CN101423874A - 口蹄疫病毒多重rt-pcr检测试剂盒、其制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种口蹄疫病毒多重RT－PCR检测试剂盒，其制备方法及应用，属于动物疫病检测领域。本发明试剂盒的正链扩增引物由引物1、引物2和引物3所示的核苷酸序列组成；所述的负链扩增引物由引物4、引物5和引物6所示的核苷酸序列组成。多重RT－PCR试剂盒具有较高的敏感性，较常规RT－PCR试剂盒的灵敏度高10～100倍，且具有很好的特异性，即使由于临床样品保存不当或采集时不新鲜时，口蹄疫病毒RNA因各种原因降解断裂，仍可以得到正确的结果，有效解决了病毒含量低微样品不易检出的问题，提高了诊断的可靠性，缩短了检测时间，减少了样品之间交叉污染的机会，检测结果更为准确、可靠。
Description
技术领域
本发明涉及一种试剂盒，尤其涉及一种利用3对特异性引物扩增口蹄疫病毒不同基因片段的多重RT-PCR检测试剂盒，本发明还涉及该试剂盒的制备和应用方法，属于动物疫病检疫检测领域。
背景技术
口蹄疫(FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus，FMDV)引起的偶蹄动物的一种烈性传染病，被国际动物卫生组织(OIE)列为A类动物疫病的首位，是纳入世界性联防计划，予以重点控制和消灭的疫病之一。FMD曾经几度在世界范围内广泛流行，严重破坏畜牧业生产，造成了动物及其产品的国际贸易障碍，带来了巨大经济损失和不可估量的社会政治影响。
FMDV的持续性感染是造成本病难以控制的原因之一，无论自然感染后康复的动物，还是弱毒疫苗或灭活不彻底的灭活疫苗免疫的动物均可造成持续感染，持续感染的时期因动物种的不同而有差异。Domingo等提出了FMD持续感染的“准种”理论，认为感染的FMDV是一群在抗原性上和基因组上有不同程度差异的病毒种群组成的，这些异质性的病毒群的传播即使在没有免疫压力的情况下也会导致抗原变异株的产生，抗原变异株病毒在机体的免疫压力下或没有免疫压力的情况下均可选择性地适应于宿主的咽/食道部上皮而造成持续性感染。带毒动物一旦接触易感畜群，则很有可能导致本病暴发流行。
FMDV难以控制的另一个原因是，本病毒的血清型多，抗原变异性较强，通过交叉保护试验和血清学试验确定了FMDV有7个血清型和65个以上的血清亚型，血清型之间无交叉免疫现象。
由于FMDV传播速度快，危害程度大，在临床上也容易和其他传染病如猪水泡病、猪水泡性口炎等容易混淆。因此，对FMD做出快速而准确的诊断就显得尤为重要，尽早发现和确诊FMD疫情，剔除带毒动物，及时切断传染源，从而有效的控制FMD的流行，这也是控制和消灭FMD的前提和基础。
常规的病原学诊断方法主要有病毒的分离与鉴定、病毒抗原检测等，每种诊断方法都有其适用的范围。用常规病原学方法对脊髓、淋巴结、扁桃体和反刍动物食道咽部刮取物(OP液)等病毒含量低微的样品进行检测，往往得不到正确的结果。尽管RT-PCR技术具有敏感、特异和操作快速简便等特点，已广泛应用于生命科学的各个领域，已成功应用于FMD的研究与诊断，但在检测FMDV持续带毒和肉品检疫等方面仍需要进一步研究以提高检测敏感性。因此建立一种适用于各种样品、敏感、快速的检测方法是控制口蹄疫的关键技术之一。
RT-PCR技术已成功应用于研究口蹄疫的各个方面，与其它方法相比，其特点是特异性好，灵敏度高，简便快速，对检测样品要求低。可以检测不同的组织，如水泡皮、扁桃体、淋巴结、脊髓、肌肉和反刍动物食道/咽部分泌物等组织。目前已有许多实验室将其用于FMD的诊断和检测。它不但可以最快的对田间毒株做出分析，用于疫源追踪和分子流行病学调查，而且还可检测持续感染的病毒携带者。但由于FMDV是RNA病毒，在采集田间样品时，如果保存不当或样品不新鲜，都易造成病毒RNA降解，用单一引物RT-PCR扩增时由于RNA的降解，往往不能扩增出完整的目的片段，会出现假阴性结果。因此，如何提高检测准确性，成为急需解决的难点。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有检测试剂盒对于口蹄疫病毒含量低微的样品其准确率不高的问题，提供一种多重RT-PCR检测试剂盒，该试剂盒对于样品中含量低微的口蹄疫病毒(FMDV)也能够准确检出。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
一种口蹄疫病毒多重RT-PCR检测试剂盒，包括彼此独立分装的以下各组分，各组分的用量至少不低于进行一次RT-PCR反应的用量：RT-PCR反应缓冲液，dNTP混合物，25mmol/L的MgCl2；反转录酶，RNa se抑制子，Taq酶，无RNA酶的双蒸水，正链扩增引物和负链扩增引物，其中，所述的正链扩增引物由以下三种引物组成：引物1：GACTCG/AACGTCT CCC/TGCCAACT(SEQ ID NO：1)，
引物2：ACGACG/CGGGGCTTTTGCTTTCAC(SEQ ID NO：2)，
引物3：CG/TGGAAACGCAC/TGAGCAGTATC(SEQ ID NO：3)；
所述的负链扩增引物由以下三种引物组成：
引物4：TGCGG/TACGGCCACC/GTACTACTTC(SEQ ID NO：4)，
引物5：AGCTCCACGAA/GAAA/GGTGTCGAG(SEQ ID NO：5)和
引物6：CGTGATGTG/AGCG/AAGAATGAAGAA(SEQ ID NO：6)；
优选的，所述的正链扩增引物由引物1、引物2和引物3按照1:1:2的重量比例组成；所述的负链扩增引物由引物4、引物5和引物6按照1:1:2的重量比例组成。
所述的反转录酶为AMV Reverse Transcriptase XL；所述的Taq酶是AMV-Optimized Taq；
作为参考：
所述的正链扩增引物按照以下方法配制得到：将引物1、引物2或引物3分别用自动DNA合成仪合成后，稀释成浓度为12.5pmol/μl的溶液，再按照1:1:2的重量或体积比例配制而成；所述的负链扩增引物按照以下方法配制得到：将引物4、引物5或引物6分别用自动DNA合成仪合成后，稀释成浓度为12.5pmo l/μl的溶液，再按照1:1:2的重量或体积比例配制而成。
所述的试剂盒中，上述各种组分的最低包装量是进行一次RT-PCR反应的最低用量，该最低用量可参考以下用量：RT-PCR反应缓冲液5μL，dNTP混合物5μL，25mmol/L的MgCl210μL；反转录酶1μL，RNase抑制子1μL，Taq酶1μL，正链扩增引物1μL，负链扩增引物1μL，无RNA酶的双蒸水15μL；
在此用量的基础上，本领域的技术人员可根据实际需要，将各组分的包装量相应的增多，例如：RT-PCR反应缓冲液的包装量可以是1-10ml，dNTP混合物的包装量可以是1-10ml，25mmol/L的MgCl2的包装量可以是1-10ml；反转录酶的包装量可以是500μL-1500μL；Taq酶的包装量可以是500μL-1500μL；RNase抑制子的包装量可以是500μL-1500μL；正链扩增引物的包装量可以是500μL-1500μL；负链扩增引物的包装量可以是500μL-1500μL；无RNA酶的双蒸水的包装量可以是5mL-100mL。
本发明多重RT-PCR检测试剂盒中各组分进行一次完整的反应的用量如下：
RT-PCR缓冲液 5μL
MgCl2(25mmol/L) 10μL
dNTP混合物(每一种单核苷酸的浓度为2.5mM) 5μL
负链引物组 1μL
正链引物组 1μL
AMV Reverse Transcriptase XL 1μL
RNase Inhibitor 1μL
AMV-Optimi zedTaq 1μL
无RNase的dH2O 15μL；
更优选的，本发明多重RT-PCR检测试剂盒的组分包括空白对照和阳性对照；其中，所述的空白对照是RNase Free dH2O；所述的阳性对照是从已确认的含有口蹄疫病毒的样品中所提取得到的RNA。
本发明多重RT-PCR检测试剂盒中的各种组分都可从商业途径购买得到，所用到的引物都可采用自动DNA合成仪合成得到。
本发明口蹄疫病毒多重RT-PCR试剂盒(FMDV Multi-RT-PCR)的检测方法的原理和常规单一引物RT-PCR基本相同，其区别是本发明多重RT-PCR试剂盒是在同一PCR反应体系里加入三对引物，同时扩增出多个核酸片段。
本发明多重RT-PCR检测试剂盒的应用方法：
将待检测的样品按照常规方法提取RNA后，用本发明多重RT-PCR检测试剂盒的各组分进行常规RT-PCR扩增反应，将扩增得到的产物进行电泳，如果阳性对照同时扩增到了634bp、483bp和278bp三种条带，待检测样品扩增到了634bp、483bp或278bp中的一种或一种以上，空白对照无扩增条带，则可判定待检样品为阳性；反之，如果阳性对照同时扩增到了634bp、483bp和278bp三种条带，待检测样品没有扩增到634bp、483bp或278bp中的任一种，空白对照无扩增条带，则可判定待检样品为阴性。
作为参考，用本发明多重RT-PCR检测试剂盒进行RT-PCR反应时，所述的RT-PCR反应具体可参考以下条件进行：
一、反应体系：
10×RT-PCR缓冲液 5μL
MgCl2(25mmol/L) 10μL
dNTP混合物(每一种dNTP的浓度为2.5mM) 5μL
负链引物组 1μL
正链引物组 1μL
AMV Reverse Transcriptase XL 1μL
RNase Inhibitor 1μL
AMV-Optimized Taq 1μL
无Rnase的dH2O 15μL
待检RNA样品 10μL；
二、反应条件：1)50℃，30min；2)94℃，2min；3)94℃，50s；58℃，50s；72℃，60s；35个循环；4)72℃，8min。
FMDV是一种多血清型且高度易变的小RNA病毒，常规RT-PCR技术主要针对口蹄疫病毒某一特定基因设计引物，但如果病料保存不当或采集的样品不新鲜时，容易引起病毒RNA降解，不能扩增出目的基因，会出现假阴性结果。
本发明多重RT-PCR检测试剂盒可针对不同质量或来源的样品进行检测(例如：1、样品中的FMDV含量非常低微，2、样品中的RNA降解非常严重)，从样品中FMDV基因组可能因多种原因造成断裂入手，在一次反应中添加多对引物，使其总能捕获到任一引物对间的完整片段，扩增出特异性条带，增加RT-PCR的敏感性和检出率。本发明利用这一特点，设计了3对用于钓取FMDV不同基因片段的特异性寡核苷酸引物，建立了适于检测FMDV O、A、Asial三个血清型的Multi-RT-PCR方法，所设计的引物为简并引物，可以提高扩增的敏感性。
本发明多重RT-PCR试剂盒具有较高的敏感性，较常规RT-PCR试剂盒的灵敏度高10～100倍，且具有很好的特异性；因此不仅适合在FMD暴发时进行快速检测，而且在剔除持续带毒动物、肉品检疫方法也具有重要的应用价值。本发明人通过对多种样品的对比检测，证明了本发明多重RT-PCR试剂盒具有敏感、特异、快速的特点，可以检测不同低微含量样品中的FMDV。
本发明多重RT-PCR试剂盒的检测从病毒总RNA到扩增形成DNA，采用一步法完成反应，适合多血清型(包括A、O和Asia-I型)FMDV的检测，尤其适用于动物淋巴结、扁桃体、肉品及OP液等病毒含量低微样品的检测。
本发明的主要有益效果如下：
1、本发明重点解决了口蹄疫病毒含量低微样品不易检出的问题。利用可以扩增口蹄疫病毒不同基因片段的3对特异引物，在同一扩增体系中扩增，出现任一扩增条带均可判为阳性结果，因此，即使由于临床样品保存不当或采集时不新鲜时，口蹄疫病毒RNA因各种原因降解断裂，仍可以得到正确的结果，有效解决了病毒含量低微样品不易检出的问题，提高了诊断的可靠性。
2、对反应条件、引物比例、反应液配制的优化，组装成口蹄疫病毒多重RT-PCR检测试剂盒。利用一步法反应体系，缩短了检测时间，减少了样品之间交叉污染的机会，使检测结果更准确、可靠。
具体实施方式
以下通过实施例来进一步描述本发明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的范围。
实施例1、试剂盒的制备和组装
一、负链引物组和正链引物组的设计及配制
参考Genebank中的FMDV序列，设计了3对特异引物，分别位于VP1、3A、和3C基因，扩增产物片段大小分别为483bp、634bp、和278bp。引物序列如下：
VP1负链引物：5’TGC GG/TA CGG CCA CC/GT ACT ACT TC3’(23mer)(2个碱基简并)(SEQ ID NO：4)
VP1正链引物：5’GAC TCG/A ACG TCT CCC/T GCC AAC T3’(21mer)(SEQ IDNO：1)(2个碱基简并)，预期扩增片段长度为483bp。
3A负链引物：5’AGC TCC ACG AA/GA AA/GG TGT CGA G 3’(22mer)(SEQ IDNO：5)(2个碱基简并)；
3A正链引物：5’ACG ACG/C GGG GCT TTT GCT TTC AC 3’(23mer)(1个碱基简并)(SEQ ID NO：2)；预期扩增片段长度为634bp。
3C负链引物：5’CGT GAT GTG/A GCG/A AGA ATG AAG AA 3’(23mer)(2个碱基简并)(SEQ ID NO：6)；
3C正链引物：5’CG/TG GAA ACG CAC/T GAG CAG TAT C 3’(22mer)(2个碱基简并)(SEQ ID NO：3)；预期扩增片段长度为278bp。
采用自动DNA合成仪合成，稀释为12.5pmo l/μl。3对引物的使用比为VP1:3A:3C＝1:1:2。
二、试剂盒的组装
(1)10×RT-PCR缓冲液 1-10mL
(2)MgCl2(25mmol/L) 1-10mL
(3)dNTP Mixture(2.5mM each) 1-10μL
(4)负链引物组(3A634:VP483:3C278＝1:1:2) 1-500μL
(5)正链引物组(3A1:ZDVP1:3C1＝1:1:2) 1-500μL
(6)AMV Reverse Transcriptase XL 1-500μL
(7)RNase Inhibitor 1-500μL
(8)AMV-Optimized Taq 1-500μL
(9)无Rnase的dH2O 0.1-50mL
(10)空白对照(RNase Free dH2O) 1-5mL
(11)阳性对照 1-500μL；
其中，RT-PCR缓冲液，MgCl2，dNTP Mixture，AMV Reverse Transcriptase XL，AMV-Optimized Taq，RNase Free dH2O，RNase Inhibitor均来自于从Takara公司购买得到的One step RNA PCR试剂盒(说明：上述这些组分也可从任何一种生物试剂公司中单独购买得到)
试验例1 本发明多重RT-PCR试剂盒在检测口蹄疫病毒中的应用
一、检测田间样品来源：
舌皮、水泡皮样本共37份，均来自疑似口蹄疫症状病畜，但有部分样品为陈旧、腐烂样品。
淋巴结、扁桃体、脊髓等组织样本共66份，为来自西北五省区的肉品检疫样本和可疑病料。
OP液样本：牛、羊OP液样品共458份，采自采自疫区或非疫区同群且无口蹄疫症状的牛和羊。
二、待检测病毒样品总RNA的提取：
①取500μL组织样品研磨上清液置1.5mL eppendorf管中，加等量(500μL)三氯甲烷，快速振荡数秒，8000r/min，4℃，离心5min。细胞毒、水泡液、阳性样品不经此步处理。
②取上清液200μL置1.5mL eppendorf管中，加入1000μL样品裂解液TRIzol(Invitrogen公司)，反复混匀，冰上放置5min。
③加200μL三氯甲烷，小心盖上帽盖，用力摇动eppendorf管15s，室温放置5min。
④12000r/min，4℃，离心15min，可见分为三层，上层水相含RNA。
⑤转移水相至一新eppendorf管，加入等量异丙醇(约500μL)，混匀，室温放置15min。
⑥12000r/min，4℃，离心10min，离心后在eppendorf管边和底部可见有胶样RNA沉淀。
⑦洗RNA：弃上清，加1000μL 75％乙醇(使用前用RNase Free dH2O加无水乙醇配置而成，-20℃预冷)漂洗沉淀，漂洗二次，10000r/min，4℃，离心5min。
⑧室温充分干燥RNA沉淀。加10μL RNase Free dH2O，即可用于Multi-RT-PCR扩增。可以-20℃保存备用。
三、RT-PCR反应：
(1)每一个反应总体积50μL，其中：
10×One Step RNA PCR缓冲液 5μL
MgCl2(25mmol/L) 10μL
dNTP Mixture(2.5mM each) 5μL
负链引物组(3A634:VP483:3C278＝1:1:2) 1μL
正链引物组(3A1:ZDVP1:3C1＝1:1:2) 1μL
AMV Reverse Transcriptase XL 1μL
RNase Inhibitor 1μL
AMV-Optimized Taq 1μL
待检测RNA样品 10μL
无RNase的dH2O 15μL
空白对照：以RNase Free dH2O代替RNA模板，同样条件下扩增。
阳性对照：阳性对照样品和待检样品同时提取RNA，同一条件下扩增。
高速离心10s后，将反应管放入扩增仪中，指令设定程序开始工作。
(2)反应条件：1)50℃，30min；
2)94℃，2min；
3)94℃，50s；58℃，50s；72℃，60s；35个循环；
4)72℃，8min。
四、琼脂糖凝胶电泳和结果判定：
(一)琼脂糖凝胶电泳
(1)1.5％琼脂糖凝胶板的制备称取1.5g琼脂糖，加入100mL1×TAE缓冲液中。加热融化后加5μL(10mg/mL)溴乙锭，混匀后倒入放置在水平台面上的凝胶盘中，胶板厚5mm左右。依据样品数选用适宜的梳子。待凝胶冷却凝固后拔出梳子(胶中形成加样孔)，放入电泳槽中，加1×TAE缓冲液淹没胶面。
(2)加样取6-8μL PCR扩增产物和2μL加样缓冲液混匀后加入一个加样孔。每次电泳同时上样标准DNA Marker和空白对照。
(3)电泳电压80V-100V或电流40mA-50mA。电泳30min-40min。
(4)结果观察和判定电泳结束后，取出凝胶板置于紫外透射仪上打开紫外灯观察。强阳性样品电泳结果应为三条大小不一的条带，分别为634bp、483bp和278bp。如某一待检样品扩增产物的DNA带至少有一条与以上条带大小相符，同时空白对照无扩增条带，则该样品判定为阳性。
(二)组织样品检测结果
(1)采用本发明多重RT-PCR试剂盒对37份舌皮和水泡皮样品检测其中是否含有口蹄疫病毒，其中共检出27份阳性，阳性率高达73％，新鲜样品的检出率要比陈旧样品高；66份淋巴结和扁桃体样本共检出26份阳性，阳性率为39.4％。
(2)、OP液样品检测结果：采用本发明多重RT-PCR试剂盒共检测了OP液样品458份，检测出口蹄疫病毒阳性93份，阳性率为20.3％。
说明：对以上样品中检测为口蹄疫病毒阳性的部分样品进行序列测定，结果为口蹄疫病毒基因，说明本发明多重RT-PCR试剂盒的检测结果准确、可靠。
试验例2本发明多重RT-PCR试剂盒、常规RT-PCR试剂盒和病毒分离检测结果比较
检测样品：舌皮、水泡皮10份，为田间样品，采集时已陈旧、破溃。淋巴结、脊髓10份，OP液10份均为田间样品。
1、采用本发明多重RT-PCR试剂盒检测上述样品的检测结果
10份OP液检测结果均为口蹄疫病毒阳性；10份淋巴结、脊髓中检测出口蹄疫病毒阳性8份；10份舌皮、水泡皮中阳性2份。对上述阳性样品进行测序验证，证明所得序列均为口蹄疫病毒特异序列。
2、采用常规RT-PCR试剂盒(该试剂盒的引物序列为：正链引物：5’CG/TGGAAACGCAC/TGAGCAGTATC3’(22mer)(2个碱基简并)；负链引物：5’CGTGATGTG/AGCG/AAGAATGAAGAA3’(23mer)(2个碱基简并)；其它试剂与检测方法与本发明多重RT-PCR试剂盒相同)检测上述样品的检测结果
10份OP液中检出阳性1份；10份淋巴结、脊髓中检出2份阳性。10份舌皮、水泡皮均为阴性。
3、病毒分离结果
对所选的OP液、舌皮、水泡皮、淋巴结和脊髓样品以实验室常规方法接种3-5日龄乳鼠，连续传3代，乳鼠未发病，均为阴性。详细结果见表1。
表1本发明多重-RT-PCR试剂盒与常规RT-PCR和病毒分离的比较结果
| 样品种类 | 份数 | 常规RT-PCR试剂盒 | 多重-RT-PCR试剂盒 | 病毒分离 |
| 舌皮、水疱皮 | 10 | 阴性 | 阳性2份 | 阴性 |
| OP液 | 10 | 阳性1份 | 阳性5份 | 阴性 |
| 淋巴结、脊髓 | 10 | 阳性2份 | 阳性8份 | 阴性 |
以上30份样品对比检测结果进一步证明本发明口蹄疫病毒多重RT-PCR检测试剂盒可以准确检测出样品中所存在的低微含量的口蹄疫病毒。
Claims (5)
1、一种口蹄疫病毒多重RT-PCR检测试剂盒，包括彼此独立分装的以下各组分，各组分的用量至少不低于进行一次RT-PCR反应的用量：RT-PCR反应缓冲液，dNTP混合物，25mmol/L的MgCl2，反转录酶，RNase抑制子，Taq酶，无RNA酶的双蒸水，正链扩增引物和负链扩增引物，其特征在于：所述的正链扩增引物由以下三种引物组成：引物1：GACTCG/AACGTCTCCC/TGCCAACT，
引物2：ACGACG/CGGGGCTTTTGCTTTCAC，
引物3：CG/TGGAAACGCAC/TGAGCAGTATC；
所述的负链扩增引物由以下三种引物组成：
引物4：TGCGG/TACGGCCACC/GTACTACTTC，
引物5：AGCTCCACGAA/GAAA/GGTGTCGAG，
引物6：CGTGATGTG/AGCG/AAGAATGAAGAA。
2、按照权利要求1的口蹄疫病毒多重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：所述的正链扩增引物由引物1、引物2和引物3按照1:1:2的重量比例组成；所述的负链扩增引物由引物4、引物5和引物6按照1:1:2的重量比例组成。
3、按照权利要求2的口蹄疫病毒多重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的正链扩增引物按照以下方法配制得到：将引物1、引物2或引物3分别用自动DNA合成仪合成后，稀释成浓度为12.5pmol/μl的溶液，再按照1:1:2的重量或体积比例配制而成；所述的负链扩增引物按照以下方法配制得到：将引物4、引物5或引物6分别用自动DNA合成仪合成后，稀释成浓度为12.5pmol/μl的溶液，再按照1:1:2的重量或体积比例配制而成。
4、按照权利要求1的口蹄疫病毒多重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：所述的反转录酶为AMV Reverse Transcriptase XL；所述的Taq酶是AMV-Optimized Taq。
5、按照权利要求1的口蹄疫病毒多重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：该检测试剂盒含有空白对照或/和阳性对照。
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