CN116716273B - 一种末端脱氧核苷酸转移酶突变体及其组合物与制备方法 - Google Patents
一种末端脱氧核苷酸转移酶突变体及其组合物与制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种末端脱氧核苷酸转移酶突变体及其组合物与制备方法，所述末端脱氧核苷酸转移酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明中提供的末端脱氧核苷酸转移酶突变体相比野生型末端脱氧核苷酸转移酶具有更短的氨基酸序列，更小的催化蛋白结构域体积，且具有较好的催化活性。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质工程技术领域，尤其涉及一种末端脱氧核苷酸转移酶突变体及其组合物与制备方法。
背景技术
人工DNA合成技术是现代基因技术的重要基础。DNA人工合成的关键方法包括：柱式化学寡核苷酸合成、芯片化学寡核苷酸合成、寡核苷酸纯化、寡核苷酸拼装、基因合成纠错与克隆筛选、大片段基因合成组装以及DNA的新一代酶法合成。DNA人工合成的传统方法大多依赖亚磷酰胺化学完成反应，近年来以酶促合成为原理的第三代DNA人工合成逐渐崛起，成为前景广阔的DNA人工合成方法，其中以末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）为核心的酶促合成技术是极具前景的DNA合成策略。
新型核苷酸酶促合成法是利用非模版依赖性的TdT进行体外的寡核苷酸片段合成，即TdT是生物酶促法合成寡聚核苷酸的重要工具。TdT最先由Bollum发现并提出该酶可用于单链寡核苷酸的合成，随后Schott和Schrade研究发现，TdT对四种核苷酸的偏好性差异小、偶联效率高，持续合成和延伸单链DNA可产生长达8000 nt的均聚物。为了实现TdT催化的可控DNA合成，TdT的活性需要被可逆控制。Keasling团队在2018年构建的TdT催化活性控制机制，利用TdT与单个核苷酸的可逆共价键链接，来阻止TdT催化合成的DNA链的进一步延伸。当该可逆共价键断裂后，DNA链便可进入新的核苷酸添加循环。该方法平均偶联效率可达97.7%，单个循环需2~3 min。基于创新TdT的DNA合成得到了学术界和工业界的普遍关注。
由于TdT越发显著的DNA合成应用，针对TdT开展酶工程设计以实现TdT酶活性的灵活调控意义逐渐凸显。然而，当前常见的野生型TdT由于具有较大的催化蛋白结构域体积和较长的氨基酸序列，使得基于野生型TdT的进一步蛋白改造操作受限，更小且具有催化活性的TdT突变体对TdT的后期蛋白质工程设计具有重要意义。
因此，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种TdT突变体及其组合物与制备方法，旨在解决现有野生型TdT由于具有较大的催化蛋白结构域体积和较长的氨基酸序列，使得基于野生型TdT的进一步蛋白改造操作受限的问题。
本发明的技术方案如下：
本发明的第一方面，提供一种TdT突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明的第二方面，提供一种本发明如上所述的TdT突变体的制备方法，其中，包括步骤：
构建如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
基于所述SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列构建重组表达质粒，转化进大肠杆菌进行蛋白质重组表达，得到所述TdT突变体。
可选地，所述构建如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的步骤具体包括：
将如SEQ ID NO:2所示的野生型鸟类来源的TdT的氨基酸序列中第1-216号氨基酸残基删除，得到如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
可选地，所述将如SEQ ID NO:2所示的野生型鸟类来源的TdT的氨基酸序列中第1-216号氨基酸残基删除，得到如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的步骤具体包括：
先将如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中没有催化功能的第1-146号氨基酸残基删除，得到147-513号氨基酸残基；
再将147-513号氨基酸残基中的第147-216号氨基酸残基删除后，得到如SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列。
本发明的第三方面，提供一种TdT突变体组合物，其中，包括第一TdT突变体和第二TdT突变体；其中，所述第一TdT突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述第二TdT突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
本发明的第四方面，提供一种本发明如上所述的TdT突变体组合物的制备方法，其中，包括步骤：
制备氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的第一TdT突变体和氨基酸序列如SEQ IDNO:4所示的第二TdT突变体；
将所述第一TdT突变体和所述第二TdT突变体进行混合，得到所述TdT突变体组合物。
可选地，所述第一TdT突变体的制备方法包括步骤：
构建如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
将所述SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的C端与氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的第一感光蛋白结构域通过氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的第一连接子连接，得到如SEQID NO:3所示的氨基酸序列；
基于所述SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列构建重组表达质粒，转化进大肠杆菌进行蛋白质重组表达，得到所述第一TdT突变体。
可选地，所述构建如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的步骤具体包括：
将如SEQ ID NO:2所示的野生型鸟类来源的TdT的氨基酸序列中第1-216号氨基酸残基删除，得到如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
可选地，所述将如SEQ ID NO:2所示的野生型鸟类来源的TdT的氨基酸序列中第1-216号氨基酸残基删除，得到如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的步骤具体包括步骤：
先将如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中没有催化功能的第1-146号氨基酸残基删除，得到147-513号氨基酸残基；
再将147-513号氨基酸残基中的第147-216号氨基酸残基删除后，得到如SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列。
可选地，所述第二TdT突变体的制备方法包括步骤：
如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中第147-216号氨基酸残基的氨基酸序列如SEQID NO:7所示；
将如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的N端与氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示的第二感光蛋白结构域通过氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示的第二连接子连接，得到如SEQ IDNO:4所示的氨基酸序列；
基于所述SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列构建重组表达质粒，转化进大肠杆菌进行蛋白质重组表达，得到所述第二TdT突变体。
有益效果：本发明中氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的TdT突变体相比野生型TdT具有更短的氨基酸序列，更小的催化蛋白结构域体积，且具有较好的催化活性。
附图说明
图1为本发明实施例1中氨基酸序列TdT-H1、 TdT-H2、 pMag-TdT-H1、TdT-H2-nMag的构建示意图。
图2为本发明实施例中TdT突变体组合物光照后发生异体二聚催化活性被抑制的原理示意图。
图3为本发明实施例3中蛋白质表达结果图。
图4中A为本发明实施例4中不同TdT突变体的催化速率结果图；B为TdT突变体组合物在有无光照条件下的催化速率结果图。
具体实施方式
本发明提供一种TdT突变体及其组合物与制备方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术术语和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。
野生型TdT具有较大的体积和较长的氨基酸序列，其催化蛋白结构域体积较大，且尚未明确更小的TdT催化单元。因此，使得对野生型TdT进一步的蛋白改造操作受限，更小且具有催化活性的TdT能显著方便TdT的后期蛋白质工程设计。基于此，本发明实施例提供一种TdT突变体，其中，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明实施例中氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的TdT突变体相比野生型TdT具有更短的氨基酸序列，更小的催化蛋白结构域体积，且具有较好的催化活性。
本发明实施例还提供一种本发明实施例如上所述的TdT突变体的制备方法，其特征在于，包括步骤：
S11、构建如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
S12、基于如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列构建重组表达质粒，转化进大肠杆菌进行蛋白质重组表达，得到所述TdT突变体。
本发明通过蛋白质工程，构建如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，然后通过构建重组表达质粒，转化进大肠杆菌进行蛋白质重组表达，得到所述TdT突变体。通过本实施例提供的制备方法制备得到的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的TdT突变体相比野生型TdT具有更短的氨基酸序列，更小的催化蛋白结构域体积，且具有较好的催化活性。
步骤S11中，在一些实施方式中，所述构建如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的步骤具体包括：
S111、将如SEQ ID NO:2所示的野生型鸟类来源的TdT的氨基酸序列中第1-216号氨基酸残基删除，得到如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
步骤S111中，在一些实施方式中，所述将如SEQ ID NO:2所示的野生型鸟类来源的TdT的氨基酸序列中第1-216号氨基酸残基删除，得到如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的步骤具体包括：
S1111、先将如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中没有催化功能的第1-146号氨基酸残基删除，得到147-513号氨基酸残基；
S1112、再将147-513号氨基酸残基中的第147-216号氨基酸残基删除后，得到如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
目前，仍缺少TdT活性受光调控，特别是受光可控可逆抑制的解决方案。当前的TdT活性调控仍主要依赖于反应溶液中Co2+或Mg2+等辅因子，Co2+或Mg2+对TdT活性的调控的灵活性有限，且需要依赖频繁地转换反应体系溶液才可调控TdT活性，限制了TdT的效率。基于此，本发明实施例提供一种TdT突变体组合物，其中，包括第一TdT突变体和第二TdT突变体，所述第一TdT突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述第二TdT突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
本实施例中，新型TdT突变体组合物包括可感光异二聚化（Heterodimerization）的两个组分第一TdT突变体和第二TdT突变体，其中第一TdT突变体单独存在时表现出较强的酶催化活性，第二TdT突变体单独存在时无催化活性。当对TdT突变体组合物进行光照后，第一TdT突变体和第二TdT突变体异体二聚形成复合体，第二TdT突变体的靠近阻挡了第一TdT突变体催化位点的开放程度，影响了底物进出催化位点的速率，所以形成的复合体表现出较弱的酶催化活性，进而实现了酶催化活性的感光抑制，其代表了一种新型的TdT活性调控模式。当撤掉光照后TdT突变体组合物整体的催化活性恢复。本发明实施例提供的TdT突变体组合物具有可逆感光抑制的催化活性。
本发明实施例还提供一种本发明实施例如上所述的TdT突变体组合物的制备方法，其中，包括步骤：
S21、制备氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的第一TdT突变体和氨基酸序列如SEQID NO:4所示的第二TdT突变体；
S22、将所述第一TdT突变体和第二TdT突变体进行混合，得到所述TdT突变体组合物。
步骤S21中，在一些实施方式中，所述第一TdT突变体的制备方法包括步骤：
S2111、构建如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
S2112、将所述SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的C端与氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的第一感光蛋白结构域通过氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的第一连接子连接，得到如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；
S2113、基于所述SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列构建重组表达质粒，转化进大肠杆菌进行蛋白质重组表达，得到所述第一TdT突变体。
步骤S2111中，在一些实施方式中，所述构建如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的步骤具体包括：
将如SEQ ID NO:2所示的野生型鸟类来源的TdT的氨基酸序列中第1-216号氨基酸残基删除，得到如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
具体地，所述将如SEQ ID NO:2所示的野生型鸟类来源的TdT的氨基酸序列中第1-216号氨基酸残基删除，得到如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的步骤具体包括步骤：
先将如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中没有催化功能的第1-146号氨基酸残基删除，得到147-513号氨基酸残基；
再将147-513号氨基酸残基中的第147-216号氨基酸残基删除后，得到如SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列。
本实施例通过蛋白质工程先删除SEQ ID NO:2所示的野生型鸟类来源的TdT氨基酸序列中不直接发挥催化功能的蛋白结构域（第1-146氨基酸残基），然后发明人发现，野生型鸟类来源的TdT的氨基酸序列中第147-216氨基酸残基对应的蛋白结构域也不影响TdT催化功能，进而进一步地删除了147-216氨基酸残基，剩余的217-513氨基酸残基序列即为第一TdT突变体的氨基酸序列（如SEQ ID NO:1所示），其表现出显著的酶催化活性，147-216氨基酸残基即为第二TdT突变体的氨基酸序列（如SEQ ID NO:7所示）。
在一些实施方式中，所述第二TdT突变体的制备方法包括步骤：
S2121、如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中第147-216号氨基酸残基的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；将如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的N端与氨基酸序列如SEQ IDNO:8所示的第二感光蛋白结构域通过氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示的第二连接子连接，得到如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；
S2122、基于所述SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列构建重组表达质粒，转化进大肠杆菌进行蛋白质重组表达，得到所述第二TdT突变体。
下面对TdT突变体组合物催化活性的可逆感光抑制进行详细说明。
氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的第一感光蛋白和氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示的第二感光蛋白是改造的感光蛋白元件，即是改造的光调控蛋白（VVD）。VVD是最小的含有光、氧、电压（LOV）结构域的蛋白，其N端螺旋结构在蓝光照射下发生空间构象变化，导致同源二聚化。两者通过工程化改造，克服了VVD非光照下聚集和聚集-解离半衰期长的缺点。因此，如图2所示，当对TdT突变体组合物进行光照后，第一TdT突变体和第二TdT突变体通过第一感光蛋白结构域（即图2中的nMag）和第二感光蛋白结构域（即图2中的pMag）进行异体二聚形成复合体，第二TdT突变体（没有催化活性）的靠近阻挡了第一TdT突变体（有较高催化活性）催化位点的开放程度，具体地，第二TdT突变体中没有催化活性的结构域（对应实施例1-3中的TdT-H1部分）阻挡了第一TdT突变体中的有催化活性的结构域（对应实施例1-3中的TdT-H2部分），进而影响了底物进出催化位点的速率，所以形成的复合体表现出较弱的酶催化活性，进而实现了酶催化活性的感光抑制，其代表了一种新型的TdT活性调控模式。当撤掉光照后，第一感光蛋白结构域和第二感光蛋白结构域会迅速解离，进而使复合体中的两个结构域（第二TdT突变体中没有催化活性的结构域和第一TdT突变体中的有催化活性的结构域）分离，进而使第一TdT突变体的催化活性恢复，TdT突变体组合物整体的催化活性恢复。
下面通过具体的实施例进行详细说明。
实施例1 TdT突变体（TdT-H2突变体、TdT-H1突变体、第一TdT突变体、第二TdT突变体）氨基酸序列的构建
如图1所示，根据氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的野生型鸟类来源的TdT（wtZaTdT）的3D结构和功能解析，通过蛋白质工程删除wt ZaTdT氨基酸序列中没有实质催化功能的1-146号氨基酸残基，同时进一步发现wt ZaTdT的147-216号氨基酸残基对应的蛋白结构域也不影响其催化功能，因此进一步删除了147-216号氨基酸残基；剩余的第217-513号氨基酸残基定义为TdT-H2，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；而147-216氨基酸残基序列被定义为TdT-H1，其氨基酸序列SEQ ID NO:7所示。
如图1所示，利用PCR，将第二感光蛋白结构域（记作pMag，其氨基酸序列如SEQ IDNO:8所示）通过连接子（其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，具体为GSGGSGGSGGSG）融合在TdT-H1的N端，将第一感光蛋白结构域（记作nMag，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示）通过连接子（其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，具体为GGSGGSGGSGGGS）融合在TdT-H2的C端，得到氨基酸序列分别记作pMag-TdT-H1（如SEQ ID NO:4所示）和TdT-H2-nMag（如SEQ ID NO:3所示）。
实施例2 TdT-H1突变体、TdT-H2突变体、第二TdT突变体和第一TdT突变体的表达与纯化
分别基于TdT-H1、TdT-H2、pMag-TdT-H1和TdT-H2-nMag构建重组表达质粒，转入大肠杆菌进行蛋白质重组表达并纯化，分别获得TdT-H1突变体（其氨基酸序列如SEQ ID NO:7）、TdT-H2突变体（其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示）、第二TdT突变体（其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示）和第一TdT突变体（其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示），具体包括步骤：
通过同源重组手段基于TdT-H1、TdT-H2、pMag-TdT-H1和TdT-H2-nMag分别构建TdT-H1突变体、TdT-H2突变体、第二TdT突变体和第一TdT突变体的基因，即构建重组表达质粒；
取1μL测序正确的质粒加入大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，冰上孵育30 min后，置于42℃水浴锅中热激45 s后立刻取出置于冰上5 min；加入500 μL BL培养基，于37℃培养箱中，190 rpm转速培养50 min；以10000 rpm 转速离心1 min，将沉淀细胞均匀涂于培养皿后置于培养箱过夜，次日挑取单克隆；
选取单克隆突变，在含100 μg /mL卡那霉素的200 mL的 LB培养基中孵育3小时至OD600值为0.6；加入IPTG （异丙基-β- d -硫半乳糖）至终浓度为0.5 mM，230 rpm转速，16℃下诱导过夜；6000 g离心10 min收集细胞，然后在50 mL裂解缓冲液（30 mM Tris-HCL缓冲液，500 mM NaCl，20mM咪唑）中重悬；用高压均质器裂解细胞，在4℃下以6000 g离心10min去除细胞碎片，使澄清的裂解液在重力作用下流过镍亲和色谱柱；用50 mL洗涤缓冲液（30 mM Tris-HCL缓冲液，200 mM NaCl，40 mM咪唑）去除非目标蛋白，然后用5 mL洗脱缓冲液（30 mM Tris-HCL缓冲液，200 mM NaCl，200 mM咪唑）收集目标蛋白，用30 kDa分子量的超滤离心柱对洗脱蛋白进行浓缩和透析，得到纯化的TdT突变体。重复此步骤4次，依次采用基于TdT-H1、TdT-H2、pMag-TdT-H1和TdT-H2-nMag构建的质粒，分别得到TdT-H1突变体、TdT-H2突变体、第二TdT突变体和第一TdT突变体。
实施例3 TdT-H1突变体、TdT-H2突变体、第二TdT突变体和第一TdT突变体表达量测试（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，简称SDS-PAGE）：
将TdT-H2突变体、TdT-H1突变体、pMag-TdT-H1突变体和TdT-H2-nMag突变体样品各5 μL分别与20 μL的5X上样缓冲液混合，70℃加热5 min，得到待测样品（4种）；
配置10%的分离胶8 mL和10%的浓缩胶5 mL，将分离胶灌注于制胶架玻璃板间，等待凝固后灌注浓缩胶并插入样品梳，装好电泳系统，加入SDS电泳缓冲液拔去样品梳并在样品孔加入Marker和待测样品，恒压200 V下进行电泳，时间为60 min；将胶取出置于考马斯亮蓝溶液染色30 min后过夜脱色并进行成像，结果如图3所示，图3中TdT-H1、TdT-H2、pMag-TdT-H1和TdT-H2-nMag分别表示TdT-H1突变体、TdT-H2突变体、第二TdT突变体和第一TdT突变体，由图3可知，各突变体具有良好的表达。
实施例4 TdT-H1突变体、TdT-H2突变体、第一TdT突变体、第二TdT突变体、第一TdT突变体和第二TdT突变体组合物的活性验证（变性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳，简称变性尿素PAGE）
将寡核苷酸引物、脱氧核糖核苷酸、CoCl2加入到HEPES缓冲液中，配制得到含有浓度为1 μM寡核苷酸引物、0.1 mM脱氧核糖核苷酸、0.25 mM CoCl2的反应预备液，置于30℃金属浴中保存备用；
取TdT突变体样品（分别为1 μL浓度为0.5 mg/mL的TdT-H2突变体，1 μL浓度为0.5mg/mL的TdT-H1突变体，1 μL浓度为0.5 mg/mL的第一TdT突变体，1 μL浓度为0.5 mg/mL的第二TdT突变体，1μL浓度为0.5 mg/mL 的第一TdT突变体和浓度为0.5 mg/mL的第二TdT突变体混合物）；
对于1 μL浓度为0.5 mg/mL的TdT-H2突变体，1 μL浓度为0.5 mg/mL的TdT-H1突变体，1 μL浓度为0.5 mg/mL的第一TdT突变体，1 μL浓度为0.5 mg/mL的第二TdT突变体，将其分别加入到20 μL反应预备液中，用移液枪混合均匀后，37℃反应30 min，然后95℃加热15s停止反应；取5 μL反应液和5 μL 2X上样缓冲液混合，得到待测样品；
对于1 μL浓度为0.5 mg/mL 的第一TdT突变体和浓度为0.5 mg/mL的第二TdT突变体混合物，取两组样品，分别加入到20 μL反应预备液中，用移液枪混合均匀后，37℃分别在440 nm蓝光和黑暗下反应30 min，然后95℃加热15 s停止反应；取5 μL反应液和5 μL 2X上样缓冲液混合，得到待测样品；
配置15%的尿素变性胶10 mL，然后灌注于制胶架玻璃板间并插入样品梳，装好电泳系统，加入TBE电泳缓冲液拔去样品梳并在样品孔加入Marker和待测样品，恒压200 V下进行电泳，时间为60 min，在凝胶成像仪下观察结果，此活性测试以wt ZaTdT作为对照。
不同TdT突变体的催化速率如图4中A和B所示，由图A可知，TdT-H1 突变体（对应图中的TdT-H1）和第二TdT突变体（对应图中的pMag-TdT-H1）单独存在时均无活性，TdT-H2突变体（对应图中的TdT-H2）和第一TdT突变体（对应图中的TdT-H2-nMAg）单独存在时均表现出显著的酶催化活性，由图B可知，第二TdT突变体和第一TdT突变体组合物在无蓝光照射时具有显著的酶催化活性，在有蓝光照射时表现出显著降低的酶催化活性。经过测试发现，撤除蓝光照射后，第二TdT突变体和第一TdT突变体组合物的催化活性恢复。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (10)
1.一种末端脱氧核苷酸转移酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种如权利要求1所述的末端脱氧核苷酸转移酶突变体的制备方法，其特征在于，包括步骤：
构建如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
基于所述SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列构建重组表达质粒，转化进大肠杆菌进行蛋白质重组表达，得到所述末端脱氧核苷酸转移酶突变体。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述构建如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的步骤具体包括：
将如SEQ ID NO:2所示的野生型鸟类来源的末端脱氧核苷酸转移酶的氨基酸序列中第1-216号氨基酸残基删除，得到如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述将如SEQ ID NO:2所示的野生型鸟类来源的末端脱氧核苷酸转移酶的氨基酸序列中第1-216号氨基酸残基删除，得到如SEQID NO:1所示的氨基酸序列的步骤具体包括：
先将如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中没有催化功能的第1-146号氨基酸残基删除，得到147-513号氨基酸残基；
再将147-513号氨基酸残基中的第147-216号氨基酸残基删除后，得到如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
5.一种末端脱氧核苷酸转移酶突变体组合物，其特征在于，包括第一末端脱氧核苷酸转移酶突变体和第二末端脱氧核苷酸转移酶突变体；其中，所述第一末端脱氧核苷酸转移酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述第二末端脱氧核苷酸转移酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
6.一种如权利要求5所述的末端脱氧核苷酸转移酶突变体组合物的制备方法，其特征在于，包括步骤：
制备氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的第一末端脱氧核苷酸转移酶突变体和氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的第二末端脱氧核苷酸转移酶突变体；
将所述第一末端脱氧核苷酸转移酶突变体和所述第二末端脱氧核苷酸转移酶突变体进行混合，得到所述末端脱氧核苷酸转移酶突变体组合物。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述第一末端脱氧核苷酸转移酶突变体的制备方法包括步骤：
构建如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
将所述SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的C端与氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的第一感光蛋白结构域通过氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的第一连接子连接，得到如SEQ IDNO:3所示的氨基酸序列；
基于所述SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列构建重组表达质粒，转化进大肠杆菌进行蛋白质重组表达，得到所述第一末端脱氧核苷酸转移酶突变体。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述构建如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的步骤具体包括：
将如SEQ ID NO:2所示的野生型鸟类来源的末端脱氧核苷酸转移酶的氨基酸序列中第1-216号氨基酸残基删除，得到如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述将如SEQ ID NO:2所示的野生型鸟类来源的末端脱氧核苷酸转移酶的氨基酸序列中第1-216号氨基酸残基删除，得到如SEQID NO:1所示的氨基酸序列的步骤具体包括步骤：
先将如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中没有催化功能的第1-146号氨基酸残基删除，得到147-513号氨基酸残基；
再将147-513号氨基酸残基中的第147-216号氨基酸残基删除后，得到如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述第二末端脱氧核苷酸转移酶突变体的制备方法包括步骤：
如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中第147-216号氨基酸残基的氨基酸序列如SEQ IDNO:7所示；
将如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的N端与氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示的第二感光蛋白结构域通过氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示的第二连接子连接，得到如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；
基于所述SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列构建重组表达质粒，转化进大肠杆菌进行蛋白质重组表达，得到所述第二末端脱氧核苷酸转移酶突变体。
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