CN117887897A - 一种鹅腺病毒4型的pcr检测引物及其试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鹅腺病毒4型的PCR检测引物及其试剂盒，属于生物技术与诊断检测技术领域。所述引物包括如SEQ ID NO.1所示的上游引物和如SEQ ID NO.2所示的下游引物，所述试剂盒包括所述引物。采用本发明的试剂盒，仅需将待检样品使用一对特异性引物进行PCR扩增后再进行电泳即可快速鉴定鹅腺病毒4型，简单实用、无需进行病原分离培养和电镜观察。当前尚未见基于分子生物学方法特异性鉴定鹅腺病毒4型的方法报道，本发明属于国内外首创，可填补相关研究领域空白。

Description

一种鹅腺病毒4型的PCR检测引物及其试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术与诊断检测技术领域，更具体地，涉及一种鹅腺病毒4型的PCR检测引物及其试剂盒。

背景技术

鹅腺病毒(Goose adenovirus)于1967年由Csontos等首次从匈牙利鹅群中发现(Csontos，1967)，随后该病毒在匈牙利及其周边地区蔓延。Zsa等从匈牙利某2-4周龄发病雏鹅的肝脏和肠道中分离到7株GoAdV，并根据其限制性内切酶切割模式将其分为三种基因型(GoAdV-1、GoAdV-2和GoAdV-3)(Zsa，1984)。Kajan等对20世纪70年代自匈牙利某死亡雏鹅中分离的鹅腺病毒P29株进行全基因组序列测定，并根据病毒全基因组特征将其命名为鹅腺病毒4型(GoAdV-4)，国际病分类委员会将该毒株归类为腺病毒科、禽腺病毒属的鹅腺病毒A种(http://ictv.global/report/adenoviridae)。

2022年4月，本申请的发明人团队于国内首次从病死雏鹅中分离获得GoAdV-4，同时通过分子生物学手段获取了国内第一株GoAdV-4的全基因组序列(CH-FJZZ-202201株，登录号：OR842729)。GoAdV-4感染宿主和日龄有不断扩大趋势，给我国养鹅业造成了较大威胁。因此建立一种准确、快速、灵敏的检测方法对其进行流行动态监测，保障养鹅业健康发展迫在眉睫。

聚合酶链式反应(PCR)因其特异性好、灵敏性高、重复性好、操作简便等优点，该方法在医学、动物、植物及微生物检验检疫等领域被广泛应用。目前国内外尚无特异性检测GoAdV-4的PCR检测试剂盒及检测方法。

发明内容

针对现有技术中缺乏特异性检测鹅腺病毒4型的PCR检测方法这一技术问题，本发明的目的在于提供一种鹅腺病毒4型的PCR检测引物及其试剂盒。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种鹅腺病毒4型的PCR检测引物，包括如SEQ ID NO.1所示的上游引物和如SEQID NO.2所示的下游引物。

本发明根据本团队上传至美国国家生物技术信息中心(National Center ofBiotechnology Information，NCBI)数据库的国内唯一1株鹅腺病毒4型(CH-FJZZ-202201株，登录号：OR842729)及国内外其它型腺病毒Hexon基因序列信息，经比对分析，设计特异性检测鹅腺病毒4型的引物(SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2)，建立了PCR方法，提供了一种鹅腺病毒4型的PCR检测试剂盒，可对鹅腺病毒4型感染快速鉴别诊断，节省了时间和成本，提高了准确性。

实际操作中，针对该基因特异性区域设计引物时，可设计出长度、起点和终点各不相同的无数引物。本发明人研究了各引物的可用性，不断调整引物设计参数，经大量理论数据筛选和临床样品检测，最终挑选出本发明所述引物。本发明引物发夹结构少、错配率低，扩增特异性好，可用于鹅腺病毒4型的检测和特异性扩增。

优选地，本发明提供一种鹅腺病毒4型的PCR检测试剂盒，包含上述的引物。

优选地，所述试剂盒还包括扩增反应液，更优选地，所述扩增反应液为2×PCRMaster Mix。所述2×TaqPCR Mix由DNA聚合酶、2×TaqPCR buffer和dNTP Mixture组成。

优选地，所述引物的浓度为10μM。

优选地，所述试剂盒的扩增反应体系为：扩增反应液10μL、SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示的引物各0.75μL、待测样本核酸模板2.0μL，剩余为灭菌去离子水，反应体系的总体积为20μL。

优选地，所述试剂盒的扩增反应条件为：94℃预变性5min后进入循环；94℃变性30s、54℃退火30s、72℃延伸45s；30个循环结束后，72℃终延伸10min。

本发明还提供利用上述试剂盒检测鹅腺病毒4型的方法，包括以下步骤：

S1：提取待测样本基因组

S2、PCR反应

其中，扩增反应体系为：扩增反应液10μL、SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物各0.75μL、待测样本核酸模板2.0μL，剩余为灭菌去离子水，反应体系的总体积为20μL。

扩增反应条件为：94℃预变性5min后进入循环；94℃变性30s、54℃退火30s、72℃延伸45s；30个循环结束后，72℃终延伸10min。

S3：结果判定

若出现长度为650bp的条带，即说明待测样本为鹅腺病毒4型阳性，反之则为阴性。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种鹅腺病毒4型的PCR检测引物，仅需将待检样品使用一对特异性引物进行PCR扩增后再进行电泳即可快速鉴定鹅腺病毒4型，简单实用、无需进行病原分离培养或电镜观察。当前尚未见基于分子生物学方法鉴定鹅腺病毒4型的方法报道，本发明可填补相关研究领域空白。

附图说明

图1为鹅腺病毒4型PCR检测结果图。

注：M：DL2000分子量标准；1：鹅腺病毒4型；2：灭菌去离子水。

图2为PCR扩增特异性试验结果图。

注：M：DL2000分子量标准；1：鹅腺病毒4型(GoAdV-4)；2：禽腺病毒4型(FAdV-4)；3：鸭腺病毒3型(DAdV-3)；4：减蛋综合征病毒(EDSV)；5：禽流感病毒(AIV-H9)；6：鹅圆环病毒(GoCV)；7：鹅星状病毒(GoAdV)；8：小鹅瘟病毒(GPV)；9：禽坦布苏病毒(ATV)；10：番鸭细小病毒(MDPV)；11：灭菌去离子水。

图3为PCR扩增敏感性试验结果图。

注：M：DL2000分子量标准；1：质粒10^-9稀释；2：质粒10^-8稀释；3：质粒10^-7稀释；4：质粒10^-6稀释；5：质粒10^-5稀释；6：质粒10^-4稀释；7：质粒10^-3稀释；8：质粒10^-2稀释；9：灭菌去离子水。

图4为PCR扩增重复性试验结果图。

M：DL2000分子量标准；1，3，5：鹅腺病毒4型；2，4，6：灭菌去离子水。

图5为临床应用结果图。

M：DL2000分子量标准；1-12，临床样品。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料；所用的设备，如无特殊说明，均为常规实验设备，所涉及的溶液无特殊说明均为水溶液。

试验用鹅腺病毒4型(CH-FJZZ-202201株)、禽腺病毒4型、鸭腺病毒3型、减蛋综合征病毒、禽流感病毒(H9)、鹅圆环病毒、鹅星状病毒、小鹅瘟病毒、禽坦布苏病毒和番鸭细小病毒均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所禽病研究室保存。12份鹅源组织病料来自2021年～2023年国内某鹅场送检的临床样品。

2×TransTaq-T PCR Super Mix、Easy Pure Viral DNA/RNA Kit、Easy PureBacteria Genomic DNA Kit和DNA分子量标准DL2000等均购自北京全式金生物技术有限公司。

实施例1一种鹅腺病毒4型的PCR引物及检测方法

1.1、引物设计

根据NCBI数据库的鹅腺病毒4型CH-FJZZ-202201株(登录号：OR842729)Hexon基因序列的特异性保守区域(18470～19119)，利用Lasergene DNAStar进行核苷序列分析比对，利用引物设计软件Oligo 7.0设计引物，序列如下：

上述引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2、病毒核酸的提取

试验用鹅腺病毒4型CH-FJZZ-202201株按照EasyPure Viral DNA/RNA Kit试剂盒的方法提取相应的病毒核酸，-80℃冻存备用。

1.3、PCR反应条件

按照2×TransTaq^-T PCR Super Mix试剂盒推荐的20μL体系进行扩增，其中2×PCRMaster Mix扩增反应液10μL、上游引物、下游引物(各10μM)分别为0.75μL、提取的核酸模板为2.0μL、补充灭菌去离子水至终体积20μL，混匀后进行PCR扩增。扩增条件为94℃预变性5min后进入循环，94℃变性30s、54℃退火30s、72℃延伸45s，30个循环结束后，72℃终延伸10min。

1.4、电泳检测

反应结束后，经1％琼脂糖凝胶电泳检查PCR扩增产物，鹅腺病毒4型的阳性对照样本扩增产物的条带大小为650bp，若待测样品电泳检测后出现650bp大小的条带则含有鹅腺病毒4型，反之则不含有鹅腺病毒4型(图1)。

实施例2特异性试验

按照实施例1的方法，分别对鹅腺病毒4型、禽腺病毒4型、鸭腺病毒3型、减蛋综合征病毒、禽流感病毒(H9)、鹅圆环病毒、鹅星状病毒、小鹅瘟病毒、禽坦布苏病毒和番鸭细小病毒参考毒株，以灭菌去离子水作为阴性对照进行PCR反应，检测本发明方法的特异性。以上扩增产物均用1％琼脂糖凝胶电泳进行分析。

结果显示，鹅腺病毒4型核酸扩增出了与预期大小相符的650bp的条带，而阴性对照以及其它病毒核酸均未扩增出任何条带。上述结果表明本发明方法能特异性扩增鹅腺病毒4型核酸，而不与其它病毒核酸发生交叉反应，本发明PCR检测方法具有很好的特异性(图2)。

实施例3敏感性试验

针对目的片段，以鹅腺病毒4型(CH-FJZZ-202201株)Hexon基因为模板(SEQ IDNO.3)，构建标准阳性质粒pMD18-Hexon，载体pMD18-T为TAKARA公司产品。阳性质粒经分光光度计(A260)测得质粒浓度为235.7ng/μL，通过计算获得标准阳性质粒的拷贝数为6.4×10¹⁰拷贝数/μL，-20℃保存。

按照实施例1的方法，分别对10^-2～10^-9稀释的阳性质粒和灭菌去离子水进行PCR反应，检测该方法的敏感性，PCR扩增产物均用1％琼脂糖凝胶电泳进行分析。结果显示，可检测到的最低质粒浓度为6.4×10³拷贝数/μL，表明该方法具有较好的敏感性(图3)。

实施例4重复性试验

按照实施例1的方法，对同一模板于不同时间做3次重复，其检测结果一致，证明该方法具有良好的重复性(图4)。

实施例5临床应用

按照实施例1的方法，对12份临床样品进行检测，结果获得阳性样品3份；对阳性样品送生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定，对获得序列比对分析发现，其均为鹅腺病毒4型(图5)。

以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

Claims (7)

1.一种鹅腺病毒4型的PCR检测引物，其特征在于，所述引物包括如SEQ ID NO.1所示的上游引物和如SEQ ID NO.2所示的下游引物。

2.一种鹅腺病毒4型的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的PCR检测引物。

3.根据权利要求2所述的一种鹅腺病毒4型的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括扩增反应液，所述扩增反应液为2×TaqPCR Mix，所述2×TaqPCR Mix由DNA聚合酶、2×TaqPCR buffer和dNTP Mixture组成。

4.根据权利要求3所述的一种鹅腺病毒4型的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的扩增反应体系为：扩增反应液10 μL，上游引物、下游引物各0.75 μL，待测样本核酸模板2.0 μL，剩余为灭菌去离子水，反应体系的总体积为20 μL。

5.根据权利要求4所述的一种鹅腺病毒4型的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述上游引物、下游引物的浓度均为10 μM。

6.根据权利要求2所述的一种鹅腺病毒4型的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的扩增反应条件为：94 ℃预变性5 min后进入循环；94 ℃变性30 s、54 ℃退火30 s、72 ℃延伸45s；30个循环结束后，72℃终延伸10 min。

7.一种采用权利要求2所述的试剂盒检测鹅腺病毒4型的方法，其特征在于,包括以下步骤：

S1：提取待测样本基因组

S2：PCR反应

其中，扩增反应体系为：扩增反应液10 μL，上游引物、下游引物各0.75 μL待测样本核酸模板2.0 μL，剩余为灭菌去离子水，反应体系的总体积为20 μL；

扩增反应条件为：94 ℃预变性5 min后进入循环；94 ℃变性30 s、54 ℃退火30 s、72℃延伸45s；30个循环结束后，72℃终延伸10 min；

S3：结果判定

若出现长度为650bp的条带，即说明待测样本为鹅腺病毒4型阳性，反之则为阴性。