアルキル基、或いは、−ＣＯＯ^-又は−ＳＯ₃ ^-を置換基として有する又は無置換アルキル基が挙げられる。より好ましい具体例としては、Ｒ^1’及びＲ^2’は、一方が−ＣＯＯ^-又は−ＳＯ₃ ^-を置換基として有するアルキル基、好ましくは−ＳＯ₃ ^-を置換基として有するアルキル基であり、より好ましくは、−ＳＯ₃ ^-を置換基として有する炭素数１〜５のアルキル基であり、他方が、一般式［101］で示される基を置換基として有するアルキル基、好ましくは一般式［101］で示される基を置換基として有する炭素数１〜５のアルキル基である。Ｒ^3’及びＲ^4’は、その何れか一方が、−ＣＯＯ^-又は−ＳＯ₃ ^-を置換基として有するアルキル基、好ましくは、−ＣＯＯ^-又は−ＳＯ₃ ^-を置換基として有する炭素する１〜５のアルキル基であり、他方が、無置換のアルキル基、好ましくは無置換の炭素する１〜５のアルキル基である。Ｒ^5’及びＲ^6’は、その何れか一方が、−ＣＯＯ^-又は−ＳＯ₃ ^-を置換基として有するアルキル基、好ましくは、−ＣＯＯ^-又は−ＳＯ₃ ^-を置換基として有する炭素数１〜５のアルキル基であり、他方が、無置換のアルキル基、好ましくは無置換の炭素する１〜５のアルキル基である。

一般式［１’］中のＲ^7’〜Ｒ^10’で示される、アルキル基、アルキニル基、アリール基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、置換アミノ基、−ＣＯＯ^-、−ＳＯ₃ ^-及びハロゲン原子の具体例及び好ましいものは、一般式［１］中のＲ⁷〜Ｒ¹⁰で記載したものと同じである。また、一般式［１’］中のＲ^7’〜Ｒ^10’の好ましい具体例としては、−ＣＯＯ^-、−ＳＯ₃ ^-又は水素原子が挙げられる。より好ましい具体例としては、Ｒ^7’〜Ｒ^10’の中の３つが水素原子であり、残りの一つが−ＣＯＯ^-又は−ＳＯ₃ ^-、好ましくは−ＳＯ₃ ^-のものである。

一般式［１’］中のＲ^11’で示されるアルキル基、アルキニル基及びアリール基の具体例及び好ましいものは、一般式［１］中のＲ¹¹で記載したものと同じである。また、一般式［１’］中のＲ^11’の好ましい具体例としては、アルキル基が挙げられる。

一般式［１’］中のｎは、通常０〜３の整数、好ましくは１又は２、より好ましくは２である。

一般式［１’］に於いて、Ｒ^1’〜Ｒ^6’のうち少なくとも１つは一般式［101］で示される基を置換基として有するアルキル基であるが、Ｒ^１’〜Ｒ^６’のうちの１つが、一般式［101］で示される基を置換基として有するアルキル基であるのが好ましく、Ｒ^１’が一般式［101］で示される基を置換基として有するアルキル基であるのが特に好ましい。なお、本発明に係るアニオン基含有化合物が一般式［１］で示される化合物であって、その化合物が−ＣＯＯ^-を置換基として有するアルキル基含む場合には、その−ＣＯＯ^-を一般式［101］で示される基を置換して、一般式［101］で示される基を置換基として有するアルキル基とするのが好ましい。

一般式［１’］に於いて、Ｒ^1’〜Ｒ^11’のうち少なくとも２個の基は、−ＣＯＯ^-、−ＳＯ₃ ^-であるか、或いはこれらを置換基として有する基であるのが好ましく、３個の基が、−ＣＯＯ^-、−ＳＯ₃ ^-であるか、或いはこれらを置換基として有する基であるのがより好ましく、３個の基が−ＳＯ₃ ^-であるか或いはこれを置換基として有する基であるのが特に好ましい。

本発明の化合物［１’］の中でも、例えば下記一般式［１a’］

（式中、Ｒ^1a’〜Ｒ^6a’は夫々独立して一般式［101］

（式中、Ｒ¹⁰¹〜Ｒ¹⁰⁴は上記と同じ。）で示される基を置換基として有するアルキル基、或いは、アミド結合を有していてもよい、−ＣＯＯ^-又は−ＳＯ₃ ^-を置換基として有する若しくは無置換アルキル基を表し、
Ｒ^8a'は、−ＳＯ₃ ^-を表し、Ｒ^11ａ'はアルキル基を表し、ｍは前記に同じ。
但し、Ｒ^１’〜Ｒ^６’のうち少なくとも１つは一般式［101］で示される基を置換基として有するアルキル基である。）で示されるものが好ましい。

一般式［１ａ’］中のＲ^1a’〜Ｒ^6a’で示される、一般式［101］で示される基を置換基として有するアルキル基、或いは、アミド結合を有していてもよい、−ＣＯＯ^-又は−ＳＯ₃ ^-を置換基として有する又は無置換のアルキル基のアルキル基としては、一般式［１’］中のＲ^1’〜Ｒ^6’で示される、アミド結合を有していてもよい、−ＣＯＯ^-又は−ＳＯ₃ ^-を置換基として有する又は無置換のアルキル基のアルキル基と同じものが挙げられ、好ましいものも同じである。

Ｒ^1a’及びＲ^2a’は、一方が−ＣＯＯ^-又は−ＳＯ₃ ^-を置換基として有するアルキル基、好ましくは−ＳＯ₃ ^-を置換基として有するアルキル基であり、他方が、一般式［101］で示される基を置換基として有するアルキル基であるものが好ましく、一方が−ＳＯ₃ ^-を置換基として有する炭素数１〜５のアルキル基であり、他方が、一般式［101］で示される基を置換基として有する炭素数１〜５のアルキル基であるものがより好ましい。

Ｒ^3a’及びＲ^4a’は夫々独立して−ＣＯＯ^-又は−ＳＯ₃ ^-を置換基として有する又は無置換のアルキル基が挙げられるが、中でもその一方が−ＣＯＯ^-又は−ＳＯ₃ ^-を置換基として有するアルキル基であり、他方が無置換アルキル基であるものが好ましく、一方が−ＣＯＯ^-又は−ＳＯ₃ ^-を置換基として有する炭素数１〜５のアルキル基であり、他方が炭素数１〜５のアルキル基であるものがより好ましい。

Ｒ^5a’及びＲ^6a’は夫々独立して−ＣＯＯ^-又は−ＳＯ₃ ^-を置換基として有する又は無置換のアルキル基が挙げられるが、中でもその一方が−ＣＯＯ^-又は−ＳＯ₃ ^-を置換基として有するアルキル基であり、他方がアルキル基であるものが好ましく、一方が−ＣＯＯ^-又は−ＳＯ₃ ^-を置換基として有する炭素数１〜５のアルキル基であり、他方が炭素数１〜５のアルキル基であるものがより好ましい。

Ｒ^11a’で示されるアルキル基としては、前記一般式［１］に於けるＲ¹¹で示されるアルキル基の例示と同様のものが挙げられ、好ましいものも同じである。

一般式［１a’］に於いて、Ｒ^１a’〜Ｒ^６a’のうち少なくとも１個の基は一般式［101］で示される基を置換基として有するアルキル基であり、少なくともＲ^１a’が一般式［101］で示される基を置換基として有するアルキル基であることが好ましい。

一般式［１a’］に於いて、Ｒ^１a’〜Ｒ^6a’のうち少なくとも１個の基は、−ＣＯＯ^-、−ＳＯ₃ ^-であるか、或いはこれらを置換基として有する基であるのが好ましく、２個の基が、−ＣＯＯ^-、−ＳＯ₃ ^-であるか、或いはこれらを置換基として有する基であるのがより好ましく、２個の基が−ＳＯ₃ ^-であるか或いはこれを置換基として有する基であるのが特に好ましい。

一般式［１a’］中のｎは、通常０〜３の整数、好ましくは１又は２である。

一般式［１’］の好ましい具体例としては、例えば

が挙げられ、中でも

が好ましい。

［本発明に係るカチオン基導入化合物の合成方法]
一般式［１’］の合成は、例えばインドレニン化合物とピラゾール化合物を用いて、下記方法によって合成し得る。

（式中、Ｒ^17’はアルキル基又はアリール基を表し、Ｒ^1’〜Ｒ^11’及びｎは前記に同じ。）
一般式［１０］及び［１１］に於いて、Ｒ^17’で示されるアルキル基としては、直鎖状、分枝状或いは環状の何れでもよく、通常炭素数１〜１０、好ましくは１〜３のものが挙げられ、具体的には、例えばメチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、n-ペンチル基、イソペンチル基、sec-ペンチル基、tert-ペンチル基、ネオペンチル基、n-ヘキシル基、イソヘキシル基、sec-ヘキシル基、tert-ヘキシル基、ネオヘキシル基、n-ヘプチル基、イソヘプチル基、sec-ヘプチル基、tert-ヘプチル基、ネオヘプチル基、n-オクチル基、イソオクチル基、sec-オクチル基、tert-オクチル基、ネオオクチル基、n-ノニル基、イソノニル基、sec-ノニル基、tert-ノニル基、ネオノニル基、n-デシル基、イソデシル基、sec-デシル基、tert-デシル基、ネオデシル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基、シクロノニル基、シクロデシル基等が挙げられる。

Ｒ^17’で示されるアリール基としては、通常炭素数６〜１０のものが挙げられ、具体的には、例えばフェニル基、ナフチル基等が挙げられる。

即ち、先ず、一般式［８］で示されるインドレニン化合物（インドレニン骨格部分）、一般式［９］で示される化合物〔一般式［８］で示される化合物に対して１〜２倍モル〕及び一般式［１０］で示される酸無水物〔一般式［８］で示される化合物に対して１〜２０倍モル〕（例えば無水酢酸、無水プロピオン酸、無水酪酸、安息香酸無水物等）を、必要ならば溶媒（例えば、酢酸、プロピオン酸、酪酸等のカルボン酸類、例えばアセトニトリル、プロピオニトリル、ｎ-ブチロニトリル等のニトリル類等）に溶解し、０〜１５０℃（好ましくは４０〜１２０℃）で０．１〜２４時間（好ましくは０．５〜１２時間、より好ましくは１〜８時間）で反応させることにより一般式［１１］で示される化合物が得られた。

次いで、一般式［１１］で示される化合物及び一般式［１２］で示される化合物（ピラゾール骨格部分）〔一般式［１１］で示される化合物に対して０．５〜１０倍モル、好ましくは１〜５倍モル〕を、塩基性触媒（例えばピリジン、トリエチルアミン、N,N-ジメチルアニリン、ピペリジン、ピリジン、4-ジメチルアミノピリジン、1,5-ジアザビシクロ[4.3.0]ノナ-5-エン、1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ-7-エン、トリ-n-ブチルアミン等の有機アミン類、例えば水素化ナトリウム等の金属水素化物類、例えばn-ブチルリチウム等の塩基性アルカリ金属化合物類等）の存在下、脱水縮合剤〔例えば濃硫酸、五酸化二リン、無水塩化亜鉛等の無機脱水剤類、例えばジシクロヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピルカルボジイミド)塩酸塩等のカルボジイミド類、無水酢酸、ポリリン酸、カルボニルジイミダゾール、p-トルエンスルホニルクロライド等〕を用いて、必要ならば溶媒（例えばN,N-ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、N,N-ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、アセトアミド、Ｎ-メチルピロリドン等のアミド類、例えばアセトニトリル、プロピオニトリル、ｎ-ブチロニトリル等のニトリル類、例えばメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、エチレングリコール、1,4-ブタンジオール等のアルコール類、例えばテトラヒドロフラン、ジオキサン、アニソール、エチレングリコールモノエチルエーテル等のエーテル類、例えばジメチルスルホキシド等のスルホキシド類）中で０〜１５０℃（好ましくは４０〜１２０℃）で０．１〜２４時間（好ましくは０．５〜１２、より好ましくは１〜８時間）で反応させ、目的物である一般式［１’］で示される化合物が得られる。

本発明に係る一般式［１０１］で示される基を導入する方法を、一般式［１’］で示される化合物のうち、一般式［２４］で示される化合物〔即ち、一般式［１’］に於けるＲ^1’が一般式［１０１］で示される基（但し、Ｒ¹⁰⁴が水素原子である場合に相当）を置換基として有するアルキル基である化合物に相当）を合成する場合を例にとって以下に説明する。

（式中、Ｔ₁₂はアルキレン基を表し、Ａはテトラフルオロボレート又はヘキサフルオロホスフェートを表し、ｑは２〜１０の整数を表し、Ｒ^3’〜Ｒ^11’、Ｒ^12’、Ｒ¹⁰¹〜Ｒ¹⁰³、Ａ、ｍ及びｎは前記に同じ。）
尚、一般式［２２］で示される化合物は、一般式［１’］で示される化合物のうち、Ｒ^1’が一般式［２］で示される基を置換基として有するアルキル基（即ち、−Ｔ₁₂−ＣＯＯＲ¹²基に相当）である場合の化合物に相当する。

一般式［２２］〜［２４］に於いて、Ｔ₁₂で示されるアルキレン基としては、直鎖状又は分枝状でもよく、好ましくは直鎖状のものであり、通常炭素数１〜６、好ましくは１〜４のものであり、具体的には、例えばメチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、テトラメチレン基、ヘキサメチレン基等の直鎖状アルキレン基、例えばエチリデン基、プロピレン基、イソプロピリデン基、エチルエチレン基、1,2-ジメチルエチレン基、1,2-ジエチルエチレン基、1,2-ジ-n-プロピルエチレン基、1,2-ジ-n-ブチルエチレン基等の分枝状アルキレン基等が挙げられ、中でも直鎖状アルキレン基が好ましく、就中、エチレン基、ペンタメチレン基等がより好ましい。

即ち、一般式［２２］で示される化合物を、例えば一般式［６２］で示される化合物等のスクシンイミド化試薬（一般式［２２］で示される化合物に対して１〜１０倍モル）と塩基性触媒（例えばN-エチルジイソプロピルアミン、ピリジン、トリエチルアミン、N,N-ジメチルアニリン、ピペリジン、4-ジメチルアミノピリジン、1,5-ジアザビシクロ[4.3.0]ノナ-5-エン、1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ-7-エン、トリ-n-ブチルアミン等の有機アミン類等）の存在下、適当な溶媒（例えばＤＭＦ、ＤＭＡ、アセトアミド、N-メチルピロリドン等のアミド類等）中、０〜４０℃で０．１〜１２時間反応させることにより、一般式［２３］で示される化合物が得られる。

次いで、一般式［２３］で示される化合物と、例えば一般式［１０２］で示されるカチオン化試薬（一般式［２３］で示される化合物に対して１〜５倍モル）を適当な溶媒（例えばＤＭＦ、ＤＭＡ、アセトアミド、N-メチルピロリドン等のアミド類等）中、０〜４０℃で０．１〜１２時間反応させることにより、一般式［２４］で示される化合物が得られる。

本発明に係るスクシンイミド化試薬としては、上記一般式［６２］で示される化合物に限らず、通常この分野で用いられるものが全て挙げられ、具体的には、例えばジ（N-スクシンイミジル）カルボネート（ＤＳＣ）、2-スクシンイミド-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＳＴＵ）、2-（5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシミド）-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＮＴＵ）等が挙げられる。また、スクシンイミド化反応を行う場合には、適宜塩基性触媒（例えばトリエチルアミン、N-エチルジイソプロピルアミン、ピリジン、N,N-ジメチルアニリン、ピペリジン、4-ジメチルアミノピリジン、1,5-ジアザビシクロ[4.3.0]ノナ-5-エン、1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ-7-エン、トリ-n-ブチルアミン等の有機アミン類等）の存在下で反応させてもよい。

一般式［８］で示される化合物（インドレニン骨格部分）の合成法を以下に説明する。

（式中、Ｘはハロゲン原子を表し、Ｒ^1’、Ｒ^3’、Ｒ^4’及びＲ^7’〜Ｒ^10’は前記に同じ。）
一般式［１６］に於いて、Ｘで示されるハロゲン原子としては、例えばフッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。

即ち、一般式［１３］で示されるケトン化合物及び一般式［１４］で示される化合物を適当な溶媒中（例えば酢酸、プロピオン酸等のカルボン酸類、例えばエチレングリコール、1,4-ブタンジオール等のアルコール類等）で、４０〜２５０℃で０．１〜２４時間反応させることにより、一般式［２１］で示される化合物が得られる（例えばJournal of Organic Chemistry, 42(14), 2474~80, 1977等）。

次いで、一般式［１５］で示される化合物を一般式［１６］で示されるハロゲン化化合物）又は一般式［１７］で示されるトシレート化合物とを、適当な溶媒中（例えばクロロベンゼン、1,2-ジクロロベンゼン等のハロゲン化芳香族炭化水素類、例えば1,2-ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類、例えばトルエン、キシレン、ベンゼン等の芳香族炭化水素類、例えばＤＭＡ、ＤＭＦ、アセトアミド、N-メチルピロリドン等のアミド類等）に溶解し、４０〜２００℃で１〜２４時間反応させることにより一般式［８］で示されるインドレニン化合物が得られる（例えばJ. Chem. Soc., Perkin Trans.1. 947~952. 1984等）。

一般式［１３］で示されるケトン化合物は、市販品（例えば3-メチル-2-ブタノン、3-メチル-2-ペンタノン、3-メチル-2-ヘキサノン、１-シクロプロピルエタノン、1-シクロブチルエタノン等）を用いてもよいし、常法により適宜合成されたものを用いてもよい。該ケトン化合物の合成例としては、例えば2-メチルアセト酢酸エチルと脱離基（例えばハロゲン原子、トシレート基等）を有する化合物を塩基性触媒（例えば水素化ナトリウム、水素化カリウム等の金属水素化物類、例えば炭酸リチウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等のアルカリ金属炭酸塩、例えばナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウムtert-ブトキシド等のアルカリ金属アルコキシド類等、例えばn-ブチルリチウム等の塩基性アルカリ金属化合物類、例えばリチウムジイソプロピルアミド等のアルカリ金属アミド類等）の存在下、適当な溶媒（例えばＤＭＦ、ＤＭＡ、アセトアミド、Ｎ-メチルピロリドン等のアミド類、例えばメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、エチレングリコール等のアルコール類、例えばテトラヒドロフラン、ジオキサン、エチレングリコールモノエチルエーテル等のエーテル類、例えばジメチルスルホキシド等のスルホキシド類等）中、−８０〜１００℃で０．１〜２４時間反応させ、次いで、得られた溶液を、酸触媒を用いて脱炭酸を行う方法（例えばModern Synthetic Reactions, California, 2 nd ed.,p.492, 510, 756 (1972)等参照）等が挙げられる。

一般式［１４］で示される化合物は、市販品を用いてもよいし、常法により適宜合成されたものを用いてもよい。

一般式［１２］で示される化合物（ピラゾール骨格部分）の合成法を以下に説明する。

（式中、Ｒ^2’、Ｒ^5’〜Ｒ^6’、Ｒ^11’及びＸは前記に同じ。）
即ち、一般式［１８］で示されるジケトン化合物とヒドラジンを、適当な溶媒（例えばメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、エチレングリコール等のアルコール類等）中、６０〜１００℃で１〜４時間脱水反応させ、一般式［２６］で示される４Ｈ−ピラゾール化合物が得られる（例えばAdv. Heterocycle. Chem. Vol.34. 53~78. 1983等）。

次いで、一般式［１９］で示される４Ｈ−ピラゾール化合物を一般式［２０］で示されるハロゲン化化合物又は一般式［２１］で示されるトシレート化合物とを、適当な溶媒（例えばクロロベンゼン、1,2-ジクロロベンゼン等のハロゲン化芳香族炭化水素類、例えば1,2-ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類、例えばトルエン、キシレン、ベンゼン等の芳香族炭化水素類、例えばＤＭＦ、ＤＭＡ、アセトアミド、N-メチルピロリドン等のアミド類等）中、８０〜１４０℃で１〜１２時間でN-アルキル化反応させ、一般式［１２］で示される化合物が得られる（例えばJ. Chem. Soc., Perkin Trans.1. 947~952. 1984等）。

一般式［１８］で示されるジケトン化合物は、市販品（例えば3,3-ジメチル-2,4-ペンタンジオン等）を用いてもよいし、常法により適宜合成されたものを用いてもよい。該ケトン化合物の合成例としては、例えば3-メチル-2,4-ペンタンジオンや4-アセチル-5-オキソヘキサン酸エチルエステルを脱離基（例えばハロゲン原子、トシレート基等）を有する化合物を塩基性触媒（例えば水素化ナトリウム、水素化カリウム等の金属水素化物類、例えば炭酸リチウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等のアルカリ金属炭酸塩、例えばナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウムtert-ブトキシド等のアルカリ金属アルコキシド類、例えばn-ブチルリチウム等の塩基性アルカリ金属化合物類、例えばリチウムジイソプロピルアミド等のアルカリ金属アミド類等）の存在下、適当な溶媒（例えばＤＭＦ、ＤＭＡ、アセトアミド、Ｎ-メチルピロリドン等のアミド類、例えばメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、エチレングリコール等のアルコール類、例えばテトラヒドロフラン、ジオキサン、エチレングリコールモノエチルエーテル等のエーテル類、例えばジメチルスルホキシド等のスルホキシド類等）中、−８０〜１００℃で０．１〜２４時間反応させる方法（例えばModern Synthic Reactions, California, 2 nd ed.,p.492, 510, 756 (1972)等）等が挙げられる。

［本発明に係るカチオン基をその分子内に３個以上有する化合物（以下、本発明に係るカチオン基含有化合物と略記する場合がある）]
本発明に係るカチオン基含有化合物としては、その分子中にカチオン基を通常３〜１０個有するものであり、５〜８個を有するものが好ましく、５〜６個を有するものがより好ましい。上記のような化合物は、プラスからマイナス方向に電気泳動させた場合、泳動速度が速くなるため、何れの測定対象物質よりも早い時間にピークが検出され、有用な内部標準物質として用いることができる。上記カチオン基としては、例えば、ジメチルアンモニウムイオン、ジエチルアンモニウムイオン、トリメチルアンモニウムイオン等のアンモニウムイオン等が挙げられる。

［本発明に係るカチオン基含有化合物のカチオン基の１〜３個がアニオン基に置換された化合物（以下、本発明に係るアニオン基導入化合物と略記する場合がある。）］
本発明に係るアニオン基導入化合物は、本発明に係るカチオン基含有化合物と骨格は同じでそのカチオン基の１〜３個をアニオン基に置換したものであり、これにより、プラスからマイナス方向に電気泳動させた場合、本発明に係るカチオン基含有化合物より泳動時間を遅らせることが可能となる。即ち、測定対象物質の泳動時間に応じてカチオン基１〜３個をアニオン基に置換することにより、本発明に係るカチオン基含有化合物と本発明に係るアニオン基導入化合物とを組み合わせて内部標準物質として用いた場合、測定対象物質のピークを２つの内部標準物質のピークの間に位置させることが可能となる。

［本発明の測定方法］
本発明の測定方法は、上記の如き本発明に係る、(1)アニオン基含有化合物とカチオン基導入化合物との組合せ、及び、(2)カチオン基含有化合物とアニオン基導入化合物との組合せを内部標準物質として用いる方法であるが（以下、上記化合物の組合せを総称して本発明に係る内部標準物質として略記する場合がある）、本発明に係るアニオン基含有化合物と本発明に係るカチオン基導入化合物の組合せを用いるのが好ましい。なお、上記組合せを内部標準物質とするのであれば、上記組合せに更に内部標準物質を１種以上加えてもよい。即ち、例えば、本発明に係るアニオン基含有化合物１種と本発明に係るカチオン基導入化合物２種の組み合わせ、本発明に係るアニオン基含有化合物２種と本発明に係るカチオン基導入化合物１種の組み合わせ、本発明に係るカチオン基含有化合物２種と本発明に係るアニオン基導入化合物１種の組み合わせ、本発明に係るカチオン基含有化合物１種と本発明に係るアニオン基導入化合物２種の組み合わせ等を内部標準物質として用いてもよい。

本発明の測定方法に係る測定対象物質としては、通常この分野で測定されているもの全てが含まれ、特に限定はされないが、具体的には、例えばペプチド鎖（例えばＣ−ペプチド、アンジオテンシンＩ等）、タンパク質［例えば免疫グロブリンＡ（IgA），免疫グロブリンＥ（IgE），免疫グロブリンＧ（IgG），免疫グロブリンＭ（IgM），免疫グロブリンＤ（IgD），β2−ミクログロブリン、アルブミン、これらの分解産物、フェリチン等の血清タンパク質、例えばアミラーゼ、アルカリホスファターゼ、γ−グルタミルトランスフェラーゼ等の酵素タンパク質、例えば結核菌，肺炎球菌，ジフテリア菌，髄膜炎菌，淋菌，ブドウ球菌，レンサ球菌，腸内細菌，大腸菌，ヘリコバクター・ピロリ等の細菌、ルベラウイルス，ヘルペスウイルス，肝炎ウイルス，ＡＴＬウイルス，ＡＩＤＳウイルス，インフルエンザウイルス，アデノウイルス,エンテロウイルス，ポリオウイルス，ＥＢウイルス，ＨＡＶ，ＨＢＶ，ＨＣＶ，ＨＩＶ，ＨＴＬＶ等のウイルス、例えばカンジダ，クリプトコッカス等の真菌、レプトスピラ，梅毒トレポネーマ等のスピロヘータ、クラミジア、マイコプラズマ等の微生物等に由来するタンパク質又はペプチド或いは糖鎖、例えばハウスダスト，例えばコナヒョウダニ，ヤケヒョウダニ等のダニ類、例えばスギ、ヒノキ、スズメノヒエ，ブタクサ，オオアワガエリ，ハルガヤ，ライムギ等の花粉、例えばネコ，イヌ，カニ等の動物、例えば米，卵白等の食物、真菌、昆虫、木材、薬剤、化学物質等に由来するアレルゲン等の気管支喘息，アレルギー性鼻炎，アトピー性皮膚炎等のアレルギーの原因となる各種アレルゲン、例えばリポタンパク質等の脂質、例えばトリプシン，プラスミン，セリンプロテアーゼ等のプロテアーゼ、例えばＡＦＰ，ＰＳＡ，ＣＥＡ，ＰＧＩ，ＰＧII等の腫瘍マーカータンパク等］、糖鎖（例えばＣＡ１９−９，ＰＩＶＫＡ ＩＩ，ＣＡ１２５，癌細胞の産生する特殊な糖鎖を有する物質が有する糖鎖等の腫瘍マーカー糖鎖抗原糖鎖、例えばＡＢＯ糖鎖等）、レクチン（例えばコンカナバリンＡ，レンズマメレクチン，インゲンマメレクチン，ダツラレクチン，小麦胚芽レクチン等）、リン脂質（例えばカルジオピリン等）、リポ多糖（例えばエンドトキシン等）、化学物質（例えばＰＴＨ，Ｔ３,Ｔ４，ＴＳＨ，インシュリン，ＬＨ，ＦＳＨ，プロラクチン等のホルモン、例えばトリブチルスズ，ノニルフェノール，４−オクチルフェノール，フタル酸ジ−ｎ−ブチル，フタル酸ジシクロヘキシル，ベンゾフェノン，オクタクロロスチレン，フタル酸ジ−２−エチルヘキシル等の環境ホルモン）、レセプター（例えばエストロゲン，ＴＳＨ等に対するレセプター）、リガンド（例えばエストロゲン，ＴＳＨ等）等が挙げられ、中でも例えばＡＦＰ，ＰＳＡ，ＣＥＡ，ＰＧＩ，ＰＧII等の腫瘍マーカータンパクやＣＡ１９−９，ＰＩＶＫＡ−ＩＩ，ＣＡ１２５，癌細胞の産生する特殊な糖鎖を有する物質が有する糖鎖等の腫瘍マーカー糖鎖抗原糖鎖が好ましく、ＡＦＰ、ＰＩＶＫＡ ＩＩが特に好ましい。

本発明の測定方法に係るキャピラリー電気泳動法としては、通常この分野で用いられる方法全て含まれるが、中でも、キャピラリーチップで行われる電気泳動法が好ましい。キャピラリー（マイクロ）チップ電気泳動法とは、チップ基板上に断面の直径100μm以下のキャピラリーを形成させ、このキャピラリー中で電気泳動を行なう技術であり、キャピラリー内に電圧をかけることによってサンプル内に存在する物質の電荷の差をその移動度の差として分離する方法である。

キャピラリー電気泳動法は、用いられる泳動溶液により、キャピラリーゾーン電気泳動法やキャピラリーゲル電気泳動法に分類されるが、本発明の方法は何れにも適用し得る。分離の精度を考慮すると、上記の中でもキャピラリーゲル電気泳動法が好ましい。

上記キャピラリー電気泳動法で用いられるキャピラリーの材質としては、通常この分野で用いられているものであればよく、特に限定されないが、具体的には、例えばガラス，石英，シリコン等のシリカ系化合物、例えばサイクリックオレフィンコポリマー(COC)，サイクリックオレフィンポリマー（COP），ポリメチルメタクリレート，ポリメチルシロキサン，ポリビニルクロライド，ポリウレタン，ポリスチレン，ポリスルホン，ポリカーボネート，ポリテトラフルオロエチレン等の合成ポリマー等が挙げられ、中でも合成ポリマーが好ましい。また、キャピラリーの内径及び長さは、測定対象物質を分離し得るものであればよく特に限定されないが、内径は、通常１〜1000μm、好ましくは１〜200μm、より好ましくは１〜100μmであり、長さは、通常0.1mm〜100cm、好ましくは0.1mm〜20cm、より好ましくは0.1mm〜10cmである。

本発明に係るキャピラリー電気泳動法で用いられる泳動溶液としては、通常この分野で用いられているものであればよく、特に限定されないが、キャピラリーゾーン電気泳動法の場合、具体的には、例えばpH5〜10、好ましくは6〜8の緩衝液が挙げられ、緩衝液としては具体的には例えば乳酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、コハク酸緩衝液、グリシン緩衝液、フタル酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリエタノールアミン緩衝液、ホウ酸緩衝液、グリシン緩衝液、バルビツール緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液、酒石酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。また、キャピラリーゲル電気泳動法の場合、例えばポリエチレンオキサイド（ポリエチレングリコール），ポリプロピレンオキサイド等のポリエーテル類、例えばポリエチレンイミン等のポリアルキレンイミン、例えばポリアクリル酸，ポリアクリル酸エステル，ポリアクリル酸メチル等のポリアクリル酸系ポリマー、例えばポリアクリルアミド，ポリメタクリルアミド等のポリアミド系ポリマー、例えばポリメタクリル酸，ポリメタクリル酸エステル，ポリメタクリル酸メチル等のポリメタクリル酸系ポリマー、例えばポリビニルアセテート，ポリビニルピロリドン，ポリビニルオキサゾリドン等のポリビニル系ポリマー、例えばプルラン，エルシナン，キサンタン，デキストラン，グアガム等の水溶性ヒドロキシルポリマー、例えばメチルセルロース，ヒドロキシエチルセルロース，ヒドロキシプロピルセルロース等の水溶性セルロース化合物、これらの誘導体、及びこれらポリマーを構成するモノマーユニットを複数種含有するコポリマー等のポリマーを、上記キャピラリーゾーン電気泳動の泳動溶液として用いられる緩衝液に添加したもの等が挙げられる。尚、上記ポリマーは、２種以上を組み合わせて添加してもよい。また、上記した如きポリマーの分子量としては、通常500Da〜6000kDa、好ましくは１〜1000kDa、より好ましくは100〜1000kDaである。また、上記ポリマーの濃度は、通常この分野で用いられている範囲から適宜選択すればよく、通常0.01〜40％（W/V）、好ましくは0.01〜20％（W/V）、より好ましくは0.1〜10％（W/V）である。尚、上記充填剤を泳動用緩衝液に添加した際の、泳動用緩衝液の粘度は、通常1〜50センチポアズ、好ましくは1〜20センチポアズ、より好ましくは1〜10センチポアズである。

上記泳動溶液には、電気浸透流の影響を減らすための物質、例えばポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、ポリエチレンイミン、含フッ素芳香族炭化水素、糖類等を含んでいてもよく、その濃度は通常この分野で用いられる範囲で設定されればよい。

本発明に係るキャピラリー電気泳動法における泳動時の電圧は、泳動溶液や用いられる装置等により異なるため通常この分野で用いられている範囲から適宜設定されればよい。

本発明に係るキャピラリー電気泳動法における試料や本発明に係る内部標準物質の導入方法は通常この分野でなされている方法であればよく、特に限定されないが、例えば吸引法、加圧法、電気的導入法等が挙げられ、中でも加圧法が好ましい。なお、本発明に係る内部標準物質は、試料中に予め溶解した状態で導入しても、試料と内部標準物質を含む溶液を別々に導入しても何れでもよい。内部標準物質を含む溶液の導入量は、キャピラリーの内径や長さ、検出器の種類や感度等の条件により異なるが、通常、試料の注入量と同じ量が用いられるが、キャピラリー中に通常0.001〜100fmol導入される。なお、上記試料や本発明に係る内部標準物質の導入は、自体公知の等速電気泳動（ITP）により濃縮した後、その濃縮物をそのままキャピラリー電気泳動に導入してもよい。この場合、例えばマイクロチップ電気泳動で行う場合には、ITP電気泳動とキャピラリー電気泳動とが連結しているチップを用い、連続してITP電気泳動、キャピラリー電気泳動を行うのが望ましい。

上記キャピラリー電気泳動方法で用いられる試料としては、上記測定対象物質が含まれる溶液であればよく、特に限定はされないが、具体的には例えば血清，血漿，髄液，滑液，リンパ液等の体液、尿，糞便のような排泄物、喀たん，膿，皮膚由来物等の生体由来試料、例えば食品，飲料，水道水，海水，湖沼水，河川水，工場廃液，半導体用洗浄水，医療器具等を洗浄した後の洗浄液等の環境試料及びこれらを水や通常この分野で用いられている例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液等の緩衝液等に適宜溶解させて再構成して得られた処理物等が挙げられる。

本発明の測定方法におけるキャピラリー電気泳動法は、上記キャピラリー中に上記泳動溶液を充填し、その後上記試料及び本発明に係る内部標準物質を上記導入方法によりキャピラリー内に導入し、通常この分野で用いられる電圧を印加して電気泳動を行い、蛍光検出器やUV検出器等の検出器等により測定することでなされる。より具体的には例えば、内径50〜100μm、長さ１〜10cmのキャピラリーに、例えば0.1〜1.0％ ポリジメチルアクリルアミド、1〜5％グリセロール、0.01〜0.1％BSAを含有するTris-HClバッファーを充填し、キャピラリーの開始末端から、1〜10psiで30〜60秒の加圧法により内部標準物質１種を含む試料をキャピラリーに導入し、次いで1〜10psiで30〜60秒の加圧法によりその他の内部標準物質をキャピラリーに導入した後、例えば1000〜3000Vの電圧を10〜60分印加することにより電気泳動を行い、蛍光検出器により測定される。

本発明の測定方法においては、上記の如き条件でキャピラリー電気泳動を行い、測定対象物質及び内部標準物質の泳動状態を蛍光検出器やUV検出器等の検出器により測定してエレクトロフェログラムを得、該エレクトロフェログラム中の内部標準物質のピークを同定した後、その泳動時間等から測定対象物質のピークを同定する。

具体的に説明すると、例えば内部標準物質２つを用い、試料中の測定対象物質を測定する場合、予め内部標準物質と測定対象物質の標準品を電気泳動させ、内部標準物質２つ及び測定対象物質の泳動時間、並びに、内部標準物質それぞれの泳動時間の比率及び内部標準物質と測定対象物質の泳動時間の比率を測定する。次いで、試料と測定対象物質とを同条件で電気泳動し、泳動時間及び先に求めた内部標準物質それぞれの泳動時間の比率から２つの内部標準物質のピークを特定する。最後に、該２つの内部標準物質の泳動時間及び先に求めた内部標準物質と測定対象物質の泳動時間の比率から測定対象物質のピークが特定される。

以下、本発明についての実験例及び実施例を記載するが、本発明はこれに限定されるものではない。

実験例１ 本発明に係る内部標準物質１の合成
下記本発明に係る内部標準物質１を合成した。

（１） 先ずインドレニン化合物8を以下の如く合成した。

※Et＝エチル基、Ph＝フェニル基

詳細について以下で説明する。
〔化合物2の合成〕
N,N-ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（80ml）中に、エチル-２-メチルアセトアセテート(1)（25.0g、0.173mol）、１，３−プロパンスルトン（23.3g、0.190mol）及び水素化ナトリウム（8.5g、0.208mol）を添加し、90℃で終夜攪拌反応を行った。反応終了後、溶媒を減圧留去し、水（200ml）、ジエチルエーテル（200ml）を加え２回洗浄を行った。その後水層部分を減圧留去し、化合物2を得た（42.1g、収率９１％）。

〔化合物3の合成〕
化合物2（40.5g、0.152mol）を濃塩酸（60ml）中、100℃で３時間攪拌反応を行った。反応終了後、溶媒を減圧留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：メタノール）を用いて精製し、化合物3を得た（16.6g、収率５６％）。

〔化合物5の合成〕
化合物3（10.0g、0.051mol）及び化合物4（12.9g、0.066mol）を酢酸（50ml）中、120℃で４時間加熱還流を行った。反応終了後、溶媒を減圧留去し、逆相カラムクロマトグラフィー（溶出液：水）を用いて精製し、化合物5を得た（11.5g、収率６５％）。
物性データ：IR(KBr) (cm^-1)：3450, 1196

〔化合物6の合成〕
化合物5（11.5g、0.033mol）を水（50ml）及びエタノール（50ml）中に溶解し、室温下で４時間攪拌反応を行った。反応終了後、溶媒を減圧留去し、逆相カラムクロマトグラフィー（溶出液：水）を用いて精製し、化合物6を得た（10.3g、収率８０％）。
物性データ：Mass（nega=346）
IR(KBr) (cm^-1)：3444, 1193

〔化合物7の合成〕
化合物6（10.0g、0.026mol）及び６−ブロモヘキサン酸（9.97g、0.052mol）を１，２−ジクロロベンゼン（100ml）中に溶解し、１２０℃で終夜攪拌反応を行った。反応終了後、溶媒を減圧留去し、酢酸エチルを用いて３回洗浄し、化合物(7)を得た（11.5g、収率８９％）。
物性データ：Mass（nega=460）
IR(KBr) (cm^-1)：3446, 1723, 1194

〔化合物8の合成〕
化合物7（1.5g、2.967mmol）及びマロン酸アルデヒドアニリド塩酸塩（0.77g、2.967mmol）を無水酢酸（20ml）中に溶解し、１２０℃で１時間攪拌反応を行った。反応終了後、溶媒を減圧留去し、逆相カラムクロマトグラフィー（溶出液：１０％アセトニトリル水溶液）を用いて精製し、インドレニン化合物8を得た（0.18g、収率１０％）。 物性データ：Mass（nega:posi=631:633）
IR(KBr) (cm^-1)：3443, 1716, 1574, 1465, 1189

（２）ピラゾール化合物12の合成
次いで、以下のようにしてピラゾール化合物12を合成した。

※ＤＭＡ＝ジメチルアセトアミド

詳細について以下で説明する。
〔化合物10の合成〕
ＤＭＦ（100ml）中、３−メチル−２,４−ペンタンジオン（化合物9）（15.0g、0.13mol）、１，３−プロパンスルトン（16.1g、0.13mol）及び水素化ナトリウム（5.0g、0.208mol）を用いて、５０℃で１６時間攪拌反応を行った。反応終了後、１Ｎ水酸化ナトリウムで中和し、溶媒を減圧留去し、水（200ml）及びジエチルエーテル（200ml）を加え２回洗浄を行った。その後水層部分を減圧留去し、ピラゾール化合物10を得た（32.2g、収率９６％）。
物性データ：IR(KBr) (cm^-1)：3474, 1695, 1665, 1191

〔化合物11の合成〕
化合物10（10.0g、0.042mol）及びヒドラジン一水和物（2.1g、0.042mol）をエタノール（EtOH）（150ml）中に溶解し、８０℃で３時間攪拌反応を行った。反応終了後、溶媒を減圧留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：メタノール/クロロホルム=１/１）を用いて精製し、化合物11を得た（9.0g、収率９２％）。
物性データ：IR(KBr) (cm^-1)：3421, 1195

〔化合物12の合成〕
化合物11（4.8g、0.019mol）及び１，３−プロパンスルトン（2.5g、0.02mol）をジメチルアセトアミド（30ml）中に溶解し、１４０℃で４時間攪拌を行った。反応終了後、酢酸エチル（200ml）を加え、析出した結晶を濾過し、ピラゾール化合物(12)を得た（5.3g、収率７６％）。
物性データ：Mass（nega=352）
IR(KBr) (cm^-1)：3446, 1194

（３）インドレニン化合物−ピラゾール化合物複合体13の合成

実験例１の（１）で得られたインドレニン化合物8（0.1g、0.158mmol）及び実施例１の(2)で得られたピラゾール化合物12 （0.17g、0.474mmol）をＤＭＦ（2ml）中に溶解し、ピリジン（1ml）及び無水酢酸（0.5ml）を加え、８０℃で１時間攪拌を行った。反応終了後、溶媒を減圧留去し、逆相カラムクロマトグラフィー（溶出液：１０％メタノール水溶液）及びSephadex LH−２０〔ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株）（旧アマシャムバイオサイエンス（株））社製〕（溶出液：メタノール）を用いて精製し、化合物(13)を得た（15mg、収率１２％）。以下の実施例では、該化合物8を内部標準物質１とした。
物性データ：Mass（nega=850）
化合物(13)の蛍光特性を以下に示す。

実験例２（カチオン基導入内部標準物質の合成方法）
下記化合物15を下記合成反応により合成した。なお、該化合物15は、内部標準物質２として以下の実施例で用いた。

※Me＝メチル基

（１）インドレニン化合物−ピラゾール化合物複合体14の合成
実験例１で得られた化合物13（13mg、0.015mmol）をＤＭＦ（0.6ml）中に溶解し、２−スクシンイミド−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＳＴＵ）（46mg）及びN−エチルジイソプロピルアミン（(i-Pr)₂NEt）（600μl）を加え、室温で１時間攪拌を行った。反応終了後、酢酸エチル（15ml）を加えて晶析させた後、遠心分離により、化合物14を得た（13mg、収率９０％）。
物性データ：Mass（nega=947）

（２）インドレニン化合物−ピラゾール化合物複合体15の合成
上記化合物14（7mg）をＤＭＦ（0.5mL）に溶解し、Ｎ，Ｎ-ジメチルアミノエチルアミン（10mg）、トリエチルアミン（Et₃N）（2μl）を添加した後、３時間攪拌を行った。反応終了後、溶媒を減圧留去し、分取逆相カラムを用いて精製することで化合物15を得た（3.2mg）。なお、該化合物15は、内部標準物質２として以下の実施例で用いた。
物性データ：Mass（nega=933）
化合物(15)の蛍光特性を以下に示す。

実施例１ AFPの分離測定
〔分析物（抗原）〕
α−フェトプロテイン（AFP）（和光純薬工業（株）製）

〔移動度変化結合物質（DNA標識抗体）〕
図１に示した手順に従って、DNAが結合した抗AFP抗体Fab'フラグメントを調製した。
即ち、先ず、常法により５’末端にNH₂基が導入された250bpのDNA断片を精製し（精製末端アミノ化DNA）、次いで、このDNA断片に導入されたNH₂基とスルホサクシニミジル 4-（p-マレイミドフェニル）ブチレイト（Sulfo-SMPB）リンカー（スクシンイミド基とマレイミド基を有するリンカー、ピアス社製）のスクシンイミド基とを常法により反応させた後、ゲル濾過処理を行い、未反応リンカーを除去して、リンカーが結合した250bpDNA断片を得た。得られたリンカー結合250bpDNA断片と、予め抗AFP抗体ＷＡ１（和光純薬工業（株）製）を用いて常法に従い調製した抗AFP抗体ＷＡ１Fab’フラグメントとを反応させた。得られた反応物を、夫々DEAEカラムを用いて精製し、250bpDNA断片が結合した抗AFP抗体ＷＡ１Fab’フラグメント（250bpDNA標識抗体）を調製した。

〔標識結合物質（蛍光標識抗体）〕
ＷＡ１抗体とは異なるＡＦＰのエピトープを認識する抗AFP抗体ＷＡ２（和光純薬工業（株）製）を常法により処理して抗AFP抗体ＷＡ２Fab’フラグメントとし、当該フラグメントのアミノ基に、常法により蛍光物質HiLyte647（AnaSpec社製）を導入して、HiLyte647標識抗AFP抗体ＷＡ２Fab’フラグメント（蛍光標識抗体）を調製した。

〔内部標準物質〕
実験例１及び２で得た内部標準物質１及び２を用いた。

〔キャピラリーチップ〕
図２に示すレイアウトを有するキャピラリーチップを、マイクロ化学チップの技術と応用 北森武彦ほか 2004年出版（丸善株式会社）に記載の方法に従い、以下のように作成した。
即ち、石英基板上に成膜したSi上にフォトレジスト膜を成膜した。このフォトレジストに図２に示すキャピラリデザイン（レイアウト）を有するマスクを用いて露光し、現像を行った。現像によりフォトレジストが除かれた部分のSiをスパッタによって除去した後、フッ化水素溶液を用いてウエットエッチングを行って石英基板にキャピラリチャンネル溝（細管）を作製した。石英基板上に残るフォトレジスト及びSi膜を除去した後、当該石英基板と液だめのための穴（ウェル）を有するカバープレートとをHF接合法によって張り合わせてキャピラリーチップを作製した。
尚、図２中、ＴＢはトレーリングバッファー導入用ウェル、ＬＢ１及びＬＢ２はリーディングバッファー導入用ウェルを、Ｓは泳動用試料導入用ウェルを、Ｒ１は試液（250bpDNA標識抗体含有溶液）導入用ウェルを、Ｗ１、Ｗ２及びＷ３は、ドレイン用ウェルをそれぞれ示す。

〔電気泳動〕
(1)リーディングバッファー
ポリジメチルアクリルアミド (pDMA)を0.6 ％ (w/v)、グリセロールを3 ％ (w/v)、NaClを75mM, 牛血清アルブミン(BSA)を0.01 ％及びLCAを4 mg/ml 含有する75mM Tris-HClバッファー(pH 7.5)を、リーディングバッファーとした。

(2)トレーリングバッファー
pDMAを0.6 ％(w/v)、グリセロールを3％ (w/v)、BSA を0.01％及びHEPESを125mM 含有する75mM Trisバッファーをトレーリングバッファーとした。

(3)泳動用試料
ポリジメチルアクリルアミド (pDMA)を0.6 ％ (w/v)、グリセロールを3 ％ (w/v)、NaClを75mM、BSAを0.01 ％及びMESを3.6mM含有する75mM Tris-HClバッファー(pH 7.5)を、サンプルバッファーとし、100pMのAFPを含む血清 １μL、1μM 蛍光標識抗体及び1nM 内部標準物質１１μL、サンプルバッファー ８μLを0.5mLチューブで混合し、10μLの反応液を調製した。
反応液は氷上に静置させ、約30分抗原抗体反応させ、蛍光標識抗体−AFP免疫複合体を形成させた。尚、蛍光標識抗体の最終濃度は、100nMである。
得られた、免疫複合体含有反応液を泳動用試料とした。

(4)試液（250bpDNA標識抗体含有溶液）
100nM 250bpDNA標識抗体及び1nM 内部標準物質２を含有するリーディングバッファー（50mM Cl⁻イオン含有）を試液とした。

(5)電気泳動手順
a)泳動用試料及び試液の導入
図２のＳウェル（泳動用試料導入用ウェル）に泳動用試料（蛍光標識抗体−AFP免疫複合体含有溶液） 10μL、Ｒ１ウェル（試液導入用ウェル）に試液（DNA標識抗体含有溶液） 10μL、ＬＢ１ウェル及びＬＢ２ウェルにリーディングバッファー 10μL、ＴＢウェルにトレーリングバッファー 10μLをそれぞれ滴下し、Ｗ１（ドレイン用ウェル）−Ｗ２（ドレイン用ウェル）−Ｗ３（ドレイン用ウェル）間に 30秒間、-５psiの圧力を印加して、泳動用試料、試液及びリーディングバッファー、トレーリングバッファーをチャネルに導入した。キャピラリー内の泳動用試料と試液の配置関係を、図３に模式的に示す。尚、図３中、斜線部分は泳動用試料の配置部分を、また、点部分は試液の配置部分をそれぞれ示す。

b)ITP（反応、濃縮、分離）・検出
図３のＴＢウェル−ＬＢ１ウェル間に、3000Vの電圧を印加して、30℃で、試液中の250bpDNA標識抗体を泳動用試料中の蛍光標識抗体−AFP免疫複合体と接触させて、蛍光標識抗体−AFP−250bpDNA標識抗体の免疫複合体を形成させ、これを等速電気泳動（ITP）で濃縮した。
尚、反応時間は約100秒（250bpDNA標識抗体が電気泳動試料のゾーン（斜線ゾーン）を通り抜ける時間として）であった。ＬＢ２まで等速電気泳動されて、免疫複合体がＬＢ２を通り抜けたことを電圧の変化で判断して、陰電極をＴＢからＬＢ２に切り替えて、
さらに検出部分（ＬＢ２チャネルクロス部分から２cmのキャピラリー部分）で、蛍光標識抗体−AFP−250bpDNA標識抗体の免疫複合体のピークが検出されるまでキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）を行った。
尚、検出は、635nmレーザー励起によりＬＢ２チャネルクロス部分から２cmのキャピラリー部分の蛍光強度を蛍光顕微鏡（BX-50；KSオリンパス（株）製）により経時的に測定することによって行った。

〔結果〕
図４に、泳動用試料を用いた場合の電気泳動像（エレクトロフェログラム）を示す。尚、図４において、縦軸は蛍光強度を、横軸はリテンションタイムをそれぞれ示す。
上記結果より、本発明に係る内部標準物質１及び２を用いて上記の如く電気泳動を行うと、内部標準物質両者のピークの間に測定対象とするAFP-L1とAFP-L3のピークが現れるようになり、両者のピークを容易に同定できることが判った。

実施例２ PIVK IIの分離測定
〔分析物（抗原）〕
Poser JW, Price PA. J Biol Chem. 1979 Jan 25;254(2):431-6に記載の方法より、PIVK IIを調整した。

〔移動度変化結合物質（DNA標識抗体）〕
抗AFP抗体ＷＡ１Fab’フラグメントの代わりにPIVKA II Fab’フラグメントを用いた以外は実施例１と同様に調製し、抗PIVKA II抗体Fab’フラグメント（250bpDNA標識抗体）を得た。

〔標識結合物質（蛍光標識抗体）〕
抗プロトロンビン抗体を常法により調製、処理して抗プロトロンビン抗体Fab’フラグメントとし、当該フラグメントのアミノ基に、常法により蛍光物質HiLyte647（AnaSpec社製）を導入して、HiLyte647標識抗プロトロンビン抗体Fab’フラグメント（蛍光標識抗体）を調製した。

〔内部標準物質〕
実験例１及び２で得た内部標準物質１及び２を用いた。
〔キャピラリーチップ〕
実施例１と同じものを用いた。

〔電気泳動〕
(1)リーディングバッファー
実施例１と同じものを用いた。
(2)トレーリングバッファー
実施例１と同じものを用いた。
(3)泳動用試料
ポリジメチルアクリルアミド (pDMA)を0.6 ％ (w/v)、グリセロールを3 ％ (w/v)、NaClを75mM、BSAを0.01 ％及びMESを3.6mM含有する75mM Tris-HClバッファー(pH 7.5)を、サンプルバッファーとし、100pMのPIVKA IIを含む血清 １μL、1μM 蛍光標識抗体及び1.4nM 内部標準物質１ 5μL、サンプルバッファー ８μLを0.5mLチューブで混合し、反応液を調製した。
反応液は氷上に静置させ、約30分抗原抗体反応させ、蛍光標識抗体−PIVKA II免疫複合体を形成させた。尚、蛍光標識抗体の最終濃度は、100nMである。
得られた、免疫複合体含有反応液を泳動用試料とした。
(4)試液（250bpDNA標識抗体含有溶液）
200nM 250bpDNA標識抗体及び140pM内部標準物質２を含有するリーディングバッファー（50mM Cl⁻イオン含有）を試液とした。
(5)電気泳動手順
実施例１と同じ方法で、泳動用試料及び試液を導入し、ITPで濃縮後、ＣＧＥを行い、635nmレーザー励起によりＬＢ２チャネルクロス部分から２cmのキャピラリー部分の蛍光強度を蛍光顕微鏡（BX-50；KSオリンパス（株）製）により経時的に測定した。

〔結果〕
図５に、泳動用試料を用いた場合の電気泳動像（電気泳動エレクトロフェログラム）を示す。尚、図５において、縦軸は蛍光強度を、横軸はリテンションタイムをそれぞれ示す。

上記結果より、本発明に係る内部標準物質１及び２を用いて電気泳動を行うことにより、PIVKA IIのピークを両内部標準物質の間に位置させることができ、それによりPIVKA IIのピークを容易に同定できることが判った。

Claims (5)

1. 下記一般式［１］で示される化合物又はその塩と下記一般式［１’］で示される化合物又はその塩との組合せを内部標準物質として用いて、測定対象物質のピークを同定することを特徴とする、キャピラリー電気泳動法による測定対象物質の測定方法；
   

   

   〔式中、Ｒ ^１ 〜Ｒ ^６ は夫々独立して、アミド結合を有していてもよい、−ＣＯＯ ^- 又は−ＳＯ ₃ ^- を置換基として有する又は無置換のアルキル基を表し、
   Ｒ ^７ 〜Ｒ ¹⁰ は夫々独立して、アルキル基、アルキニル基、アリール基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、置換アミノ基、−ＣＯＯ ^- 、−ＳＯ ₃ ^- 、ハロゲン原子、水素原子、水酸基、シアノ基若しくはニトロ基を表し、
   Ｒ ¹¹ は、水素原子、アルキル基、アルキニル基若しくはアリール基を表し、ｎは０〜３の整数を表す。
   但し、Ｒ ^１ 〜Ｒ ¹¹ のうち少なくとも３個の基は−ＣＯＯ ^- 、−ＳＯ ₃ ^- であるか、或いはこれらを置換基として有する基である。〕；
   

   

   〔式中、Ｒ ^1’ 〜Ｒ ^6’ は夫々独立して、一般式［101］
   

   

   （式中、Ｒ ¹⁰¹ 〜Ｒ ¹⁰⁴ は夫々独立して水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基を表し、ｍは２〜６の整数を表す。また、Ｒ ¹⁰² 〜Ｒ ¹⁰⁴ のうちの２〜３個の基とそれらが結合する窒素原子とでヘテロ環状アンモニウムカチオンを形成していてもよい。）で示される基を置換基として有するアルキル基、或いは、アミド結合を有していてもよい、−ＣＯＯ ^- 又は−ＳＯ ₃ ^- を置換基として有する若しくは無置換アルキル基を表し、
   Ｒ ^7’ 〜Ｒ ^10’ は夫々独立して、アルキル基、アルキニル基、アリール基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、置換アミノ基、−ＣＯＯ ^- 、−ＳＯ ₃ ^- 、ハロゲン原子、水素原子、水酸基、シアノ基若しくはニトロ基を表し、
   Ｒ ^11’ は、水素原子、アルキル基、アルキニル基若しくはアリール基を表し、ｎは０〜３の整数を表す。
   但し、Ｒ ^１’ 〜Ｒ ^６’ のうち少なくとも１つは一般式［101］で示される基を置換基として有するアルキル基である。〕。
2. 一般式［１］で示される化合物は、Ｒ^１〜Ｒ^６が夫々独立して、−ＣＯＯ^-又は−ＳＯ₃ ^-を置換基として有する又は無置換のアルキル基を表し、
   Ｒ^７〜Ｒ¹⁰が夫々独立して、−ＣＯＯ^-、−ＳＯ₃ ^-又は水素原子を表し、
   Ｒ¹¹がアルキル基を表すものであり、
   一般式［１’］で示される化合物は、Ｒ^1’〜Ｒ^6’が夫々独立して、一般式［101］
   

   

   （式中、Ｒ¹⁰¹〜Ｒ¹⁰⁴は上記と同じ。）で示される基を置換基として有するアルキル基、或いは、−ＣＯＯ^-又は−ＳＯ₃ ^-を置換基として有する又は無置換のアルキル基を表し、Ｒ^7’〜Ｒ^10’が夫々独立して、−ＣＯＯ^-、−ＳＯ₃ ^-又は水素原子を表し、
   Ｒ^11’がアルキル基を表すものである、請求項１記載の測定方法。
3. Ｒ^１及びＲ^２が夫々独立して、−ＣＯＯ^-又は−ＳＯ₃ ^-を置換基として有するアルキル基であり、Ｒ^３及びＲ^４の何れか一方が、−ＣＯＯ^-又は−ＳＯ₃ ^-を置換基として有するアルキル基であり、他方が、無置換のアルキル基であり、Ｒ^５及びＲ^６の何れか一方が、−ＣＯＯ^-又は−ＳＯ₃ ^-を置換基として有するアルキル基であり、他方が、無置換のアルキル基である、請求項２記載の測定方法。
4. Ｒ^1’及びＲ^2’は、一方が−ＣＯＯ^-又は−ＳＯ₃ ^-を置換基として有するアルキル基であり、他方が、一般式［101］で示される基を置換基として有するアルキル基であり、Ｒ^3’及びＲ^4’の何れか一方が、−ＣＯＯ^-又は−ＳＯ₃ ^-を置換基として有するアルキル基であり、他方が、無置換のアルキル基であるあり、Ｒ^5’及びＲ^6’の何れか一方が、−ＣＯＯ^-又は−ＳＯ₃ ^-を置換基として有するアルキル基であり、他方が、無置換のアルキル基である、請求項２記載の測定方法。
5. 測定対象物質がＡＦＰ、ＰＩＶＫＡＩＩである、請求項１〜４記載の測定方法。

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