CN106497892A - 带KT3标签的重组病毒rPCV2‑KT3的构建方法 - Google Patents

带KT3标签的重组病毒rPCV2‑KT3的构建方法 Download PDF

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Abstract

带KT3标签的重组病毒rPCV2‑KT3的构建方法，涉及检测PCV2病毒的克隆体的构建方法，包括KT3标签引物的设计、感染性克隆（rPCV2‑KT3）的构建。本发明建立的感染性克隆（rPCV2‑KT3）可用作PCV2感染PCR诊断的标准阳性对照；用于疫苗免疫效果评价中抗体水平测定的靶抗原及临床诊断中PCV2病毒分离的阳性对照。

Description

带KT3标签的重组病毒rPCV2-KT3的构建方法
技术领域
本发明涉及检测PCV2病毒的克隆体的构建方法。
背景技术
猪圆环病毒病（Porcine circovirus disease，简称PCVD）是由猪圆环病毒2型（PCV2）引起的一类猪病的总称，主要包括断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎肾病综合征、猪呼吸道疾病综合征和母猪的繁殖障碍。PCVD现已在全世界范围内发生和流行，其发病率可达60%，死亡率3%-10%，发病严重地区猪场在暴发本病时死淘率达到40%左右，给世界养猪业带来了巨大的损失。为控制猪圆环病毒病的流行，目前，商品化全病毒灭活疫苗和亚单位疫苗已在世界各地养猪场应用，并取得较好的效果。但是这些疫苗接种成本较高，并不能完全阻断PCV2的传播。
临床上最常用的检测PCV2病毒的方法是PCR方法，该方法往往需要阳性对照，通常的做法是使用PCV2强毒作为阳性对照，该做法存在两个问题，一是可能散毒，且一旦散毒后无法区分扩散的是检测用强毒还是流行的野毒；二是目标DNA难以定量；同样，测定猪圆环病毒病免疫效果，间接免疫荧光是常用方法，通常以PCV2强毒感染的PK-15细胞作为检测抗原，与PCV2病毒检测方法相似，该方法同样存在两个问题，一是存在散毒风险；二是作为目标抗原的PCV2病毒缺乏识别标记，当存在PCV2、PCV1污染时，难以区分测得的抗体是针对PCV1、还是PCV2的抗体。
发明内容
为了避免野生病毒制作的诊断抗原可能存在的污染、难以标准化等问题，本发明目的是提出构建带KT3标签的PCV2感染性克隆和带KT3标签的PCV2病毒。
本发明包括以下步骤：
1）引物设计：设计PCV2全长引物，所述PCV2全长引物的上、下游引物的5’端插入病毒基因组自带的Sac II限制性内切酶酶切位点；
设计在PCV2全基因组的ORF2的羧基端（C端）插入含猿猴病毒40大T抗原（KT3）标签（含11个aa：KPPTPPPEPET）的引入KT3的上下游引物引物；
以PCV2唯一的酶切位点Nco I设计一对鉴定pSK-KT3-dPCV2双拷贝重组质粒用引物；
2）PCV2病毒DNA的提取；
3）将步骤2）中获得的病毒DNA使用步骤1）设计的引物利用重叠延伸PCR的方法，扩增带KT3标签的PCV2全基因组；
4）胶回收PCR产物并连接至pMD®19-T Vector，获得重组质粒pSK-KT3-dPCV2；
5）将重组质粒pSK-KT3-dPCV2转化大肠杆菌DH5α，获得重组质粒T-sPCV2-KT3；
6）构建pSK-KT3-sPCV2单拷贝重组质粒；
7）构建pSK-KT3-dPCV2双拷贝重组质粒；
8）电转化Dulac细胞并进行传代培养，获得带KT3标签的rPCV2-KT3重组病毒。
本发明目设计一对引物在PCV2全基因组的ORF2的羧基端（C端）插入含猿猴病毒40大T抗原（KT3）标签（含11个aa：KPPTPPPEPET），利用重叠延伸PCR方法，获得含KT3标签的全长序列，将其连接至pMD®19-T Vector，重组质粒转化大肠杆菌DH5α，获得重组质粒T-sPCV2-KT3。利用SacII限制性内切酶对重组质粒T-sPCV2-KT3进行酶切和胶回收，pBluescript II SK(+) 载体以同样限制性内切酶酶切、去磷酸化并回收，将两者的回收产物利用T4连接酶进行过夜连接、转化，获得pSK-KT3-sPCV2单拷贝重组质粒。利用PCV2基因组中唯一的限制性内切酶Sac II、Nco I与Nde I进行酶切，获得三个目的片段，T4连接酶连接，获得首尾依次串联的双拷贝重组质粒pSK-KT3-dPCV2。以电转染的方法转入Dulac细胞，经传代培养最终获得含KT3标签的rPCV2-KT3重组病毒。
本发明借助分子克隆技术，在体外构建含猿猴病毒40大T抗原（KT3）的感染性克隆；感染性克隆电转化无PCV污染的PK-15细胞，获得带KT3标签的PCV2病毒。感染性克隆可用作PCV2感染PCR诊断的标准阳性对照；带KT3标签的PCV2病毒既可用于临床诊断中PCV2病毒分离的阳性对照，也可用于疫苗免疫效果评价中抗体水平测定的靶抗原。由于感染性克隆完全在体外构建，电转化过程也在完全可控的条件下进行，因此所获纯净的带KT3标签的PCV2病毒，避免了野生病毒制作的诊断抗原可能存在的污染、难以标准化等问题。
本发明以上步骤1）中所述PCV2全长引物为：
P1-SacII-F 5’-GAATCACCGCGGGCTGGCTGAACTTTTGAAAGT-3’ ；
Sac II
P2-SacII-R 5’-GCAACTCCGCGGAAATTTCTGACAAACGTTACA-3’ 。
Sac II
所述引入KT3的上下游引物为：
所述鉴定pSK-KT3-dPCV2双拷贝重组质粒用引物为：
PCV2 -Nco I-F1 5’-CATACCATGGTGAAGAAGTGGTTGTTATTG-3’ ；
Nco I
PCV2 -Nco I-R1 5’-CATACCATGGTAACCATCCCACCACTTG-3’ 。
Nco I
以提取的DNA为模板，利用高保真酶与上游引物P1-SacII-F、下游引物P2-SacII-R扩增PCV2的全基因组（长度1767 bp）。用引物P1-SacII-F/ P4-KT3-Rp1扩增出一条580 bp的片段，用P3-KT3-Fp1/P2-SacII-R扩增出一条1200 bp的片段。将两个PCR的产物，用PCR产物回收试剂盒回收目的片段。利用重叠延伸的方法，再以全长引物P1-SacII-F/P2-SacII-R扩增出带有KT3标签的1800 bp的全长基因组。
步骤4）中通过连接pMD®19-T Vector，利用感受态细胞大肠杆菌DH5α转化，获得重组质粒T-sPCV2-KT3。重组质粒T-sPCV2-KT3利用SacII限制性内切酶进行酶切和胶回收，pBluescript II SK(+) 载体同样用限制性内切酶SacII进行酶切、去磷酸化并回收，将两者的回收产物利用T4连接酶进行过夜连接、转化，获得pSK-KT3-sPCV2单拷贝重组质粒。利用PCV2上唯一的限制性内切酶Sac II、Nco I与Nde I进行酶切，获得三个目的片段，T4连接酶连接，获得首尾依次串联的双拷贝重组质粒pSK-KT3-dPCV2。
步骤8）中所述将大量提取的双拷贝重组质粒pSK-KT3-dPCV2电转化Dulac细胞，进行传代获得感染性克隆rPCV2-KT3，进行PCR鉴定和TCID50/mL的测定。
本发明的有益效果：猪圆环病毒病是我国养猪业最重要的传染病之一，造成的经济损失难以估量。PCV2感染的实验室诊断，主要以PCR方法为主，因此，诊断用标准化核酸的需求量巨大；同时，PCV2疫苗免疫效果的评价，间接免疫荧光方法又是最常用的方法之一，纯净、标准化、带标签的PCV2自然具有巨大的市场需求，而带KT3标签的PCV2病毒正好满足了这一需求。本专利内容为PCV2感染的确诊、疫苗的评价提供了无可替代的新型工具，对我国猪圆环病毒病的防控将带来革命性的影响。
附图说明
图1为重组质粒pSK-KT3-dPCV2双拷贝感染性克隆的构建图。
图2为KT3-PCV2全基因组的PCR扩增产物在琼脂糖凝胶中的电泳条带图。
图3为重组质粒T-KT3-PCV2的PCR鉴定与酶切鉴定图。
图4为单拷贝重组质粒pSK-KT3-sPCV2的PCR鉴定与酶切鉴定图。
图5为双拷贝重组质粒pSK-KT3-dPCV2的PCR鉴定与酶切鉴定图。
图6为 rPCV2-KT3拯救病毒的PCR检测结果图。
图7为以rPCV2-KT3克隆毒株接种Dulac细胞后的荧光鉴定照片。
图8为以rPCV2-KT3克隆毒株接种Dulac细胞后的荧光鉴定照片。
图9为以 rPCV2-KT3克隆毒株接种Dulac细胞后的荧光鉴定照片。
图10为以PCV2阳性对照接种接种Dulac细胞后的荧光鉴定照片。
具体实施方式
本发明的具体技术方案如下：
（1）引物的设计：
根据PCV2基因序列，设计PCV2全长引物，其上、下游引物的5’端插入病毒基因组自带的Sac II限制性内切酶酶切位点：
P1-SacII-F 5’-GAATCACCGCGGGCTGGCTGAACTTTTGAAAGT-3’ ；
Sac II
P2-SacII-R 5’-GCAACTCCGCGGAAATTTCTGACAAACGTTACA-3’ 。
Sac II
另外一对引物在PCV2全基因组的ORF2的羧基端（C端）插入含猿猴病毒40大T抗原（KT3）标签（含11个aa：KPPTPPPEPET）：
以PCV2唯一的酶切位点Nco I设计一对鉴定pSK-KT3-dPCV2双拷贝重组质粒：
PCV2 -Nco I-F1 5’-CATACCATGGTGAAGAAGTGGTTGTTATTG-3’ ；
Nco I
PCV2 -Nco I-R1 5’-CATACCATGGTAACCATCCCACCACTTG-3’ 。
Nco I
以上第一对引物可以扩增出PCV2的全长DNA序列1800 bp；P1-SacII-F/ P4-KT3-Rp1可扩增出一条580 bp的片段，P3-KT3-Fp1/P2-SacII-R扩增出一条1200 bp的片段。
将两个PCR产物，用PCR产物回收试剂盒回收目的片段。经核酸测定仪测出回收片段浓度，利用重叠延伸PCR方法，重新利用全长引物P1-SacII-F/P2-SacII-R扩增出带有KT3标签的1800 bp的全长基因组，重组质粒（pSK-KT3-dPCV2）双拷贝感染性克隆的构建图如图1所示。
（2）PCV2病毒DNA的提取：
取培养离心后的细胞培养液上清或反复冻融后的组织研磨液上清100 μL于1.5 mL指形管中，依次加入400 μL超纯水、92 μL 10% SDS溶液和8 μL蛋白酶K（20 mg/mL），涡旋混匀后置58℃金属浴30 min。再加入体积比为1:1的苯酚:氯仿600 μL，剧烈震荡混匀，12000 r/min离心15 min，小心吸取上清400 μL，加入-20℃预冷的无水乙醇800 μL，反复颠倒数次，-20℃静置20-30 min，12000 r/min离心10 min。弃上清，加入70%乙醇800 μL洗涤，12000 r/min离心5 min，弃上清，瞬离，弃残液并晾干，加入30 μLRTE，37℃作用30 min，立刻使用或-20℃保存备用。
（3）利用重叠延伸PCR的方法，扩增带KT3标签的PCV2全基因组：
①病毒DNA的扩增
在PCR管中分别加入下列试剂，组成50 μL的扩增反应体系：
A、PCR扩增580 bp的目的片段
B、PCR扩增1200 bp的目的片段
C、将A和B的PCR扩增产物纯化回收后，利用重叠延伸PCR的方法引入KT3标签，扩增1800bp的PCV2全长序列：
PCR扩增参数：98℃预变性10 s，98℃变性5 s，55℃退火1 min，72℃延伸2 min，30个循环；72℃延伸10 min。PCR反应结束后，于10℃保存。将扩增的PCR产物在琼脂糖凝胶中进行电泳检测（浓度：1%，含溴化乙锭0.5 μg/mL）电泳，结果如图2所示。
图2中：
M：DL5000 DNA marker；
1: PCR product of PCV2b1B/121108YZ by P1-SacII-F/P4-KT3-Rp1 (580 bp)
2: PCR product of PCV2b1B/121108YZ by P3-KT3-Fp1/P2-SacII-R (1200 bp)
3: PCR product of rPCV2-KT3 by P1-SacII-F/P2-SacII-R (1800 bp)
4: Positive control: PCR product of rPCV2 by P1-SacII-F/P2-SacII-R (1767bp)
5: Negative control。
从图2可见：将PCV2b1B/121108YZ的DNA模板，利用设计的引物P1-SacII-F/P4-KT3-Rp1和P3-KT3-Fp1/P2-SacII-R 分别进行PCR扩增，分别可以扩增出580 bp和1200 bp的目的片段。然后将扩增出的目的片段利用全长引物P1-SacII-F/P2-SacII-R，通过重叠延伸PCR技术再次进行PCR扩增，最后可扩增出带有KT3标签的1800 bp的目的片段，而阴性对照孔显示阴性，说明PCV2b1B/121108YZ中的KT3标签引入成功。
②DNA片段的纯化回收
PCR产物电泳鉴定正确后，切下目的条带于1.5 mL指形管中，用Agarose gel DNAextraction kit（Axygen公司产品）按产品说明书回收目的片段，最后用15 μL超纯水或缓冲液洗脱并测定DNA浓度，-20℃保存。
③回收产物连接pMD®19-T Vector
10 μL的连接体系：5 μL超纯水，1 μL10×Rapid ligation buffer，2 μL胶回收DNA片段，1 μL载体，1 μL T4DNA连接酶，混匀后4℃连接过夜。
④重组质粒转化
用CaCl2法制备感受态大肠杆菌DH5α，冰浴4 h后供转化试验用。将200 μL感受态细胞与连接产物轻轻吹匀，冰浴30 min，42℃热休克不超过90 s，立即冰浴3 min，补加37℃预热的LB培养基至1 mL，上下缓慢颠倒数次，置37℃摇床100 rpm，45-60 min，5000 rpm离心5min，弃去800 μL培养基，将剩余200 μL培养基重悬菌体，均匀涂布AIX平板，置37℃培养箱中培养过夜。
⑤质粒DNA小量制备
于AIX平板上无菌挑取单个白色菌落，接种于Amp/LB液体培养基并置37℃摇床220rpm，培养14 h左右。用碱裂解法小提质粒，取1 mL培养物，12000 rpm离心1 min，弃上清，加入100 μL预冷的溶液Ⅰ重悬细菌沉淀，加入200 μL现配的溶液Ⅱ，上下颠倒数次混匀后，冰浴不超过5 min，再加入150 μL预冷的溶液Ⅲ，上下颠倒混匀，冰浴3-5 min。12000 rpm离心10 min，小心吸取400 μL上清，用等体积的酚:氯仿（1:1）抽提一次，取上清，加入2倍体积的-20℃预冷的无水乙醇，上下轻柔颠倒数次后，-20℃静置15-30 min，12000 rpm离心10min，弃上清，用70%的乙醇洗涤一次，离心弃上清，瞬离，吸干。待乙醇挥发干净后，加入30 μL含RNase A（20 μg/mL）的TE buffer（pH8.0），37℃水浴30 min，溶解DNA沉淀，-20℃冻存备用。
按照步骤①中C的方法，取步骤⑤提取的质粒进行PCR扩增，通过限制性内切酶SacII酶切鉴定。经1%的琼脂糖凝胶电泳，若为阳性质粒则可扩增出一条1800 bp的条带，经限制性内切酶Sac II酶切可观察到1800 bp和3000 bp的两个条带，如图3所示。将阳性质粒送至测序，测序结果证实含KT3标签的PCV2片段已成功克隆到pMD®19-T Vector上。
酶切鉴定：在指形管中，配制总体积为20 μL 的酶切体系：
图3中：
M: DL5000 DNA marker；
1:PCR product of T-KT3-PCV2 by P1-SacII-F/P2-SacII-R (1800 bp)；
2:T-KT3-PCV2 plasmid by SacII enzyme digestion (1800 bp、3000 bp)；
3:Negative control。
由图3可见：重组阳性质粒T-KT3-PCV2通过全长引物 P1-SacII-F/P2-SacII-R进行PCR鉴定，可扩增出一条1800 bp的目的片段。另外，通过限制性内切酶SacII进行酶切作进一步鉴定，可以酶切出1800 bp和3000 bp的两条目的片段，而阴性对照无条带，说明重组质粒T-KT3-PCV2构建成功。
（4）单拷贝重组质粒pSK-KT3-sPCV2的构建
①将鉴定正确的T-KT3-PCV2重组质粒利用限制性内切酶Sac II进行酶切，重组质粒通过0.8% 琼脂糖凝胶电泳，用Agarose gel DNA extraction kit (Axygen公司) 按产品说明书进行目的片段的回收，最后用20 μL缓冲液或超纯水洗脱回收，并测定DNA的浓度。
②pBluescript II SK(+) 载体的酶切及去磷酸化
pBluescript II SK(+) 质粒用限制性内切酶Sac II酶切，将酶切后的线性质粒用CIAP（Taraka公司）进行去磷酸化，用10 μL灭菌超纯水洗脱回收。然后将①和②回收的目的片段用T4连接酶进行连接。
10 μL连接体系：
16℃金属浴过夜连接，按照步骤（3）中④的方法进行转化。
③单拷贝重组质粒pSK-KT3-sPCV2的PCR鉴定与酶切鉴定
按照用步骤（3）中⑤的方法，小量制备质粒，用步骤（1）中设计的PCV2全长引物P1-SacII-F /P2-SacII-R 进行PCR鉴定，并用限制性内切酶Bgl II和
Hind III酶切鉴定，配制总量为20 μL 的酶切体系。
A、Sac II限制性内切酶酶切
B、Hind Ⅲ 限制性内切酶酶切
如图4所示，将鉴定正确的质粒送至测序并进行序列的比对。
图4中：
M: DL5000 DNA marker；
1:PCR product of pSK-KT3-sPCV2 by P1-SacII-F/P2-SacII-R (1800 bp)；
2:Recombinant plasmid (pSK-KT3-sPCV2) by BglII enzyme digestion (1800 bp、2692 bp)；
3:Recombinant plasmid (pSK-KT3-sPCV2) by HindIII enzyme digestion (4492bp)；
4: Negative control。
由图4可见：单拷贝重组阳性质粒pSK-KT3-sPCV2通过PCR鉴定，利用全长引物 P1-SacII-F/P2-SacII-R可以扩增出一条1800 bp的目的片段。同时，利用限制性内切酶BglII和HindIII分别酶切作进一步鉴定，其中限制性内切酶BglII可以酶切出1800 bp和2692 bp的两条目的片段，而限制性内切酶HindIII进行单酶切出现一条4492 bp的条带，而阴性对照无条带，说明重组质粒pSK-KT3-sPCV2构建成功。
（5）单拷贝重组质粒pSK-KT3-sPCV2的大量制备
取阳性菌液，接种于500 mL Amp/LB液体培养基于37℃摇床220 rpm，培养16 h左右，按照 碱裂解法大量提取质粒DNA，用聚乙二醇沉淀法纯化质粒DNA，测定质粒DNA浓度及纯度后分装，-70℃保存备用。
（6）双拷贝重组质粒pSK-KT3-dPCV2的构建
①单拷贝重组质粒pSK-KT3-sPCV2的酶切及目的片段的回收
利用PCV2上唯一的三个酶切位点（限制性内切酶Sac II、Nco I与Nde I）进行酶切，具体步骤如下：
A、Nco I与Nde I进行双酶切，酶切体系（50 μL）：
B、Sac II与Nco I进行双酶切，酶切体系（50 μL）：
C、Sac II与Nde I进行双酶切，酶切体系（50 μL）：
37℃反应2 h后，在0.8%的琼脂糖凝胶电泳，用Agarose gel DNA extraction kit(Axygen公司) 按产品说明书进行目的片段的回收，最后用30 μL缓冲液或超纯水洗脱回收，并测定核酸DNA的浓度。
②连接反应
回收目的片段4491 bp、483 bp和1626 bp三个片段用T4 DNA Ligation（Takara公司）进行连接，16℃过夜连接。
③转化连接产物
将10 μL连接产物转化DH5α感受态细胞，将培养物均匀地涂布于LB平板（100 μg/mLIPTG、200 μg/mL X-Gal），置37℃培养箱中15 min，待涂抹物充分吸收后，将平板倒置于培养箱中继续培养。挑选白色单菌落接种到Amp/LB液体培养基进行少量扩增培养。
（7）双拷贝重组质粒pSK-KT3-dPCV2的PCR鉴定和酶切鉴定
①双拷贝重组质粒pSK-KT3-dPCV2的PCR鉴定
将过夜培养的菌液，通过菌液PCR的方法，利用PCV2-NcoI-F1/ PCV2-NcoI-R1引物进行PCR初步鉴定。
PCR反应体系（25 μL）：
PCR扩增参数：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸2 min，30个循环；72℃延伸10 min。PCR反应结束后，于10℃保存。将扩增的PCR产物在琼脂糖凝胶中进行电泳检测（浓度：1%，含溴化乙锭0.5 μg/mL）电泳，结果如图5所示。
②双拷贝重组质粒pSK-KT3-dPCV2的酶切鉴定
为了进一步确定构建的双拷贝重组质粒的正确性，分别用限制性内切酶
Bgl II与Hind III进行进一步的酶切鉴定。阳性质粒经限制性内切酶Bgl II酶切后会出现两条带，分别为1800 bp和4800 bp。限制性内切酶Hind III酶切重组质粒pSK-KT3-dPCV2，会出现一条6600 bp的单条带，如图5所示。
图5中：
M: DL5000 DNA marker；
1:PCR product of pSK-KT3-dPCV2 by P1-SacII-F/P2-SacII-R (1800 bp)；
2: Recombinant plasmid (pSK-KT3-dPCV2) by BglIIenzyme digestion (1800 bp、4800 bp)；
3: Recombinant plasmid (pSK-KT3-dPCV2) by HindIII enzyme digestion (6600bp)；
4: Negative control。
由图5可见：重组阳性质粒 pSK-KT3-dPCV2通过PCR方法进行初步鉴定，利用全长引物P1-SacII-F/P2-SacII-R可以扩增出一条1800 bp的目的片段。此外，利用限制性内切酶BglII和HindIII分别酶切作进一步鉴定，通过限制性内切酶BglII可以酶切出1800 bp和4800 bp的两条目的片段，限制性内切酶HindIII可以切出一条6600 bp的目的片段，而阴性对照孔显示阴性，说明重组质粒 pSK-KT3-dPCV2构建成功。
（8）双拷贝重组质粒pSK-KT3-dPCV2的大量制备
按照碱裂解法大量提取质粒DNA，本步骤与本部分步骤（5）中单拷贝重组质粒pSK-KT3-sPCV2的大量制备方法相同，-70℃保存备用。
（9）双拷贝重组质粒pSK-KT3-dPCV2的电转染
用大量提取的pSK-KT3-dPCV2的重组质粒，待Dulac细胞长至汇合度为90％左右时进行DNA 质粒的电转染。步骤如下：
将生长状态良好、待长至汇合度90％左右的Dulac细胞，用0.25%胰酶消化后转入离心管中，小心吹打混匀，1000 rpm离心5 min，弃去离心后的上清液，再用PBS洗涤3次，于最后一次洗涤后，将离心管瞬离，吸去管底少量的PBS。将10 μg质粒DNA与800 μL低渗液充分混匀后作为转染液，然后用转染液将离心在管底的细胞轻柔重悬并吹打混匀，室温静置2min。将细胞悬液加入到电转杯中，放入电穿孔转染仪中进行电击，电击完成后，静置5 min后取出。设定电转参数：电压为350 V，时间为400 μs，脉冲数为2。将电转杯中的转染液加入6 mL的细胞培养液中，混匀后转入6孔细胞板，在37℃，5% CO2培养箱中培养。同时设健康的Dulac细胞作为阴性对照。
（10）感染性克隆（rPCV2-KT3）的PCR检测及间接免疫荧光（IFA）检测
①感染性克隆rPCV2-KT3的PCR检测
将转染的细胞进行连续传代，盲传至第8代与第12代时，收取病毒液提取病毒核酸DNA进行PCR检测，提取方法与步骤（2）相同，运用步骤（1）设计的PCV2全长引物进行进行PCR的扩增，结果如图6所示。
图6中：
M：DL5000 DNA marker；
1：PCR product of rPCV2-KT3 (F8) by P1-SacII-F/P2-SacII-R (1800 bp)；
2：PCR product of rPCV2-KT3 (F12) by P1-SacII-F/P2-SacII-R (1800 bp)；
3：Negative control。
由图6可见：将盲传至第8代和第12代的感染性克隆rPCV2-KT3通过PCR方法进行检测，利用全长引物by P1-SacII-F/P2-SacII-R均可扩增出1800 bp的目的条带，而阴性对照孔显示阴性，说明感染性克隆rPCV2-KT3已克隆成功。
②感染性克隆rPCV2-KT3的间接免疫荧光（IFA）检测
收取第8代和第12代的感染性克隆rPCV2-KT3病毒液经反复冻融3次后，-70℃超低温冰箱保存备用。
将无PCV1污染且长势良好的健康Dulac细胞，消化后取适量分装到96孔板中，于5% CO2的37℃恒温培养箱中，培养18-24 h至细胞的对数生长期，弃去培养基，PBS洗涤3次，将PCV2细胞毒进行连续10倍稀释 (10-1-10-6) ，100 μL/孔，每个稀释度做8孔，以PCV2 （本实验室保存的PCV2b1B/Yangzhou/JS/121108YZ毒株）感染的Dulac细胞为阳性对照、健康的Dulac细胞为阴性对照，37℃吸附作用1.5 h，补加4% 胎牛血清(FBS)的DMEM培养基继续培养。60 h后结束培养并弃去培养液，5 min/次，用PBS洗涤96孔板，共洗涤3次，拍干或自然晾干，冷甲醇-20℃固定20 min，弃去固定液，自然晾干。
用PBS稀释猪源PCV2阳性血清 (1:1000) 与兔抗KT3多克隆抗体 (1:250)，加入96孔板各孔中，50 μL/孔，37℃孵育温箱1 h，PBS洗涤3次/5 min，吸水纸上拍干；避光加入25μL的1:200稀释的FITC标记的羊抗猪荧光二抗 (IgG)，37℃温箱避光孵育45 min后，PBS洗涤三次后拍干，再加入1:100稀释的Anti-Rabbit IgG (Fc specific)-Texas RedTM,antibody produced in donkey二抗25 μL，37℃温箱避光孵育45 min再洗涤3次，将96孔板放在倒置荧光显微镜下观察结果，第8代和第12代的拯救病毒rPCV2-KT3与亲本株PCV2的TCID50结果相似，TCID50/mL分别为105.8、106.0和106.0，可看到特异性的绿色荧光斑。
拯救病毒rPCV2-KT3的IFA结果可观察到能与PCV2血清发生特异性反应的绿色荧光斑，也能与KT3标签发生特异性反应的红色荧光斑，而对照的阴性健康细胞中无荧光，如图7至10所示。说明拯救病毒rPCV2-KT3在盲传的Dulac细胞中存在PCV2的病毒粒子，且KT3标签可随着PCV2的滾环复制得到表达。
从图7的以rPCV2-KT3克隆毒株接种Dulac细胞后的荧光鉴定照片可见：有绿色荧光。
从图8的以rPCV2-KT3克隆毒株接种Dulac细胞后的荧光鉴定照片可见：有抗KT3标签--红色荧光。
从图9的以 rPCV2-KT3克隆毒株接种Dulac细胞后的荧光鉴定照片可见：有以上两种组合的黄绿色荧光。
从图10的以PCV2阳性对照接种Dulac细胞后的荧光鉴定照片可见：有绿色荧光。
而阴性对照即健康的Dulac细胞后的荧光鉴定后，照片中则无荧光。
<110>扬州大学
<120>带KT3标签的重组病毒rPCV2-KT3的构建方法
<160>6
<210>1
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据PCV2全长基因设计
<400>1
gaatcaccgc gggctggctg aacttttgaa agt
<210>2
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据PCV2全长基因设计
<400>2
gcaactccgc ggaaatttct gacaaacgtt aca
<210>3
<211>57
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据KT3基因设计
<400>3
cattaggttt ccggttccgg cggcggggtc ggcggtttag ggttaagtgg ggggtct
<210>4
<211>57
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据KT3基因设计
<400>4
accctaaacc gccgaccccg ccgccggaac cggaaaccta atgaataata aaaacca
<210>5
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据鉴定pSK-KT3-dPCV2双拷贝重组质粒设计
<400>5
cataccatgg tgaagaagtg gttgttattg
<210>6
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据鉴定pSK-KT3-dPCV2双拷贝重组质粒设计
<400>6
cataccatgg taaccatccc accacttg
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<120>带KT3标签的重组病毒rPCV2-KT3的构建方法
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<223>根据PCV2全长基因设计
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<223>根据鉴定pSK-KT3-dPCV2双拷贝重组质粒设计
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Claims (4)

1.带KT3标签的重组病毒rPCV2-KT3的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）引物设计：设计PCV2全长引物，所述PCV2全长引物的上、下游引物的5’端插入病毒基因组自带的Sac II限制性内切酶酶切位点；
设计在PCV2全基因组的ORF2的羧基端插入含猿猴病毒40大T抗原标签的引入KT3的上下游引物；
以PCV2唯一的酶切位点Nco I设计一对鉴定pSK-KT3-dPCV2双拷贝重组质粒用引物；
2）PCV2病毒DNA的提取；
3）将步骤2）中获得的病毒DNA使用步骤1）设计的引物利用重叠延伸PCR的方法，扩增带KT3标签的PCV2全基因组；
4）胶回收PCR产物并连接至pMD®19-T Vector，获得重组质粒pSK-KT3-dPCV2；
5）将重组质粒pSK-KT3-dPCV2转化大肠杆菌DH5α，获得重组质粒T-sPCV2-KT3；
6）构建pSK-KT3-sPCV2单拷贝重组质粒；
7）构建pSK-KT3-dPCV2双拷贝重组质粒；
8）电转化Dulac细胞并进行传代培养，获得带KT3标签的rPCV2-KT3重组病毒。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于所述步骤1）所述PCV2全长引物为：
P1-SacII-F
5’-GAATCACCGCGGGCTGGCTGAACTTTTGA AAGT-3’ ；
P2-SacII-R
5’-GCAACTCCGCGGAAATTTCTGACAAACGTTACA-3’ ；
所述引入KT3的上下游引物为：
P3-KT3-Fp1：
P4-KT3-Rp1：
所述鉴定pSK-KT3-dPCV2双拷贝重组质粒用引物为：
PCV2 -Nco I-F1
5’-CATACCATGGTGAAGAAGTGGTTGTTATTG-3’
PCV2 -Nco I-R1
5’-CATACCATGGTAACCATCCCACCACTTG-3’ ；
以提取的DNA为模板，利用高保真酶与上游引物P1-SacII-F、下游引物P2-SacII-R扩增出1767 bp的 PCV2全基因组；
用引物P1-SacII-F/ P4-KT3-Rp1扩增出580 bp的片段；
用P3-KT3-Fp1/P2-SacII-R扩增出1200 bp的片段；
将上述后两个PCR的产物，用PCR产物回收试剂盒回收目的片段，利用重叠延伸PCR的方法，以全长引物P1-SacII-F和P2-SacII-R扩增出带有KT3标签的1800 bp的全长基因组。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于所述步骤4）中通过连接pMD®19-TVector，重组质粒转化大肠杆菌DH5α，获得重组质粒T-sPCV2-KT3；然后利用SacII限制性内切酶对重组质粒T-sPCV2-KT3进行酶切和胶回收，pBluescript II SK(+) 载体以同样限制性内切酶酶切、去磷酸化并回收，将两者的回收产物利用T4连接酶进行过夜连接、转化，获得pSK-KT3-sPCV2单拷贝重组质粒；再利用PCV2基因组中唯一的限制性内切酶Sac II、NcoI与Nde I进行酶切，获得三个目的片段，T4连接酶连接，获得首尾依次串联的双拷贝重组质粒pSK-KT3-dPCV2。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于所述步骤8）中，将大量提取的双拷贝重组质粒pSK-KT3-dPCV2电转化Dulac细胞，进行传代获得带KT3标签的rPCV2-KT3重组病毒。
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