KR101394421B1

KR101394421B1 - 돼지 콜레라의 검출 방법

Info

Publication number: KR101394421B1
Application number: KR1020077020641A
Authority: KR
Inventors: 베른트 호프만; 클라우스 디프너; 마르틴 비어
Original assignee: 아이덱스 래보러토리즈, 인코포레이티드
Priority date: 2005-02-09
Filing date: 2006-02-08
Publication date: 2014-05-14
Also published as: EP1856297A2; US7608433B2; WO2006086377A3; CA2597383A1; JP2008529527A; KR20070112789A; EP1856297B1; EP1856297A4; WO2006086377A2; US20060177818A1; CA2597383C; MX2007009547A

Abstract

본 발명은 돼지 콜레라(CSFV)의 간단하고 신속한 진단을 위해 이종체의 내부 대조군 시스템(즉, EGFP-RNA)을 구비한 복합 실시간 RT-PCR 분석에 관한 것이다. CSFV에 특이적인 프라이머들 및 FAM-표지된 타크만(TaqMan) 탐침은 다양한 CSFV 균주의 5'-비전사된 영역의 일치하는 서열을 분석함으로써 선택된다. 분석 감도를 결정하기 위해 5'-NTR의 체외전사(T7-PC3Alf)가 제조되고 시험되었다. 나아가, 내부 대조군의 서열의 검출을 위한 프라이머-탐침 시스템이 규정되었고, CSF-시스템 1 및 IC 실시간 PCR을 이용하는 복합 분석이 감도 또는 특이성의 손실 없이 한개의 튜브 분석으로서 수행될 수 있었다.

돼지 콜레라, 올리고뉴클레오타이드

Description

돼지 콜레라의 검출 방법{METHOD OF DETECTION OF CLASSICAL SWINE FEVER}

본 발명은 프라이머 및 탐침으로서 유용한 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 돼지 콜레라(Classical Swine Fever) 바이러스 핵산을 바람직하게는 분리된 생물학적 샘플에서 검출하기 위해 본 프라이머 및 탐침을 이용하는 방법 및 이들의 시약 및 키트에 관한 것이다. 구체적인 실시예에서, 본 발명은 돼지 콜레라의 간단하고 신속한 진단을 위한 내부 조절 시스템을 구비한 완전히 입증된, 즉석의 복합적인 실시간 역전사 폴리머라아제 사슬반응("RT-PCR") 분석법에 관한 것이다.

돼지 콜레라(CSF, Classical Swine Fever)는 매우 전염성인 돼지 및 멧돼지의 질병이다. 많은 국가에서 근절되었다고는 하지만 CSF는 세계 다른 국가들에서 심각한 문제를 일으키고 있다(Moenning 등, Clinical Signs And Epidemiology Of Classical Swine Fever: The Global Situation, Vet. Microbiol. 2000, 73, 103-19). 원인균(causative agent), CSF 바이러스(CSFV, classical swine fever virus)는 플라비바이러스(Flaviviridae)과의 페스티바이러스(Pestivirus)속의 하나이다. 페스티바이러스속 내의 다른 구성원들은 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV, bovine viral diarrhoea virus) 및 보더병(border disease) 바이러스(BDV)이다. BVDV 및 BDV의 자연의 숙주들은 각각 소 및 양이지만, 두 바이러스 모두는 자연적으로 돼지도 감염시킬 수 있다. BVD바이러스 및 BD바이러스에 대한 항체는 혈청학적 분석법에서 CSFV와 교차반응(cross-react)할 수 있으며, 진단성 문제점을 야기시킨다(Terpstra, C., Wensvoort, G., A Congenital Persistent Infection Of Bovine Virus Diarrhoea Virus In Pigs: Clinical, Virological And Immunological Observation. Vet. Q., 1997, 19, 97-101; Paton, D.J., Done, S.H., Congenital Infection Of Pigs With Ruminant-Type Pestiviruses, J.Comp. Pathol. 1994, 111, 151-63; Paton 등. Infection Of Pigs And Cattle With Bovine Viral Diarrhoea Virus On A Farm In England, Vet. Rec., 1992, 131, 185-8). CSFV만이 국제 수역 사무국(OIE : Office International des Epizooties)의 목록에 분류되기 때문에, CSFV와 BVDV 또는 BDV를 구별하는 것이 중요하다.

페스티바이러스는 대략 12.5kb의 양성센스 단일가닥(positive sense single stranded) RNA를 가진 작은 외피보유 바이러스(enveloped virus)이다. 이의 유전체는 매우 보전성인 5'- 및 3'- 비전사영역(NTR, non-translated region)에 접한 큰 ORF(open reading frame)를 가진다. 지난 10년간, 5'-NTR은 주로 RT-PCR을 이용함으로써 종 및 속이 겹쳐지는 유전자 증폭의 주형으로서 공헌하였다(Vilcek 등, Pestiviruses Isolated From Pigs, Cattle And Sheep Can Be Allocated Into At Least Three Genogroups Using Polymerase Chain Reaction And Restriction Endonuclease Analysis. Arch. Virol. 1994. 136. 309-23; Sandvik 등, Detection And Identification Of Ruminant And Porcine Pestiviruses By Nested Amplification Of 5' Untranslated Cdna Regions. J. Virol. Methods, 1997, 64, 43-56; Hyndman 등, A Novel Nested Reverse Transcription PCR Detects Bovine Viral Diarrhoea Virus In Fluids From Aborted Bovine Fetuses, J. Virol. Methods, 1998, 71, 69-76; Paton 등, Classical Swine Fever Virus: A Ring Test To Evaluate RT-PCR Detection Methods, Vet. Microbiol,. 2000, 73, 159-74; Paton 등, Classical Swine Fever Virus: A Second Ring Test To Evaluate RT-PCR Detection Methods, Vet. Microbiol,. 2000, 77, 71-87; Barlic-Maganja 및 Grom, highly Sensitive One-Tube RT-PCR And Microplate Hybridisation Assay For The Detection And For The Discrimination Of Classical Swine Fever Virus From Other Pestiviruses, J. Virol. Methods, 2001, 95, 101-10). 전통적인 RT-PCR은 민감하고 특이적인 진단기구로 판명되었다. 그러나, 겔-기반 시스템에 의한 증폭된 PCR 생성물의 검출은 교차오염의 위험을 안고 있으며 주형 내의 유전자 복제물의 정확한 정량을 허용하지 않으며, 추가의 특이성 시험을 포함하지 않는다. 형광성 탐침(fluorogenic probe)의 도입으로 PCR 튜브를 개봉하지 않고 실시간으로 얻어지는 서열 특이적 주형의 검출이 가능해졌다(Gibson 등, A Novel Method For real Time Quantitative RT-PCR. Genome Res. 1996, 995-1001 Heid 등, 1996). 실시간 PCR이 사후 PCR 샘플 처리를 요하지 않으므로 오염을 피할 수 있으며 탐침의 혼성화는 특이성을 보장한다.

페스티바이러스의 진단을 위해 타크만-탐침(TaqMan-probe)이 실용적이고 확고한 것으로 판명되었으며 몇몇 저자들에 의해 사용되었다(McGlodrick 등, A Novel Approach To The Detection Of Classical Swine Fever Virus By RT-PCR With A Fluorogenic Probe(TaqMan). J. Virol. Methods, 1998, 72, 125-35; 1999; Bhudevi 및 Weinstock, Detection of bovine viral diarrhea virus in fromalin fixed paraffin embedded tissue sections by real time RT-PCR (Taqman), J. Virol. Methods, 2003, 109, 25-30; Bhudevi 및 Weinstock, Fluorogenic RT-PCR Assay (Taqman) For Detection And Classification Of Bovine Viral Diarrhea Virus. Vet. Microbiol. 2001, 83, 1-10; Risatti 등, Rapid Detection Of Classical Swine Fever Virus By A Portable Real-Time reverse Transcriptase PCR Assay, J. Clin. Microbiol. 2003, 41, 500-5). 근래 설명되는 5'-NTR에서 증폭된 목적물의 페스티바이러스의 서열의 검출을 위한 모든 실시간 RT-PCR 분석법은 수용할 만한 감도 및 특이성을 지닌 결과를 제공하였다. 그러나, RNA 분리 단계뿐만 아니라 RT-PCR을 입증하는 내부의 대조군이 전혀 사용되지 않았다. 2003년도에, 일반적인 양성 대조군으로서 BVDV의 5'-NTR을 지닌 키메라 CSF 바이러스가 사용된, CSFV의 검출을 위한 복합 실시간 RT-PCR이 제시되었다(Hofmann. Construction Of An Infectious Chimeric Classical Swine Fever Virus Containing The 5'UTR Of Bovine Viral Diarrhea Virus, And Its Application As A Universal Internal Positive Control In Real-Time RT-PCR. J. Virol. Methods, 2003, 114, 77-90). 그러나, 이러한 완벽한 키메라 비리온은 감염성일 수 있고, 따라서 일상적인 진단 목적으로 적합하지 않을 수 있다.

본 발명은 간단하고 신속한 CSF의 일상적인 진단을 위해 두 가지의 대조군을 가지는 확고한 즉석의 매우 민감하며 CSFV 특이적인 복합 실시간 RT-PCR 분석법을 제공한다. 제 1 대조군(양성 대조군)은 프라이머 및 탐침의 효율을 검사하는 반면, 제 2 대조군(내부 대조군)은 RNA 분리 및 시험되는 각 샘플의 RT-PCR을 검사하도록 설계되었다.

본 발명은 일 실시예에서 프라이머 또는 탐침으로 유용한 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 다른 실시예에서, 본 발명은 이종체인 내부 대조군 RNA(즉, EGFP-RNA)를 구비한 복합 실시간 RT-PCR을 이용하여 생물학적 샘플 내의 돼지 콜레라 바이러스 핵산을 검출하는 방법을 포함한다.

본 발명의 다른 실시예는 분리된 생물학적 샘플 내의 CSFV 바이러스 농도를 정량하는 방법을 포함한다.

본 발명의 또 다른 실시예는 CSFV의 검출을 위한 키트를 포함한다.

정의

본 명세서에 사용된 "증폭" 또는 "증폭된"이라는 용어는 하나 또는 소수의 복제물로부터의 다량의 DNA 복제물의 생산을 일컫는다.

본 명세서에서 "생물학적 샘플"이라는 용어는 혈청, 혈장, 정자, 소변, 또는 혈액을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 "상보적인"이라는 용어는 핵산 분자의 뉴클레오타이드 사이의 왓슨-크릭(Watson-Crick) 또는 훅스틴(Hoogsteen)계 짝지음을 일컬으며, "결합"은 두가지 폴리펩타이드 또는 화합물 또는 관련된 폴리펩타이드 또는 화합물 또는 이들의 조합 사이의 물리적 또는 화학적 상호작용을 의미한다. 결합은 이온성, 비이온성, 분자간력(Van der Waals), 친수성 상호작용을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 물리적 상호작용은 직접 또는 간접적일 수 있다. 간접적 상호작용은 다른 폴리펩타이드 또는 화합물의 영향을 통하거나 이에 의한다. 직접 결합은 다른 폴리펩타이드 또는 화합물의 영향을 통하거나 이에 의하지 않고 발생하는 상호작용을 가리키나, 또한 다른 실질적인 화학적 중간생성물이 없다.

본 명세서에서 "보존적 아미노산 치환"이라는 용어는 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 가진 아미노산 잔기로 대체되는 치환을 말한다. 유사한 측쇄를 가지는 아미노산 잔기의 무리들은 해당분야에서 정의되어 있다. 이러한 무리들은 기본 측쇄(예를 들면, 리신, 알기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들면 아스파르트산, 글루탐산), 비전하 극성 측쇄(예를 들면, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예를 들면, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지 측쇄(예를 들면, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들면, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 지닌 아미노산을 포함한다.

본 명세서에서 "CSFV의 절편" 또는 "CSFV의 부위"라는 용어는 적어도 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 자연적으로 발생하는 CSFV 또는 이의 돌연변이를 포함하는 아미노산 서열을 말한다.

본 명세서에서 "유전자"라는 용어는 생물학적 기능과 연관된 DNA 분절을 일컫는다. 따라서, 유전자는 이들의 발현에 요구되는 암호화 서열 및/또는 조절 서열을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 유전자는 예를 들면 다른 단백질에 대한 인식서열을 형성하는 비발현된 DNA 분절도 포함할 수 있다. 유전자는 관심원으로부터의 복제 또는 알려진 또는 예측된 서열 정보로부터의 합성을 포함하는 다양한 공급원으로부터 얻어질 수 있으며, 소정의 파라미터들을 가지도록 설계된 서열을 포함할 수 있다. 또한, "유전자" 또는 "재조합 유전자"라는 용어는 CSFV를 부호화하는 ORF(open reading frame)를 포함하는 핵산 분자를 가리킨다.

본 명세서에서, "이종체 폴리뉴클레오타이드" 또는 "이종체 핵산" 또는 "이종체 유전자" 또는 "외인성 DNA 분절"이라는 용어는 특정 숙주세포에 대한 외계 공급원으로부터 기원되거나, 또는 동일한 공급원으로부터라면 원시형(original form)으로부터 변형된 폴리뉴클레오타이드, 핵산 또는 DNA를 일컫는다. 따라서 상기 용어는 세포에 대해 외계 또는 이종체이거나, 또는 세포에 대해 동종체이지만 숙주 세포의 핵산 내의 지점에서 성분이 일반적으로 발견되지 않는 DNA 분절을 가리킨다. 예를 들면, 효모 세포에는 선천적이나 인간 CSFV 서열에 결합된 신호 서열은 이종체이다.

"동종체 핵산 서열" 또는 "동종체 아미노산 서열", 또는 이들의 변화형 용어는 뉴클레오타이드 수준 또는 아미노산 수준에서의 상동성이 특징인 서열을 가리킨다. 동종체 뉴클레오타이드 서열은 펩타이드의 아이소폼(isoform)에 대해 부호화된 상기 서열을 부호화한다. 아이소폼은 예를 들면 RNA의 선택적 스플라이싱(splicing)의 결과로 동일한 기관의 다른 조직에서 발현될 수 있다. 선택적으로, 아이소폼은 상이한 유전자에 의해 부호화될 수 있다. 본 발명에서, 동종체 뉴클레오타이드 서열은 인간 이외의 포유류를 포함하나 이에 제한되지 않는 종의 CSFV를 부호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 이에 따라 예를 들면 생쥐, 쥐, 토끼, 개, 고양이, 돼지, 소, 말, 및 기타 유기체를 포함할 수 있다. 동종체 뉴클레오타이드 서열은 또한 본 명세서에 제시된 뉴클레오타이드 서열의 대립형질의 변이체 및 돌연변이를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 "분리된" 핵산 서열은 아가로스 겔 전기영동에 의해 측정된 바, 다른 핵산 서열로부터 기본적으로 자유로운 핵산서열을 가리키며, 예를 들면 적어도 약 20%의 순도, 바람직하게는 적어도 약 40%의 순도, 더욱 바람직하게는 적어도 약 60%의 순도, 훨씬 더 바람직하게는 80%의 순도, 가장 바람직하게는 90%의 순도, 및 훨씬 더 가장 바람직하게는 95%의 순도를 말한다. 예를 들면, 분리된 핵산 서열은 핵산 서열을 선천적 위치로부터 재생산될 상이한 구역으로 재배치하기 위해 유전공학에서 사용되는 표준 복제 방법에 의해 얻어질 수 있다.

유전자 복제 방법은 폴리펩타이드를 부호화하는 핵산 서열을 포함하는 소정의 핵산 분절의 절단 및 분리화, 상기 분절을 벡터 분자내로 주입, 및 핵산 서열의 복수의 복제물 또는 클론들이 복제될 숙주 세포 내로의 재조합 벡터의 통합을 포함할 수 있다. 핵산 서열은 유전자, cDNA, RNA, 반합성(semi-synthetic), 합성 원형, 또는 이들의 어떠한 조합이 될 수 있다.

본 명세서에서 "복합 PCR"은 유전체에 걸친 복수의 위치를 목표로 하기 위해 반응에 하나 이상의 PCR 프라이머의 세트를 참가하는 것을 포함하는 PCR을 일컫는다: 이는 특히 조사된 다형성 유전자 좌위의 수가 증가함에 따라 두 개체 내에서 동일한 대립 유전자의 확률이 감소하기 때문에 DNA형 결정에 유용하다. 더욱이, IC(예를 들면 EGFP-RNA)로 다양화하는 것은 CSFV 실시간 PCR의 감도 또는 특이성에 영향을 끼치지 않으면서 전체 PCR의 내부 대조군을 제공한다.

본 명세서에서 "핵산", "핵산분자" 또는 "폴리뉴클레오타이드"라는 용어는 단일- 또는 이중-가닥 형태인 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 또는 이들의 폴리머를 일컫는다. 특별히 한정하지 않으면, 본 용어는 기준의 핵산과 유사한 결합특성을 가지며 자연적으로 발생하는 뉴클레오타이드와 유사한 방식으로 대사하는 천연의 뉴클레오타이드의 유사체를 함유하는 핵산을 포함한다. 달리 나타내지 않으면, 특정 핵산 서열은 무조건 보존적으로 변형된 변이체(예를 들면 변성 코돈 치환체), 상보적 서열뿐만 아니라 명확하게 지시된 서열을 포함한다. 구체적으로는 변성된 코돈 치환체는 하나 이상의(또는 모든) 선택된 코돈의 제 3 위치가 혼합된 염기 및/또는 데옥시이노신(deoxyinosine)잔기로 치환된 발생 서열에 의해 얻어질 수 있다(Batzer 등(1991) Nucleic Acid res. 19:5081; Ohtsuka 등(1985) J. Biol. Chem. 260:2605-2608; Cassol 등(1992); Rossolini 등(1994) Mol. Cell. Probes 8:91-98). 용어 핵산은 유전자, cDNA, 및 유전자에 의해 부호화되는 mRNA와 상호교환적으로 사용된다. 본 명세서에서 "핵산", "핵산 분자" 또는 "폴리뉴클레오타이드"라는 용어는 DNA 분자(예를 들면, cDNA 또는 유전체 DNA), RNA 분자(예를 들면, mRNA), 뉴클레오타이드 유사체를 이용하여 생성된 DNA 또는 RNA의 유사체, 및 유도체, 분절 및 이들의 동종체를 포함하는 의도이다.

본 명세서에서 "nt"라는 용어는 뉴클레오타이드를 의미한다.

본 명세서에서 "올리고뉴클레오타이드"라는 용어는 일련의 연결된 뉴클레오타이드 잔기를 일컬으며, 올리고뉴클레오타이드는 PCR 반응에서 사용되는 충분한 수의 뉴클레오타이드 염기를 가진다. 짧은 올리고뉴클레오타이드 서열은 유전체의 또는 cDNA 서열에 기초하거나 이로부터 설계되며, 특정 세포 또는 조직 내의 동일한, 유사한 또는 상보적인 DNA 또는 RNA의 존재를 증폭, 확인 또는 발견하기 위해 사용된다. 올리고뉴클레오타이드는 약 10nt, 50nt, 또는 100nt의 길이, 바람직하게는 약 15nt 내지 30nt의 길이를 가지는 핵산 서열 부분을 포함한다. 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 화학적으로 합성되거나 탐침으로 사용될 수 있다.

본 명세서에서 DNA 분절은 다른 DNA 분절과 기능적 관계에 있을 경우 "작동가능하게 연결된" 또는 "작동적으로 연결된"이라고 일컬어진다. 일반적으로, 작동적으로 연결된 DNA 서열은 연접해 있고, 연접하고 판독상태 모두에 있는 신호 서열 또는 융합 단백질의 경우에 있다. 그러나, 인핸서(enhancer)는 그들이 전사를 조절하는 부호화 서열과 연접할 필요가 없다. 본문에서, 연결은 용이한 억제위치 또는 대신 삽입된 접합체 또는 연결자에서의 묶음에 의해 달성된다.

본 명세서에서 "PCR"은 일반적으로 열에 안정한 폴리머라아제, 및 하나는 증폭될 서열의 한 말단에서 (+)-가닥과 상보적이며, 다른 하나는 다른 말단에서 (-)-가닥과 상보적인 두 개의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 이용하여 DNA 또는 RNA 염기서열을 증폭하는 방법이다. 새롭게 합성된 DNA 또는 cDNA 가닥은 이어서 동일한 프라이머 서열의 추가적인 주형으로 제공되기 때문에, 연이은 프라이머 결합, 가닥 연장, 및 해리(dissociation)의 단계가 원하는 서열의 신속하고 매우 특이적인 증폭을 이루어낸다.

본 명세서에서 "탐침"이라는 용어는 용도에 따라 다양한 길이, 바람직하게는 적어도 약 10nt 또는 약 100nt 길이의 핵산 서열을 일컫는다. 탐침은 동일한, 유사한 또는 상보적인 핵산 서열의 검출에 사용된다. 긴 길이의 탐침은 보통 자연적으로 또는 재조합 공급원으로부터 얻어지며 매우 특이적이고 올리고머보다 훨씬 혼성화가 느리다. 탐침은 단일- 또는 이중-가닥일 수 있으며, PCR, 막 기반 혼성화 기술, 또는 ELISA와 같은 기술, 바람직하게는 PCR, 더욱 바람직하게는 RT-PCR, 훨씬 더 바람직하게는 실시간 RT-PCR에 특이성을 가지도록 설계된다.

본 명세서에서 "프라이머"라는 용어는 일반적으로 50 이하, 바람직하게는 18-25bp 뉴클레오타이드(DNA가 통상 이중 가닥이기 때문에 그 길이는 염기쌍으로 측정된다; 단일가닥 DNA는 염기 또는 뉴클레오타이드로 측정된다)이며 증폭될 유전체 분절의 개시부 및 말단과 정확히 들어맞는 짧은 인공 올리고뉴클레오타이드 가닥을 일컫는다. 프라이머는 DNA 폴리머라아제가 결합되어 새로운 DNA 가닥의 합성이 시작되는 DNA 주형의 시작점 및 종점에 어닐링(결합)된다. 프라이머의 길이 및 이들의 녹는점(Tm)의 선택은 고려대상의 수에 의존한다. PCR 공정의 제 1 단계에서의 DNA의 녹는점과 별개인 프라이머의 녹는점은, 그 아래에서는 프라이머가 DNA 주형에 결합되며 그 위에서는 DNA 주형으로부터 프라이머가 해리(떨어짐)되는 온도로 정의된다. 녹는점은 프라이머의 길이에 따라 증가한다. 너무 짧은 프라이머는 긴 DNA 주형의 여러 위치에서 결합되는데, 이는 비특이적 복제를 야기시킨다. 한편, 프라이머의 길이는 녹는데 요구되는 온도에 의해 제한된다. 너무 높은(즉, 80℃ 이상) 녹는점은 DNA 폴리머라아제가 그 온도에서 덜 활성적이게 되므로 문제를 일으킬 수도 있다. 적절한 녹는점은 60 내지 75℃ 사이이다. 순방향 서열분석 프라이머는 역방향 프라이머에 비해 5'에 결합되며, 역방향 서열분석 프라이머는 순방향 프라이머에 비해 3'에 결합된다. 프라이머들 및 기준 서열 사이의 관계는 사용되는 좌표계에 의존한다. 순방향 프라이머는 좌표계 내에서 역방향 프라이머의 이론상 우측에 있어야 하기 때문에 순방향 프라이머의 결합 위치는 역방향 프라이머의 결합 위치보다 일반적으로 적다.

본 명세서에서 "프로모터(promoter)"는 전사를 개시하기 위한 결합 RNA 폴리머라아제에 포함된 DNA 영역을 일컫는다.

본 명세서에서 "재조합체(recombinant)"이라는 용어는 유전자 또는 DNA의 새로운 조합의 변형을 겪는 세포, 조직 또는 기관을 일컫는다.

본 명세서에서 "엄격한 혼성화 조건(stringent hybridization condition)"이라는 문구는 탐침, 프라이머 또는 올리고뉴클레오타이드가 목적 서열에 혼성화되고 다른 서열들과는 혼성화되지 않는 조건을 일컫는다. 엄격한 조건은 서열-의존적이며 상이한 환경에서는 서로 다르다. 긴 서열은 짧은 서열보다 더 높은 온도에서 특이적으로 혼성화된다. 일반적으로, 엄격한 조건은 한정된 이온강도 및 pH에서 특정 서열의 녹는점(Tm)보다 약 5℃ 낮게 선택된다. Tm은 평형에서 목적 서열에 상보적인 탐침의 50%가 목적 서열에 혼성화되는 온도(한정된 이온강도, pH 및 핵산 농도 하에서)이다. 목적 서열이 일반적으로 과량 존재하기 때문에, Tm에서 탐침의 50%가 평형에서 점유된다. 전형적으로, 엄격한 조건은 pH 7.0 내지 8.3에서 염의 농도가 약 0.1M의 나트륨 이온, 통상적으로는 약 0.01 내지 1.0M의 나트륨 이온(또는 다른 염들)보다 낮으며, 온도는 짧은 탐침, 프라이머 또는 올리고뉴클레오타이드(예를 들면 10nt 내지 50nt)에 대해 적어도 30℃이며, 긴 탐침, 프라이머 또는 올리고뉴클레오타이드에 대해 적어도 약 60℃이다. 엄격한 조건은 또한 포름아마이드와 같은 불안정화제의 첨가로 얻어질 수도 있다. 엄격한 조건은 당업자들에게 공지되어 있고, 아우수벨 등(eds.)의 "Current Protocols in Molecular Biology"(John Wiley & Sons, 뉴욕 (1989), 6.3.1-6.3.6))에서 찾을 수 있다. 바람직하게는 이 조건은 서로에 대해 적어도 약 65%, 70%, 75%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동종체의 서열이 전형적으로 서로 혼성화된 채로 남는 조건이다. 엄격한 혼성화 조건의 비제한적 사례는 6×SSC, 50mM Tris-HCl(pH 7.5), 1mM EDTA, 0.02% PVP, 0.02% 피콜(Ficoll), 0.02% BSA, 및 65℃에서의 변성된 연어 정자 DNA 500mg/ml를 포함하는 고염 버퍼 내에서의 혼성화 및 이어서 50℃에서 0.2×SSC, 0.01% BSA 내에서 한번 이상의 세척이다.

본 명세서에서 "대상"이라는 용어는 인간, 또는 동물, 바람직하게는 돼지, 소, 양 또는 멧돼지가 될 수 있다.

본 명세서에서 "타크만(TaqMan)"이라는 용어는 Taq DNA 폴리머라아제의 5'→3' 핵산말단분해효소(exonuclease) 활성을 채용함으로써 PCR 생성물 내에서 특정 서열을 검출하는데 사용되는 탐침을 일컫는다.

3' 말단에서 무력해진 타크만 탐침(약 20-30bp)은 형광 리포터 염료 및 형광 소광자 염료에 의해 표지된 자리 특이적 서열로 구성된다.

PCR 동안 타크만 탐침은 PCR 목적물 내의 상보적 단일 가닥 DNA 서열에 혼성화된다. 증폭이 일어날 경우 타크만 탐침은 Taq DNA 폴리머라아제의 5'→3' 핵산말단분해효소(exonuclease) 활성 때문에 쇠퇴하게 되고, 이로 인해 신장 동안 리포터로부터 소광자를 분리시킨다. 리포터에 대한 억제 효과가 방출됨에 따라 리포터 염료의 형광 세기가 증가한다. 전체 증폭 과정 동안, 빛의 방출은 지수적으로 증가하며 PCR의 종료 후 분광광도계에 의해 최종 수치가 측정된다. 리포터 염료의 형광 세기의 증가가 목적 서열에 대한 탐침 혼성화 및 증폭이 일어난 경우에만 달성되기 때문에, 타크만 분석법은 특정 서열의 존재 또는 부재를 검출하는데 민감한 방법을 제공한다. 따라서, 이러한 기술은 관심있는 특성의 통합 및 존재를 위한 샘플의 스크리닝 또는 병원체 또는 질병의 검출과 같은 진단적 적용에 특히 유용하다.

타크만 분석법은 검출에 겔-전기영동이 요구되지 않기 때문에 높은 샘플 처리량을 허용한다. 타크만 탐침은 목적 증폭 산물에 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드에 혼성화되기 위해 PCR에 사용된 DNA 폴리머라아제의 5'-핵산가수분해효소 활성에 의존한다.

구체적으로는, 타크만 탐침은 5' 말단에 결합된 형광 리포터 염료 및 3' 말단에 결합된 소광자 모이어티를 지닌 올리고뉴클레오타이드이다. 이러한 탐침은 PCR 생성물의 내부 영역에 혼성화되도록 설계된다. 혼성화 상에서 형광 리포터 및 억제 분자의 접근은 탐침으로부터의 형광 신호의 검출을 방해한다. PCR 동안, 타크만 탐침이 결합할 주형을 폴리머라아제가 복제하는 때, 폴리머라아제의 5' 말단 핵산가수분해효소 활성이 탐침을 쪼갠다. 이는 형광 및 억제 염료들을 분리시키며 형광 공명 에너지전이(FRET)가 더 이상 발생하지 않는다. 따라서 매 순환에서 탐침 분할의 양에 비례하여 형광이 증가한다.

본 명세서에서 "열적으로 안정한 폴리머라아제 효소"라는 용어는 열에 안정하고 열에 내성이며 각 핵산 가닥에 상보적인 프라이머 신장 생성물을 형성하기 위해 적합한 방식으로 뉴클레오타이드의 조합을 촉진시키는(용이하게 하는) 효소를 일컫는다. 일반적으로 상기 합성은 프라이머의 3' 말단에서 개시되며 합성이 종료할 때까지 상이한 길이의 분자를 생성하면서 주형 가닥을 따라 5' 방향으로 진행한다. 그러나 전술한 것과 동일한 방법을 이용하며 5' 말단에서 합성을 개시하여 다른 방향으로 진행하는 열안정 효소가 될 수 있다. 바람직한 열안정 효소는 테르무스 아쿠티커스(Thermus aquaticus)로부터 분리된 DNA 폴리머라아제이다. 이것의 다양한 가닥이 Americal Type Culture Colletion(Rockville, Md.)으로부터 사용할 수 있으며, T. D. Brock, J.Bact.(1969) 98:289-297, 및 T. Oshima, Arch. Mircobiol.(1978) 117:189-196에 의해 개시되어 있다. 이러한 바람직한 가닥들 중 하나는 YT-1 가닥이다.

본 명세서에서 "형질전환"이라는 용어는 핵산(즉, 뉴클레오타이드 폴리머)의 세포로의 전이를 일컫는다. 본 명세서에서 "유전자성 형질전환"이라는 용어는 DNA, 특히는 재조합 DNA의 세포내로의 전이 및 통합을 말한다.

"변이체 또는 변이체들"이라는 용어는 기준 핵산 또는 폴리펩타이드와는 상이하지만 그 기본적 특성은 유지하는 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산을 일컫는다. 일반적으로 변이체는 전체적으로 밀접하게 유사하며 많은 영역에서 기준 핵산 또는 폴리펩타이드와 동일하다.

본 명세서에서 "벡터"는 외인성 핵산을 부호화하는 어떠한 플라스미드, 파아지미드(phagemid) 또는 바이러스를 폭넓게 일컫는다. 이 용어는 또한 예를 들면 폴리리신 화합물 및 유사체와 같이 비리온 또는 세포 내로의 전이를 용이하게 해주는 비-플라스미드, 비-파아지미드 및 비-바이러스성 화합물을 포함하는 것으로도 고려된다. 벡터는 핵산 또는 이의 돌연변이를 세포로 운반하는 운반체로서 적합한 바이러스성 벡터일 수 있거나 또는 동일한 목적에 적합한 비-바이러스성 벡터일 수 있다. 세포 및 조직으로 DNA를 운반하기 위한 바이러스성 및 비-바이러스성 벡터의 예는 해당 분야에 공지되어 있고, 예를 들면 Ma 등(1997, Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 94:12744-12746)에 개시되어 있다. 바이러스성 벡터들의 예에는 재조합 우두 바이러스, 재조합 아데노바이러스, 재조합 레트로바이러스, 재조합 아데노-연관 바이러스, 재조합 조류수두(avian pox) 바이러스, 및 유사한 것이 포함되나(Cranage 등, 1986, EMBO J. 5:3057-3063; 1994. 8. 18자로 공개된 국제 특허출원 WO 94/17810호, 1994. 10. 27자로 공개된 국제 특허출원 WO 94/23744호) 이에 제한되는 것은 아니다. 비-바이러스성 벡터의 예로는 리포좀, cDNA의 폴리아민 유도체, 및 유사한 것이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 "야생형"이라는 용어는 자연적으로 발생하는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열을 일컫는다.

발명의 실시예의 설명

본 발명의 올리고뉴클레오타이드

본 발명은 프라이머 또는 탐침으로 유용한 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 탐침으로 사용될 경우, 올리고뉴클레오타이드는 표지를 함유하는 것이 바람직하다. 예시적 실시예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 또는 SEQ ID NO: 9의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 프라이머 또는 탐침으로 활용되는 것이 바람직하다. 본 발명의 구체적인 실시예는 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 및 SEQ ID NO: 7의 올리고뉴클레오타이드의 프라이머 세트를 포함한다. 본 발명의 다른 구체적인 실시예는 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 또는 SEQ ID NO: 9의 올리고뉴클레오타이드의 탐침 세트를 포함한다. 다른 실시예에서, 본 발명의 탐침들은 표지를 더욱 포함한다. 구체적인 실시예에서, 표지는 형광그룹, 디곡시제닌(digoxigenin), 또는 비오틴(biotin)이다.

본 발명의 예시적 올리고뉴클레오타이드는 다음 뉴클레오타이드 서열을 갖는다:

SEQ ID NO. 2: 5'-ATGCCCAYAGTAGGACTAGCA-3'

SEQ ID NO. 3: 5'-TGGCGAGCTCCCTGGGTGGTCTAAGT-3'

SEQ ID NO. 4: 5'-CTACTGACGACTGTCCTGTAC-3'

SEQ ID NO. 5: 5'-GACCACTACCAGCAGAACAC-3'

SEQ ID NO. 6: 5'-AGCACCCAGTCCGCCCTGAGCA-3'

SEQ ID NO. 7: 5'-GAACTCCAGGACCATG-3'

SEQ ID NO. 8: 5'-FAM-TGGCGAGCTCCCTGGGTGGTCTAAGT-TAMRA-3'

SEQ ID NO. 9: 5'-HEX-AGCACCCAGTCCGCCCTGAGCA-BHQ1-3'

올리고뉴클레오타이드 합성

올리고뉴클레오타이드 합성은 일상적으로 되었다. 핵산 합성의 세부 설명을 위해서는 Gait, M.J.의 "올리고뉴클레오타이드 합성: 실용적 접근"(IRL Press, 영국 옥스포드)를 참조할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 고체상 합성으로 공지된 기반에 따라 합성된다. 선택적으로는, 이들은 용액 내에서 합성된다. 당업자는 표지된, 비표지된 및/또는 변형된 올리고뉴클레오타이드(DNA, RNA 및 이들의 합성 유사체) 모두가 이미 통용되고 있다는 것을 인지하고 있다. 이들은 상업적으로 활용되는 장비 및 시약을 이용해 합성될 수 있거나, 올리고뉴클레오타이드의 주문 제작자의 상인들로부터 구입할 수 있다. 핵산의 합성 및 표지를 위한 다양한 조성물, 지지체 및 방법학을 논의하는 특허들은 각각이 참증으로 통합된: 미국특허 제5,476,925호, 제5,453,496호, 제5,446,137호, 제5,419,966호, 제5,391,723호, 제5,391,667호, 제5,380,833, 제5,348,868호, 제5,281,701호, 제5,278,302호, 제5,262,530호, 제5,243,038호, 제5,218,103호, 제5,204,456호, 제5,204,455호, 제5,198,527호, 제5,175,209호, 제5,164,491호, 제5,112,962호, 제5,071,974호, 제5,047,524호, 제4,980,460호, 제4,923,901호, 제4,786,724호, 제4,725,677호, 제4,659,774호, 제4,500,707호, 제4,458,066호, 제4,415,732호를 포함한다.

본 발명의 방법

본 발명은 또한 대상의 분리된 생물학적 샘플 내의 CSFV 핵산의 검출을 위한 방법을 포함한다.

하나 이상의 CSFV 유전자를 부호화하는 RNA를 역전사하여 상보적 CSFV(CSFV cDNA)를 얻는 단계; PCR 생성물을 생성하기 위한 조건하에서 둘 이상의 프라이머들을 활용하여 상기 CSFV cDNA를 증폭하는 단계로서, 적어도 하나의 순방향 프라이머는 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오타이드 또는 이에 상보적인 가닥의 제 1 그룹에 상응하는 표적 부위에 혼성화되고, 적어도 하나의 역방향 프라이머는 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오타이드 또는 이에 상보적인 가닥의 제 2 그룹에 상응하는 표적 부위에 혼성화되는 단계; PCR 생성물 또는 이의 상보적 가닥에 탐침이 혼성화되도록 상기 PCR 생성물과 핵산 탐침을 접촉시켜 혼성화된 탐침을 제공하는 단계; 및 혼성화된 탐침의 존재를 검출하는 단계를 포함한다.

예시적 실시예에서, 본 발명은:

(i) 핵산을 역전사하여 CSFV cDNA를 얻는 단계;

(ii) 상기 CSFV cDNA를 둘 이상의 프라이머 및 DNA 폴리머라아제와, 프라이머들이 cDNA에 혼성화되는 조건 하에서, 접촉시켜 PCR 생성물을 생성하는 단계로서, 상기 프라이머는 적어도 하나의 순방향 프라이머와 적어도 하나의 역방향 프라이머를 포함하고, 적어도 하나의 순방향 프라이머가 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오타이드 75 내지 150, 바람직하게는 뉴클레오타이드 90 내지 130, 가장 바람직하게는 뉴클레오타이드 100 내지 120, 또는 이에 상보적인 가닥에 상응하는 표적 부위에 혼성화되며, 적어도 하나의 역방향 프라이머가 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오타이드 155 내지 205, 바람직하게는 뉴클레오타이드 165 내지 195, 가장 바람직하게는 뉴클레오타이드 172 내지 192, 또는 이에 상보적인 가닥에 상응하는 표적 부위에 혼성화되는 단계;

(iii) 제 1 핵산 탐침과 PCR 생성물을 접촉시켜 혼성화된 탐침을 제조하는 단계로서, SEQ ID NO: 1의 뉴클레오타이드 130 내지 175, 바람직하게는 뉴클레오타이드 135 내지 170, 가장 바람직하게는 뉴클레오타이드 141 내지 166, 또는 이에 상보적인 가닥에 상응하는 표적 부위에서 PCR 생성물과 탐침이 혼성화되는 단계; 및

(iv) 혼성화된 탐침의 존재를 검출하는 단계
를 포함하는 생물학적 샘플 내의 CSFV 핵산을 검출하기 위한 방법을 포함한다.

다른 실시예에서, 본 발명은 플라스미드 벡터 pEGFP-1(즉, SEQ ID NO: 10)의 EGFP-서열의 내부 대조군을 추가로 첨가하는 단계를 포함한다.

다른 예시적 실시예에서, 제 2 순방향 프라이머가 SEQ ID NO: 10의 뉴클레오타이드 625 내지 675, 바람직하게는 뉴클레오타이드 630 내지 665, 가장 바람직하게는 뉴클레오타이드 637 내지 656 또는 이에 상보적인 가닥에 상응하는 표적 부위에 혼성화되며, 제 2 역방향 프라이머가 SEQ ID NO: 10의 뉴클레오타이드 740 내지 780, 바람직하게는 뉴클레오타이드 745 내지 775, 가장 바람직하게는 뉴클레오타이드 750 내지 768 또는 이에 상보적인 가닥에 상응하는 표적 부위에 혼성화된다.

본 발명의 다른 예시적 실시예는 탐침이 SEQ ID NO: 10 또는 이에 상보적인 가닥에 혼성화되는 제 2 핵산 탐침을 첨가하는 단계를 포함한다.

다른 예시적 실시예에서, 제 2 핵산 탐침은 SEQ ID NO: 10의 뉴클레오타이드 또는 이에 상보적인 가닥 690 내지 735, 바람직하게는 뉴클레오타이드 695 내지 730, 가장 바람직하게는 뉴클레오타이드 703 내지 724에 상응하는 표적 부위와 혼성화된다.

본 발명의 다른 예시적 실시예는:

(i) 핵산을 역전사하여 상보적 CSFV 복합체(즉, CSFV cDNA)를 얻는 단계;

(ii) 상기 CSFV cDNA와 둘 이상의 제 1 프라이머들 및 DNA 폴리머라아제를 접촉시켜 PCR 생성물을 제조하는 단계로서, 제 1 순방향 프라이머가 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오타이드 100 내지 120 또는 이에 상보적인 가닥에 상응하는 표적 부위에 혼성화되고, 제 1 역방향 프라이머가 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오타이드 172 내지 192 또는 이에 상보적인 가닥에 상응하는 표적 부위에 혼성화되는 단계;

(iii) PCR 생성물과 제 1 핵산 탐침을 접촉시켜 탐침이 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오타이드 141 내지 166 또는 이에 상보적인 가닥에 상응하는 표적 부위에 혼성화되는 단계;

(iv) 적어도 둘 이상의 제 2 프라이머들 및 내부 대조군을 첨가하는 단계로서, 적어도 하나의 제 2 순방향 프라이머가 SEQ ID NO: 10의 뉴클레오타이드 637 내지 656 또는 이에 상보적인 가닥에 상응하는 표적 부위에 혼성화되고, 제 2 역방향 프라이머가 SEQ ID NO: 10의 뉴클레오타이드 750 내지 768 또는 이에 상보적인 가닥에 상응하는 표적 부위에 혼성화되는 단계;

(v) 적어도 하나의 제 2 핵산 탐침을 첨가하여 탐침이 SEQ ID NO: 10의 뉴클레오타이드 703 내지 724 또는 이에 상보적인 가닥에 상응하는 표적 부위에 혼성화되는 단계;

(vi) 혼성화된 탐침들의 존재를 검출하는 단계
를 포함하는 생물학적 샘플 내의 CSFV 핵산을 검출하기 위한 방법을 포함한다.

본 발명의 방법의 다른 구체적인 실시예에서는 탐침이 각각 밀폐된 튜브 형태 내에서 실시간으로 또는 분석 말기에 검출된다. 본 발명의 방법의 또 다른 구체적인 실시예에서는 동일한 샘플 및 동일한 분석물 내의 관심있는 둘 이상의 목적분자(예를 들면 CSFV 핵산)를 동시에 검출, 동정 또는 정량하기 위해 사용되는 단일 복합 분석물에 적어도 둘 이상의 각각의 검출가능한 PCR 생성물이 존재한다.

본 발명의 다른 실시예는 CSFV 유전자들을 부호화하는 RNA를 역전사하여 CSFV cDNA를 얻는 단계; 및 프라이머들이 상기 cDNA에 혼성화되는 조건 하에서, 적어도 하나의 순방향 프라이머(즉, 제 1 순방향 프라이머) 및 적어도 하나의 역방향 프라이머(즉, 제 1 역방향 프라이머)와 함께 상기 CSFV cDNA를 증폭하여 PCR 생성물을 형성하는 단계로서, 적어도 하나의 순방향 프라이머가 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오타이드의 제 1 그룹에 상응하는 표적 부위에 혼성화되며 적어도 하나의 역방향 프라이머가 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오타이드의 제 2 그룹에 상응하는 표적 부위에 혼성화되는 단계; 제 1 핵산 탐침과 PCR 생성물을 접촉시키는 단계로서, 탐침은 PCR 생성물 또는 이의 상보적 가닥에 혼성화되어 혼성화 탐침을 형성하는 단계; 및 혼성화 탐침의 존재를 검출하는 단계를 포함하는 생물학적 샘플 내의 CSFV 핵산의 복합 실시간 RT-PCR 검출을 위한 방법을 포함한다. 본 발명은 SEQ ID NO: 10의 내부 대조군의 존재 및 둘 이상의 추가의 순방향 프라이머들 및 둘 이상의 추가의 역방향 프라이머들을 더 포함하며, 여기서 적어도 하나의 순방향 프라이머는 SEQ ID NO: 10의 뉴클레오타이드의 제 1 그룹 또는 이에 상보적인 가닥에 상응하는 표적 부위에 혼성화되고 적어도 하나의 역방향 프라이머는 SEQ ID NO: 10의 뉴클레오타이드의 제 2 그룹 또는 이에 상보적인 가닥에 상응하는 표적 부위에 혼성화되며, SEQ ID NO: 10의 뉴클레오타이드의 그룹 또는 이에 상보적인 가닥에 상응하는 표적 부위에 혼성화되는 제 2 핵산 탐침의 첨가를 더욱 포함한다.

예시적인 실시예에서, 제 1 순방향 프라이머는 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오타이드 75 내지 150, 바람직하게는 뉴클레오타이드 90 내지 130, 가장 바람직하게는 뉴클레오타이드 100 내지 120 또는 이에 상보적인 가닥에 상응하는 표적 부위에 혼성화된다. 적어도 하나의 역방향 프라이머는 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오타이드 155 내지 205, 바람직하게는 뉴클레오타이드 165 내지 195, 가장 바람직하게는 뉴클레오타이드 172 내지 192 또는 이에 상보적인 가닥에 상응하는 표적 부위에 혼성화된다. 다른 예시적 실시예에서, 제 1 탐침은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오타이드 130 내지 175, 바람직하게는 뉴클레오타이드 135 내지 170, 가장 바람직하게는 뉴클레오타이드 141 내지 166 또는 이에 상보적인 가닥에 상응하는 표적 부위에 혼성화된다.

다른 예시적 실시예에서, 제 2 순방향 프라이머는 SEQ ID NO: 10의 뉴클레오타이드 625 내지 675, 바람직하게는 뉴클레오타이드 630 내지 665, 가장 바람직하게는 뉴클레오타이드 637 내지 656 또는 이에 상보적인 가닥에 상응하는 표적 부위에 혼성화된다. 다른 예시적 실시예에서, 제 2 역방향 프라이머는 SEQ ID NO: 10의 뉴클레오타이드 740 내지 780, 바람직하게는 뉴클레오타이드 745 내지 775, 가장 바람직하게는 뉴클레오타이드 750 내지 768 또는 이에 상보적인 가닥에 상응하는 표적 부위에 혼성화된다. 다른 예시적 실시예에서, 제 2 탐침은 SEQ ID NO: 10의 뉴클레오타이드 690 내지 735, 바람직하게는 뉴클레오타이드 695 내지 730, 가장 바람직하게는 뉴클레오타이드 703 내지 724 또는 이에 상보적인 가닥에 상응하는 표적 부위와 혼성화된다.

구체적인 실시예에서, 본 발명은 한개의 튜브 프로토콜(protocol)에서 이종체 내부 대조군(IC)을 포함하는 CSFV 유전체들의 검출을 위한 표준화된 민감한 CSFV특이적 복합 실시간 RT-PCR을 포함한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 두 프라이머들(예를 들면, 순방향 및 역방향 프라이머) 모두와 타크만 탐침은 100% 일치하는 올리고뉴클레오타이드가 선택된 것으로 묘사된 78개의 상이한 CSFV 균주들의 5'-NTR 일치 서열을 이용하여 선택되고, 단지 CSFV 분리주들의 소그룹만이 공개된 CSFV 서열들에 비해 최대 하나의 뉴클레오타이드 교환을 가지는 프라이머 결합자리를 가졌다. CSF-시스템 1의 CSFV 프라이머들과 타크만 탐침은 탐침 영역에서 2개 까지의 불일치를 가지는 유전체 서열의 검출을 가능하게 했다. "CSF-시스템 1"은 CSF100-F/CSF192-R의 프라이머쌍, 및 FAM-표지된 탐침 CSF-탐침1(도 1, 표 1)로 이루어지며, CSFV(균주 Alfort 187[접수번호 X87939], 도 1)의 5'-NTR의 100 내지 192nt 사이의 93bp의 분절을 증폭시킨다. 상이한 CSFV 균주들 및 분리주들 모두의 검출이 가정될 수 있었고, 상이한 유전형의 CSFV의 큰 패널을 구비한 모든 실험들은 모든 CSFV 균주들 및 분리주들을 검출하는 CSF-시스템 1의 능력을 보여주었다. CSF-시스템 1의 종 특이성을 입증하기 위해, 상이한 BDV, BVDV1, BVDV2, 및 비정형 페스티바이러스가 100% CSF 특이성을 보이며 조사되었다.

IC는 RNA 감쇠 및 억제 효과들에 의해 야기되는 부정확한 부정적인 결과를 피하기 위해 사용된다(Hofmann, Construction Of An Infectious Chimeric Classical Swine Fever Virus Containing The 5'UTR Of Bovine Viral Diarrhea Virus, And Its Application As A Universal Internal Positive Control In Real-Time RT-PCR; J. Virol. Methods, 2003, 114, 77-90). 독립 프라이머/탐침 시스템을 이용하여 검출된 체외 전사된 EGFP RNA는 내부 대조군으로 사용될 수 있다. 이러한 IC는 또한 다른 병원균에 대한 복합 PCR 분석법에 사용될 수도 있다. 선택적으로, 목적 CSFV 서열을 복제하는 항존 유전자(housekeeping gene) 또는 내부 대조군이 사용될 수 있다(Gorzelnik 등, Validation Of Endogenous Controls For Gene Expression Studies In Human Adipocytes And Preadipocytes. Horm. Metab. Res., 2001, 33, 625-627; Korimbocus 등, Improved Detection Of Sugarcane Yellow leaf Virus Using A Real-Time Fluorescent (Taqman) RT-PCR Assay. J. Virol. Methods, 2002, 103, 109-120). 그러나, 항존 유전자들은 특히 혈장 또는 혈청 같은 세포 배제 샘플들에서 이들의 농도가 알려져 있지 않다는 결점을 가지고 있다.

최근 공개된 CSFV 복합 PCR(예를 들면, Hofmann, 2003)과 대조적으로 감염성이고 유전적으로 조작된 CSFV를 사용하는 것이 기피되어 본 발명의 IC 시스템은 표준적이고 생물학적 안전도 2급의 실험실이 아닌 곳에도 사용될 수 있다. 이종체인 체외 전사된 RNA를 IC로서 사용하는 것은 일괄된 RNAse-보호 바이러스성 RNA로부터 INA의 추출을 완벽하게 보여주지 못한다(Drosten 등, 2001. Taqman 5'Nuclease Human Immunodeficiency Virus Type 1 PCR Assay With Phage -Packaged Competitive Internal Control For High - Throughput Blood Donor Screening. J. Clin . Microbiol ., 2001, 39, 4302-4308). 추출단계 동안의 IC RNA 감쇠 또는 비리온들로부터의 RNA 방출은 CSFV RNA 추출에 결정적이지 않다. 따라서, 본 발명은 40회의 냉동/해동 순환 후에도 안정한 것으로 확인된 일반적이고, 비-감염성인 IC RNA를 제공한다.

본 발명은 한편으로는 CSF 시스템 1의 고감도를 가능하게 하기 위해, 다른 한편으로는 복합 분석물 내의 IC의 상대적으로 일정한 증폭을 허용하기 위해 CSFV-특이적 증폭 산물보다 현저히 더 길도록 선택된 표지된 저농도의 IC, 매우 제한된 양의 IC 프라이머들, 및 IC 증폭 산물의 사용을 허용한다.

그 결과, 단일 및 복합 CSF 분석을 위한 독특한 분석적 감도가 얻어질 수 있다. 체외 전사된 양성 RNA의 log₂-희석물을 사용함으로써 RT-PCR 반응당 8 복제물의 평균 검출 한도가 단일 및 복합 CSF 분석에 대해 9log₁₀ 단계들의 광범위한 역동적 범위와 조합으로 얻어진다.

그럼에도 불구하고, 매우 다량의 목적 RNA를 사용함에 있어서 IC 증폭의 억제가 관찰될 수 있다. 이러한 부분적인 또는 완전한 IC 증폭의 억제는 용인할 만한데, IC가 부정확한 부정적 결과들을 배제하기 위해 사용되기 때문이며, 이는 CSFV 목적 RNA의 다량의 경우와 무관하다(Hofmann, 2003, 전술한 내용 참조). 더욱이, CSF-시스템 1 복합 RT-PCR의 감도는 CSF 진단에서 "황금표준"으로 여겨지는 바이러스 분리의 경우와 비교할만하다. 나아가, "황금표준"으로서 사용된 세포 배양의 감도는 계산에 결정적이며 따라서 결과들은 CSFV 분야의 분리주들에 비해 CSFV Alfort 187과 같은 세포 배양에 적용된 균주들에 대해 상이할 수 있다.

CSF-시스템 1의 복합형에 의한 다양한 유전형의 36개의 CSFV 분리주의 분석은 모든 CSF에 대해 유사한 검출 특성을 보였다. 유전형 3.4 CSFV 균주 "카나가와(Knagawa)"의 경우에서조차 형광 신호 및 역치 사이클(threshold cycle)을 고려한 차이점이 발견되지 않았다. 본 CSF-시스템 1과는 대조적으로, 5'-NTR 내의 더 아래쪽에 위치한 서열들에 기초한 공지된 CSFV 특이적 실시간 RT-PCR 분석은 "카나가와" 균주에서 소량의 형광곡선만을 생성하였다.

CSFV 프라이머 및 타크만 탐침의 효과적인 대조군으로 플라스미드계, 비감염성 양성 대조군이 제조되었다. CSFV 양성 샘플들에 함유된 바이러스성 RNA를 정량하기 위해 체외 전사된 양성 대조군 RNA의 일련의 희석물들이 기준으로 사용되었다.

따라서 본 발명의 복합 CSF-시스템 1 내의 양 대조군들(IC 및 PC)은 체외 전사된 비감염성 RNA들이다.

본 발명은: (a) "하나의 튜브" RT-PCR 반응, (b) 입증되고 효과가 높은 RT-PCR 키트의 사용, (c) 안정하고 비감염성인 IC의 통합, (d) 정량 가능한 비감염성 PC의 사용, 및 (e) 감도높고 CSFV 특이적인 두가지 색의 복합 RT-PCR 반응으로서 전체 시스템의 입증을 포함하는 2색 복합 RT-PCR 시스템을 더 포함한다.

구체적으로는, 본 발명의 실시간 RT-PCR 방법은 CSFV의 임상적 증상이 없는 일시적으로 감염된 돼지들이 초기에 더 빈번하게 그리고 세포 배양 분리 방법에 비해 더 장기간에 걸쳐 검출되게 한다. 표준화된 PCR 시스템은 박멸 캠페인 또는 긴급 상황에서 CSFV의 매우 민감하고 특이적인 검출을 위한 확고한 장비로서 사용될 수 있다.

복합 분석

본 발명의 바람직한 실시예에서, 복합 혼성화 분석법이 수행된다. 복합 분석은 분석 도중 또는 완료 후에 샘플 성분 및 이에 관련된 자료를 분류하는 기능에 기반한다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 명백하게 개별적으로 검출 가능한 모이어티(moiety)는 둘 이상의 상이한 복합체의 표지 성분으로 사용된다. 목적 서열에 대해 구분되게(독립적으로) 표지된 복합체 각각의 혼성화와 연관된 자료가 샘플 내에서 검출되어야하는 목적 서열 또는 목적 분자의 존재, 부재 또는 양과 상관관계가 있기 때문에 개별적으로 검출 가능한 모이어티들의 구분 및/또는 정량 기능은 혼성화 분석을 복합화하는 수단을 제공한다.

결과적으로, 본 발명의 복합 분석법은 동일한 샘플 또는 동일한 분석물 내의 둘 이상의 목적 서열 또는 목적 분자의 존재, 부재 또는 양을 동시에 검출하는데 사용될 수 있다. 복합체가 자가 표시성이고 개별적으로 검출가능하도록 설계될 수 있기 때문에, 본 발명의 복합 분석법은 동일한 분석물 내의 관심대상인 둘 이상의 목적 서열 또는 목적 분자의 실시간 및 종기 분석에 대해 동시에 자료를 제공하도록 밀폐된 튜브 형태 내에서 수행될 수 있다. 또한, 본 분석법은 분석 성능을 확인하기 위한 일분자 탐침의 통합에 의해 추가로 복합화될 수 있거나 또는 관심대상인 목적 서열 또는 목적 분자의 특정 형태를 검증하기 위해 사용될 수 있다.

복합 적용

다음 실시예들에 의해 설명되는 바와 같이, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 각 올리고뉴클레오타이드가 적어도 하나의 독립적으로 검출가능한 모이어티를 함유하는 복수의 올리고뉴클레오타이드의 세트를 포함하는 적용에 특히 유용하다. 바람직하게는, 독립적으로 검출가능한 모이어티들은 독립적으로 검출 가능한 형광단(fluorophore)이다. 예를 들면, 하나 이상의 상이한 올리고뉴클레오타이드는 네가지 상이한 목적 서열들 각각을 검출하는데 사용될 수 있는데, 여기서 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 독립적으로 검출 가능한 형광단을 포함한다. 상기 예에서, 상이한 목적 서열들의 존재, 부재 또는 양의 검출은 혼합물이 관심 샘플과 배양된 후 개별적으로 검출 가능한 상이한 형광단 각각의 검출 및/또는 정량에 의해 가능해진다. 앞서 논의한 바와 같이, 올리고뉴클레오타이드는 또한 개별적으로 검출 가능한 모이어티가 동일한 분석 내에서 일어나는 동일한 또는 상이한 공정들의 조작을 구별하기 위해 사용된 분석에도 사용될 수 있다. 이러한 복합 분석법은 올리고뉴클레오타이드가 탐침 또는 프라이머로 사용되든 간에 가능하다.

본 발명의 탐침

본 발명의 다른 실시예는 SEQ ID NO: 1 또는 이에 상보적인 가닥의 표적 부위에 혼성화되어 검출가능한 신호를 제공하는 제 1 탐침을 포함한다. 본 발명의 또다른 실시예는 SEQ ID NO: 10 또는 이에 상보적인 가닥의 표적 부위에 혼성화되어 검출가능한 신호를 제공하는 제 2 탐침을 포함한다.

더욱 구체적인 실시예에서, 제 1 탐침은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오타이드 130 내지 175 또는 이에 상보적인 가닥에 상응하는 표적 부위에 혼성화된다. 다른 구체적인 실시예에서, 제 1 탐침은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오타이드 135 내지 170 또는 이에 상보적인 가닥에 상응하는 표적 부위에 혼성화된다. 또 다른 구체적인 실시예에서, 제 1 탐침은 SEQ ID NO: 1의 141 내지 166 뉴클레오타이드에 상응하는 표적 부위에 혼성화된다.

다른 구체적인 실시예에서, 제 2 탐침은 SEQ ID NO: 10 또는 이에 상보적인 가닥의 690 내지 735 뉴클레오타이드에 상응하는 표적 부위에 혼성화된다. 구체적인 실시예에서, 제 2 탐침은 SEQ ID NO: 10의 뉴클레오타이드 695 내지 730 또는 이에 상보적인 가닥에 상응하는 표적 부위에 혼성화된다. 구체적인 실시예에서, 제 2 탐침은 SEQ ID NO: 10의 뉴클레오타이드 703 내지 724 또는 이에 상보적인 가닥에 상응하는 표적 부위에 혼성화된다.

본 발명의 다른 구체적인 실시예에서, 본 발명의 탐침은 올리고뉴클레오타이드 탐침들이다. 더욱 구체적인 실시예에서, 탐침들은 50개의 뉴클레오타이드까지, 바람직하게는 10-30개의 뉴클레오타이드의 길이, 더욱 바람직하게는 15-25개의 뉴클레오타이드의 길이를 포함한다. 훨씬 더 구체적인 실시예에서 탐침은 SEQ ID NO: 3의 서열 또는 SEQ ID NO: 6의 서열이다. 다른 구체적인 실시예에서, 탐침은 형광으로 표지된다.

표지

본 발명의 탐침에 결합되는 표지는 적어도 하나의 주개(donor) 및 적어도 하나의 받개(acceptor)를 포함하는 에너지 또는 전자 전이 모이어티의 세트를 포함한다. 표지는 구분 표지(예를 들면, CSF 특이적이지 않은 핵산서열), 검출가능한 표지(예를 들면, 형광 이소티오시아네이트 등을 이용하는 공지의 방법에 의해 삽입된 형광 그룹), 또는 디곡시제닌, 또는 (예를 들면 스트렙타비딘 코팅된 표면에 올리고뉴클레오타이드가 결합되는 수단에 의해) 비오틴과 같은 고정될 수 있는 분자의 임의의 형태도 될 수 있다.

전형적으로, 표지는 단일한 주개 모이어티 및 단일한 받개 모이어티를 포함할 것이다. 그럼에도 불구하고, 표지는 하나 이상의 주개 모이어티 및/또는 받개 모이어티를 포함할 수 있다. 예를 들면, 하나의 세트는 세 개의 모이어티를 포함할 수 있다. 모이어티 1은 여기되고 모이어티 2에 근접하게 위치할 경우 표지의 모이어티 2에 에너지를 전이시킬 수 있는 주개 형광단(donor fluorophore)일 수 있다. 이후, 모이어티 2는 여기되고 모이어티 3에 근접하게 위치할 경우 표지의 모이어티 3에 에너지를 전이시킬 수 있다. 결과적으로, 에너지는 세 개의 모든 모이어티 사이에서 전이된다. 이러한 세트에서, 모이어티 2는 모이어티 1로부터 에너지 받개이고, 모이어티 3으로 에너지의 주개이다.

주개 및 받개 모이어티는 하나 이상의 받개 모이어티가 하나 이상의 주개 모이어티로부터 전이된 에너지를 수용하거나, 아니면 주개 모이어티로부터의 신호를 소광시키도록 작동된다.

에너지의 전이는 표지의 밀접하게 연관된 모이어티들의 충돌(비-FRET) 또는 형광 공명 에너지 전이(FRET)와 같은 비복사 방법을 통해 일어난다. FRET가 발생하기 위해서는 주개 및 받개 모이어티 사이의 에너지 전이는 모이어티가 공간상 가깝고 주개의 방출 스펙트럼이 받개의 흡수 스펙트럼과 실질적으로 겹치는 것을 요구한다(Yaron 등, Analytical Biochemistry, 95, 228-235(1979) 및 특히 col.1의 232페이지부터 col.1의 234페이지까지 참조). 선택적으로, 비-FRET 에너지 전이는 주개의 방출 스펙트럼이 받개의 흡수 스펙트럼과 실질적으로 겹치는 것과 상관없이 매우 밀접하게 연관된 주개 및 받개 모이어티 사이에서 일어날 수 있다(Yaron 등, Analytical Biochemistry, 95, 228-235(1979) 및 특히 col.1의 229페이지부터 col.1의 232페이지까지 참조). 소광이 주개 및 받개 모이어티의 직접 접촉에 의해 야기되는 것으로 여겨지기 때문에 이러한 방법은 분자간 충돌로 일컬어진다.

바람직한 주개 및 받개 모이어티는 각각 형광단 및 소광자의 조합이다. 수많은 아민 활성 표지 시약이 상업적으로 유통된다(예를 들면, Eugene, Oreg.의 Molecular Probes로부터). 바람직한 표지 시약은 카르복시산류 또는 카르복시산류의 N-하이드록시석시니딜 에스테르류로서 제공된다. 바람직한 형광색소(형광단)는 5(6)-카르복시플루오레세인(Flu), 6-((7-아미노-4-메틸코우마린-3-아세틸)아미노)헥사논산(Cou), 5(및 6)-카르복시-X-로다민(Rox), 시아닌 2(Cy2) 염료, 시아닌 3(Cy3) 염료, 시아닌 3.5(Cy3.5) 염료, 시아닌 5(Cy5) 염료, 시아닌 5.5(Cy5.5) 염료, 시아닌 7(Cy7) 염료, 시아닌 9(Cy9) 염료(시아닌 2, 3, 3.5, 5 및 5.5는 Arlington Heights, Ill.의 Amersham으로부터의 NHS 에스테르류로서 유통됨), 또는 알렉사 염료 시리즈(Eugene, Oreg.의 Molecular Probes로부터)를 포함한다. 가장 바람직한 형광단은 플루오레세인의 유도체 및 구체적으로는 5 및 6-카르복시플루오레세인이다. 받개 모이어티는 제 2 형광단이 될 수 있으나, 바람직하게는 받개 모이어티는 소광자 모이어티이다. 소광자 모이어티는 형광단과 같은 주개 모이어티로부터의 검출가능한 신호를 억제할 수 있는 모이어티이다. 가장 바람직하게는, 소광자 모이어티는 하나 이상의 아조 또는 니트로 그룹들로 치환된 방향족 또는 헤테로방향족이다. 가장 바람직한 소광자 모이어티는 4-((4-(디메틸아미노)페닐)아조)벤조산(dabcyl)이다.

본 발명의 키트

본 발명은 또한 본 발명에 따른 프라이머를 포함하고 PCR을 수행하기 위해 개별적으로 꾸려진 시약을 포함하는 CSFV 검출용 키트를 포함한다. 이러한 키트는 바람직하게는 프라이머에 의해 증폭되는 영역 내의 CSFV를 검출하는 적어도 하나의 표지된 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.

키트의 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.4, SEQ ID NO.6 및 SEQ ID NO.7이 될 수 있다. 키트의 표지된 올리고뉴클레오타이드 탐침은 SEQ ID NO.3, SEQ ID NO.6, SEQ ID NO.8 또는 SEQ ID NO.9가 될 수 있으며, SEQ ID NO.3 및 SEQ ID NO.6은 원하는 대로 표지될 수 있다.

본 발명의 바람직한 키트는 PCR 반응을 수행하기 위한 모든 시약을 포함한다.

키트의 각 표지된 탐침들은 CSFV의 존재, 부재 또는 양에 대해 샘플을 관찰하는데 사용된다. 바람직한 실시예에서, 키트의 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드는 PCR 반응에서 프라이머들로 작용한다.

전형적인 키트는 적어도 두 개의 프라이머, 적어도 하나의 탐침, 뉴클레오타이드 3인산염, 폴리머라아제 효소(바람직하게는 열안정 폴리머라아제) 및 완충용액(조절된 이온강도, 조절된 마그네슘 함량 및 pH 조절자와 함께)을 포함할 것이다.

도 1은 78개 CSFV 균주들의 5'-NTR의 공통 서열(consensus sequence) 및 CSFV-특이적 실시간 RT-PCR 시스템의 위치결정을 나타낸다. 공통 서열은 뉴클레오타이드의 단일문자 코드를 이용하여 도시하였다. 밑줄 친 문자들은 특정 뉴클레오타이드에 대한 선호도가 있는 동요 서열(wobble sequence)을 묘사하였다. 비교된 78개의 뉴클레오타이드 중 1 내지 3개만이 불일치하였다. 굵은 글씨로 인쇄된 동요 서열과 함께, 4 이상의 뉴클레오타이드에서 불일치한 배열이 특징지어졌다.

도 2는 체외 전사된 PC의 10배 희석 시리즈에 기초한 CSF-시스템 1의 분석적 감도를 나타낸다. 증폭점(A) 및 관련된 기준 곡선 그래프(B)가 도시되었다(NTC = 주형이 없는 대조군).

도 3은 단일 분석법과 비교한 CSF-시스템 1 복합 분석법의 감도를 나타낸다. 도 3의 A는 양 분석법의 FAM 형광 수치를 나타낸다. 도 3의 B에서는 IC-RNA의 동반증폭(co-amplification)을 도시하였다. 복합 분석법만을 위해 HEX 형광 수치가 관 찰되었다. (굵은선 = 단일 분석, 사각형을 지닌 가는 선 = 복합 분석)

실시예

A. 실시예 1: 바이러스 및 세포

본 실험에 사용된 바이러스들(9×BDV, 22×BVDV 1, 19×BVDV 2, 36×CSFV, 비정형 페스티바이러스(Pestivirus) Giraffe(Avalost 등, 2001), 비정형 페스티바이러스 D32/00 "HoBi"[Schirmeier 등, 2004])은 독일의 Insel Riems의 프리드리히-뢰플러-협회에 위치한 CSF에 대한 국가표준실험실(National Reference Laboratory)의 바이러스 은행 내에 등록되어 있다. 분리주의 일부는 CSF에 대한 집행위원회 산하연구소(Community Reference Laboratory)(TiHo 하노버, 독일)로부터 입수하였다. 모든 CSFV 균주는 돼지의 신장세포(PK-15)를 이용하여 배양되었으며, BDV 및 BVDV들은 소 신장세포(MDBK) 또는 양 흉선세포(SFT-R)를 이용해 증식되었다. 세포주들은 독일 Insel Riems의 수의학 세포주 컬렉션(CCLV, the Collection of Cell Lines in Veterinary medicine)으로부터 제공받았다.

B. 실시예 2: 세포 배양을 이용한 바이러스 분리

세포주는 바이러스 균주들의 상이한 희석제와 접종되었으며, 37℃에서 배양되었다. 4일 후, 세포들의 단층이 열고정되고, 페스티바이러스 특이적 단클론성 항체 C16으로 염색되었다(Peters 등, 1986). 모든 바이러스 분리주들은 복제가 수행되었다. CSFV 역가는 ml 당 조직 배양 감염성 복용량 50%(TCID₅₀)대로 계산되었다.

C. 실시예 3: RNA 분리 및 내부 대조군의 첨가

바이러스의 RNA는, QIAamp 바이러스 RNA 키트(Qiagen)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 세포 배양액(cell culture)으로부터 추출되었고, 내부 대조군(IC) RNA의 첨가에 의해 변형되었다. 간략히, 140㎕의 세포 배양액 상등액이 560㎕의 용해(lysis) 버퍼에 첨가되었고, 볼텍스(vortex)되고, 실온에서 5분간 인큐베이션(incubation)되었다. 이어서, 5㎕의 체외 전사된 IC RNA(2×10⁵ 복제물/㎕)이 첨가되었다. 5분 후, 560㎕의 에탄올이 첨가되었고 용액은 QIAamp 스핀 컬럼을 통해 원심분리되었다. 적절한 버퍼로 컬럼을 2회 세척한 후 50㎕의 용리(elution) 버퍼를 이용해 RNA가 용리되었고, -20℃에서 보관되었다.

D. 실시예 4: 프라이머, 탐침, 및 타크만® 실시간 RT-PCR

상이한 CSFV 서열의 정렬이 유전자 컴퓨터 그룹 소프트웨어 패키지(GCG 위스콘신)를 이용해 수행되었다. 정렬에 기초한 프라이머 및 탐침 선택은 소프트웨어 패키지 비컨 디자이너 2.06(PremierBiosoft)에 의해 지원되었다. 모든 올리고뉴클레오타이드는 MWG 바이오텍 AG(독일 Ebersberg)에 의해 합성되었고, 사용할 때까지 -20℃에서 보관되었다. 표 1은 본 실험의 실시간 RT-PCR에 사용될 프라이머 및 탐침을 나타낸다.

교차 감염의 위험을 최소화하기 위하여 상업적으로 유통되는 QuantiTect^TM 탐침 RT-PCR 키트(Qiagen)를 이용하는 단일 단계의 RT-PCR 프로토콜이 선택되었다. 실시간 RT-PCR 분석은 총 부피 25㎕를 이용하여 최적화되었다. 간략히, 3.25㎕의 RNase 배제수(水)의 단일 웰(well)에 대해 12.5㎕의 2×QuantiTect 탐침 RT-PCR 마스터 믹스, 0.25㎕의 QuantiTect 탐침 RT 믹스, 2㎕의 CSF 특이적 프라이머-탐침-믹스(0.6μM의 CSF 특이적 프라이머 + 0.1μM의 CSF 특이적 탐침) 및 2㎕의 IC-특이적 프라이머-탐침-믹스(0.2μM의 EGFP-특이적 프라이머 + 0.1μM의 EGFP1-HEX 탐침)이 마스터 믹스로서 모이고, 최종적으로 5㎕의 주형(템플릿)이 첨가되었다.

실시간 RT-PCR이 다음 온도 분포를 이용하여 iCycler IQTM 실시간 검출 시스템(BioRad)에서 수행되었다: 50℃에서 30분(역전사), 95℃에서 15분(역전사효소의 비활성화/Taq 폴리머라아제의 활성화), 이어서 94℃에서 15초(변성, denaturation), 57℃에서 30초(결합, annealing) 및 68℃에서 30초(신장, elongation)의 42회 순환. 동일한 온도 분포가 모든 실시간 RT-PCR 실행에 사용되었고 결합 단계 동안에 형광 수치가 수집되었다.

E. 실시예 5: 플라스미드 DNA 의 체외 전사

선형화되고 겔 정제된 플라스미드 DNA가 Riboprobe^® 시스템-SP6/T7(Promega)을 이용하여 제조사의 지침에 따라 체외 전사되었다. 전사된 T7 양성 대조군 및 전사된 SP6 내부 대조군이 제공된 DNase로 분해되었고 RNeasy 키트(Qiagen)를 이용해 정제되었다. 전사된 RNA의 정확한 길이가 포름알데히드 아가로스 겔 전기영동에 의해 확인되었고, 분광광도계에 의해 농도가 측정되었다. 다음 공식을 이용해 RNA 분자의 정확한 수가 계산되었다:(X g/㎕ RNA / [뉴클레오타이드의 전사길이×340])×6.022×10²³ = Y 분자들/㎕.

보통, 10¹² 내지 10¹³ RNA 분자들이 50㎕의 체외 전사 과정에서 얻어졌으며 수천 번의 RT-PCR에 충분하였다. 체외 전사된 RNA의 원액(stock solution)은 -70℃에서 보관되었으며, 희석된 모액(working solution)은 -20℃에서 보관되었다.

F. 실시예 6: CSF -특이적 실시간 RT - PCR 의 설계

제 1 단계에서, 상이한 CSFV 균주들의 5'-NTR의 78개의 서열들이 정렬되었고 일치하는 서열들이 계산되었다(도 1). (도 1의 밑줄 친) 4개 이상의 비교 CSFV 균주들에서 불일치하는, 단지 연관 동요 뉴클레오타이드가 프라이머 및 탐침의 선택을 위해 고려되었다. 불일치하는 뉴클레오타이드가 단일 CSFV 균주의 5'-NTR의 일부가 아닌 경우, 일치하는 서열 내에서 두 개의 연관 동요 뉴클레오타이드를 지닌 올리고뉴클레오타이드만이 사용되었다. 제 2 단계에서, CSFV-특이적 실시간 RT-PCR 시스템이 설계되었고, "CSF-시스템 1"이라 명명되었다. "CSF-시스템 1"은 프라이머쌍 CSF100-F/CSF192-R, 및 FAM-표지된 탐침 CSF-탐침 1(도 1, 표 1)로 이루어졌으며, CSFV의 5'-NTR의 100nt 내지 192nt 사이의 93bp의 분절을 증폭하였다(균주 Alfort 187[접수번호 X87939]; 도 1).

"CSF-시스템 1"의 프라이머 및 탐침 모두는 가장 적절한 농도를 확인하기 위해 체커보드(chequerboard) 분석법 내에서 적정되었고, 이는 최초의 역치 사이클과 조합된 최대 형광 수치로서 정의되었다. "CSF-시스템 1"을 위해 프라이머 0.6μM/반응 및 탐침 0.1μM/반응이 CSFV 유전체들을 위한 최적치로서 동정되었다.

G. 실시예 7: 양성 및 내부 대조군 플라스미드의 제조

프라이머들 CSF100-F 및 CSF383-R(표 1)을 이용하여 CSFV Alfort/187의 5'-NTR(접수번호 X87939)의 284bp 분절이 RT-PCR에 의해 증폭되었고, 정제되었으며 표준 클로닝 벡터 pGEM-Teasy(Promega) 내로 삽입되었다. 얻어진 플라스미드 pGEM-PC3alf(도 2)는 양성 대조군(PC) RNA의 체외 전사에 사용되었다. 내부 대조군(IC) 플라스미드가 유사하게 제조되었다. 프라이머 EGFP1-F 및 EGFP2-R(표 1)을 사용하여 pEGFP-1 표준 벡터(BD 바이오사이언스 클론텍)의 132bp 분절이 PCR에 의해 증폭되었고 pGEM-Teasy 클로닝 벡터로 복제되었다(도 2). 결과물인 IC 플라스미드는 pGEM-EGFP1로 명명되었다. 양 플라스미드들은 M13 표준 프라이머로 서열분석함으로써 조절되었다. pGEM-PCalf 내의 CSFV 5'-NTR 분절은 순방향의 기원에서 연결(ligation)하였으며 이로써 EGFP 분절이 역방향 기원에서 pGEM-EGFP1 내로 삽입되었다.

H. 실시예 8: " CSF -시스템 1"의 분석적 감도

"CSF-시스템 1"의 분석적 감도가 체외 전사된 PC-RNA의 일련의 희석물로 측정되었다. 체외 전사된 PC-RNA의 첫 번째 10배 희석물 시리즈에서 "CSF-시스템 1"이 선형 방식으로 10¹ 복제물/well부터 10⁹ 복제물/well까지 99.8%의 PCR 효율로 PC를 증폭시켰음을 확인하였다. 더 구체적인 분석에서, 분석법의 특이적 분석적 감도 한계가 PC-RNA의 2배 희석물 시리즈를 이용해 측정되었다. 최종적으로, 단일 "CSF-시스템 1" 분석법에 대해 약 8 복제물/well의 검출한계가 측정되었다(표 2).

I. 실시예 9: 증폭을 위한 EGFP -특이적 실시간 RT - PCR 의 설계 및 내부 대조군의 검출

RNA 분리 및 RT-PCR을 고려하는 각 샘플 또는 샘플 풀(pool)의 내부 대조군에 대해 이종체 IC-RNA 실시간 RT-PCR 분석물이 설계되었다. 체외 전사된 IC는 RNA 분리 전 또는 RT-PCR 후에 각 샘플에 첨가될 수 있었고, "IC-시스템 1"로 명명된 EGFP-특이적 실시간 RT-PCR 시스템으로 증폭되었다. 프라이머쌍 EGFP1-F/EGFP2-R의 132bp 증폭 산물은 HEX-표지된 탐침 EGFP1-HEX을 이용하여 검출되었다(표 1). 바둑알 분석법에서 양 프라이머 및 탐침에 대한 농도가 적정되었고, "IC-시스템 1"의 분석적 감도가 체외 전사된 IC-RNA의 일련의 희석물을 사용하여 분석되었다. 마지막으로, 10 내지 100 복제물/well 사이의 IC 분석물의 감도 한계가 측정되었다(자료는 도시하지 않음).

CSFV-특이적 실시간 RT-PCR 시스템의 최대 감도에 대해 "IC-시스템 1"의 프라이머들을 제한하는 것이 필요하였다. 역치 사이클을 현저히 증가시키지 않고 EGFP 분절을 증폭시킨 프라이머의 최소 농도가 복합 실시간 RT-PCR 분석법의 미세조정(fine tuning)을 위해 측정되었다. 마지막으로, 0.2μM/반응의 EGFP 순방향 및 역방향 프라이머들 및 0.1μM/반응의 탐침이 복합 분석법의 IC 검출을 위해 사용되었다.

J. 실시예 10: 복합 실시간 RT - PCR 분석에 " CSF -시스템 1" 및 " IC -시스템 1"의 조합

최적의 단일 CSF-특이적 실시간 RT-PCR 분석물 내의 프라이머 및 탐침 농도의 검출, 및 IC-특이적 프라이머들에 대한 제한된 농도의 결정 후에 최적화된 복합 CSF-특이적 실시간 RT-PCR 프로토콜이 확립되었다. 따라서, 단일 및 복합 실시간 RT-PCR 분석법의 분석적 감도들이 비교되었다. 우선, PC-RNA의 2배 희석물의 일련의 배치(batch)들이 IC-RNA의 동반증폭과 함께 또는 없이 증폭되었다. RT-PCR 웰 당 PC-RNA 1000개의 복제물로 시작하여, 단일뿐만 아니라 복합 분석에 대한 RT-PCR 반응 당 8 복제물의 동일한 감도 한계가 검출될 수 있었다(표 4). 두번째로, 추출된 CSFV-RNA의 일련의 희석물이 IC의 동반증폭과 함께 또는 없이 증폭되었다. 상기 실험들에서, 양 시스템들에 대해 동일한 결과가 생성되었다. 예로써, CSFV 균주 "Paderborn"(유전형 2.1)의 RNA의 일련의 희석물의 증폭에 이은 형광 신호들을 도 3의 A에 나타내었다. 굵은 선은 단일 분석의 FAM-형광발광 수치를 나타내며, 사각형을 지닌 가는 선은 IC의 동반증폭을 포함하는 복합 분석의 FAM-형광발광 수치를 나타낸다. 내부 대조군(IC)의 증폭은 도 3의 B에 분리되어 도시되었다. IC의 동반증폭과 함께한 모든 RT-PCR 반응들이 검출 가능한 HEX 형광 신호들을 보였으며, IC-RNA의 양이 대략 30의 역치 사이클(TC)에 도달하도록 조절되었음을 주시해야 한다. 복합 분석에서의 IC에 대한 TC들의 관찰 범위는 29 내지 32 사이였으며(도 3의 B), IC의 TC 값들은 테스트 내에 있던 CSFV 유전체들의 복제 숫자가 높을수록 높았다(도 3의 B). 그럼에도 불구하고, 다량의 CSFV-RNA의 선호되는 증폭에 의해 야기된 IC 증폭의 경쟁 억제가 관찰되었다(도 3의 B).

K. 실시예 11: "황금표준" 바이러스 분리에 대한 복합 "CSF-시스템 1"의 감도

"CSF-시스템 1"과 "황금표준" 바이러스 분리의 비교연구를 위해 CSFV 양성 세포 배양 부유체의 10배 희석물 시리즈들이 준비되었다(표 2). 각 희석물 시리즈 중 하나의 부분표본(aliquot)이 바이러스 분리에 사용되었으며, 두 번째 부분표본이 RNA 분리 및 복합 실시간 RT-PCR 분석에 사용되었다. 상이한 CSFV 유전형의 몇몇 균주들이 조사에 포함되었으며, 결과는 복합 실시간 RT-PCR 분석의 높은 감도를 확인시켜주었다. 대부분의 경우에서, 실시간 RT-PCR 분석의 감도가 적어도 바이러스 분리와 적어도 동일하거나(CSFV-Uelzen, 유전형 2.3) 오히려 높았다(CSFV-Kozlov, 유전형 1.2; CSFV-Paderborn, 유전형 2.1)(표 3). 그러나, 세포 배양이 균주 Alfort 187(유전형 1.1)에 적용된 경우에는 실시간 RT-PCR의 감도가 바이러스 분리에 비해 대략 10배 감소하였다(표 3).

L. 실시예 12: CSF-실시간 RT-PCR 분석법의 특이성

복합 분석이 BVDV, BDV, 또는 비정형 페스티바이러스들로부터 CSFV를 구별하는 능력을 측정하기 위해 90개의 상이한 페스티바이러스 균주들의 패널(panel)이 시험되었다(표 3). 모든 공지된 CSFV 유전형들의 구성원인 36개의 상이한 CSFV 균주들이 정확하게 검출되었고(표 3), 나아가 형광 신호들의 경사진 곡선 진행이 모든 증례들에서 관찰되었다(자료는 도시하지 않음). 유전형 3.4 CSFV인 CSFV 균주 "카나가와"에서조차 TC 값들의 눈에 띄는 차이점 및 형광 신호가 관찰되지 않았다(자료는 도시하지 않음). 실시간 RT-PCR 분석의 특이성은 또한 제한된 음성의 돼지군으로부터의 혈청 샘플(n=100)로 입증되었다. RNA가 샘플로부터 분리되었고, 복합 CSFV-특이적 실시간 RT-PCR에서 시험되었다. 모든 샘플은 음의 값을 기록하였고 배경 형광 수치만이 관찰되었다.

본 발명은 본 발명의 일부 양태의 설명을 목적으로 하는 설명된 예들의 특정 실시예들에 의해 범위가 제한되지 않으며, 기능적으로 동등한 실시예들도 본 발명의 범위 내이다. 사실, 본 명세서에 나타내고 설명한 것들에 더하여 본 발명의 다양한 변화들이 당업자들에게 명백할 것이며 첨부된 청구항들의 범위 내에 있게 된다.

모든 인용된 특허, 특허출원 및 출판물들은 그 전체가 참증으로서 본 명세서에 통합되었다.

(a)각각 CSFV Alfort/187(접수번호 X87939) 및 표준 클로닝벡터 pEGFP-1(BD 바이오사이언스 클론텍, 접수번호 U55761)에 따른 유전체 위치.

본 명세서 내에 포함되어 있음.

SEQUENCE LISTING <110> Idexx Laboratories Hoffmann, Bernd Depner, Klaus Beer, Martin <120> Method of Detection of Classical Swine Fever <130> 61635-5019-MX <150> US 11/052,762 <151> 2005-02-09 <160> 10 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 12298 <212> DNA <213> Classical swine fever virus <400> 1 gtatacgagg ttagttcatt ctcgtatgca tgattggaca aattaaaatt tcaatttgga 60 tcagggcctc cctccagcga cggccgaact gggctagcca tgcccacagt aggactagca 120 aacggaggga ctagccgtag tggcgagctc cctgggtggt ctaagtcctg agtacaggac 180 agtcgtcagt agttcgacgt gagcagaagc ccacctcgat atgctatgtg gacgagggca 240 tgcccaagac acaccttaac cctagcgggg gtcgctaggg tgaaatcaca ccacgtgatg 300 ggagtacgac ctgatagggt gctgcagagg cccactatta ggctagtata aaaatctctg 360 ctgtacatgg cacatggagt tgaatcattt tgaactttta tacaaaacaa acaaacaaaa 420 accaatggga gtggaggaac cggtatacga tgccacgggg aaaccattgt ttggagaccc 480 gagtgaggta cacccacaat caacactgaa gctaccacat gataggggga gaggtaacat 540 caaaacaaca ctgaagaacc tacctaggaa aggcgactgc aggagtggca accatctagg 600 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fever virus <400> 2 atgcccayag taggactagc a 21 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Classical swine fever virus <400> 3 tggcgagctc cctgggtggt ctaagt 26 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Classical swine fever virus <400> 4 ctactgacga ctgtcctgta c 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Enhanced Green Fluoresenct Protein probe <400> 5 gaccactacc agcagaacac 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Enhanced Green Fluoresenct Protein probe <400> 6 agcacccagt ccgccctgag c 21 <210> 7 <211> 16 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Enhanced Green Fluoresenct Protein probe <400> 7 gaactccagg accatg 16 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Classical swine fever virus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(26) <223> 5' FAM labelled <220> <221> misc_feature <222> (1)..(26) <223> 3' TAMRA labelled <400> 8 tggcgagctc cctgggtggt ctaagt 26 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Enhanced Green Fluoresenct Protein probe <220> <221> misc_feature <222> (1)..(22) <223> 5' HEX labelled <220> <221> misc_feature <222> (1)..(22) <223> 3' BHQ1 labelled <400> 9 agcacccagt ccgccctgag ca 22 <210> 10 <211> 4151 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cloning vector pEGFP-1 <400> 10 tagttattac tagcgctacc ggactcagat ctcgagctca agcttcgaat tctgcagtcg 60 acggtaccgc gggcccggga tccaccggtc gccaccatgg tgagcaaggg cgaggagctg 120 ttcaccgggg tggtgcccat cctggtcgag ctggacggcg acgtaaacgg ccacaagttc 180 agcgtgtccg gcgagggcga gggcgatgcc acctacggca agctgaccct gaagttcatc 240 tgcaccaccg gcaagctgcc cgtgccctgg cccaccctcg tgaccaccct gacctacggc 300 gtgcagtgct tcagccgcta ccccgaccac atgaagcagc acgacttctt caagtccgcc 360 atgcccgaag gctacgtcca ggagcgcacc atcttcttca aggacgacgg caactacaag 420 acccgcgccg aggtgaagtt cgagggcgac accctggtga accgcatcga gctgaagggc 480 atcgacttca aggaggacgg caacatcctg gggcacaagc tggagtacaa ctacaacagc 540 cacaacgtct atatcatggc cgacaagcag aagaacggca tcaaggtgaa cttcaagatc 600 cgccacaaca tcgaggacgg cagcgtgcag ctcgccgacc actaccagca gaacaccccc 660 atcggcgacg gccccgtgct gctgcccgac aaccactacc tgagcaccca gtccgccctg 720 agcaaagacc ccaacgagaa gcgcgatcac atggtcctgc tggagttcgt gaccgccgcc 780 gggatcactc tcggcatgga cgagctgtac aagtaaagcg gccgcgactc tagatcataa 840 tcagccatac cacatttgta gaggttttac ttgctttaaa aaacctccca cacctccccc 900 tgaacctgaa acataaaatg aatgcaattg ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttata 960 atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc 1020 attctagttg tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta aggcgtaaat tgtaagcgtt 1080 aatattttgt taaaattcgc gttaaatttt tgttaaatca gctcattttt taaccaatag 1140 gccgaaatcg gcaaaatccc ttataaatca aaagaataga ccgagatagg gttgagtgtt 1200 gttccagttt ggaacaagag tccactatta aagaacgtgg actccaacgt caaagggcga 1260 aaaaccgtct atcagggcga tggcccacta cgtgaaccat caccctaatc aagttttttg 1320 gggtcgaggt gccgtaaagc actaaatcgg aaccctaaag ggagcccccg atttagagct 1380 tgacggggaa agccggcgaa cgtggcgaga aaggaaggga agaaagcgaa aggagcgggc 1440 gctagggcgc tggcaagtgt agcggtcacg ctgcgcgtaa ccaccacacc cgccgcgctt 1500 aatgcgccgc tacagggcgc gtcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct 1560 atttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga 1620 taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag agtcctgagg cggaaagaac cagctgtgga 1680 atgtgtgtca gttagggtgt ggaaagtccc caggctcccc agcaggcaga agtatgcaaa 1740 gcatgcatct caattagtca gcaaccaggt gtggaaagtc cccaggctcc ccagcaggca 1800 gaagtatgca aagcatgcat ctcaattagt cagcaaccat agtcccgccc ctaactccgc 1860 ccatcccgcc cctaactccg cccagttccg cccattctcc gccccatggc tgactaattt 1920 tttttattta tgcagaggcc gaggccgcct cggcctctga gctattccag aagtagtgag 1980 gaggcttttt tggaggccta ggcttttgca aagatcgatc aagagacagg atgaggatcg 2040 tttcgcatga ttgaacaaga tggattgcac gcaggttctc cggccgcttg ggtggagagg 2100 ctattcggct atgactgggc acaacagaca atcggctgct ctgatgccgc cgtgttccgg 2160 ctgtcagcgc aggggcgccc ggttcttttt gtcaagaccg acctgtccgg tgccctgaat 2220 gaactgcaag acgaggcagc gcggctatcg tggctggcca cgacgggcgt tccttgcgca 2280 gctgtgctcg acgttgtcac tgaagcggga agggactggc tgctattggg cgaagtgccg 2340 gggcaggatc tcctgtcatc tcaccttgct cctgccgaga aagtatccat catggctgat 2400 gcaatgcggc ggctgcatac gcttgatccg gctacctgcc cattcgacca ccaagcgaaa 2460 catcgcatcg agcgagcacg tactcggatg gaagccggtc ttgtcgatca ggatgatctg 2520 gacgaagagc atcaggggct cgcgccagcc gaactgttcg ccaggctcaa ggcgagcatg 2580 cccgacggcg aggatctcgt cgtgacccat ggcgatgcct gcttgccgaa tatcatggtg 2640 gaaaatggcc gcttttctgg attcatcgac tgtggccggc tgggtgtggc ggaccgctat 2700 caggacatag cgttggctac ccgtgatatt gctgaagagc ttggcggcga atgggctgac 2760 cgcttcctcg tgctttacgg tatcgccgct cccgattcgc agcgcatcgc cttctatcgc 2820 cttcttgacg agttcttctg agcgggactc tggggttcga aatgaccgac caagcgacgc 2880 ccaacctgcc atcacgagat ttcgattcca ccgccgcctt ctatgaaagg ttgggcttcg 2940 gaatcgtttt ccgggacgcc ggctggatga tcctccagcg cggggatctc atgctggagt 3000 tcttcgccca ccctaggggg aggctaactg aaacacggaa ggagacaata ccggaaggaa 3060 cccgcgctat gacggcaata aaaagacaga ataaaacgca cggtgttggg tcgtttgttc 3120 ataaacgcgg ggttcggtcc cagggctggc actctgtcga taccccaccg agaccccatt 3180 ggggccaata cgcccgcgtt tcttcctttt ccccacccca ccccccaagt tcgggtgaag 3240 gcccagggct cgcagccaac gtcggggcgg caggccctgc catagcctca ggttactcat 3300 atatacttta gattgattta aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc 3360 tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag 3420 accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct 3480 gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac 3540 caactctttt tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgtccttc 3600 tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg 3660 ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt 3720 tggactcaag acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt 3780 gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc 3840 tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca 3900 gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata 3960 gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg 4020 ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct 4080 ggccttttgc tcacatgttc tttcctgcgt tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta 4140 ccgccatgca t 4151

Claims

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(i) CSFV(classical swine fever virus) 핵산을 역전사하여 CSFV cDNA를 수득하는 단계;

(ii) 상기 CSFV cDNA를, 적어도 하나의 제 1 순방향 프라이머 및 적어도 하나의 제 1 역방향 프라이머를 포함하는 둘 이상의 제 1 프라이머 및 DNA 폴리머라아제와 접촉시켜 PCR 생성물을 생성하는 단계로서, 제 1 순방향 프라이머는 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오타이드 75 내지 150 또는 이에 상보적인 가닥에 상응하는 표적 부위에 혼성화되고, 제 1 역방향 프라이머는 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오타이드 155 내지 205 또는 이에 상보적인 가닥에 상응하는 표적 부위에 혼성화되는 것인 단계;

(iii) 상기 PCR 생성물과 제 1 핵산 탐침을 접촉시켜, 탐침이 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오타이드 130 내지 175 또는 이에 상보적인 가닥에 상응하는 표적 부위에 혼성화되는 단계;

(iv) SEQ ID NO: 10의 내부 대조군을, 내부 대조군에 혼성화될 수 있는, 적어도 하나의 제 2 순방향 프라이머 및 적어도 하나의 제 2 역방향 프라이머를 포함하는 둘 이상의 제 2 프라이머와 접촉시키는 단계로서, 제 2 순방향 프라이머는 SEQ ID NO: 10의 뉴클레오타이드 625 내지 675 또는 이에 상보적인 가닥에 상응하는 표적 부위에 혼성화되고, 제 2 역방향 프라이머는 SEQ ID NO: 10의 뉴클레오타이드 740 내지 780 또는 이에 상보적인 가닥에 상응하는 표적 부위에 혼성화되는 것인 단계;

(v) 적어도 하나의 제 2 핵산 탐침을 첨가하여, 탐침이 SEQ ID NO: 10의 뉴클레오타이드 690 내지 735 또는 이에 상보적인 가닥에 상응하는 표적 부위에 혼성화되는 단계; 및

(vi) 혼성화된 탐침의 존재를 검출하는 단계

를 포함하는 생물학적 샘플 내의 CSFV 핵산을 검출하기 위한 방법.
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(i) CSFV(classical swine fever virus) 핵산을 역전사하여 CSFV cDNA를 수득하는 단계;

(ii) 상기 CSFV cDNA를, 적어도 하나의 제 1 순방향 프라이머 및 적어도 하나의 제 1 역방향 프라이머를 포함하는 둘 이상의 제 1 프라이머 및 DNA 폴리머라아제를 접촉시켜 PCR 생성물을 제조하는 단계로서, 제 1 순방향 프라이머는 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오타이드 100 내지 120 또는 이에 상보적인 가닥에 상응하는 표적 부위에 혼성화되고, 제 1 역방향 프라이머는 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오타이드 172 내지 192 또는 이에 상보적인 가닥에 상응하는 표적 부위에 혼성화되는 것인 단계;

(iii) 상기 PCR 생성물을 제 1 핵산 탐침과 접촉시켜, 탐침이 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오타이드 141 내지 166 또는 이에 상보적인 가닥에 상응하는 표적 부위에 혼성화되는 단계;

(iv) SEQ ID NO: 10의 내부 대조군을, 적어도 하나의 제 2 순방향 프라이머 및 적어도 하나의 제 2 역방향 프라이머를 포함하는 둘 이상의 제 2 프라이머와 접촉시켜, 제 2 순방향 프라이머는 SEQ ID NO: 10의 뉴클레오타이드 637 내지 656 또는 이에 상보적인 가닥에 상응하는 표적 부위에 혼성화되고, 제 2 역방향 프라이머는 SEQ ID NO: 10의 뉴클레오타이드 750 내지 768 또는 이에 상보적인 가닥에 상응하는 표적 부위에 혼성화되는 단계;

(v) 적어도 하나의 제 2 핵산 탐침을 접촉시켜, 탐침이 SEQ ID NO: 10의 뉴클레오타이드 703 내지 724 또는 이에 상보적인 가닥에 상응하는 표적 부위에 혼성화되는 단계; 및

(vi) 혼성화된 탐침의 존재를 검출하는 단계

를 포함하는 생물학적 샘플 내의 CSFV 핵산을 검출하기 위한 방법.
제 7 항 또는 제 50 항에 있어서,

제 1 탐침 또는 제 2 탐침이 올리고뉴클레오타이드 탐침인 생물학적 샘플 내의 CSFV 핵산을 검출하기 위한 방법.
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제 51 항에 있어서,

제 1 탐침 또는 제 2 탐침이 15 내지 25개의 뉴클레오타이드 길이인 생물학적 샘플 내의 CSFV 핵산을 검출하기 위한 방법.
제 7 항 또는 제 50 항에 있어서,

검출이 형광의 변화를 측정하는 것인 생물학적 샘플 내의 CSFV 핵산을 검출하기 위한 방법.
제 51 항에 있어서,

탐침이 형광으로 표지되는 것인 생물학적 샘플 내의 CSFV 핵산을 검출하기 위한 방법.
제 7 항 또는 제 50 항에 있어서,

순방향 및 역방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 50개 이하의 뉴클레오타이드를 포함하는 것인 생물학적 샘플 내의 CSFV 핵산을 검출하기 위한 방법.
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(i) 샘플을 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 또는 SEQ ID NO: 9의 뉴클레오타이드 서열을 가진 탐침과 접촉시키는 단계로서, 탐침은 SEQ ID NO: 1 또는 이의 상보적인 가닥에 의해 정의된 표적 영역에 혼성화되고, 혼성화는 제 1 검출 가능한 신호를 제공하는 단계, 및 상기 제 1 검출 가능한 신호의 세기를 측정하는 단계;

(ii) 알려진 CSFV(classical swine fever virus) 바이러스 농도를 가진 대조군 샘플을 상기 (i) 단계의 탐침과 동일한 탐침으로 접촉시켜 제 2 검출 가능한 신호를 제공하는 단계 및 상기 제 2 검출 가능한 신호의 세기를 측정하는 단계; 및

(iii) 제 1 검출 가능한 신호의 세기와 제 2 검출 가능한 신호의 세기를 비교함으로써 분리 샘플 내의 돼지 콜레라 바이러스 농도를 정량하는 단계

를 포함하는, 분리 샘플 내의 돼지 콜레라(CSFV) 바이러스 농도를 정량하는 방법.
제 7 항 또는 제 50 항에 있어서,

CSFV가 실시간 또는 분석의 종기 중 하나에서 밀폐된 튜브 형식 내에서 독립적으로 검출될 수 있는 생물학적 샘플 내의 CSFV 핵산을 검출하기 위한 방법.
제 7 항 또는 제 50 항에 있어서,

제 1 순방향 프라이머는 SEQ ID NO: 2로 이루어지고, 제 1 역방향 프라이머는 SEQ ID NO: 4로 이루어지고, 제 1 핵산 탐침은 SEQ ID NO:3으로 이루어지는 것인 생물학적 샘플 내의 CSFV 핵산을 검출하기 위한 방법.