CN116478955A - 一对可分裂重组的末端脱氧核苷酸核酸转移酶及构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一对可分裂重组的末端脱氧核苷酸核酸转移酶及构建方法。所述一对可分裂重组的末端脱氧核苷酸核酸转移酶包括由TdT经切割得到的两个TdT蛋白结构域，所述两个TdT蛋白结构域分别记为TdT‑D1和TdT‑D2，当所述TdT‑D1和TdT‑D2分别单独存在时不独立表现出TdT催化活性；当所述TdT‑D1和TdT‑D2同时存在且靠近时，TdT‑D1和TdT‑D2会发生重组并表现出TdT催化活性。本发明设计可分裂重组的TdT，通过调控TdT‑D1和TdT‑D2的相对距离，实现TdT酶活性的灵活调控。基于TdT‑D1和TdT‑D2的酶法DNA合成不再需要依赖保护剂和去保护剂即可实现DNA合成酶活性的调控，从而明显简化了DNA人工合成的循环步骤。本发明为灵活、简便地调控TdT酶活性提供了新模式。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一对可分裂重组的末端脱氧核苷酸核酸转移酶及构建方法与应用。
背景技术
DNA人工合成技术是现代基因技术的重要基础。DNA人工合成的关键方法包括：柱式化学寡核苷酸合成、芯片化学寡核苷酸合成、寡核苷酸纯化、寡核苷酸拼装、基因合成纠错与克隆筛选、大片段基因合成组装，以及DNA的新一代酶法合成。DNA人工合成的传统方法大多依赖亚磷酰胺化学完成反应。近年来以酶促合成为原理的第三代DNA人工合成逐渐崛起，成为前景广阔的DNA人工合成方法。其中以末端脱氧核糖核苷转移酶(TdT)为核心的酶促合成技术是极具前景的DNA合成策略。
新型核苷酸酶促合成法是利用非模版依赖性的DNA末端核酸转移酶(TdT)进行体外的寡核苷酸片段合成。TdT由Bollum首先发现并提出该酶可用于单链寡核苷酸的合成。随后Schott和Schrade研究发现，TdT对四种核苷酸的偏好性差异小、偶联效率高，持续合成和延伸单链DNA可产生长达8000nt的均聚物。为了实现TdT催化的可控DNA合成，DNA合成酶的活性需要被可逆控制。Keasling团队在2018年构建的TdT催化活性控制机制利用了TdT与单个核苷酸的可逆共价键链接，用于阻止TdT催化合成的DNA链的进一步延伸。当该可逆共价键链接断裂后，DNA链便可进入新的核苷酸添加循环。该方法平均偶联效率可达97.7％，单个循环需2～3min。基于创新TdT的DNA合成得到了学术界和工业界的普遍关注。
由于TdT越发显著的DNA合成应用，针对TdT开展酶工程设计以实现TdT酶活性的灵活调控意义逐渐凸显。现有实现TdT酶活性调节的方法选择有限，主要依赖人工修饰的特异性脱氧核糖核苷酸作为TdT底物，并在底物分子3’-OH上添加保护基团。该保护基团形成的空间位阻有效阻挡了下一个底物单体的连接过程。但在添加下一个碱基时，需要对3'末端的保护基团进行脱保护处理，然后才能进行下一步循环反应。因此，现有基于TdT的DNA合成仍需要多步反应才能实现，限制了酶法DNA合成的自动化程度。
针对该问题，本发明设计了可分裂重组的TdT结构域，进而通过控制TdT蛋白结构域(TdT-D1，TdT-D2)的相互作用显著调控TdT酶催化活性，不再需要依赖保护剂和去保护剂。
因此，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一对可分裂重组的末端脱氧核苷酸核酸转移酶及构建方法与应用，旨在解决现有调节TdT酶活性的方法需要依赖保护剂和去保护剂，导致基于TdT的DNA合成仍需要多步反应才能实现的问题。
本发明的技术方案如下：
一对可分裂重组的末端脱氧核苷酸核酸转移酶，其中，包括由TdT经切割得到的两个TdT蛋白结构域，所述两个TdT蛋白结构域分别记为TdT-D1和TdT-D2，当所述TdT-D1和TdT-D2分别单独存在时不独立表现出TdT催化活性；当所述TdT-D1和TdT-D2同时存在且靠近时，TdT-D1和TdT-D2会发生重组并表现出TdT催化活性。
可选地，所述TdT-D1的N端连接有pMag，记为pMag-TdT-D1；所述TdT-D2的C端连接有nMag，记为TdT-D2-nMag；
在蓝光照射前，所述pMag-TdT-D1和TdT-D2-nMag单独存在时不独立表现出TdT催化活性；
在蓝光照射下，pMag和nMag会二聚并使所述TdT-D1和TdT-D2靠近，TdT-D1和TdT-D2会发生重组并表现出TdT催化活性。
可选地，所述pMag-TdT-D1和TdT-D2-nMag的摩尔比为1:1。
可选地，所述TdT-D1的N端通过第一连接子连接pMag，所述TdT-D2的C端通过第一连接子连接nMag，所述第一连接子的氨基酸序列为GSGGSGGSGGSG。
可选地，所述由TdT经切割得到的两个TdT蛋白结构域具体包括：TdT删除了没有实质催化功能的1-146氨基酸之后，剩余TdT经切割得到的两个TdT蛋白结构域；
其中，所述TdT的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述TdT删除了没有实质催化功能的1-146氨基酸之后，剩余TdT的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
可选地，所述TdT-D1的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述TdT-D2的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
可选地，所述pMag-TdT-D1的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述TdT-D2-nMag的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
一对本发明所述的可分裂重组的末端脱氧核苷酸核酸转移酶的构建方法，其中，包括步骤：
提供TdT；
用第二连接子将所述TdT的N端和C端连接起来，在TdT上从N端开始逐段选择切割位点，构建出不同TdT变体形式；
从不同TdT变体形式中筛选出高表达水平和高催化活性的TdT变体，得到候选TdT变体；
将所述候选TdT变体中的第二连接子去除，得到所述TdT-D1和TdT-D2，且当所述TdT-D1和TdT-D2分别单独存在时不独立表现出TdT催化活性；当所述TdT-D1和TdT-D2同时存在且靠近时，TdT-D1和TdT-D2会发生重组并表现出TdT催化活性。
可选地，所述第二连接子的氨基酸序列为GTGGSGGTGG；
得到所述TdT-D1、TdT-D2后，还包括步骤：将光响应蛋白元件pMag和光响应蛋白元件nMag分别连接到TdT-D1的N端和TdT-D2的C端上，得到pMag-TdT-D1和TdT-D2-nMag。
本发明所述的一对可分裂重组的末端脱氧核苷酸核酸转移酶催化DNA合成反应的应用。
有益效果：本发明提出的可分裂重组的TdT由两个TdT蛋白结构域(TdT-D1，TdT-D2)组成，其分别单独存在时不表现出可观测的DNA合成催化活性；但当两个蛋白结构域靠近后，TdT-D1和TdT-D2会发生重组，并表现出DNA合成催化活性。本发明设计可分裂重组的TdT，通过调控TdT-D1和TdT-D2的相对距离，实现TdT酶活性的灵活调控。基于TdT-D1和TdT-D2的酶法DNA合成不再需要依赖保护剂和去保护剂即可实现DNA合成酶活性的调控，从而明显简化了DNA人工合成的循环步骤。
附图说明
图1为本发明实施例提供的一对可分裂重组的末端脱氧核苷酸核酸转移酶的构建方法的流程示意图。
图2为从野生型wtZaTdT设计得到可分裂重组的TdT-D1和TdT-D2，以及得到受光调控可分裂重组的pMag-TdT-D1和TdT-D2-nMag的流程示意图。
图3为利用可分裂重组的TdT-D1和TdT-D2蛋白结构域构建TdT酶催化活性受光调控的pMag-TdT-D1和TdT-D2-nMag的示意图。
图4中A为TdT-D1、TdT-D2蛋白结构域、由连接子链接时(D1-Linker-D2)表现出的催化活性的示意图；图4中B为pMag-TdT-D1和TdT-D2-nMag单独存在，以及在黑暗状态混合时、光照状态混合后表现出的催化活性的示意图。
具体实施方式
本发明提供一对可分裂重组的末端脱氧核苷酸核酸转移酶及构建方法与应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
末端脱氧核苷酸核酸转移酶(TdT)是生物酶促法合成寡聚核苷酸的重要工具，实现TdT酶催化活性的灵活调控对DNA的可控人工酶法合成意义明显，但目前尚缺少灵活调控TdT酶活性的策略。
现有实现TdT酶活性调节的方法选择有限，主要依赖人工修饰的特异性脱氧核糖核苷酸作为TdT底物，并在底物分子3’-OH上添加保护基团。该保护基团形成的空间位阻有效阻挡了下一个底物单体的连接过程。但在添加下一个碱基时，需要对3'末端的保护基团进行脱保护处理，然后才能进行下一步循环反应。因此，现有基于TdT的DNA合成仍需要多步反应才能实现，限制了酶法DNA合成的自动化程度。
针对该技术问题，本发明提出了一对可分裂重组的TdT蛋白结构域，进而通过控制TdT蛋白结构域(TdT-D1，TdT-D2)的相互作用显著调控TdT酶催化活性，不再需要依赖保护剂和去保护剂。
具体地，本发明实施例提供了一对可分裂重组的末端脱氧核苷酸核酸转移酶，其中，包括由TdT经切割得到的两个TdT蛋白结构域，所述两个TdT蛋白结构域分别记为TdT-D1和TdT-D2，当所述TdT-D1和TdT-D2分别单独存在时不独立表现出TdT催化活性；当所述TdT-D1和TdT-D2同时存在且靠近时，TdT-D1和TdT-D2会发生重组并表现出TdT催化活性。
本实施例设计可分裂重组的TdT，通过调控TdT-D1和TdT-D2的相对距离，实现TdT酶活性的灵活调控。基于TdT-D1和TdT-D2的酶法DNA合成不再需要依赖保护剂和去保护剂即可实现DNA合成酶活性的调控，从而明显简化了DNA人工合成的循环步骤。本实施例为灵活、简便地调控TdT酶活性提供了新模式。
在一种实施方式中，所述TdT-D1的N端连接有pMag，记为pMag-TdT-D1；所述TdT-D2的C端连接有nMag，记为TdT-D2-nMag；
在蓝光照射前，所述pMag-TdT-D1和TdT-D2-nMag单独存在时不独立表现出TdT催化活性；
在蓝光照射下，pMag和nMag会二聚并使所述TdT-D1和TdT-D2靠近，TdT-D1和TdT-D2会发生重组并表现出TdT催化活性。
本实施例通过调控TdT-D1和TdT-D2蛋白的相互作用力/相互距离实现DNA合成酶活性的调控。pMag和nMag是一对相互亲和力受光照调控的感光蛋白结构域，可在蓝光照射下发生二聚。本实施例通过将pMag和nMag分别融合在TdT-D1和TdT-D2蛋白两端，实现TdT-D1和TdT-D2在光照条件下的二聚，从而获得一对可以受光照调控的pMag-TdT-D1和TdT-D2-nMag。在蓝光照射下，测试不同比例的pMag-TdT-D1和TdT-D2-nMag组合条件下的催化活性，并比较其与野生型TdT催化活性的差异，实验结果说明光照后pMag-TdT-D1和TdT-D2-nMag表现出TdT酶催化活性，但光照前不单独表现任何可观测的酶催化活性。
在一种实施方式中，所述pMag-TdT-D1和TdT-D2-nMag的摩尔比为1:1。在该比例范围下，pMag-TdT-D1和TdT-D2-nMag的组合表现出更高的TdT酶催化活性。
在一种实施方式中，所述TdT-D1的N端通过第一连接子连接pMag，所述TdT-D2的C端通过第一连接子连接nMag，所述第一连接子的氨基酸序列为GSGGSGGSGGSG。
在一种实施方式中，所述由TdT经切割得到的两个TdT蛋白结构域具体包括：TdT删除了没有实质催化功能的1-146氨基酸之后，剩余TdT经切割得到的两个TdT蛋白结构域。
本实施例基于TdT的蛋白质序列和3D结构，首先根据TdT的3D结构和功能解析，删除了TdT没有实质催化功能的1-146氨基酸。随后基于剩余的蛋白结构域，获得两个可以重组的TdT蛋白结构域：TdT-D1和TdT-D2。
在一种实施方式中，所述TdT的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述TdT删除了没有实质催化功能的1-146氨基酸之后，剩余TdT的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在一种实施方式中，所述TdT-D1的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述TdT-D2的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
在一种实施方式中，所述pMag-TdT-D1的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述TdT-D2-nMag的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明实施例提供一对可分裂重组的末端脱氧核苷酸核酸转移酶的构建方法，如图1所示，包括步骤：
S1、提供TdT；
S2、用第二连接子(属于柔性连接子)将所述TdT的N端和C端连接起来，在TdT上从N端开始逐段选择切割位点，构建出不同TdT变体形式；
S3、从不同TdT变体形式中筛选出高表达水平和高催化活性的TdT变体，得到候选TdT变体；
S4、将所述候选TdT变体中的第二连接子去除，得到所述TdT-D1和TdT-D2，且当所述TdT-D1和TdT-D2分别单独存在时不独立表现出TdT催化活性；当所述TdT-D1和TdT-D2同时存在且靠近时，TdT-D1和TdT-D2会发生重组并表现出TdT催化活性。
步骤S2中，在一种实施方式中，所述用第二连接子将所述TdT的N端和C端连接起来的步骤之前，还包括步骤：
根据TdT的3D结构和功能解析，删除TdT中没有实质催化功能的1-146氨基酸。
本实施例基于TdT的蛋白质序列和3D结构，首先根据TdT的3D结构和功能解析，删除了TdT没有实质催化功能的1-146氨基酸。随后基于剩余的蛋白结构域，获得了两个可以重组的TdT蛋白结构域：TdT-D1和TdT-D2。TdT-D1和TdT-D2均包含部分TdT的结构，但是在其单独存在时不独立表现出TdT催化活性(即不表现出DNA合成催化活性)。当TdT-D1和TdT-D2同时存在且靠近时，TdT-D1和TdT-D2可重组形成有催化活性的TdT。
也就是说，删除了TdT没有实质催化功能的1-146氨基酸之后，分析剩余TdT蛋白的灵活环区(flexible loop)和潜在可切割位点，TdT原有N端到切割位点的结构域为TdT-D1，切割位点到TdT原有C端的结构域为TdT-D2，构建在不同灵活环区切割的TdT-D1和TdT-D2，确认可切割位点的选择可以实现TdT-D1与TdT-D2通过连接子强制缩短空间距离后能重组成有催化活性的TdT。
关于TdT-D1和TdT-D2的文库设计和筛选，具体如下：
为了筛选出合适的切割位点，用第二连接子(GTGGSGGTGG)将TdT的N端和C端连接起来，从原有TdT的N端开始逐段选择切割位点，构建出不同TdT变体形式。针对这些具有新的N端和C端的TdT变体进行表达水平和催化活性测试，优先选择高表达水平和相对高催化活性的TdT变体。在得到候选TdT变体后，去除TdT的原始N端和C端之间的柔性连接子(GTGGSGGTGG)，得到分开形式的TdT-D1和TdT-D2，并验证TdT-D1和TdT-D2的催化活性。实验证明TdT-D1和TdT-D2单独存在时不独立表现出TdT催化活性，但当由连接子链接时(TdT-D1-连接子-TdT-D2)，TdT-D1和TdT-D2可重组形成有催化活性的TdT。其中，所述连接子可以为GTGGSGGTGG，当然由GGTGGS单元组合而成的柔性连接子也适用。
本实施例中，获得TdT-D1和TdT-D2后，还可以包括步骤：将光响应蛋白元件pMag和光响应蛋白元件nMag分别连接到TdT-D1的N端和TdT-D2的C端上，得到pMag-TdT-D1和TdT-D2-nMag，从而得到催化活性受光调控的组合TdT。在蓝光照射下，pMag和nMag会二聚并使TdT-D1和TdT-D2靠近，进而重组成有酶催化活性的TdT。具体地，在蓝光照射下，pMag-TdT-D1和TdT-D2-nMag表现出酶催化活性，但光照前不单独表现可观测的酶催化活性。
本发明实施例提供如上所述的一对可分裂重组的末端脱氧核苷酸核酸转移酶催化DNA合成反应的应用。
本实施例中，基于TdT-D1和TdT-D2的酶法DNA合成不再需要依赖保护剂和去保护剂即可实现DNA合成酶活性的调控，从而明显简化了DNA合成的循环步骤。
下面通过具体的实施例对本发明作进一步地说明。
1、TdT-D1和TdT-D2的文库设计
结合图2所示，基于野生型ZaTdT的蛋白质序列和3D结构，删除了野生型ZaTdT中没有实质催化功能的1-146氨基酸。用柔性连接子(GTGGSGGTGG)将TdT的N端和C端连接起来，从原有TdT的N端开始逐段选择切割位点，构建出不同TdT变体形式。针对这些具有新的N端和C端的TdT变体进行表达水平和催化活性测试，优先选择高表达水平和相对高催化活性的TdT变体。在得到候选TdT变体后，去除TdT的原始N端和C端之间的柔性连接子(GTGGSGGTGG)，得到如图2所示的分开形式的TdT-D1和TdT-D2，并验证TdT-D1和TdT-D2的催化活性。
TdT-D1、TdT-D2、pMag-TdT-D1和TdT-D2-nMag转化及蛋白纯化步骤：取1μL测序正确的质粒加入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，冰上孵育30min后，置于42℃水浴锅中热激45s后立刻取出置于冰上5min；加入500μL BL培养基，于37℃培养箱中，190rpm转速培养50min；以10000rpm转速离心1min，将沉淀细胞均匀涂于培养皿后置于培养箱过夜，次日挑取单克隆；
选取单克隆突变，在含100μg/mL卡那霉素的200mL的LB培养基中孵育3小时至OD600值为0.6；加入IPTG(异丙基-β-d-硫半乳糖)至终浓度为0.5mM，230rpm转速，16℃下诱导过夜；6000g离心10min收集细胞，然后在50mL裂解缓冲液(30mM Tris-HCL缓冲液，500mMNaCl，20mM咪唑)中重悬；用高压均质器裂解细胞，在4℃下以6000g离心10min去除细胞碎片，使澄清的裂解液在重力作用下流过镍亲和色谱柱；用50mL洗涤缓冲液(30mM Tris-HCL缓冲液，200mM NaCl，40mM咪唑)去除非目标蛋白，然后用5mL洗脱缓冲液(30mM Tris-HCL缓冲液，200mM NaCl，200mM咪唑)收集目标蛋白，用30kDa分子量的超滤离心柱对洗脱蛋白进行浓缩和透析，得到纯化的TdT-D1、TdT-D2、pMag-TdT-D1和TdT-D2-nMag。
TdT-D1和TdT-D2的催化活性测试(变性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳，简称变性尿素PAGE)：
将寡核苷酸引物、脱氧核糖核苷酸、CoCl2加入到HEPES缓冲液中，配制得到含有浓度为1μM寡核苷酸引物、0.1mM脱氧核糖核苷酸、0.25mM CoCl2的反应预备液，置于30℃金属浴中保存备用；
取1μL浓度为0.5mg/mL的TdT-D1、TdT-D2样品和TdT-D1+TdT-D2混合样品分别加入到20μL反应预备液中，用移液枪混合均匀后，37℃反应30min，然后95℃加热15s停止反应；取5μL反应液和5μL 2X上样缓冲液混合，得到待测样品；配置15％的尿素变性胶10mL，然后灌注于制胶架玻璃板间并插入样品梳，装好电泳系统，加入TBE电泳缓冲液拔去样品梳并在样品孔加入Marker和待测样品，恒压200V下进行电泳，时间为60min，在凝胶成像仪下观察结果，此活性测试以寡核苷酸引物和wt ZaTdT作为对照。
2、TdT-D1和TdT-D2的催化活性验证
利用TdT-D1和TdT-D2的重组表达质粒在大肠杆菌中表达相应蛋白。利用蛋白分离技术获取纯化的TdT-D1和TdT-D2蛋白。利用TdT酶活性表征方法表征TdT-D1和TdT-D2单独存在及同时存在条件下的酶活性。选择单独不表现但共存表现显著催化活性的TdT-D1和TdT-D2。
3、结合图3所示，将pMag和nMag分别融合在TdT-D1和TdT-D2蛋白两端，构建相应的重组表达质粒。在蓝光照射下，测试不同比例的pMag-TdT-D1和TdT-D2-nMag组合条件下的催化活性，并比较其与野生型TdT催化活性的差异，实验结果说明光照后pMag-TdT-D1和TdT-D2-nMag同时存在于反应体系中时，表现出显著的TdT酶催化活性，但光照前不单独表现任何可观测的酶催化活性。
4、pMag-TdT-D1和TdT-D2-nMag催化活性测试(变性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳，简称变性尿素PAGE)：
将寡核苷酸引物、脱氧核糖核苷酸、CoCl2加入到HEPES缓冲液中，配制得到含有浓度为1μM寡核苷酸引物、0.1mM脱氧核糖核苷酸、0.25mM CoCl2的反应预备液，置于30℃金属浴中保存备用；
取1μL浓度为0.5mg/mL的pMag-TdT-D1、TdT-D2-nMag突变体和pMag-TdT-D1+TdT-D2-nMag混合突变体样品加入到20μL反应预备液中，用移液枪混合均匀后，分别在蓝光和黑暗下于37℃反应30min，然后95℃加热15s停止反应；取5μL反应液和5μL 2X上样缓冲液混合，得到待测样品；配置15％的尿素变性胶10mL，然后灌注于制胶架玻璃板间并插入样品梳，装好电泳系统，加入TBE电泳缓冲液拔去样品梳并在样品孔加入Marker和待测样品，恒压200V下进行电泳，时间为60min，在凝胶成像仪下观察结果，此活性测试以寡核苷酸引物和wt ZaTdT作为对照。
测试结果如下：
从图4中A可知，TdT-D1和TdT-D2蛋白结构域单独存在时没有DNA合成酶催化活性，但由连接子链接时(D1-Linker-D2)表现出明显催化活性。
从图4中B可知，pMag-TdT-D1和TdT-D2-nMag单独存在，以及在黑暗状态混合时没有有DNA合成酶催化活性，但在光照状态混合时表现出显著的DNA合成酶催化活性。
本实施例中涉及的序列如下：
SEQ ID NO.1：野生型ZaTdT
MDRFKAPAVISQRKRQKGLHSPKLSCSYEIKFSNFVIFIMQRKMGLT
RRMFLMELGRRKGFRVESELSDSVTHIVAENNSYLEVLDWLKGQAVGD
SSRFELLDISWFTACMEAGRPVDSEVKYRLMEQSQSLPLNMPALEMPAFI
ATKVSQYSCQRKTTLNNYNKKFTDAFEVMAENYEFKENEIFCLEFLRAA
SLLKSLPFSVTRMKDIQGLPCVGDQVRDIIEEIIEEGESSRVNEVLNDERY
KAFKQFTSVFGVGVKTSEKWYRMGLRTVEEVKADKTLKLSKMQKAGL
LYYEDLVSCVSKAEADAVSLIVKNTVCTFLPDALVTITGGFRRGKNIGHD
IDFLITNPGPREDDELLHKVIDLWKKQGLLLYCDIIESTFVKEQLPSRKVD
AMDHFQKCFAILKLYQPRVDNSTCNTSEQLEMAEVKDWKAIRVDLVITP
FEQYPYALLGWTGSRQFGRDLRRYAAHERKMILDNHGLYDRRKRIFLKA
GSEEEIFAHLGLDYVEPWERNA
SEQ ID NO.2：删除了野生型ZaTdT没有实质催化功能的1-146氨基酸之后的剩余的蛋白结构域
TKVSQYSCQRKTTLNNYNKKFTDAFEVMAENYEFKENEIFCLEFLRAASLLKSLPFSVTRMKDIQGLPCVGDQVRDIIEEIIEEGESSRVNEVLNDERYKAFKQFTSVFGVGVKTSEKWYRMGLRTVEEVKADKTLKLSKMQKAGLLYYEDLVSCVSKAEADAVSLIVKNTVCTFLPDALVTITGGFRRGKNIGHDIDFLITNPGPREDDELLHKVIDLWKKQGLLLYCDIIESTFVKEQLPSRKVDAMDHFQKCFAILKLYQPRVDNSTCNTSEQLEMAEVKDWKAIRVDLVITPFEQYPYALLGWTGSRQFGRDLRRYAAHERKMILDNHGLYDRRKRIFLKAGSEEEIFAHLGLDYVEPWERNA
SEQ ID NO.3：TdT-D1
TKVSQYSCQRKTTLNNYNKKFTDAFEVMAENYEFKENEIFCLEFLRAASLLKSLPFSVTRMKDIQGLPCVGDQVRDIIEEIIEEGESSRVNEVLNDERYKAFKQFTSVFGVGVKTSEKWYRMGLRTVEEVKADKTLKLSKMQKAGLLYYEDLVSCVSKAEADAVSLIVKNTVCTFLPDALVTITGGFRRGKNIGHDIDFLITNPGPRE
SEQ ID NO.4：TdT-D2
SHTLYAPGGYDIMGYLDQIGNRPNPQVELGPVDTSCALILCDLKQKDTPIVYASEAFLYMTGYSNAEVLGRNCRFLQSPDGMVKPKSTRKYVDSNTINTIRKAIDRNAEVQVEVVNFKKNGQRFVNFLTIIPVRDETGEYRYSMGFQCETE
SEQ ID NO.5：pMag-TdT-D1
TLYAPGGYDIMGYLRQIRNRPNPQVELGPVDTSCALVLCDLKQKDTPVVYASEAFLYMTGYSNAEVLGRNCRFLQSPDGMVKPKSTRKYVDSNTINTMRKAIDRNAEVQVEVVNFKKNGQRFVNFLTMIPVRDETGEYRYSMGFQCETEGSGGSGGSGGSGTKVSQYSCQRKTTLNNYNKKFTDAFEVMAENYEFKENEIFCLEFLRAASLLKSLPFSVTRMKDIQGLPCVGDQVRDIIEEIIEEGESSRVNEVLNDERYKAFKQFTSVFGVGVKTSEKWYRMGLRTVEEVKADKTLKLSKMQKAGLLYYEDLVSCVSKAEADAVSLIVKNTVCTFLPDALVTITGGFRRGKNIGHDIDFLITNPGPRE
SEQ ID NO.6：TdT-D2-nMag
DDELLHKVIDLWKKQGLLLYCDIIESTFVKEQLPSRKVDAMDHFQKCFAILKLYQPRVDNSTCNTSEQLEMAEVKDWKAIRVDLVITPFEQYPYALLGWTGSRQFGRDLRRYAAHERKMILDNHGLYDRRKRIFLKAGSEEEIFAHLGLDYVEPWERNAGGSGGSGGSGGGSHTLYAPGGYDIMGYLDQIGNRPNPQVELGPVDTSCALILCDLKQKDTPIVYASEAFLYMTGYSNAEVLGRNCRFLQSPDGMVKPKSTRKYVDSNTINTIRKAIDRNAEVQVEVVNFKKNGQRFVNFLTIIPVRDETGEYRYSMGFQCETE
综上所述，本发明提供的一对可分裂重组的末端脱氧核苷酸核酸转移酶及构建方法与应用。本发明设计可分裂重组的TdT，通过调控TdT-D1和TdT-D2的相对距离，实现TdT酶活性的灵活调控。基于TdT-D1和TdT-D2的酶法DNA合成不再需要依赖保护剂和去保护剂即可实现DNA合成酶活性的调控，从而明显简化了DNA人工合成的循环步骤。该方法同时为灵活、简便地调控TdT酶活性提供了新模式。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (10)
1.一对可分裂重组的末端脱氧核苷酸核酸转移酶，其特征在于，包括由TdT经切割得到的两个TdT蛋白结构域，所述两个TdT蛋白结构域分别记为TdT-D1和TdT-D2，当所述TdT-D1和TdT-D2分别单独存在时不独立表现出TdT催化活性；当所述TdT-D1和TdT-D2同时存在且靠近时，TdT-D1和TdT-D2会发生重组并表现出TdT催化活性。
2.根据权利要求1所述的一对可分裂重组的末端脱氧核苷酸核酸转移酶，其特征在于，所述TdT-D1的N端连接有pMag，记为pMag-TdT-D1；所述TdT-D2的C端连接有nMag，记为TdT-D2-nMag；
在蓝光照射前，所述pMag-TdT-D1和TdT-D2-nMag单独存在时不独立表现出TdT催化活性；
在蓝光照射下，pMag和nMag会二聚并使所述TdT-D1和TdT-D2靠近，TdT-D1和TdT-D2会发生重组并表现出TdT催化活性。
3.根据权利要求2所述的一对可分裂重组的末端脱氧核苷酸核酸转移酶，其特征在于，所述pMag-TdT-D1和TdT-D2-nMag的摩尔比为1:1。
4.根据权利要求2所述的一对可分裂重组的末端脱氧核苷酸核酸转移酶，其特征在于，所述TdT-D1的N端通过第一连接子连接pMag，所述TdT-D2的C端通过第一连接子连接nMag，所述第一连接子的氨基酸序列为GSGGSGGSGGSG。
5.根据权利要求1所述的一对可分裂重组的末端脱氧核苷酸核酸转移酶，其特征在于，所述由TdT经切割得到的两个TdT蛋白结构域具体包括：TdT删除了没有实质催化功能的1-146氨基酸之后，剩余TdT经切割得到的两个TdT蛋白结构域；
其中，所述TdT的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述TdT删除了没有实质催化功能的1-146氨基酸之后，剩余TdT的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
6.根据权利要求1所述的一对可分裂重组的末端脱氧核苷酸核酸转移酶，其特征在于，所述TdT-D1的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述TdT-D2的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
7.根据权利要求3所述的一对可分裂重组的末端脱氧核苷酸核酸转移酶，其特征在于，所述pMag-TdT-D1的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述TdT-D2-nMag的氨基酸序列如SEQID NO.6所示。
8.一对权利要求1所述的可分裂重组的末端脱氧核苷酸核酸转移酶的构建方法，其特征在于，包括步骤：
提供TdT；
用第二连接子将所述TdT的N端和C端连接起来，在TdT上从N端开始逐段选择切割位点，构建出不同TdT变体形式；
从不同TdT变体形式中筛选出高表达水平和高催化活性的TdT变体，得到候选TdT变体；
将所述候选TdT变体中的第二连接子去除，得到所述TdT-D1和TdT-D2，且当所述TdT-D1和TdT-D2分别单独存在时不独立表现出TdT催化活性；当所述TdT-D1和TdT-D2同时存在且靠近时，TdT-D1和TdT-D2会发生重组并表现出TdT催化活性。
9.根据权利要求8所述的一对可分裂重组的末端脱氧核苷酸核酸转移酶的构建方法，其特征在于，所述第二连接子的氨基酸序列为GTGGSGGTGG；
得到所述TdT-D1、TdT-D2后，还包括步骤：将光响应蛋白元件pMag和光响应蛋白元件nMag分别连接到TdT-D1的N端和TdT-D2的C端上，得到pMag-TdT-D1和TdT-D2-nMag。
10.权利要求1-7任一项所述的一对可分裂重组的末端脱氧核苷酸核酸转移酶催化DNA合成反应的应用。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN202310610806.1A CN116478955A (zh) | 2023-05-25 | 2023-05-25 | 一对可分裂重组的末端脱氧核苷酸核酸转移酶及构建方法 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| CN202310610806.1A CN116478955A (zh) | 2023-05-25 | 2023-05-25 | 一对可分裂重组的末端脱氧核苷酸核酸转移酶及构建方法 |
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