CN110747292A

CN110747292A - 一种禽传染性支气管炎qx型病毒野毒与疫苗毒的鉴别方法

Info

Publication number: CN110747292A
Application number: CN201911193522.7A
Authority: CN
Inventors: 宋姗姗; 刘�东; 刘红祥; 李彬; 王群义; 张翔; 刘丰波; 任衍倍; 杜元钊
Original assignee: Qingdao Yebio Bioengineering Co Ltd
Current assignee: Qingdao Yebio Bioengineering Co Ltd
Priority date: 2019-11-28
Filing date: 2019-11-28
Publication date: 2020-02-04

Abstract

本发明提供了一种禽传染性支气管炎QX型野毒株与疫苗毒株的鉴别引物和鉴别方法，本发明利用禽传染性支气管炎QX型野毒与疫苗毒的序列差异，筛选出特异性的4条引物序列，建立鉴别QX型禽传染性支气管炎野毒和疫苗毒的双重RT‑PCR方法。本发明所述鉴别方法无需依赖深厚的专业背景，也无需借助昂贵的精密仪器，具有准确快捷、客观公正、经济实用的特点。

Description

一种禽传染性支气管炎QX型病毒野毒与疫苗毒的鉴别方法

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种禽传染性支气管炎QX型病毒野毒与疫苗毒的鉴别方法。

背景技术

传染性支气管炎(Infectious bronchitis IB)是由传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus IBV)引起鸡的一种急性、高度接触性的病毒性传染病，是当前危害养禽业最为严重的病毒性传染病之一。

IBV的血清型很多，而且新的血清型和变异株仍在不断出现,近年来QX型的IBV在我国鸡群中广泛流行，成为主要的流行毒株,为有效预防和控制该病的流行，鸡群免疫QX型疫苗，但是由于IBV血清型众多，而且无论是在免疫鸡群还是非免疫鸡群中，均可以检测到IBV毒株的流行，对于QX型野毒和疫苗毒感染缺乏有效的鉴别诊断方法。

目前国内外均没有可以鉴别诊断QX型疫苗株和野毒株感染的方法，难以对鸡群感染IBV基因型情况进行鉴定检测，这已成为目前影响动物防疫的一大难题，急需解决。

发明内容

本发明的目的是提供一种禽传染性支气管炎QX型病毒野毒与疫苗毒的鉴别方法，以及使用的引物组，从而弥补现有技术的不足。

本发明首先提供用于区别禽传染性支气管炎QX型病毒野生型病毒株与疫苗型病毒株的分子片段，以及区别于其他IBV，QX型IBV通用的分子片段。通过测得QX型疫苗型病毒株基因组全长序列以及目前流行的QX型野生型病毒株序列与GenBank上其他基因型IBV进行比对分析，找到禽传染性支气管炎QX型病毒野生型病毒株与疫苗型病毒株有差异的分子片段；通过GenBank中其他基因型IBV序列与QX型IBV序列比对分析，找到QX型IBV通用的分子片段，

其中禽传染性支气管炎QX型病毒野生型病毒株的分子片段为SEQ ID NO:1；

禽传染性支气管炎QX型病毒疫苗型病毒株的分子片段为SEQ ID NO:2；

禽传染性支气管炎QX型病毒通用的分子片段：SEQ ID NO:3；

本发明还提供一种用于检测禽传染性支气管炎QX型病毒野生型病毒株与疫苗型病毒株的的制品，所述的制品用于检测上述的分子标记；

所述的制品，优选为PCR扩增检测试剂盒或测序试剂盒。

本发明还提供用于区别禽传染性支气管炎QX型病毒野生型病毒株与疫苗型病毒株的引物对，所述的引物对用于检测上述区别禽传染性支气管炎QX型病毒野生型病毒株与疫苗型病毒株的分子片段；

其中一种具体的引物对的序列如下：

针对QX疫苗毒的上游引物：YM-F:ATACCGCCACCTGATGTTGT(SEQ ID NO:4)、

针对QX疫苗毒的下游引物：YM-R:TTTGAGCGTGTTCCTGTTGAC(SEQ ID NO:5)、

针对QX型IBV的上游引物：YD-F:AGTAGTGGTAGCGGGTCTTG(SEQ ID NO:6)、

针对QX型IBV的上游引物：YD-R:ACACACCTGCTGACGTAAC(SEQ ID NO:7)。

本发明还提供一种区别禽传染性支气管炎QX型病毒野生型病毒株与疫苗型病毒株的方法，是通过上述的引物组来进行PCR扩增检测。

本发明通过测得QX疫苗毒基因组序列以及大量目前流行的QX野毒序列，与GenBank中其他基因型IBV序列比对分析，筛选出能够区分QX疫苗毒和野毒的鉴别引物，并建立了相应的PCR鉴别方法。本发明所述鉴别方法无需依赖深厚的专业背景，也无需借助昂贵的精密仪器，具有准确快捷、经济实用的特点。

附图说明

图1：本发明中QX型IBV疫苗毒和野毒两对引物双重RT-PCR扩增结果图。

图2、图3是本发明中临床样品利用两对引物双重RT-PCR扩增结果。

具体实施方式

本发明提供了一种IBV的QX型野毒与疫苗毒的鉴别引物和鉴别方法通过测得QX疫苗毒基因组序列以及大量目前流行的QX野毒序列，与GenBank中其他基因型IBV序列比对分析，获得QX疫苗毒和野毒基因组序列的差异分子片段以及QX型IBV通用分子片段，为了检测差异分子片段，设计筛选出2对特异性的能够区分QX疫苗毒和野毒的鉴别引物；并利用上述鉴别引物建立了相应的PCR鉴别方法，依据特异性的PCR扩增结果判断鸡群感染毒株种类，从而达到鉴别QX疫苗株和野毒株感染的目的。

下面结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步详细的描述。

实施例1：QX型IBV疫苗毒和野毒株差异片段的筛选和检测引物设计

通过对QX型IBV疫苗毒、目前流行的QX野毒株、以及GenBank上其他基因型的IBV序列比对发现，与QX型疫苗株相比，其他基因型的IBV以及QX型野毒株，在IBV 1a基因上均有4个碱基的插入，根据此处差异设计引物，扩增QX型IBV疫苗毒株序列。其中禽传染性支气管炎QX型病毒野生型病毒株的分子片段为SEQ ID NO:1；禽传染性支气管炎QX型病毒疫苗型病毒株的分子片段为SEQ ID NO:2。所述引物序列为：

针对QX疫苗毒的上游引物：YM-F:ATACCGCCACCTGATGTTGT

针对QX疫苗毒的下游引物：YM-R:TTTGAGCGTGTTCCTGTTGAC

通过对GenBank中其他基因型IBV序列比对，发现不同基因型的IBV在S1基因差异较大，根据各基因型IBV S1序列比对结果，筛选出QX型IBV特有的分子片段，并在该处设计引物，扩增QX型IBV。所述禽传染性支气管炎QX型通用分子片段为SEQ ID NO:3。所述引物序列为：

针对QX型IBV的上游引物：YD-F:AGTAGTGGTAGCGGGTCTTG

针对QX型IBV的下游引物：YD-R:ACACACCTGCTGACGTAAC。

本发明还提供了利用上述鉴别引物的QX野毒和疫苗毒的鉴别方法。利用所述引物和鉴别方法鉴别临床样本QX野毒和疫苗毒感染情况。

参照天恩泽RNA提取试剂盒说明书提取所述样品的RNA。取病毒液200μL，加1000μL溶液A，混匀；加200μL氯仿溶液，震荡混匀，12 000rpm，4℃离心10min；小心吸取水相600μL加入到新的DEPC处理过的1.5mL离心管中，加等体积的溶液B混匀，分两次加到离心吸附柱中，12 000rpm，离心30s，弃穿透液，加700ul洗液，12 000rpm，离心30s，弃穿透液，12000rpm，空离30s。将离心柱转移新的DEPC处理过的1.5mL离心管中，加60ul洗脱液，12000rpm，离心30s，得到RNA-20℃保存备用。利用本发明中提供的4种引物，TAKARAPrimeScript 1 Step Enzyme对其RNA进行一步法RT-PCR扩增。

PCR反应体系为25μL，各种成分及使用量为PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 1μL、2×1 Step Buffer 12.5μL、4条引物(20μM)0.5μL、样品RNA50ng，用双蒸水补齐到25μL。PCR反应程序是50℃30min，94℃3min(94℃30sec→55℃35sec→72℃1min)×32个循环→72℃10min。

PCR反应结束后，取5μL扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测，加入Gold View I型核酸染料，然后在紫外透射反射分析仪下观察、照相和记录，根据电泳结果与提供的标准图谱对比。

实验结果如图1所示，图1为QX型IBV野毒和疫苗毒的双重RT-PCR扩增结果，其中1-4为临床上测序为QX型野毒的组织样品，5为阴性对照(SPF鸡组织样本)，6为QX型野毒阳性对照(CK/CH/JS/2010/12毒株)、7为疫苗阳性对照(青岛易邦生物工程有限公司生产的QX87疫苗毒)。M为DL2000 Marker，自上向下，大小依次为：2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。泳道1-4和6均出现了226bp条带，说明泳道1-4和6是QX野毒，泳道7出现622bp和226bp两条带，说明泳道7是QX疫苗毒。

实施例2：

从临床获得疑似IBV感染的48份组织样品，按照实施例1中所述试剂盒提取上述48份组织样品RNA，利用本发明提供的2对引物，进行双重RT-PCR反应。

在使用本发明所述引物和鉴别方法具体采样鉴别时，具体分以下情况判断样品的信息：

若待检样品用这2对引物RT-PCR扩增结果出现622bp以及226bp的两个条带则说明样品为QX型IBV疫苗毒；

若待检样品这2对引物RT-PCR扩增结果只出现226bp条带则判定为QX型IBV野毒。

若待检样品用这2对引物RT-PCR扩增结果没有条带则判定QX型IBV阴性。

图2和图3是用本发明的两对引物对48份疑似IBV感染样品进行PCR扩增结果，M为DL2000 Marker，自上向下，大小依次为：2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。泳道1-48为样品检测的PCR结果，结果显示样品2、3、4、7、19、24、44、46、47和48样品为QX疫苗毒，样品25-43和45样品为QX野毒感染。其余样品为QX型IBV阴性。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 青岛易邦生物工程有限公司

<120> 一种禽传染性支气管炎QX型病毒野毒与疫苗毒的鉴别方法

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 663

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ataccaccac ctgatgttgt gcctattaag gtaagcattg agtgttgtgg tgaaccatgg 60

aatacaatct tcaagaaggc ttataaagag cccattgaag ttgagacaga tctcacagta 120

gaacaattgc tcactgtgat ttatgataaa atgtgtgaag atctcaaact gttttcagag 180

gcaccagaac ctccaccatt tgagaatgtc gcacttgttg ataaaaatgg taaagatctg 240

gattgcataa aatcatgcca tctcatctac cgtgattatg agagcgatga tgacatcgag 300

gaagaagatg ctgaggagtg tgatacagat ccagctgatg ctgaggaatg tgatactgct 360

tcagagtgtg aagaagaaga tgaggataca aaggtgctgt ctcttttgca agacccagcc 420

agtaacaagt atcctctacc tcttgatgat gattatagtg tctataatgg atgtattgtt 480

cataaggacg ctctagatgt tgttaactta ccatctggtg aagaaacttt tgttgtcaat 540

aactgttttg aaggggctgt gaaaccgctt ccgcggaagg ttgttgatgt ccttggagat 600

tggggagagg ccgttgatgc acaagaacaa ttgtgtgaac aagagtctga atctgttaaa 660

gaa 663

<210> 2

<211> 669

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ataccgccac ctgatgttgt gcctattaag gttagcatag agtgttgtgg tgaaccatgg 60

aacactatct tcaagaaagc ttataaagag cccattgaag ttgaaactga tctcacagta 120

gaacaattgc tctctgtgat ctatgagaaa atgtgcgacg atctcaaatt gtttccggag 180

gcaccagaac ctccaccttt tgagaatgtc gcacttgttg ataagaacgg gaaagatttg 240

gattgtataa aatcatgcca ccttatctac cgtgattgtg agagcgatga tgacatcgag 300

gaagaagatg ctgaagaatg tgacacagat tcagctgatg ctgaggagtg tgacaccgcc 360

tcagaatgtg aagaagagga cgaggacact aaagtgctgg ctcttctaca ggacccagca 420

agtaataagt accccttacc tcttgatgaa gactatagcg tttacaatgg gtgcattgta 480

cataaagacg ctcttgatgt tgtgaatcta ccatctggtg aagaaacctt cgttgtcaac 540

aactgttttg atggagcagt taaaccgctg ccacaaaaag ttgttgacgt tctcggcgat 600

tggggtgagg ctgttgatgc acaagaacaa ctgtgtcaac aggaacacgc tcaaaacaat 660

tctgaagga 669

<210> 3

<211> 226

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agtagtggta gtgggtcttg tcctataaca ggcatgattc cacgtgatca tattcgtatt 60

tctgcaatga aaaatggttc tttattttat aatttaacag ttagcgtatc taaataccct 120

aattttaaat cttttcaatg tgttaacaac ttcacatctg tttatttaaa tggtgatctt 180

gtttttactt ccaataaaac tactgatgtt acgtcagcag gtgtgt 226

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ataccgccac ctgatgttgt 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tttgagcgtg ttcctgttga c 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

agtagtggta gcgggtcttg 20

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

acacacctgc tgacgtaac 19

Claims

1.一种区别禽传染性支气管炎QX型病毒野生型病毒株与疫苗型病毒株的分子片段，其特征在于，所述的分子片段，

其中禽传染性支气管炎QX型病毒野生型病毒株的分子片段为SEQ ID NO:1，

禽传染性支气管炎QX型病毒疫苗型病毒株的分子片段为SEQ ID NO:2，

禽传染性支气管炎QX型病毒通用的分子片段：SEQ ID NO:3。

2.一种用于检测禽传染性支气管炎QX型病毒野生型病毒株与疫苗型病毒株的制品，其特征在于，所述的制品用于检测权利要求1所述的分子片段。

3.如权利要求2所述的制品，其特征在于，所述的制品为PCR扩增检测试剂盒或测序试剂盒。

4.一种用于检测禽传染性支气管炎QX型病毒野生型病毒株与疫苗型病毒株的引物对，其特征在于，所述的引物对用于检测权利要求1所述的分子片段。

5.如权利要求4所述的引物对，其特征在于，所述的引物对中包含有：

用于检测QX疫苗毒的引物对，其上下游引物的序列分别为SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5；

用于检测QX野生型病毒株的引物对，其上下游引物的序列分别为SEQ ID NO:6和SEQID NO:7。

6.权利要求4或权利要求5所述的引物对在制备用于检测禽传染性支气管炎QX型病毒野生型病毒株与疫苗型病毒株的试剂盒中的应用。

7.一种区别禽传染性支气管炎QX型病毒野生型病毒株与疫苗型病毒株的方法，其特征在于，所述的方法是通过权利要求4或权利要求5所述的引物对来进行PCR扩增检测检测。