CN113637703A - 一种布鲁氏菌L7/L12和GroES真核表达载体的构建方法及其应用 - Google Patents

一种布鲁氏菌L7/L12和GroES真核表达载体的构建方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种布鲁氏菌L7/L12和GroES真核表达载体的构建方法及其应用，属于生物技术领域。本发明公开的一种布鲁氏菌L7/L12和GroES真核表达载体的构建方法，利用OverlapPCR方法连接基因L7/L12和GroES，利用pcDNA3.1构建真核表达载体pcDNA3.1‑LG。真核表达载体pcDNA3.1‑LG用于制备布鲁氏菌疫苗。本发明通过构建L7/L12和GroES的融合表达真核载体，免疫小鼠后，机体产生了良好的体液和细胞免疫力，为布鲁氏菌核酸疫苗的开发奠定了重要基础。

Description

一种布鲁氏菌L7/L12和GroES真核表达载体的构建方法及其 应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一种布鲁氏菌L7/L12和GroES真核表达载体的构建方法及其应用。
背景技术
布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的人兽共患传染病，给牛羊养殖业造成了巨大经济损失，同时严重威胁人类健康。疫苗免疫是预防布鲁氏菌病较为有效的方法，商品化的布鲁氏菌疫苗有A19、S2、Rev1、M5和RB51等，均为弱毒疫苗，但是存在安全性不足的缺点，例如A19可导致怀孕动物流产，并存在排毒风险，且大都能够感染人并引起一过性疾病。DNA疫苗安全性高，且现有研究显示某些基因能够刺激机体产生较强的保护力，逐渐得到人们的重视。
基于布鲁氏菌L7/L12基因的DNA疫苗在能够产生良好的保护作用。GroES是热休克蛋白hsp60家族的辅助蛋白，可以激活宿主免疫反应，同时参与抗原呈递，增强宿主免疫应答水平。
因此，提供一种布鲁氏菌L7/L12和GroES真核表达载体的构建方法及其应用是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种布鲁氏菌L7/L12和GroES真核表达载体的构建方法及其应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种布鲁氏菌L7/L12和GroES真核表达载体的构建方法，具体步骤如下：
(1)提取B.abortus 2308基因组DNA；
(2)利用引物LG-1和LG-2 PCR扩增L7/L12基因，LG-3和LG-4 PCR扩增GroES基因；扩增产物纯化后1：1混匀作为重叠PCR的模板，以引物LG1和LG4进行扩增，将L7/L12和GroES两个基因连接，获得L7/L12-GroES；
其中，LG-1和LG-2以及LG-3和LG-4的引物序列如下：
LG-1：5’-GCGGATCCACCATGGTGGCTGATCTCGCAAAGATCGTT-3’；SEQ ID NO.1；
LG-2：5’-GCGCTCGGGCAGTATCATCATTCCTCCCTTGAGTTCAACCTTGGCGCCAGCA-3’；SEQID NO.2；
LG-3：5’-GGCGCCAAGGTTGAACTCAAGGGAGGAATGATGATACTGCCCGAGCGCCT-3’；SEQ IDNO.3；
LG-4：5’-GCCTCGAGTCAGACAAGCGCATGTAGAGAAGCA-3’；SEQ ID NO.4；
(3)将纯化后的L7/L12-GroES与质粒pcDNA3.1进行双酶切、连接和转化，涂布Amp平板培养过夜；挑取单菌落进行PCR鉴定，获得阳性克隆，提取质粒，经测序验证正确，获得真核表达载体pcDNA3.1-LG。
进一步，步骤(2)所述PCR和重叠PCR的反应体系为：上下游引物各1μL，DNA模板1μL，PCR Mixture 25μL，蒸馏水补齐50μL；反应条件为：94℃预变性5min；94℃ 60s，50℃30s，72℃延伸60s，32个循环；72℃终末延伸8min。
进一步，所述的一种布鲁氏菌L7/L12和GroES真核表达载体在制备布鲁氏菌疫苗中的应用。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种布鲁氏菌L7/L12和GroES真核表达载体的构建方法及其应用，通过构建L7/L12和GroES的融合表达真核质粒，免疫小鼠后，机体产生了良好的体液和细胞免疫力，为布鲁氏菌核酸疫苗的开发奠定了重要基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明L7/L12和GroES基因PCR扩增及重叠PCR；
其中，M：DL2000 Plus DNA Marker；1：L7/L12；2：GroES；3：L7/L12-GroES；
图2附图为本发明IPTG诱导重组蛋白表达后SDS-PAGE分析；
其中，M：蛋白质预染Marker；1：重组质粒pET32a-LG转化大肠杆菌感受态BL21；2：空载体pET32a转化大肠杆菌感受态BL21；
图3附图为本发明IPTG诱导重组蛋白表达后Western blot分析；
其中，1：重组质粒pET32a-LG转化大肠杆菌感受态BL21；2：空载体pET32a转化大肠杆菌感受态BL21；
图4附图为本发明重组蛋白表达形式的SDS-PAGE分析；
其中，M：蛋白质预染Marker；1：全菌；2：沉淀；3：上清；
图5附图为本发明重组蛋白纯化前后的SDS-PAGE分析；
其中，M：蛋白质预染Marker；1：包涵体；2：包涵体纯化后；
图6附图为本发明多克隆抗体的Western blot验证；
其中，1：pET32a-LG；2：pET32a；
图7附图为本发明间接免疫荧光验证重组蛋白在293T细胞中的表达；
图8附图为本发明Western blot验证重组蛋白在293T细胞中的表达；
其中，1：pcDNA3.1-LG；2：pcDNA3.1；
图9附图为本发明ELISA方法测定免疫小鼠血清抗体水平；*：p<0.05；**：p<0.01；***：p<0.001；
图10附图为本发明淋巴细胞转化试验测定细胞免疫水平(MTT法)；**：p<0.01；***：p<0.001。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
Ni-琼脂糖凝胶、His标签鼠源单克隆抗体和HRP-羊抗鼠IgG、无内毒素质粒提取试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司；ConA、DMSO、MTT、红细胞裂解液、SDS-PAGE及Western blot相关试剂购自购自北京索莱宝生物科技有限公司。
实施例1重组表达载体和表达菌株的构建
提取B.abortus 2308基因组DNA，通过PCR扩增获得L7/L12和GroES融合基因片段。引物信息见表1，其中引物LG-1和LG-2用于扩增L7/L12基因，LG-3和LG-4用于扩增GroES基因，扩增产物纯化后1：1混匀作为重叠PCR的模板，以引物LG1和LG4进行扩增，将L7/L12和GroES两个基因连接在一起，获得L7/L12-GroES；用于构建原核或真核表达载体。
L7/L12-GroES的核苷酸入列如下：
atggctgatctcgcaaagatcgttgaagacctttcggccctgaccgttctggaagccgctgagctgtccaagcttctcgaagagaagtggggcgtttcggctgctgctccggtcgctgttgctgctgccggtggcgctgcccctgctgctgccgcagaagaaaagaccgaattcgacgtcgttctcgctgacggcggcgctaacaagatcaacgtgatcaaggaagtgcgcgcactcaccggtctcggcctcaaggaagccaaggacctggtcgaaggcgctccgaaggctgtcaaggaaggcgcctcgaaggacgaagctgagaagatcaaggcacagctcgaagctgctggcgccaaggttgaactcaaggaagaaatgatgatactgcccgagcgcctcgacgatctgacggaccgatatgatgcgatcttttgcgacgtctggggcgttgtacacaacggcgaaacgtcctttgcgccggccatcgccgccttgcagcgcgctcgcgccaagggtgtgacaatcattctcgtgaccaattctccacgcccgcatccgggcgttgtcgcgcagatgtcgcttctgggtgtgcccgaagatgcctatgaccgtgttgtcacttccggtgatgttacgcgcgatcttatcgccgaagggccgcgccggattttccacatcggctgcgagcgcgagcttgccatttatgatgggcttgacgtggagctggtcgaggaatttgaggcggcaggcgtggtttgtaccgggctttatgacgatgaagtcgaaacgccagaagactacagggaattgctccagcgtctgcgcgcgcgcaacctgcctttcatttgcgccaatcctgatatcatggtggaacgcgggcctcgcctcatctggtgcgcgggcgcgcttgcacgcgaatacggccagcttggagggcgcaccctgattgcaggcaagccccatcgcccgatctatgaggcggcgcttcgcgcggtggaaagcattcgcggtggaagcgtggacaagagccgcattcttggcattggcgacggcgttttgaccgatgtgaaaggggctgcggattttggcctcgatgtgctttatatttcgggcggcgttcatgccgccgattatgcggtgaacggggatctcgatatggcgaagatggaggcttttctggaaaagcatggccatcgccccattgcttctctacatgcgcttgtctga；SEQ ID NO.9。
PCR和重叠PCR反应体系均为：上下游引物各1μL，DNA模板1μL，PCR Mixture 25μL，蒸馏水补齐50μL。PCR反应条件均为：94℃预变性5min；94℃ 60s，50℃ 30s，72℃延伸60s，32个循环；72℃终末延伸8min。
扩增结果见图1，表明用牛种布鲁氏菌2308基因组DNA为模板，通过Overlap PCR方法成功融合了L7/L12和GroES两基因。
纯化后的扩增产物与质粒pET32a、pcDNA3.1进行双酶切，将酶切纯化后的扩增产物分别与酶切纯化后的质粒pET32a、pcDNA3.1连接和转化，涂布Amp平板培养过夜。挑取单菌落使用相应引物(T7和S-tag引物，pcDNA3.1-F和pcDNA3.1-R，见表1)进行PCR鉴定，阳性菌株提取质粒、双酶切鉴定，送生工测序。鉴定无误的重组质粒分别命名为pET32a-LG和pcDNA3.1-LG。
表1引物信息
Figure BDA0003200761450000051
实施例2重组蛋白的诱导表达、验证及纯化
将重组质粒pET32a-LG转化到大肠杆菌感受态BL21中，经终浓度为1mmol/L的IPTG37℃诱导表达4h后，进行SDS-PAGE和Western blot分析，验证其表达。
SDS-PAGE结果见图2，条带大小约为65kDa，符合预期。为了进一步验证分泌蛋白表达，对融合蛋白进行针对表达标签His的Western blot鉴定，结果见图3，进一步证明目的蛋白获得了表达。
诱导表达后，一部分菌体加入蛋白上样缓冲液煮样，作为全菌上样；一部分菌体进行超声裂解，离心分离上清和沉淀，分别进行SDS-PAGE，对表达产物形式进行分析，结果见图4，重组蛋白主要为包涵体表达。对表达产物进行Ni柱纯化，并进行SDS-PAGE验证，结果见图5，得到了纯度较高的融合表达蛋白(重组蛋白)。
实施例3重组蛋白的鼠源多克隆抗体的制备及鉴定
首次免疫使用弗氏完全佐剂乳化重组蛋白，在小鼠背部皮下多点注射免疫小鼠，剂量为100μɡ/只；两周后二免，使用弗氏不完全佐剂乳化蛋白，剂量为50μɡ/只；一周后三免，方法同二免；一周后加强免疫，不使用佐剂，剂量为100μɡ/只，腹腔注射；一周后禁食一天，次日取血、分离血清。取重组蛋白进行SDS-PAGE和转膜，使用制备的鼠血清作为一抗，HRP标记的羊抗鼠多克隆抗体作为二抗，LG原核蛋白作为抗原进行Western blot分析，结果见图6，表明多抗制备成功。
选择蛋白浓度100ng/孔包被板子，对血清进行倍比稀释，二抗使用1:5000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，测定血清抗体滴度。
经过ELISA测定，血清稀释度1:15000时，P/N值仍大于2.1，因此确定该血清的抗体效价为15000。
实施例4重组质粒pcDNA3.1-LG的瞬时转染、真核表达产物的间接免疫荧光鉴定和Western blot鉴定
采用无内毒素质粒提取试剂盒提取质粒pcDNA3.1-LG。在6孔培养板中铺293T细胞，浓度为2×105CFU/孔。次日，将2μɡ的质粒溶于200μL
Figure BDA0003200761450000061
buffer，旋涡震荡10秒；再加入4μL
Figure BDA0003200761450000062
reagent，旋涡震荡10秒，室温孵育10min；然后将细胞培养孔中的培养基弃去，加入无血清培养基，将转染混合物轻柔加入到培养孔中，充分混匀，置于细胞培养箱中培养4h后，吸弃培养基，换为含10％血清的培养基，继续培养24h后，取其中一块6孔板进行间接免疫荧光；另一块6孔板培养48h后，收集293T细胞用于Western blot检测。
(1)间接免疫荧光检测pcDNA3.1-LG在293T细胞中的表达
取转染后的293T细胞，弃去培养基，用PBS洗涤3遍；2％多聚甲醛室温固定15min，用PBS洗涤3遍；1％Triton X-100，室温下作用15min，用PBS洗涤3次；2％BSA，4℃封闭过夜，PBS洗涤3遍；使用原核表达纯化蛋白免疫小鼠制备的LG抗血清，37℃孵育1h，PBS洗涤3次；加入FITC标记的羊抗鼠二抗，37℃避光孵育1h；PBS洗涤6次，加入PBST 1mL，荧光显微镜下观察，并拍照保存，结果见图7。图7结果表明，在转染pcDNA3.1-LG重组质粒的293T细胞中，可以看到特异绿色荧光，可见pcDNA3.1-LG重组质粒能在293T细胞中获得表达。
(2)Western blot分析pcDNA3.1-LG在293T细胞中的表达
取出转染的293T细胞置于冰上，用冰冷的PBS洗涤3次，加入蛋白上样缓冲液，收获细胞至1.5mL EP管中，煮沸15min；4℃，14000rpm/min离心10min，取上清即为蛋白样品，western blot分析表达情况，结果见图8。Western blot结果显示，在转染重组质粒pcDNA3.1-LG的293T细胞中，可以检测到大小约为45kDa的蛋白质条带；而在转染空载体质粒的293T细胞中，未检测到相应的目的条带。
实施例5免疫效果评价
(1)动物免疫
将BALB/c小鼠分为3组，每组5只，前两组分别免疫重组质粒pcDNA3.1-LG和空质粒pcDNA3.1，剂量为100μg/只，免疫方式为腿部肌肉注射；第三组为对照组，肌注等体积PBS。首次免疫后，在一周和两周时加强免疫，剂量和方法同首次免疫。首次免疫后每间隔7d，随机取3只小鼠采血，收集血清，-20℃保存，共采血3次。每次采血后，处死小鼠，分离脾细胞，进行淋巴细胞转化试验。
(2)血清抗体滴度检测
采取间接ELISA法对血清抗体滴度进行检测，以纯化后的LG重组蛋白为抗原(200ng/孔)进行包被，小鼠血清为一抗(稀释倍数为1:50)，HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗(稀释倍数1:5000)，测定OD450。
采用ELISA方法对免疫后的小鼠进行血清抗体检测，结果见图9；图9结果显示，免疫重组质粒pcDNA3.1-LG后的抗体水平高于空质粒组和PBS组。
(3)淋巴细胞转化试验
取处死小鼠脾脏，制备脾细胞悬液，注意使用红细胞裂解液裂解红细胞，PBS洗涤后，使用细胞培养基重悬细胞。细胞以105CFU/孔铺96孔板，每只小鼠脾细胞铺6孔，其中1～3孔加入11μL纯化的LG重组蛋白(5μg/mL)，作为试验组；4～6孔加入11μL 1640培养基，作为未刺激组；另往10～12孔加入1640培养基，作为无细胞对照组。作用72h后，加入MTT，继续培养4h，然后往孔中加入Formazan溶解液，混匀后培养4h，测定OD570。计算刺激指数＝(试验组OD570nm均值-无细胞对照组的OD570nm均值)/(未刺激组的OD570nm均值-无细胞对照组的OD570nm均值)。
以试验组刺激指数/未刺激组刺激指数为纵坐标，以时间为横坐标作图，结果见图10；图10结果显示，重组质粒pcDNA3.1-LG免疫组的刺激指数高于PBS组和空质粒组。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 河北科技师范学院
<120> 一种布鲁氏菌L7/L12和GroES真核表达载体的构建方法及其应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
gcggatccac catggtggct gatctcgcaa agatcgtt 38
<210> 2
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
gcgctcgggc agtatcatca ttcctccctt gagttcaacc ttggcgccag ca 52
<210> 3
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
ggcgccaagg ttgaactcaa gggaggaatg atgatactgc ccgagcgcct 50
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
gcctcgagtc agacaagcgc atgtagagaa gca 33
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
taatacgact cactataggg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
tgctagttat tgctcagcgg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
ctagagaacc cactgcttac 20
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
tagaaggcac agtcgagg 18
<210> 9
<211> 1230
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
atggctgatc tcgcaaagat cgttgaagac ctttcggccc tgaccgttct ggaagccgct 60
gagctgtcca agcttctcga agagaagtgg ggcgtttcgg ctgctgctcc ggtcgctgtt 120
gctgctgccg gtggcgctgc ccctgctgct gccgcagaag aaaagaccga attcgacgtc 180
gttctcgctg acggcggcgc taacaagatc aacgtgatca aggaagtgcg cgcactcacc 240
ggtctcggcc tcaaggaagc caaggacctg gtcgaaggcg ctccgaaggc tgtcaaggaa 300
ggcgcctcga aggacgaagc tgagaagatc aaggcacagc tcgaagctgc tggcgccaag 360
gttgaactca aggaagaaat gatgatactg cccgagcgcc tcgacgatct gacggaccga 420
tatgatgcga tcttttgcga cgtctggggc gttgtacaca acggcgaaac gtcctttgcg 480
ccggccatcg ccgccttgca gcgcgctcgc gccaagggtg tgacaatcat tctcgtgacc 540
aattctccac gcccgcatcc gggcgttgtc gcgcagatgt cgcttctggg tgtgcccgaa 600
gatgcctatg accgtgttgt cacttccggt gatgttacgc gcgatcttat cgccgaaggg 660
ccgcgccgga ttttccacat cggctgcgag cgcgagcttg ccatttatga tgggcttgac 720
gtggagctgg tcgaggaatt tgaggcggca ggcgtggttt gtaccgggct ttatgacgat 780
gaagtcgaaa cgccagaaga ctacagggaa ttgctccagc gtctgcgcgc gcgcaacctg 840
cctttcattt gcgccaatcc tgatatcatg gtggaacgcg ggcctcgcct catctggtgc 900
gcgggcgcgc ttgcacgcga atacggccag cttggagggc gcaccctgat tgcaggcaag 960
ccccatcgcc cgatctatga ggcggcgctt cgcgcggtgg aaagcattcg cggtggaagc 1020
gtggacaaga gccgcattct tggcattggc gacggcgttt tgaccgatgt gaaaggggct 1080
gcggattttg gcctcgatgt gctttatatt tcgggcggcg ttcatgccgc cgattatgcg 1140
gtgaacgggg atctcgatat ggcgaagatg gaggcttttc tggaaaagca tggccatcgc 1200
cccattgctt ctctacatgc gcttgtctga 1230

Claims (3)

1.一种布鲁氏菌L7/L12和GroES真核表达载体的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)提取B.abortus 2308基因组DNA；
(2)利用引物LG-1和LG-2PCR扩增L7/L12基因，LG-3和LG-4PCR扩增GroES基因；扩增产物纯化后1：1混匀作为重叠PCR的模板，以引物LG1和LG4进行扩增，将L7/L12和GroES两个基因连接，获得L7/L12-GroES；
其中，LG-1和LG-2以及LG-3和LG-4的引物序列如下：
LG-1：5’-GCGGATCCACCATGGTGGCTGATCTCGCAAAGATCGTT-3’；SEQ ID NO.1；
LG-2：5’-GCGCTCGGGCAGTATCATCATTCCTCCCTTGAGTTCAACCTTGGCGCCAGCA-3’；SEQ IDNO.2；
LG-3：5’-GGCGCCAAGGTTGAACTCAAGGGAGGAATGATGATACTGCCCGAGCGCCT-3’；SEQ IDNO.3；
LG-4：5’-GCCTCGAGTCAGACAAGCGCATGTAGAGAAGCA-3’；SEQ ID NO.4；
(3)将纯化后的L7/L12-GroES与质粒pcDNA3.1进行双酶切、连接和转化，涂布Amp平板培养过夜；挑取单菌落进行PCR鉴定，获得阳性克隆，提取质粒，经测序验证正确，获得真核表达载体pcDNA3.1-LG。
2.根据权利要求1所述的一种布鲁氏菌L7/L12和GroES真核表达载体的构建方法，其特征在于，步骤(2)所述PCR和重叠PCR的反应体系为：上下游引物各1μL，DNA模板1μL，PCRMixture 25μL，蒸馏水补齐50μL；反应条件为：94℃预变性5min；94℃60s，50℃30s，72℃延伸60s，32个循环；72℃终末延伸8min。
3.权利要求1所述的一种布鲁氏菌L7/L12和GroES真核表达载体在制备布鲁氏菌疫苗中的应用。
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