KR102132885B1

KR102132885B1 - 생체물질과 연결될 수 있는 양쪽성 형광물질

Info

Publication number: KR102132885B1
Application number: KR1020180104377A
Authority: KR
Inventors: 차준회; 최학수
Original assignee: (주)씨바이오멕스
Priority date: 2018-09-03
Filing date: 2018-09-03
Publication date: 2020-07-10
Also published as: KR20200026445A

Abstract

발명은 생체물질과 연결될 수 있는 양쪽성 형광물질을 제공한다.
상기 양쪽성 형광물질은 하기 구조식 1 로 표시되는 화합물 중 적어도 하나를 포함한다.
<구조식 1>

상기 구조식 1에서, L은 명세서에 정의된 바와 같다.

Description

생체물질과 연결될 수 있는 양쪽성 형광물질{ZWITTERIONIC FLUORESCENT MATERIAL LINKABLE TO BIOMOLECULAR MATERIAL}

본 발명은 생체물질과 연결될 수 있는 양쪽성 형광물질에 관한 것이다.

형광염료(fluorescent dye)는 생물학적 연구에 광범위하게 사용되어 왔으며, 최근에는 임상진단(면역화학, 분자진단 등)뿐만 아니라 암치료와 같은 특수 수술에 활용되고 있다.

오믹스 관련 미세배열기술, 세포 분석 연구 등에 형광염료가 사용되어 왔으며, 최근에는 웨스턴 블롯(western blot), real-time PCR 등 분자생물학적 연구에도 형광염료가 활용되고 있다.

형광염료는 전통적인 면역화학진단에서부터 최근 개발된 POCT(point of care testing), 분자진단(바이오 센서 등)에 광범위하게 활용되고 있다.

또한, 최근 표적 치료제 및 동반진단기술이 발달하면서, 형광염료를 이용하여 암 수술과 동시에 암세포의 전이 정도를 확인할 수 있는 기술이 개발되고 있다.

기존에 개발되어 상품화된 대부분의 형광염료는 전하를 띄고 있어 전하를 가진 단백질, 핵산, 지질 등 바이오 거대분자들과 비특이적 결합을 유도한다.

완벽한 중성의 형광염료의 경우, 강한 방향성 및 소수성으로 인해 방향성이 큰 아미노산을 다수 포함한 단백질이나, 소수성이 큰 거대 생체 분자들과의 비특이적 결합에 의한 위양성 반응(false positive)을 나타낸다. 이러한 위양성 반응은 단백질 특이적 펩타이드 기술의 면역화학진단 및 바이오칩 활용에서 신뢰성 감소를 야기시킨다.

한편, 펩타이드, 압타머 등과 같은 미세 생체분자(small biomolecule)는 분자량이 작아 기존의 형광염료와 결합할 경우 형광염료가 가진 전하적 특성에 지배를 받게 된다.

형광염료와 생체분자 사이의 비특이적 결합의 최소화를 위해, 완충용액이나 중성 계면활성제를 사용하는 방법 등이 고려될 수 있지만, 최근 형광염료가 바이오센서, 외과 수술에 사용되면서 분석의 정밀성이 요구된다.

본 발명은 상기한 종래기술의 문제점을 해결하고자 발명된 것으로, 본 출원의 발명자들은 형광염료를 아미노산 및 단백질의 기본 특성인 양쪽성 물질로 개발하여 형광염료의 생체분자에 대한 비특이적 반응성 자체를 최소화할 수 있음에 착안하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 단백질 검출·분석의 정확성을 향상시킬 수 있는 신규 형광염료를 제공하는 것이다.

본 발명의 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

발명에 따른 생체물질과 연결될 수 있는 양쪽성 형광물질은 하기 구조식 1 로 표시되는 화합물들 중 적어도 하나를 포함한다.

<구조식 1>

상기 구조식 1에서, L은 -(L1)_n-(L2) 이다.

상기 구조식 1에서, L1은 -NH-CH₂-(CH₂-O-CH₂)_m-CH₂-C(=O)- 이다.

상기 구조식 1에서, L2는 아자이드(azide), 아세틸렌(acetylene), 말레이미드(maleimide), 바이오틴(biotin), 하이드라자이드(hydrizide),

,

, -R₃-(C(=O)₂-NH-NH₂ 및 -R₄-(S(=O)₂-NH-NH₂ 중 하나이며, R¹, R², R₃, R₄는 각각 C1~6의 2가 지방족 탄화수소, C1~6의 알킬렌 또는 2가 방향족 탄화수소 및 이의 유도체이다.

상기 구조식 1에서, n은 0 또는 1이다.

상기 구조식 1에서, m은 0 내지 4 의 정수이다.

기타 실시예들의 구체적인 사항들은 상세한 설명 및 도면들에 포함되어 있다.

본 발명은 적어도 다음과 같은 효과가 있다.

본 발명에 따른 양쪽성 형광물질은 생체물질에 대한 비특이적 반응을 최소화하여 단백질 검출·분석의 정확성을 향상시킬 수 있다.

본 발명에 따른 효과는 이상에서 예시된 내용에 의해 제한되지 않으며, 더욱 다양한 효과들이 본 명세서 내에 포함되어 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 양쪽성 형광물질의 UPLC(Ultra-Performance Liquid Chromatography) 분석결과이다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

또한, 본 명세서에 개시된 기술을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 명세서에 개시된 기술의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

본 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함한다", "갖는다" 라고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

또한, 본 명세서 전체에서, "A 내지 B"는 A 이상 B 이하의 범위 내인 것을 의미하고, "A 이상 내지 B 미만"은 A 이상 B 미만의 범위 내인 것을 의미하며, "A 초과 내지 B 이하"는 A 초과 B 이하의 범위 내인 것을 의미한다. 본 명세서에서, "Ca~b"는 탄소수가 a 내지 b 인 것을 의미한다.

발명의 양쪽성 형광물질은 양이온과 음이온이 공존하는 양쪽성 이온 모이어티(moiety)를 포함하고 있으므로, 아미노산, 펩타이드 또는 단백질 등과 같은 생체물질에 대한 비특이적 반응을 최소화할 수 있다.

발명에 따른 생체물질과 연결될 수 있는 양쪽성 형광물질(이하, '발명의 양쪽성 형광물질'이라 함)은 하기 구조식 1 로 표시되는 화합물들 중 적어도 하나를 포함한다.

<구조식 1>

상기 구조식 1로 표시되는 화합물들은 펜타메틴시아닌 염료(pentamethine cyanine dye)에 양쪽성 이온 모이어티 쌍과 아미노산, 펩타이드 또는 단백질 등과 같은 생체물질에 연결할 수 있는 연결기로서, -Ph-CH₂-CH₂-C(=O)-L 를 도입한 화합물들이다. Ph는

이다.

발명자들이 확인한 바에 따르면, 연결기로 -O-Ph-CH₂-CH₂-C(=O)-L 가 도입된 대조군은 버퍼 수용액(buffer aqueous solution)에서 구조가 불안정하였으며, 단백질 등의 생체물질에 라벨링(labeling) 했을 때, 시간이 경과함에 따라 스크린 시 형광세기가 약해졌다. 반면에, 연결기로 -Ph-CH₂-CH₂-C(=O)-L 가 도입된 발명의 양쪽성 형광물질은 상기 대조군에 비해 버퍼 수용액에서의 구조적 안정성이 높았다.

상기 구조식 1에서, L은 -(L1)_n-(L2) 이다. L1은 -NH-CH₂-(CH₂-O-CH₂)_m-CH₂-C(=O)- 이며, L2는 아자이드(azide), 아세틸렌(acetylene), 말레이미드(maleimide), 바이오틴(biotin), 하이드라자이드(hydrizide),

,

, -R₃-(C(=O)₂-NH-NH₂ 및 -R₄-(S(=O)₂-NH-NH₂ 중 하나이다. R¹, R², R₃, R₄는 각각 C1~6의 2가 지방족 탄화수소, C1~6의 알킬렌 또는 2가 방향족 탄화수소 및 이의 유도체이다.

상기 구조식 1에서, n은 0 또는 1이다. 상기 n이 0 인 경우, -Ph-CH₂-CH₂-C(=O)-L 에서, -L은 -L2 이다. 상기 n이 1인 경우, -Ph-CH₂-CH₂-C(=O)-L 에서, -L 은 -L1-L2 이다.

상기 구조식 1에서, m은 0 내지 4 의 정수이다. 상기 m이 0 인 경우, L1은 -NH-CH₂-CH₂-C(=O)- 이고, 상기 m이 1인 경우, L1은 -NH-CH₂-CH₂-O-CH₂ -CH₂-C(=O)- 이며, 상기 m이 2인 경우, L1은 -NH-CH₂-(CH₂-O-CH₂)-(CH₂-O-CH₂)-CH₂-C(=O)- 이고, 상기 m이 3인 경우, L1은 -NH-CH₂-(CH₂-O-CH₂)-(CH₂-O-CH₂)-(CH₂-O-CH₂)-CH₂-C(=O)- 이며, 상기 m이 4인 경우, L1은 -NH-CH₂-(CH₂-O-CH₂)-(CH₂-O-CH₂)-(CH₂-O-CH₂)-(CH₂-O-CH₂)-CH₂-C(=O)- 이다.

상기 m의 값이 커질수록 버퍼 수용액에서 발명의 양쪽성 형광물질의 용해도가 증가되어 라벨링(labeling)이 효과적으로 진행될 수 있었으며, 단백질 등의 생체물질과 발명의 양쪽성 형광물질 간의 거리를 벌려 단백질 등의 생체물질에 발명의 양쪽성 형광물질이 미치는 영향을 최소화할 수 있다.

예를 들어, 상기 구조식 1로 표시되는 화합물들이 하기 구조식 2로 표시되는 화합물들 중 적어도 하나일 수 있다.

<구조식 2>

상기 구조식 2에서, L1, n은 각각 상기 구조식 1에 정의한 바와 같다.

예를 들어, 상기 구조식 2로 표시되는 화합물들 중 하나는 하기 구조식 3으로 표시되는 화합물 또는 하기 구조식 4로 표시되는 화합물일 수 있다.

<구조식 3>

<구조식 4>

<합성예 >

하기의 합성 스킴(scheme)에 따라 구조식 4로 표시되는 화합물을 합성하였다.

(E)-N-((Z)-2-Bromo-3-(phenylamino)allylidene)benzenaminium bromide (1).

무코브롬산(Mucobromic acid) (5.940 g, 23.04 mmol) 을 에탄올 (40 mL) 에 용해시킨 뒤, 10 분 넘게 에탄올 (20 mL) 로 희석시킨 아닐린 (4.286 g, 4.2 mL, 46.1 mmol)을 적가하였다.

반응조를 격렬하게 교반하였고 40 ℃ 까지 서서히 가열하였다. 아닐린의 적가가 완료된 후에, 반응이 종료되지 않았음을 나타내는 이산화탄소(CO₂)가 추가적으로 생성되었다. 이산화탄소의 방출이 완료된 후, 황금-갈색 반응 혼합물을 얼음 조(ice bath)에서 냉각시켰다. 밝은 황색 고체가 침전될 때까지 저온에서 교반하면서 디에틸에테르 (50 mL)를 첨가하였다. 생성된 고체를 여과하고, 에테르로 세척하였으며, 건조한 뒤, 정제하지 않고 후속 반응에서 사용하였다.

수율(Yield) 75%; 녹는점(mp) 189 ℃ 내지 191 ℃; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 7.330 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 7.496 (t, J = 8 Hz, 4H), 7.708 (d, J = 8 Hz, 4H), 9.559 (s, 2H), 11.513 (s, 2H); 13C NMR (100 MHz, DMSO- d6): d 89.3, 119.5, 123.9, 126.0, 129.2, 129.6, 138.5, 157.4.

2,3,3-Trimethyl-1-[3-(trimethylammonio)propyl]-3H-indolium-5-sulfonate dibromide (2).

2,3,3-트리메틸-3H-인돌-5-설폰산(2,3,3-trimethyl-3H-indole-5-sulfonic acid) (7.17 g, 36.4 mmol)과 (3-브로모프로필)트리메틸 암모늄 브롬화물((3-bromopropyl)trimethyl ammonium bromide) (10.5 g, 40 mmol) 의 혼합물의 톨루엔 (60 mL) 용액을 질소 분위기 하에서 72 시간 동안 130 ℃ 에서 가열하였다. 혼합물을 실온까지 냉각하였고 용매를 따라 내었다. 조 생성물(crude product)을 메탄올 및 MTBE로부터 결정화시켜 분홍색 결정을 수득하고, 이를 추가 정제없이 후속 단계에서 사용하였다.

수율(Yield) 81%; 녹는점(mp) 232 ℃ 내지 235 ℃; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 1.56 (s, 6H), 2.51 (s, 3H), 3.07 (m, 2H), 3.12 (s, 9H), 3.62 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 4.50 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 7.71 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.79 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.01 (s, 1H). 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ 15.0, 21.6, 22.3, 45.2, 53.1, 55.0, 62.4, 115.4, 121.2, 126.8, 141.3, 142.0, 149.9, 199.1. C₁₇H₂₇N₂O₃S [M]+에 대한 HRMS (ESI) m/z 계산치 339.1740, m/z 실측치 339.1742.

2-((1E,3Z)-3-bromo-5-((E)-3,3-dimethyl-5-sulfonato-1-(3-(trimethylammonio)propyl)indolin-2-ylidene)penta-1,3-dien-1-yl)-3,3-dimethyl-1-(3-(trimethylammonio)propyl)-3H-indol-1-ium-5-sulfonate bromide (3).

무수 아세트산(acetic anhydride) (8 mL)과 나트륨 아세테이트(sodium acetate) (4 mol eq)의 존재 하 70 ℃ 에서, N-헤테로사이클릭 4급 암모늄 모이어티 2(N-heterocyclic quaternary ammonium moiety 2) (2mol eq)를 가진 치환된 2,3,3-트리메틸 인돌레닌염(Substituted 2,3,3-trimethyl indolenine salts)을 브롬화 메틴 시약 1 (1 mol eq)과 반응시켰다.

메탄올 중의 UV-Vis-NIR 흡수 분광법 및 LC-MS 를 이용하여 반응을 모니터링하였다. 2 ~ 4 시간 후, 반응이 완료되었다. 용매를 진공 하에서 제거하였다. 크루드 물질(crude material)을 메탄올과 물의 구배 용매 조성을 이용한 플루카(Fluka) 실리카 겔 90 Å C18 역상 크로마토 그래피를 사용하여 정제하여 고순도의 최종 화합물을 수득하였다.

수율(Yield) 77%; 녹는점(mp) 252 ℃ 내지 254 ℃; 1HNMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 2.05 (s, 12H), 2.71 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 3.47 (s, 18H), 3.86 (tt, J = 7.6 Hz, 7.2 Hz, 4H), 4.64 (t, J = 7.2 Hz, 4H), 6.78 (d, J = 13.2 Hz, 2H), 7.73 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 8.21 (d, J = 8 Hz, 2H), 8.25 (s, 2H), 8.56 (d, J = 13.2 Hz, 2H); 13CNMR (100 MHz, DMSO-d6), δ: 20.3, 26.3, 40.6, 49.7, 52.3, 63.6, 103.0, 110.2, 116.4, 119.1, 126.6, 140.3, 141.3, 142.5, 150.6, 176.7. 이론적 조성: (x3H₂O): C (47.95%), H (6.31%), N (6.05%); 실제 조성: C (47.46%), H (6.48%), N (6.05%); [C₃₇H₅₂BrN₄O₆S₂]+에 대한 HRMS (ESI) m/z 이론치 792.8822, m/z 실측치 792.8854.

3-(4-((1E,3Z,5E)-1-(3,3-dimethyl-5-sulfonato-1-(3-(trimethylammonio)propyl)-3H-indol-1-ium-2-yl)-5-(3,3-dimethyl-5-sulfonato-1-(3-(trimethylammonio)propyl)indolin-2-ylidene)penta-1,3-dien-3-yl)phenyl)propanoate (5).

브로모 염료 전구체 3 (1.0 mmol) 과 3-(4-보로노페닐)프로피온산 (3-(4-boronophenyl)propanoic acid) 4 (1.8 mmol)의 수용액을 72 시간 동안 Pd(PPh₃)₄ (0.065 mmol) 의 존재 하에서 환류 하에 가열하였다.

브로모로시아닌(bromorocyanine)의 흡수가 사라질 때까지 메탄올로 희석한 분취량으로 가시/근적외선 분광법으로 반응 진행을 모니터링하였다.

이어서, 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, H₂O를 감압 하에 제거하였다. 고체를 MeOH/아세톤으로 침전시켜 분리하고, 침전물을 아세톤으로 추가 세척하였다.

개방-역상 컬럼 크로마토그래피(아세토니트릴/물로 용리)를 사용하여 최종 형광물질을 수득하였다.

수율(Yield) 72%; 녹는점(mp) > 260℃; λmax = 645 nm in H₂O; 1H NMR (DMSO- d6), δ: 1.78 (s, 12H), 1.99 (br s, 4H), 2.65 (br s, 2H), 2.93 (br s, 2H), 3.08 (s, 18H), 3.25 (br s, 4H), 3.84 (br s, 4H), 5.65 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 7.27 (d, J = 3.8 Hz, 2H), 7.35 (d, J = 4.2 Hz, 2H), 7.42 (d, J = 4.0 Hz, 2H), 7.60 (d, J = 4.2 Hz, 2H), 7.87 (s, 1H), 8.54 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 12.33 (s, 1H); 13C NMR (100 MHz, D2O, 70 °C), δ: 21.16, 27.51, 32.25, 39.42, 41.30, 49.82, 53.84, 63.95, 102.87, 111.37, 120.49, 127.51, 129.92, 130.67, 133.25, 137.19, 141.23, 142.04, 143.57, 155.23, 175.21, 181.88; C₄₆H₆₀N₄O₈S₂에 대한 HRMS (TOF MS ES+) m/z 이론치 860.3853 [M]+, m/z 실측치 862.4038 [M+2H]+.

화합물 5에 -NH-CH₂-(CH₂-O-CH₂)₄-CH₂-C(=O)-NHS를 도입하여, 구조식 4로 표시되는 화합물을 얻었다.

< NHS >

<구조식 4>

도 1에는 구조식 4로 표시되는 화합물의 UPLC(Ultra-Performance Liquid Chromatography) 분석결과가 도시되어 있다.

UPLC 분석

UPLC: 워터스(WATERS).

컬럼(Column): HSS C18 SB 1.8 mm 2.1 × 50 mm.

그래디언트(Gradient): 3분 넘게 5 내지 50% 메탄올로 진행.

이상 본 발명의 실시예들을 설명하였으나, 본 발명은 상기 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 제조될 수 있으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

삭제
삭제
삭제
하기 구조식 4로 표시되는 화합물이며, 생체물질과 연결될 수 있는 양쪽성 형광물질.
<구조식 4>
제 4항의 양쪽성 형광물질을 이용한 생체물질의 검출 방법으로, 이때 상기 생체물질이 상기 형광물질과 특이적 결합을 함으로써 상기 생체물질을 검출하는 검출 방법.
제 5항에 있어서,
상기 생체물질은 아미노산, 펩타이드 또는 단백질인 검출 방법.
제 4항의 양쪽성 형광물질을 이용한 생체물질의 분석 방법으로, 이때 상기 생체물질이 상기 형광물질과 특이적 결합을 함으로써 상기 생체물질을 검출하여 검출된 생체물질을 분석하는 분석 방법.
제 7항에 있어서,
상기 생체물질은 아미노산, 펩타이드 또는 단백질인 분석 방법.