CN102274523A - 一种猪圆环病毒ⅱ型核酸疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的技术方案是：一种猪圆环病毒II型核酸疫苗，在真核表达载体pIRES的2个多克隆位点中分别插入了猪圆环病毒II型LY株ORF2和猪IL-18基因，所述核酸疫苗共表达猪圆环病毒II型LY株Cap和猪IL-18蛋白。本发明经PCR、双酶切及测序鉴定，证明成功构建了共表达质粒pIRES-ORF2/PIL18。将构建成功的重组质粒pIRES-ORF2/PIL18用脂质体法转染猪肾PK-15细胞，以RT-PCR和间接免疫荧光检测目的蛋白的表达情况。经RT-PCR检测到两种目的基因的转录；间接免疫荧光试验检测到ORF2蛋白在细胞浆和细胞核中观察到了特异性的亮绿色荧光，证明蛋白得到表达。
Description
技术领域
本发明涉及一种核酸疫苗，具体涉及一种猪圆环病毒II型核酸疫苗及其制备方法。
背景技术
猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)是迄今为止发现的一种最小的动物病毒，有猪圆环病毒I型(PCV1)和猪圆环病毒II型(PCV2)两种基因型。猪是PCV2的易感动物，各种年龄、不同性别的猪都可以感染PCV2。常见的仔猪断奶后多系统衰竭综合征(Postweaningmultisystemic wasting syndrome，PMWS)主要发生在哺乳期和育成期的仔猪，尤其是5～12周龄的仔猪，一般于断奶后2～3天开始发病。从发病的季节来看，一年四季均可发病，但高峰期在五月，其次是四月和六月。发病日龄随着地区的不同也存在着差异，这与独特的诱发因素、母源抗体的水平以及它的下降速度不同都有一定的关系。在疾病感染流行过程中发病率和死亡率都较低，急性发病猪群中的死亡率可达10％，在感染PCV2的猪群中常常由于并发或继发细菌或病毒感染而死亡率大大增加。PCV2具有致病性，是PMWS的主要病原，PMWS呈世界性分布，是困扰养猪业的重要疾病。PCV2感染后导致猪体的免疫抑制，从而引起继发感染，进一步加重PCV2病情，给世界养猪业造成了巨大的经济损失。因此，PCV2及其所致的相关疾病引起了兽医界的高度重视，成为当前研究的热点。
PCV2为无囊膜的单股环状负链DNA病毒，属于圆环病毒科圆环病毒属。该病毒无囊膜，病毒粒子直径为14～25nm，基因组大小为1767bp或1768bp，ORF1和ORF2是最主要的读码框。ORF2大小为702bp，编码233个氨基酸，是病毒的主要结构蛋白(核衣壳蛋白)，具有良好的免疫原，产生的抗体在血清中维持时间长，是构建重组疫苗和检测的首选基因。Liu等用大肠埃希氏菌表达了ORF2融合蛋白，并证明该表达产物具有很强的免疫原性。
目前在生产中通常采用加强饲养管理、减少应激、做好其他疫病的预防等措施来控制该病的发生和流行。由于PCV2在体外细胞上增殖滴度不高，毒价测定须借助免疫过氧化物酶单层试验等，因此用全病毒来制备灭活疫苗或弱毒疫苗操作繁琐，成本高。而基因工程疫苗如DNA疫苗、亚单位疫苗及病毒活载体疫苗等将是研制PCV2疫苗的主要方向。DNA疫苗作为第3代疫苗，因其既有亚单位疫苗的安全性，又有减毒活疫苗的有效性而受到研究人员的重视，它能诱导机体产生特异性抗体和保护性免疫应答。研究人员对PCV2DNA疫苗的研究发现，单一抗原的DNA疫苗攻毒保护力较低。
许多研究表明，细胞因子能够增强机体对抗原的反应性或增强抗原的免疫原性。白细胞介素-18(Interleukin-18，IL-18)是近年来新发现的一种重要的细胞免疫调节因子，它可刺激Th1细胞高水平诱生IFN-γ、GM-CSF、IL-2等细胞因子，促进T细胞的增殖，显著增强Th1细胞和NK细胞的细胞毒作用等免疫调节功能。Muneta等于1999年首次成功克隆出了猪IL-18基因并对其序列进行了初步研究(Muneta Y，Mori Y，Shimoji Y，et al.Porcine interleukin18：cloning，characterization of the cDNA and expression with the baculovirus system[J].Cytokine，2000，12(6)：566-572.)。猪IL-18(pIL-18)是目前研究较多的细胞因子佐剂，其良好的免疫增强作用在一些基因疫苗的研究中得到证实。
早在DNA疫苗产生以前就有人把细胞因子作为佐剂与疫苗联用，但由于细胞因子在体内半衰期太短且造价昂贵，未能在传统疫苗中广泛应用。直接利用大肠杆菌表达的重组猪IL-18作佐剂，也仍有较大困难。一是由于大肠杆菌为原核表达系统，该系统表达的蛋白存在非糖基化形式和非天然状态折叠等缺陷，这使得表达的蛋白分子失去天然结构，因而对重组蛋白的活性还存在争议；二是要使猪IL-18发挥佐剂效应，就必须使它到达抗原应答部位，而体外表达的重组猪IL-18被机体转运至特定部位是极其困难的。真核表达系统则对重组蛋白可进行糖基化、折叠等修饰作用，重组蛋白在结构和生物学活性等方面更接近于天然蛋白，所以真核表达系统在研究中也被广泛使用。
DNA疫苗作为第3代疫苗，由于其有着其它疫苗无可比拟的优越性，引起了医学和预防兽医学界的极大兴趣。首先DNA疫苗的抗原合成、提呈过程与病原的自然感染极为相似，抗原经内源性合成后转运到细胞表面，经MHC-I类和MHC-II类分子直接提呈给免疫细胞，从而诱导机体的细胞免疫和体液免疫，特别是特异性CD+8细胞毒淋巴细胞(CTL)的免疫反应，这对于主要依赖细胞免疫机制形成免疫保护的病原感染的防治极有意义。这是灭活疫苗和一般亚单位疫苗不可比拟的。由于DNA疫苗具有这一与弱毒疫苗相同的优点，当强毒株弱化困难或弱毒株具有潜在毒力返强危险时，DNA疫苗可能成为弱毒疫苗极有希望的取代者。其次，对于易发生变异或血清型较多的病原时，进行多价活毒疫苗研制极为困难。相反，DNA疫苗则极具潜力，由于克隆病原的免疫原基因相对更为容易，获取多种基因的表达质粒，研究多价DNA疫苗在理论和实践上都是简易而可行的。
DNA疫苗应用的关键性问题是如何提高诱导机体免疫应答效率。为了增强DNA疫苗免疫效果，常采用引入细胞因子作佐剂，将抗原基因与细胞因子质粒联合注射或共表达的方法。细胞因子的免疫佐剂作用已在乙肝疫苗、肿瘤免疫和其它疫苗的研制中得到了广泛的应用。常用的细胞因子包括IL-2、IL-12、IL-6、IL-18、IL-13、GM-CSF和IFN-γ等。这些细胞因子既可调节机体的特异性抗体反应，又可增强机体的非特异性细胞免疫。构建细胞因子与抗原共同表达的核酸疫苗，通过细胞因子的网络作用，能优化宿主的特异性免疫反应，并诱导机体产生有效的免疫保护力，尤其是对免疫力低下和免疫缺陷的个体具有十分重要的意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是预防PCV2的单一抗原的DNA疫苗攻毒保护力较低，将猪白细胞介素-18(pIL-18)作为疫苗的一种重要的细胞免疫佐剂，制备一种猪圆环病毒II型核酸疫苗。
本发明的技术方案是：一种猪圆环病毒II型核酸疫苗，在真核表达载体pIRES的2个多克隆位点中分别插入了猪圆环病毒II型LY株ORF2和猪IL-18基因，所述核酸疫苗共表达猪圆环病毒II型LY株Cap和猪IL-18蛋白。
所述的猪圆环病毒II型核酸疫苗的制备方法，它的步骤如下：
(1)设计并合成了针对猪IL-18的引物pIL18fs/pIL18rs
上游引物pIL18fs为5’-TAAGTCGACATGGCTGCTGAACCGGA-3’，
下游引物pIL18rs为5’-CGTGCGGCCGCTTAGTTCTTGTTTTG-3’，
上、下游引物分别加入Sal I和Not I酶切位点，扩增长度为599bp；
设计并合成了针对猪ORF2的引物ORF2fs/ORF2rs
上游引物ORF2fs为5’-CTTACTCGAGATGACGTATCCAAGGAG-3’，
下游引物ORF2rs为5’-CGGGACGCGTATTCATTAAGGGTTAAG-3’，
上、下游引物分别加入Xho I和Mlu I酶切位点，该对引物扩增长度为727bp；
(2)利用引物pIL18fs/pIL18rs，PCR扩增猪IL-18基因，将PCR产物经Sal I和Not I双酶切回收后，插入pIRES的MCS B位点上，得到真核表达质粒pIRES-PIL18；
(3)利用引物ORF2fs/ORF2rs，PCR扩增ORF2基因，PCR产物经Xho I与Mlu I双酶切后，回收目的片段，插入同样处理的重组真核表达质粒pIRES-PIL18的MCS A位点上，得到真核表达质粒pIRES-ORF2/PIL18，制成猪圆环病毒II型核酸疫苗。
所述步骤(2)中PCR扩增猪IL-18基因的步骤为：以pGEM-T-PIL18质粒为模板，进行PCR扩增反应，扩增体系为：Premix Ex Taq DNA聚合酶25μL，1μL模板质粒，上、下游引物各1μL，补超纯水至50μL，混匀后于PCR仪上进行扩增另设无DNA对照，扩增程序为94℃预变性5min；然后进入94℃40s，58℃30s，72℃1min，进行30个循环；最后72℃延伸10min后置4℃保存，反应结束后取5μL PCR产物，以1％琼脂搪凝胶电泳观察结果。
所述步骤(3)中PCR扩增ORF2基因的步骤为：以pGEM-T-PCV2为模板，扩增PCV2ORF2全基因，反应体系为25μL Premix Ex Taq DNA聚合酶，1μL模板DNA，上、下游引物各1μL，补灭菌去离子水至50μL，PCR扩增条件为94℃预变性5min，然后进入94℃1min，58℃50s，72℃3.5min循环，进行30个循环，最后72℃延伸10min，PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测和PCR产物的回收。
所述步骤(3)中PCR产物经Xho I与Mlu I双酶切后，回收目的片段的步骤为：取回收的PCR产物50μL于200μL反应管中，加入10×buffer(H)10μL、Mlu I 5μL、Xho I 5μL，加灭菌水至100μL，置37℃水浴中消化3h，电泳切下所需的目的条带，参照V-gene DNA凝胶回收试剂盒说明书，纯化回收特异的DNA条带，电泳观察回收情况。
本发明的有益效果是：本发明经PCR、双酶切及测序鉴定，证明成功构建了共表达质粒pIRES-ORF2/PIL18。将构建成功的重组质粒pIRES-ORF2/PIL18用脂质体法转染猪肾PK-15细胞，以RT-PCR和间接免疫荧光检测目的蛋白的表达情况。经RT-PCR检测到两种目的基因的转录；间接免疫荧光试验检测到ORF2蛋白在细胞浆和细胞核中观察到了特异性的亮绿色荧光，证明蛋白得到表达。
本发明采用的真核双表达载体pIRES，在启动子下游的MCS A和MCS B的多克隆酶切位点分别插入猪圆环病毒II型ORF2基因片段和猪白介素-18基因片段，获得真核双表达质粒pIRES-ORF2/PIL18，构建的共表达重组质粒能在PK-15细胞上表达CAP蛋白和猪IL-18蛋白。本发明将猪圆环病毒ORF2基因片段和猪IL-18基因同时插入真核双表达载体pIRES，避免两种质粒共同免疫时可能存在的细胞摄取不成比例问题，提高局部抗原提成效率，增强局部免疫应答强度，缩短免疫应答潜伏期。
本发明中，重组质粒pIRES-ORF2和pIRES-ORF2/PIL18免疫小鼠，pIRES-ORF2/PIL18诱导小鼠的血清抗体，都高于pIRES-ORF2免疫组(图14)，差异不显著(P＞0.05)，而在诱导外周血T淋巴细胞亚群数量上，都要优于pIRES-ORF2(图11、图12、图13)，差异显著(P＜0.05)，这表明IL-18能增强Th1型免疫应答，由于IL-18与抗原基因共表达可以使IL-18和抗原基因存在于同一个微环境中，从而对免疫应答反应起了促进作用，从而对免疫效果加强。
附图说明
图1为猪IL-18全基因的PCR扩增，M.DNA Marker DL2000；1.PCR产物；
图2为pIRES载体图；
图3为真核共表达质粒pIRES-ORF2/PIL18载体的构建流程图；
图4为重组质粒pIRES-PIL18的PCR和酶切鉴定图，M.DNA Markerλ-EcoT14 I，1.Sal I单酶切，2.Not I+Sal I双酶切，3.重组质粒的PCR产物；
图5为PCV2 ORF2基因的PCR扩增结果，M.DNA Marker DL2000 I，1.PCR产物；
图6为重组质粒pIRES-ORF2/PIL18的菌液PCR扩增，M.DNA Marker DL2000，1.ORF2基因PCR产物，2.猪IL-18基因PCR产物；
图7为重组质粒pIRES-ORF2/PIL18的PCR和酶切鉴定图，M.DNA Markerλ-EcoT14 I，1 SalI单酶切，2.Not I+Sal I双酶切，3.重组质粒的PCR产物，m.DNA Marker DL2000；
图8为重组质粒pIRES-ORF2/PIL18的酶切鉴定图，M.DNA Markerλ-EcoT14 I，1 Mlu I单酶切，2.Xho Ⅰ和Mlu I双酶切；
图9为真核表达质粒pIRES-ORF2/PIL18转录产物的RT-PCR检测，M.DNA Marker DL2000，1.ORF2引物，2.猪IL-18引物；
图10为间接免疫荧光检测ORF2基因在CEF中的表达，A.重组质粒pIRES-ORF2/PIL18，B.阴性对照；
图11为二免后各组CD3+ T淋巴细胞亚群动态变化；
图12为二免后各组CD3+CD4+ T淋巴细胞亚群动态变化；
图13为二免后各组CD3+CD8+ T淋巴细胞亚群动态变化；
图14为免疫后血清中ELISA抗体动态(OD值)。
具体实施方式
一种猪圆环病毒II型核酸疫苗，在真核表达载体pIRES的2个多克隆位点中分别插入了猪圆环病毒II型LY株ORF2和猪IL-18基因，所述核酸疫苗共表达猪圆环病毒II型LY株Cap和猪IL-18蛋白。
所述的猪圆环病毒II型核酸疫苗的制备方法，它的步骤如下：
(1)设计并合成了针对猪IL-18的引物pIL18fs/pIL18rs
上游引物pIL18fs为5’-TAAGTCGACATGGCTGCTGAACCGGA-3’，
下游引物pIL18rs为5’-CGTGCGGCCGCTTAGTTCTTGTTTTG-3’，
上、下游引物分别加入Sal I和Not I酶切位点，扩增长度为599bp；
设计并合成了针对猪ORF2的引物ORF2fs/ORF2rs
上游引物ORF2fs为5’-CTTACTCGAGATGACGTATCCAAGGAG-3’，
下游引物ORF2rs为5’-CGGGACGCGTATTCATTAAGGGTTAAG-3’，
上、下游引物分别加入Xho I和Mlu I酶切位点，该对引物扩增长度为727bp；
(2)利用引物pIL18fs/pIL18rs，PCR扩增猪IL-18基因，将PCR产物经Sal I和Not I双酶切回收后，插入pIRES的MCS B位点上，得到真核表达质粒pIRES-PIL18；
(3)利用引物ORF2fs/ORF2rs，PCR扩增ORF2基因，PCR产物经Xho I与Mlu I双酶切后，回收目的片段，插入同样处理的重组真核表达质粒pIRES-PIL18的MCS A位点上，得到真核表达质粒pIRES-ORF2/PIL18，制成猪圆环病毒II型核酸疫苗。
所述步骤(2)中PCR扩增猪IL-18基因的步骤为：以pGEM-T-PIL18质粒为模板，进行PCR扩增反应，扩增体系为：Premix Ex Taq DNA聚合酶25μL，1μL模板质粒，上、下游引物各1μL，补超纯水至50μL，混匀后于PCR仪上进行扩增另设无DNA对照，扩增程序为94℃预变性5min；然后进入94℃40s，58℃30s，72℃1min，进行30个循环；最后72℃延伸10min后置4℃保存，反应结束后取5μL PCR产物，以1％琼脂搪凝胶电泳观察结果。
所述步骤(3)中PCR扩增ORF2基因的步骤为：以pGEM-T-PCV2为模板，扩增PCV2ORF2全基因，反应体系为25μL Premix Ex Taq DNA聚合酶，1μL模板DNA，上、下游引物各1μL，补灭菌去离子水至50μL，PCR扩增条件为94℃预变性5min，然后进入94℃1min，58℃50s，72℃3.5min循环，进行30个循环，最后72℃延伸10min，PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测和PCR产物的回收。
所述步骤(3)中PCR产物经Xho I与Mlu I双酶切后，回收目的片段的步骤为：取回收的PCR产物50μL于200μL反应管中，加入10×buffer(H)10μL、Mlu I 5μL、XhoⅠ5μL，加灭菌水至100μL，置37℃水浴中消化3h，电泳切下所需的目的条带，参照V-gene DNA凝胶回收试剂盒说明书，纯化回收特异的DNA条带，电泳观察回收情况。
具体实验操作如下：
1 材料
1.1 质粒
真核表达质粒载体pIRES/购自上海捷瑞生物工程公司，pGEM-T Easy载体等购自宝生物工程(大连)有限公司，猪IL-18的克隆质粒pGEM-T-PIL18购自河南省动物性食品安全重点实验室，PCV2LY株全基因组的克隆质粒pGEM-T-PCV2购自河南省动物性食品安全重点实验室。
1.2 主要试剂
Premix Ex Taq DNA聚合酶，DNA Markerλ-EcoT14 I，X-gal和IPTG，限制性内切酶Xho Ⅰ、Mlu I、Sal I、Not I等购自宝生物工程(大连)有限公司；DNA Marker DL2000购自博大泰克。DNA凝胶回收试剂盒购自杭州维特洁生化技术有限公司(V-gene)；DNA MarkerDL2000和质粒快速提取试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司。T4 DNA连接酶和Wizard PureFection Plasmid DNA Purification为Promega公司产品；LipofectamineTM 2000Reagent为Invitrogen公司产品；EZ Spin Column Total RNA Isolation Kit和AMV Single StepRT-PCR kit均购自BBI公司。
1.3 抗体
猪圆环病毒II型阳性血清购自武汉科前动物生物制品责任有限公司；FITC标记的兔抗猪IgG(二抗)为Sigma公司产品。
2 方法
2.1 真核表达质粒pIRES-PIL18载体的构建
2.1.1 引物设计与合成
根据哺乳动物细胞真核表达载体pIRES MCS B多克隆位点的序列和重组质粒pGEM-T-PIL18中猪IL-18基因阅读框架，设计1对引物，上、下游引物分别加入Sal I和Not I酶切位点(下划线部分)，扩增长度为599bp，上游引物位于起始密码子之前，下游引物位于终止密码子之后，两引物间包括完整的猪IL-18基因阅读框架(579bp)，引物本身不形成发夹结构，2条引物间不形成二聚体。引物由上海生物工程有限公司合成。
上游引物pIL18fs为5’-TAAGTCGACATGGCTGCTGAACCGGA-3’，
下游引物pIL18rs为5’-CGTGCGGCCGCTTAGTTCTTGTTTTG-3’。
2.1.2 猪IL-18基因的扩增
以pGEM-T-PIL18质粒为模板，进行PCR扩增反应，扩增体系为：Premix Ex Taq DNA聚合酶25μL，1μL模板质粒，上、下游引物各1μL，补超纯水至50μL。混匀后于PCR仪上进行扩增另设无DNA对照。扩增程序为94℃预变性5min；然后进入94℃40s，58℃30s，72℃1min，进行30个循环；最后72℃延伸10min后置4℃保存。反应结束后取5μL PCR产物，以1％琼脂搪凝胶电泳观察结果。
2.1.3 猪IL-18目的片段酶切回收
取回收的目的DNA 50μL于200μL反应管中，加入10×buffer(H)10μL、BSA 10μL、Trition10μL、Not I 3μL、Sal I 5μL，加灭菌水至100μL，置37℃水浴中消化过夜。电泳切下所需的目的条带，参照V-gene DNA凝胶回收试剂盒说明书，纯化回收特异的DNA条带。电泳观察回收情况。
2.1.4 真核表达载体pIRES的酶切回收
取真核表达载体pIRES 50μL于200μL反应管中，加入10×buffer(H)10μL、BSA10μL、Trition10μL、Not I 3μL、Sal I 5μL，加灭菌水至100μL，置37℃水浴中消化3h。电泳切下所需的目的条带，参照V-gene DNA凝胶回收试剂盒说明书，纯化回收特异的DNA条带。电泳观察回收情况。
2.1.5 猪IL-18目的片段与真核表达载体pIRES的连接
取酶切回收的猪IL-18目的片段7μL、pIRES载体1μL于200μL反应管中，加入10×ligation buffer 1μL、T4 DNA连接酶1μL，混匀后置16℃连接过夜，构建重组质粒pIRES-PIL18。
2.1.6 连接产物的转化
取目的片段与真核表达载体的连接产物10μL转化到50μL E.coli DH5α感受态细胞中，涂布于含氨苄青霉素(Amp)的LB平板上，37℃过夜培养12～16h。挑取白色菌落，提取真核重组表达质粒。
2.1.7 重组表达质粒pIRES-PIL18的PCR及双酶切鉴定
取重组表达质粒1μL做模板，PCR扩增体系和反应条件参照2.1.2进行，同时设以PIRES载体质粒为模板的阴性对照。上述PCR扩增产物各取5μL进行电泳分析。
取PCR扩增初步鉴定为阳性的重组质粒10μL，加入200μL反应管中，同时加入10×buffer(H)2μL，BSA 2μL、Trition 2μL、Not I 0.5μL，Sal I 1μL，加灭菌水至20μL，离心混合均匀，置37℃水浴消化3h。电泳观察酶切结果。
2.1.8 重组表达质粒pIRES-PIL18的序列鉴定
将PCR和酶切鉴定为阳性的重组质粒pIRES-PIL18送往宝生物工程(大连)有限公司，进行序列测定，验证其阅读框架及其连接方向。
2.2 真核表达质粒pIRES-ORF2/PIL18载体的构建
2.2.1 ORF2基因目的片段引物设计与合成
根据哺乳动物细胞真核表达载体pIRES MCS B多克隆位点的序列和重组质粒pGEM-T-PCV2中ORF2基因阅读框架，应用Primer(Version 5.0)基因分析软件设计1对引物，上、下游引物分别加入Xho I和Mlu I酶切位点(下划线部分)。该对引物扩增长度为727bp，上游引物位于起始密码子之前，下游引物位于终止密码子之后，两引物间包括完整的ORF2基因阅读框架(702bp)，引物本身不形成发夹结构，2条引物间不形成二聚体。引物由上海生物工程有限公司合成。
上游引物ORF2fs为5’-CTTACTCGAGATGACGTATCCAAGGAG-3’，
下游引物ORF2rs为5’-CGGGACGCGTATTCATTAAGGGTTAAG-3’。
2.2.2 ORF2基因目的克隆
应用ORF2基因特异性引物，以pGEM-T-PCV2为模板，扩增PCV2ORF2全基因。反应体系为25μL Premix Ex Taq DNA聚合酶，1μL模板DNA，上、下游引物各1μL，补灭菌去离子水至50μL。PCR扩增条件为94℃预变性5min，然后进入94℃1min，58℃50s，72℃3.5min循环，进行30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测和PCR产物的回收。取回收的PCR产物50μL于200μL反应管中，加入10×buffer(H)10μL、Mlu I 5μL、XhoⅠ5μL，加灭菌水至100μL，置37℃水浴中消化3h。电泳切下所需的目的条带，参照V-gene DNA凝胶回收试剂盒说明书，纯化回收特异的DNA条带。电泳观察回收情况。
2.2.4 真核重组表达质粒pIRES-PIL18的酶切回收
取重组表达质粒pIRES-PIL18 30μL于200μL反应管中，加入10×buffer(H)5μL、Mlu I2.5μL、Xho I 2.5μL，灭菌水至50μL，置37℃水浴中消化3h。电泳切下所需的目的条带，参照V-gene DNA凝胶回收试剂盒说明书，纯化回收特异的DNA条带。电泳观察回收情况。
2.2.5 ORF2目的片段与重组表达质粒pIRES-PIL18的连接
取Mlu I和XhoⅠ双酶切的质粒pIRES-PIL18 1μL、Mlu I和XhoⅠ双酶切回收的ORF2目的片段7μL于200μL反应管中，加入10×ligation buffer 1μL、T4 DNA连接酶1μL，混匀后置16℃连接过夜，构建重组质粒pIRES-ORF2/PIL18。
2.2.6 连接产物的转化
取目的片段与表达质粒的连接产物10μL转化到100μL E.coli DH5α感受态细胞中，涂布于含氨苄青霉素(Amp)的LB平板上，37℃过夜培养12～16h。
2.2.7 重组真核表达质粒pIRES-ORF2/PIL18的PCR及双酶切鉴定
取重组表达质粒各1μL做模板，猪IL-18基因PCR鉴定扩增体系和反应条件参照2.1.2。猪圆环病毒II型ORF2基因PCR鉴定扩增体系和反应条件参照2.2.2，同时设以pIRES质粒为模板的阴性对照。上述PCR扩增产物各取5μL进行电泳分析。
取PCR扩增初步鉴定为阳性的重组质粒各10μL，分别加入4个200μL反应管中，其中一管同时加入10×buffer(H)2μL，Mlu I 1μL，XhoⅠ1μL；一管加入10×buffer(H)2μL，Mlu I 1μL；一管同时加入10×buffer(H)2μL，Not I 1μL，Sal I 1μL；另一管加入10×buffer(H)2μL，Sal I 1μL，均加入灭菌水至20μL，离心混合均匀，置37℃水浴消化3h。电泳观察酶切结果。
2.2.8 重组表达质粒pIRES-ORF2/PIL18的序列鉴定
将PCR和酶切鉴定为阳性的重组质粒pIRES-ORF2/PIL18送往宝生物工程(大连)有限公司，进行序列测定，验证其阅读框架及其连接方向。
3.3 真核表达质粒的转染及表达产物的检测
参照Wizard PureFection Plasmid DNA Purification使用说明进行重组质粒pIRES-ORF2/PIL18的纯化。转染时，先用1640培养液洗涤已长成80％的单层PK-15猪肾传代细胞，按LipofectamineTM 2000 Reagent试剂盒的使用说明进行转染。转染细胞经37℃培养36～48h后，对其表达产物进行检测。
3.3.1 RT-PCR
以EZ Spin Column Total RNA Isolation Kit提取转染后48h及阴性对照的PK-15细胞总RNA，用ORF2和猪IL-18基因的特异性引物，按AMV Single Step RT-PCR kit试剂盒说明书进行RT-PCR检测。电泳检测扩增结果。
3.3.2 间接免疫荧光试验
待细胞转染48h后，用0.01mol/L PBS(pH7.4)洗涤1次，自然干燥；用100％丙酮固定5～10min，自然干燥后用PBST洗涤3次；10％BSA封闭30min，再PBST洗涤3次；用PBS将PCV2阳性血清作1∶40稀释，滴加于6孔培养板上，置湿盒内37℃1h。取出后用PBST洗涤3遍，每次5min，再用去离子水冲洗1遍后，自然干燥；用PBS将FITC标记的兔抗猪IgG(二抗)稀释到工作浓度，滴加在6孔培养板上，置湿盒内37℃1h，用PBST洗涤3遍，每次5min，再用去离子水冲洗1遍，自然干燥，在荧光显微镜下观察。
3 结果与分析
3.1 重组表达质粒pIRES-PIL18的构建与鉴定
3.1.1 猪IL-18基因的扩增
利用ORF2基因特异性引物，采用PCR技术，从重组载体pGEM-T-PIL18质粒为模板中扩增出约600bp的片段，如图1所示，与预期增片段大小吻合。
3.1.2 真核表达质粒pIRES-PIL18的构建
将扩增的猪白细胞介素-18基因与真核表达载体pIRES(图2)分别经用Sal I和Not I双酶切后连接，构建重组表达质粒pIRES-PIL18。重组表达质粒的构建路线如图3所示。
3.1.3 真核表达质粒pIRES-PIL18的酶切和PCR鉴定
提取重组质粒，进行PCR扩增，扩增出了1条0.6kb左右的目的条带。经Not I和Sal I双酶切后，出现了2条带，其中1条带为载体条带，位置约为6.1kb，另1条为插入的目的条带，位置约为600bp，经SalI单酶切只切出了1条约6700bp的条带，与预期结果相符(图4)。
3.1.4 重组表达质粒pIRES-PIL18的序列鉴定及分析
将PCR和酶切鉴定为阳性的重组质粒pIRES-PIL18送往宝生物工程(大连)有限公司进行序列测定，结果显示，插入的猪IL-18基因核苷酸序列为579bp，包含一个完整的开放阅读框，编码192个氨基酸，与重组质粒pGEM-T-PIL18中猪IL-18基因核苷酸序列完全一致。证明重组质粒pIRES-PIL18中插入了猪IL-18基因的核苷酸序列及阅读框完全正确。
3.2 真核表达质粒pIRES-ORF2/IL-18载体的构建与鉴定
3.2.1 PCV2 ORF2基因的扩增
利用特异性引物，以pGEM-T-ORF2作为模板，利用PCR技术扩增出ORF2基因。产物经1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测，在约0.7kb处有1条清晰带，与预期结果相符(图5)。
3.2.2 重组质粒pIRES-ORF2/IL-18的构建
回收PCR扩增的ORF2，经Xho I与Mlu I双酶切回收的ORF2基因与Mlu I和Xho Ⅰ双酶切回收的真核重组表达质粒pIRES-PIL18进行连接，构建重组表达质粒pIRES-ORF2/PIL18，重组表达质粒的构建路线如图3所示。
3.2.3 重组质粒pIRES-ORF2/PIL18的菌液PCR扩增
利用PCV2 ORF2基因和猪IL-18基因的特异性引物，采用PCR技术，以重组载体pIRES-ORF2/PIL18质粒为模板，分别进行PCR扩增，电泳结果在约0.7kb和0.6kb处出现特异性条带，与预期两条扩增片段大小吻合(图6)。
3.2.4 真核表达质粒pIRES-ORF2/PIL18的酶切鉴定重组质粒pIRES-ORF2/PIL18经Not I和Sal I双酶切后，出现了2条带，其中1条带为载体条带，位置约为6.8kb，另1条为插入的目的条带(猪IL-18)，位置约为0.6kb，经SalI单酶切只切出了1条7.4kb的条带，应用扩增猪IL-18的特异引物，以重组质粒为模板进行PCR扩增、电泳，出现1条约0.6kb的特异性条带(图7)，与预期结果相符；重组质粒pIRES-ORF2/PIL18经XhoⅠ和Mlu I双酶切后，得到约0.7kb和6.7kb的2条带，用Mlu I单酶切得到1条约7.4kb的带(图8)，与预期结果相一致。
3.2.5 重组表达质粒pIRES-ORF2/PIL18的序列鉴定及分析
将PCR和酶切鉴定为阳性的重组质粒pIRES-ORF2/PIL18送往宝生物工程(大连)有限公司，进行序列测定，与重组质粒pGEM-T-ORF2中ORF2基因核苷酸序列相一致。证明重组质粒pIRES-ORF2/PIL18中插入了ORF2基因的核苷酸序列及阅读框完全正确。
3.3 真核表达质粒pIRES-ORF2/PIL18转染后转录产物的鉴定
3.3.1 RT-PCR检测重组质粒转染PK-15细胞中猪IL-18、ORF2基因的mRNA
pIRES-ORF2/PIL18转染PK-15细胞，RT-PCR检测PK-15细胞中ORF2、猪IL-18基因的mRNA。提取pIRES-ORF2/PIL18转染后48h及阴性对照的PK-15细胞总RNA，用ORF2和猪IL-18基因的特异性引物进行RT-PCR扩增。结果表明，转染pIRES-ORF2/PIL18的细胞中能扩增出特异的ORF2和猪IL-18基因片段(图9)，而以未转染重组质粒的PK-15细胞总RNA为模板进行PCR扩增时则没有相应的片段。
3.3.2 间接免疫荧光检测
pIRES-ORF2/PIL18转染PK-15细胞，通过间接免疫荧光试验检测PCV2 Cap蛋白的表达情况。荧光显微镜下可见转染重组质粒的PK-15细胞浆中出现特异的黄绿色荧光，而转染空质粒的PK-15细胞浆内无特异性荧光(图10)。说明构建的共表达重组质粒可在哺乳动物细胞内表达有免疫反应活性的PCV2 Cap蛋白。
4 猪圆环病毒II型病毒ORF2基因与猪白介素-18基因免疫保护试验
4.1 材料与方法
4.1.1 材料
4.1.1.1 试验动物
昆明一系6周龄雌性小鼠，购自河南省试验动物中心。
4.1.1.2 质粒、细菌和抗体
工程菌DH5α、重组质粒pIRES-ORF2、pIRES-PIL18、pIRES-ORF2/PIL18及PCV2强毒LY株购自河南省动物性食品安全重点实验室。
猪圆环病毒II型ELISA检测试剂盒购自武汉科前动物生物制品责任有限公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗鼠IgG抗体购于北京鼎国生物技术发展公司。
4.1.1.3 主要仪器
超净工作台 苏净集团安泰公司
3K30冷冻离心机 德国Sigma公司
Wellscan Mks酶标仪、洗板机 芬兰雷勃集团产品
紫外凝胶成像系统 美国SIM公司
4.1.1.4 常用溶液
氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)贮存液：用ddH2O将氨苄青霉素配成100mg/mL，用0.22μm滤器过滤除菌，分装成小份，于-20℃保存备用。
PBS：140mmol/LNaCL，2.7mmol/LKCL，10mmol/LNa2HPO4，1.8mmol/LKH2PO4，加900mL ddH2O溶解，调pH值至7.2，再用ddH2O定容至1000mL，高压灭菌20min后，4℃保存。
质粒DNA提取的缓冲溶液：
溶液I：50mmol/L葡萄糖、25mmol/LTris-HCL(pH8.0)、10mmol/L EDTA(pH8.0)。溶液I可成批配制，每瓶100mL，高压灭菌15min，4℃保存备用。
溶液II：0.2M/L NaOH，1％SDS(临用前用10mol/L NaOH和10％SDS稀释)。
溶液III(100mL)：5mol/L乙酸钾60mL，11.5mL冰醋酸，28.5mLddH2O定容至100mL，并用高压灭菌。溶液终浓度为：K+3mol/L，Ac-5mol/L。
4.1.2 方法
4.1.2.1 重组质粒的大量提取及纯化
将pIRES-ORF2、pIRES-PIL18，pIRES-ORF2/PIL18及空载体pIRES真核表达质粒分别转化工程菌DH5α于LB培养基中(含氨苄青霉素70μg/mL)大量扩增培养，以碱裂解法进行制备质粒DNA。试验步骤：将洗过的500mL培养物的细菌沉淀物，重悬于10mL溶液I中。加1mL新配制的溶菌酶溶液。加20mL新配制的溶液Ⅱ。加15ml用冰预冷的溶液Ⅲ。封住瓶口，摇动离心瓶数次以混匀内容物，此时应不再出现分明的两个液相。于冰上放置10min，会出现一白色絮状沉淀。沉淀应包括染色体DNA、高分子量RNA和钾-SDS-蛋白质-膜复合物。用Sorvall GS3转头(或与其相当的转头)于4℃以4000rpm离心15min，使转头自然停止转动。如果细菌碎片贴壁不紧，则可以5000rpm再度离心20min，然后尽可能将上清全部转到另一瓶中，弃去残留在离心管内的粘稠状液体。未能形成致密沉淀块通常是由于溶液Ⅲ与细菌裂解物混合不充分。用4层经高压的纱布把上清过滤至250mL离心瓶中，加0.6体积的异丙醇，充分混匀，于室温放置10min。用Sorvall GS3转头(或与其相当的转头)于室温以500rpm离心15min，回收核酸。小心倒掉上清，敞开瓶口倒置离心瓶使残余上清液流尽，室温下用70％乙醇洗涤沉淀。倒出乙醇，并除去附于瓶壁的所有液滴，室温下将瓶倒置放在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥发完全。用3mL TE(pH8.0)溶解核酸沉淀。
4.1.2.2 质粒DNA的纯化
以聚乙二醇法进行纯化。取3mL冰预冷的5mol/L LiCI溶液加到上述制备的质粒DNA溶液中，充分混匀后12000rpm 4℃离心10min。弃沉淀，将上清转移到另一个离心管中，加入等体积的异丙醇充分混匀后，10000rpm室温离心10min。小心去掉上清，倒置离心管控干残留液滴，于室温下70％乙醇洗涤，控干后，加入500μL含RNA酶(20pg/mL)的TE溶解沉淀。将核酸溶液转入1.5mLEppendorf小管，置室温作用30min后，加入500μL含13％(W/V)PEG 8000的1.6mol/LNaCI溶液，充分混匀。12000rpm 4℃离心10min，吸出上清，加400μL TE重新溶解质粒DNA沉淀。酚/氯仿、氯仿分别抽提2次和1次，收集水相，加入100μL 10mol/L乙酸胺和2倍体积的乙醇，充分混匀，于室温静置10min。12000rpm 4℃离心10min，弃上清，沉淀以70％乙醇洗涤，真空干燥后，加入200μL TE(pH8.0)溶解沉淀。纯化后的质粒分光光度计检测浓度，适当稀释后用于动物免疫。
4.1.2.3 动物分组免疫
将100只6周龄雌性小鼠随机分为5组，20只/组。其中A为pIRES免疫组，B为pIRES-ORF2免疫组，C为pIRES-PIL18联合免疫组，D为pIRES-ORF2/PIL18质粒组，E为生理盐水对照组，免疫途径质粒均采用两后肢胫骨前肌多点注射100μg/只。生理盐水于腿部肌肉多点注射100μL，免疫方案见表1。
表1 试验鼠分组及免疫情况
4.1.2.4 淋巴细胞亚群测定方法
免疫后1、2、3、4、5、6周，随机抽取2只眼球采血2mL，柠檬酸钠抗凝，用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，用PBS溶液将细胞数调至5.0×106/mL。一管加入鼠CD3-SPRD、CD4-PE单克隆抗体各10μL，另一管加入CD3-SPRD、CD8-PE单克隆抗体各10μL，相应对照管加入鼠IgG-FITC、IgG-PE单克隆抗体各10μL，再分别加入淋巴细胞悬液50μL，混匀，4℃避光作用20min。加入PBS溶液500μL，混匀，室温避光作用10min。重悬细胞，流式细胞仪检测。
4.1.2.5 间接ELISA检测PCV2抗体水平
4.1.2.5.1 血清的制备
二次免疫后1、2、3、4、5、6周，随机抽取4只断尾采血，分离血清，用PCV2 ELISA检测试剂盒检测抗体水平。
4.1.2.5.2 抗体检测
运用武汉科前猪圆环病毒II型ELISA检测试剂盒(酶标二抗换为羊抗鼠辣根过氧化物酶标二抗)，按照说明书检测抗体。
4.1.2.6 攻毒保护试验
各组试验鼠于二免疫后第1周，应用PCV2强毒LY株强毒通过腹腔注射途径进行攻毒，500μL/只，攻毒后每周随机处死一只小鼠，无菌取各脏器，PCR检测PCV2病毒。
4.1.2.6.1 DNA的提取
取一定体积的组织悬液液，加入等体积的裂解液(5mol/LCuSCN，0.02mol/L EDTA PH8.0，0.05mol/L Tris-盐酸PH6.4，1.3％Triton X-100)混匀，37℃作用25min。取上清加等体积酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，14000rpm离心5min。取上清加1.5倍体积异丙醇，-70℃作用30min，14000rpm离心5min。弃上清，加入70％预冷乙醇，14000rpm离心5min。干燥后加入30μL灭菌双蒸水溶解DNA，置-20℃备用。
4.1.2.6.2 PCR检测
根据GenBank已发表的PCV2全基因序列(AF027217)，设计并合成1对特异引物，上游引物P1为5′-CTA ATT TTG CAG ACC CGG A-3′；下游引物P2为5′-GGG AAA GGG TGACGA ACT G-3′。扩增片段位于ORF1基因序列中，长度为354bp。
取5μLDNA，10×PCR缓冲液5μL，MgCl2浓度为4mmol/L，dNTPs浓度为200μmol/L，Taq酶1U，引物P1、P2浓度为0.5μmol/L，最后用双蒸水补至50μL，混匀后进行PCR扩增，扩增条件为：95℃预变性3min后，94℃40s，55℃30s，72℃30s，25个循环，72℃延伸8min。反应结束后，取6μL PCR产物用1％琼脂糖凝胶(含0.5μg/mL EB)进行电泳检测PCR的结果。
4.1.2.7 数据处理
用SPSS18.0 for Windows及Microsoft Excel统计软件将所得数据进行统计学处理，计算其平均值。
4.2 结果与分析
4.2.1 重组质粒及空质粒的浓度
经SDS碱裂解法制备重组质粒DNA和聚乙二醇沉淀法纯化重组质粒DNA，得到了足够数量的，用以免疫小鼠的重组质粒，如表2。
表2 重组质粒及空质粒的浓度
从表中数据可知，OD260/OD280均在1.700-1.900之间，表明所提质粒浓度及纯度符合试验要求。
4.2.2 外周血中T淋巴细胞亚群的动态变化
如图11、图12、图13和表3、表4、表5所示，二次免疫后第二周，pIRES-ORF2、pIRES-PIL18和pIRES-ORF2/PIL18组的T淋巴细胞亚群的值显著高于pIRES和生理盐水对照组差异极显著(P＜0.01)；二免后第三周pIRES-ORF2、pIRES-PIL18和pIRES-ORF2/PIL18组的外周血T淋巴细胞亚群数量都明显升高。
从试验组T淋巴细胞百分比出现的时间看，pIRES-ORF2、pIRES-PIL18和pIRES-ORF2/PIL18组在二免疫后第二周值已经显著高于二免疫前，并且各疫苗免疫组在免疫后第四周普达到峰值，与pIRES和生理盐水对照组差异极显著(P＜0.01)。比较各组T淋巴细胞百分比，值从大到小依次为：pIRES-ORF2/PIL18、pIRES-PIL18、pIRES-ORF2，pIRES和生理盐水没明显差异，说明猪IL-18能够显著提高猪圆环病毒基因工程疫苗pIRES-ORF2/PIL18 T淋巴细胞亚群百分比。
表3 二免后各组CD3+T淋巴细胞亚群动态变化
注：同一列数据肩标含不同小写字母表示差异极显著(P＜0.01)。
表4 二免后各组CD3+CD4+T淋巴细胞亚群动态变化
表5 二免后各组CD3+CD8+T淋巴细胞亚群动态变化
4.2.3 ELISA检测结果
如表6和图14所示，所有疫苗组在免疫后抗体水平都明显的升高，显著高于pIRES、PIL-18组和生理盐水对照组。pIRES-ORF2/PIL18和pIRES-ORF2组，二次免疫后第二周抗体水平达到峰值，pIRES-ORF2/PIL18的抗体整体水平高于pIRES-ORF2组(P＞0.05)，差异不显著。说明猪IL-18在提高猪圆环病毒基因工程疫苗pIRES-ORF2/PIL18抗体水平方面有一定的作用，但是效果不明显。
表6 方阵滴定的OD值结果
4.2.4 攻毒保护试验
攻毒后，从第一周开始，每周随机处死小鼠一只，连续四周，无菌取其脏器，研磨、反复冻融、离心取上清，然后按照常规DNA提取步骤提取DNA，分别通过PCR鉴定分析，结果如下：生理盐水组、pIRES组和pIRES-PIL18组，四次PCR结果均为阳性，表明存在PCV2；而pIRES-ORF2组和pIRES-ORF2/PIL18组，四次PCR结果均为阴性。
Claims (5)
1.一种猪圆环病毒II型核酸疫苗，其特征在于：在真核表达载体pIRES的2个多克隆位点中分别插入了猪圆环病毒II型LY株ORF2和猪IL-18基因，所述核酸疫苗共表达猪圆环病毒II型LY株Cap和猪IL-18蛋白。
2.如权利要求1所述的猪圆环病毒II型核酸疫苗的制备方法，其特征在于它的步骤如下：
(1)设计并合成了针对猪IL-18的引物pIL18fs/pIL18rs
上游引物pIL18fs为5’-TAAGTCGACATGGCTGCTGAACCGGA-3’，
下游引物pIL18rs为5’CGTGCGGCCGCTTAGTTCTTGTTTTG-3’，
上、下游引物分别加入Sal I和Not I酶切位点，扩增长度为599bp；
设计并合成了针对猪ORF2的引物ORF2fs/ORF2rs
上游引物ORF2fs为5’-CTTACTCGAGATGACGTATCCAAGGAG-3’，
下游引物ORF2rs为5’-CGGGACGCGTATTCATTAAGGGTTAAG-3’，
上、下游引物分别加入Xho I和Mlu I酶切位点，该对引物扩增长度为727bp；
(2)利用引物pIL18fs/pIL18rs，PCR扩增猪IL-18基因，将PCR产物经Sal I和Not I双酶切回收后，插入pIRES的MCS B位点上，得到真核表达质粒pIRES-PIL18；
(3)利用引物ORF2fs/ORF2rs，PCR扩增ORF2基因，PCR产物经Xho I与Mlu I双酶切后，回收目的片段，插入同样处理的重组真核表达质粒pIRES-PIL18的MCS A位点上，得到真核表达质粒pIRES-ORF2/PIL18，制成猪圆环病毒II型核酸疫苗。
3.根据权利要求2所述的猪圆环病毒II型核酸疫苗的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中PCR扩增猪IL-18基因的步骤为：以pGEM-T-PIL18质粒为模板，进行PCR扩增反应，扩增体系为：Premix Ex Taq DNA聚合酶25μL，1μL模板质粒，上、下游引物各1μL，补超纯水至50μL，混匀后于PCR仪上进行扩增另设无DNA对照，扩增程序为94℃预变性5min；然后进入94℃40s，58℃30s，72℃1min，进行30个循环；最后72℃延伸10min后置4℃保存，反应结束后取5μL PCR产物，以1％琼脂搪凝胶电泳观察结果。
4.根据权利要求2所述的猪圆环病毒II型核酸疫苗的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中PCR扩增ORF2基因的步骤为：以pGEM-T-PCV2为模板，扩增PCV2 ORF2全基因，反应体系为25μL Premix Ex Taq DNA聚合酶，1μL模板DNA，上、下游引物各1μL，补灭菌去离子水至50μL，PCR扩增条件为94℃预变性5min，然后进入94℃1min，58℃50s，72℃3.5min循环，进行30个循环，最后72℃延伸10min，PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测和PCR产物的回收。
5.根据权利要求2所述的猪圆环病毒II型核酸疫苗的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中PCR产物经Xho I与Mlu I双酶切后，回收目的片段的步骤为：取回收的PCR产物50μL于200μL反应管中，加入10×buffer(H)10μL、Mlu I 5μL、XhoⅠ5μL，加灭菌水至100μL，置37℃水浴中消化3h，电泳切下所需的目的条带，参照V-gene DNA凝胶回收试剂盒说明书，纯化回收特异的DNA条带，电泳观察回收情况。
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