CN116547387A - 重组型kod聚合酶 - Google Patents
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Abstract
一种重组型KOD聚合酶。KOD聚合酶突变体，为一种蛋白，如下蛋白：为将KOD DNA聚合酶GH78氨基酸序列中第267、326、347、349、353、375、378、379、380、385、451、452、453、454、457、461、465、470、474、477、478、479、480、482、484、485、486、493、496、497、514、574、584、605、610、630、665、666、667、674、676、680、682、698、707、718、723和729这48位中至少一位的氨基酸残基进行修饰，其他氨基酸序列不变，得到具有DNA聚合酶活性的蛋白；重组性的DNA聚合酶相比KOD DNA聚合酶GH78在催化方面，展示了较强的反应速率，更好的催化效率，更好的亲和力等优点，提高在测序中DNA聚合酶的反应速率，增加反应读长。
Description
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种重组型KOD聚合酶。
DNA聚合酶的作用是快速而准确地复制DNA，对于生命体能够精准的传递遗传信息并且维持遗传物质稳定性具有重要的作用。在大肠杆菌中有五种DNA聚合酶，根据DNA聚合酶的序列同源性的不同，又分为A,B,C等几种类型。DNA聚合酶的总折叠结构类似人手，分为手掌、拇指和手指三部分，虽然不同种类的DNA聚合酶的手指和手掌的结构域的结构会有变化很大，但催化的手掌区域差异较小。DNA聚合酶的活性位点的主要的氨基酸序列是保守的，但是这些保守的酶活性位点也是相对容易改变的，能够加入非天然的特定dNTP而保持DNA聚合酶的活性不显著下降(参见专利号PCT/CN2018/103764)。
KOD DNA聚合酶属于B-family DNA聚合酶，能够快速准确的复制DNA，是一种耐热的DNA聚合酶，应用范围广泛，其中最重要的一个应用就是应用于基因组测序中，例如：SBS测序。SBS测序方法中使用在3’糖羟基具有修饰的核苷酸，从而阻断其它核苷酸的加入。使用带有3’阻断基团的核苷酸允许以受控方式将核苷酸掺入多核苷酸链中。在加入每个核苷酸后，3’阻断基团的存在阻止其它核苷酸加入所述链中。在去除阻断基团后，恢复天然游离的3’羟基基团用于加入下一个核苷酸。但是目前SBS测序也存在很多技术问题，如：测序的读长较短，反应的速率太慢等。
发明公开
本发明针对进一步加快测序中生化反应步骤，缩短反应时间等改进目标，在此前工作的基础上对KOD DNA聚合酶进行了更加深入的改造,对DNA聚合酶B family在此区域涉及到的原有功能位点进行了保护，确保其仍然能够完成原有的基本功能。本发明对KOD聚合酶的palm区，finger区以及Thumb区进行了动力学模拟与统计推断为基础，获得了可用于实验筛选的突变位点。并设计实验方案，通过半理性设计、酶变体库构建和高通量筛选达到改善聚合酶的催化及理化特性，开发适合于在附着于芯片表面DNB测序工作的DNA聚合酶。最后，重组性的DNA聚合酶进行了分离和纯化。
为了获得催化反应速率快或在SBS测序中添加上3’阻断基团的非天然修饰核苷酸的DNA聚合酶，本发明提供了如下技术方案：
本发明的一个目的提供一种KOD聚合酶突变体。
本发明提供的KOD聚合酶突变体，为一种蛋白，如下A所示的蛋白或其衍生物：
A)所示的蛋白为将KOD DNA聚合酶GH78氨基酸序列中第267、326、347、349、353、375、378、379、380、385、451、452、453、454、457、461、465、470、474、477、478、479、480、482、484、485、486、493、496、497、514、574、584、605、610、630、665、666、667、674、676、680、682、698、707、718、723和729这48位中至少一位的氨基酸残基进行修饰，其他氨基酸序列不变，得到具有DNA聚合酶活性的蛋白；
所述KOD DNA聚合酶GH78的氨基酸序列为序列表中序列1；
所述A)所示的蛋白的衍生物为将A)所示蛋白的氨基酸序列末端添加标签序列且具有DNA聚合酶活性的由A)衍生的蛋白质。
上述蛋白中，所述A)所示的蛋白可以为如下：将所述KOD DNA聚合酶GH78氨基酸序列中267、326、347、349、353、375、378、379、380、385、451、452、453、454、457、461、465、470、474、477、478、479、480、482、484、485、486、493、496、497、514、574、584、605、610、630、665、666、667、674、676、680、682、698、707、718、723和729这48位中至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个、至少27个、至少28个、至少29个、至少30个、至少31个、至少32个、至少33个、至少34个、至少35个、至少36个、至少37个、至少38个、至少39个、至少40个、至少41个、至少42个、至少43个、至少44个、至少45个、至少46个、至少47个或全部48个氨基酸残基进行修饰，得到具有DNA聚合酶活性的蛋白。
所述修饰为氨基酸置换。
上述蛋白中，所述各个氨基酸置换的方式如下：
第267位的T置换为D；
第326位的F置换为L；
第347位的S置换为D或V；
第349位的T置换为G；
第353位的V置换为D；
第375位的K胺置换为I、A或E；
第378位的A置换为E、Q或K；
第379位的R置换为K、Q、E、H或Y；
第380位的R置换为E、D、S、G、N或Y；
第385位的E置换为F或R；
第451位的S置换为N、T、G、H、M、L、P、R、A、Q或K；
第452位的L置换为V；
第453位的L置换为A、T、V或I；
第454位的G置换为Q；
第457位的L置换为M；
第461位的Q置换为A或S；
第465位的K置换为Q；
第470位的T置换S；
第474位的L置换为K、V、A或T；
第477位的K置换为E；
第478位L突变为I、V、Y、M、C、N、H或G；
第479位的L突变为M；
第480位的D突变为S、R、T、N、G、F、H或E；
第482位的R突变为K；
第484位的R突变为C、D、I、V、K或G；
第485位的E突变为I、C或F；
第486位的I突变为K或R；
第493位的Y突变为F、H或L；
第496位的Y突变为T或M；
第497位的Y突变为L、F、M、I或W；
第514位的T突变为A；
第574位的A突变为L；
第584位的K突变为T；
第605位的T突变为W或V；
第610位的I突变为L或M；
第630位的L突变为F；
第665位的谷氨酸突变为R、S、K或C；
第666位的天冬酰胺突变为A、N、Q、T或K；
第667位的T突变为R、N或S；
第674位的K突变为Q、M、I、E或R；
第676位的K突变为S、L、R、H、V、I、M、A或T；
第680位的M突变为I、L、T或A；
第682位的V突变为M；
第698位的V突变为I；
第707位的S突变为G、T或K；
第718位的D突变为Q；
第723位的T突变为V、C、G、I或F；
第729位的A突变为T。
上述蛋白为如下任一种：
KOD DNA聚合酶突变体名称及其突变位置如下：
其中，将所述KOD DNA聚合酶GH78氨基酸序列中267、326、347、349、353、375、378、379、380、385、451、452、453、454、457、461、465、470、474、477、478、479、480、482、484、485、486、493、496、497、514、574、584、605、610、630、665、666、667、674、676、680、682、698、707、718、723和729这48位中至少一位的氨基酸残基进行修饰，其他氨基酸序列不变，得到具有DNA聚合酶活性的蛋白；举例如下：
GH101其氨基酸序列为将序列1的第480的D突变为N，且其他氨基酸残基保持不变；
GH102其氨基酸序列为将序列1的第676的K突变为H，且其他氨基酸残基保持不变；
GH103其氨基酸序列为将序列1的第485的E突变为I，且其他氨基酸残基保持不变；
GH104其氨基酸序列为将序列1的第497的Y突变为L，且其他氨基酸残基保持不变；
GH105其氨基酸序列为将序列1的第451的S突变为Q，且其他氨基酸残基保持不变；
GH106其氨基酸序列为将序列1的第482的R突变为K，且其他氨基酸残基保持不变；
GH107其氨基酸序列为将序列1的第453的L突变为V，且其他氨基酸残基保持不变；
GH108其氨基酸序列为将序列1的第474的I突变为T，且其他氨基酸残基保持不变；
GH109其氨基酸序列为将序列1的第267的T突变为D，且其他氨基酸残基保持不变；
GH110其氨基酸序列为将序列1的第723的T突变为V，且其他氨基酸残基保持不变；
GH111其氨基酸序列为将序列1的第379的R突变为Y，且其他氨基酸残基保持不变；
GH112其氨基酸序列为将序列1的第453的L突变为I，且其他氨基酸残基保持不变；
GH113其氨基酸序列为将序列1的第474的I突变为K，且其他氨基酸残基保持不变；
GH114其氨基酸序列为将序列1的第353的V突变为D，且其他氨基酸残基保持不变；
GH115其氨基酸序列为将序列1的第347的S突变为D，且其他氨基酸残基保持不变；
GH116其氨基酸序列为将序列1的第465的K突变为Q，且其他氨基酸残基保持不变；
GH117其氨基酸序列为将序列1的第380的R突变为D，且其他氨基酸残基保持不变；
GH118其氨基酸序列为将序列1的第461的Q突变为A，且其他氨基酸残基保持不变；
GH119其氨基酸序列为将序列1的第610的I突变为L，且其他氨基酸残基保持不变；
GH120其氨基酸序列为将序列1的第723的T突变为G，且其他氨基酸残基保持不变；
GH121其氨基酸序列为将序列1的第496的Y突变为M，且其他氨基酸残基保持不变；
GH122其氨基酸序列为将序列1的第375的K突变为A，且其他氨基酸残基保持不变；
GH123其氨基酸序列为将序列1的第497的Y突变为I，且其他氨基酸残基保持不变；
GH124其氨基酸序列为将序列1的第474的I突变为A，且其他氨基酸残基保持不变；
GH125其氨基酸序列为将序列1的第707的S突变为G，且其他氨基酸残基保持不变；
GH126其氨基酸序列为将序列1的第379的R突变为E，且其他氨基酸残基保持不变；
GH127其氨基酸序列为将序列1的第723的T突变为I，且其他氨基酸残基保持不变；
GH128其氨基酸序列为将序列1的第461的Q突变为S，且其他氨基酸残基保持不变；
GH129其氨基酸序列为将序列1的第718的D突变为Q，且其他氨基酸残基保持不变；
GH131其氨基酸序列为将序列1的第452的L突变为V，且其他氨基酸残基保持不变；
GH132其氨基酸序列为将序列1的第380的R突变为Y，且其他氨基酸残基保持不变；
GH133其氨基酸序列为将序列1的第478的L突变为V，且其他氨基酸残基保持不变；
GH134其氨基酸序列为将序列1的第478的L突变为Y，且其他氨基酸残基保持不变；
GH135其氨基酸序列为将序列1的第385的E突变为R，且其他氨基酸残基保持不变；
GH136其氨基酸序列为将序列1的第474的I突变为V，且其他氨基酸残基保持不变；
GH137其氨基酸序列为将序列1的第479的L突变为M，且其他氨基酸残基保持不变；
GH138其氨基酸序列为将序列1的第680的M突变为L，且其他氨基酸残基保持不变；
GH139其氨基酸序列为将序列1的第478的L突变为I，且其他氨基酸残基保持不变；
GH140其氨基酸序列为将序列1的第723的T突变为C，且其他氨基酸残基保持不变；
GH141其氨基酸序列为将序列1的第478的L突变为M，且其他氨基酸残基保持不变；
GH142其氨基酸序列为将序列1的第729的A突变为T，且其他氨基酸残基保持不变；
GH143其氨基酸序列为将序列1的第610的I突变为M，且其他氨基酸残基保持不变；
GH144其氨基酸序列为将序列1的第353的V突变为D，且其他氨基酸残基保持不变；
GH145其氨基酸序列为将序列1的第676的K突变为S，且其他氨基酸残基保持不变；
GH146其氨基酸序列为将序列1的第326的F突变为L，且其他氨基酸残基保持不变；
GH147其氨基酸序列为将序列1的第574的A突变为L，且其他氨基酸残基保持不变；
GH148其氨基酸序列为将序列1的第630的L突变为F，且其他氨基酸残基保持不变；
GH149其氨基酸序列为将序列1的第349的T突变为G，且其他氨基酸残基保持不变；
其中，将所述KOD DNA聚合酶GH78氨基酸序列中267、326、347、349、353、375、378、379、380、385、451、452、453、454、457、461、465、470、474、477、478、479、480、482、484、485、486、493、496、497、514、574、584、605、610、630、665、666、667、674、676、680、682、698、707、718、723和729这48位中至少2位的氨基酸残基进行修饰，其他氨基酸序列不变，得到具有DNA聚合酶活性的蛋白；举例如下：
KH222其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第451位S突变L，且其他氨基酸残基保持不变；
KH223其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第451位丝氨酸突变苏氨酸，且其他氨基酸残基保持不变；
KH224其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第484位D突变半胱氨酸，且其他氨基酸残基保持不变；
KH225其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第480位D突变苏氨酸，且其他氨基酸残基保持不变；
KH226其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第451位丝氨酸突变甘氨酸，且其他氨基酸残基保持不变；
KH227其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第453位L突变A，且其他氨基酸残基保持不变；
KH228其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为C，且将第484位R突变V，且其他氨基酸残基保持不变；
KH229其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为C，且将第451位S突变N，且其他氨基酸残基保持不变；
KH230其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为C，且将第480位D突变N，且其他氨基酸残基保持不变；
KH232其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为C，且将第484位R突变I，且其他氨基酸残基保持不变；
KH233其氨基酸序列为将序列1的第676位K突变为S，且将第680位M突变I，且其他氨基酸残基保持不变；
KH234其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为C，且将第486位I突变R，且其他氨基酸残基保持不变；
KH235其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第480位D突变S，且其他氨基酸残基保持不变；
KH236其氨基酸序列为将序列1的第493位Y突变为F，且将第497位Y突变L，且其他氨基酸残基保持不变；
KH237其氨基酸序列为将序列1的第676位K突变为L，且将第680位M突变I，且其他氨基酸残基保持不变；
KH238其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第480位D突变Q，且其他氨基酸残基保持不变；
KH239其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第480位D突变M，且其他氨基酸残基保持不变；
KH240其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第451位S突变K，且其他氨基酸残基保持不变；
KH241其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第480位D突变R，且其他氨基酸残基保持不变；
KH242其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第453位L突变N，且其他氨基酸残基保持不变；
KH243其氨基酸序列为将序列1的第676位K突变为R，且将第680位M突变I，且其他氨基酸残基保持不变；
KH244其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第451位S突变M，且其他氨基酸残基保持不变；
KH245其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第477位K突变E，且其他氨基酸残基保持不变；
KH246其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第480位D突变W，且其他氨基酸残基保持不变；
KH247其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第480位D突变K，且其他氨基酸残基保持不变；
KH248其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第451位S突变R，且其他氨基酸残基保持不变；
KH249其氨基酸序列为将序列1的第676位K突变为L，且将第680位M突变L，且其他氨基酸残基保持不变；
KH250其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第665位Q突变R，且其他氨基酸残基保持不变；
KH251其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第665位Q突变S，且其他氨基酸残基保持不变；
KH252其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第480位D突变E，且其他氨基酸残基保持不变；
KH253其氨基酸序列为将序列1的第676位K突变为H，且将第680位M突变I，且其他氨基酸残基保持不变；
KH254其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第461位Q突变A，且其他氨基酸残基保持不变；
KH255其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第451位S突变A，且其他氨基酸残基保持不变；
KH256其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第451位S突变Q，且其他氨基酸残基保持不变；
KH257其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第666位I突变Q，且其他氨基酸残基保持不变；
KH258其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第666位I突变T，且其他氨基酸残基保持不变；
KH259其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第605位T突变W，且其他氨基酸残基保持不变；
KH260其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第379位R突变Y，且其他氨基酸残基保持不变；
KH261其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第453位L突变T，且其他氨基酸残基保持不变；
KH262其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第480位D突变C，且其他氨基酸残基保持不变；
KH263其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第605位T突变V，且其他氨基酸残基保持不变；
KH264其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第480位D突变N，且其他氨基酸残基保持不变；
KH266其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第480位D突变G，且其他氨基酸残基保持不变；
KH267其氨基酸序列为将序列1的第465位K突变为Q，且将第718位D突变Q，且其他氨基酸残基保持不变；
KH268其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第379位R突变H，且其他氨基酸残基保持不变；
KH269其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第465位K突变Q，且其他氨基酸残基保持不变；
KH270其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第480位D突变P，且其他氨基酸残基保持不变；
KH271其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第480位D突变F，且其他氨基酸残基保持不变；
KH272其氨基酸序列为将序列1的第676位K突变为V，且将第680位M突变L，且其他氨基酸残基保持不变；
KH273其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第453位L突变V，且其他氨基酸残基保持不变；
KH274其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第480位D突变H，且其他氨基酸残基保持不变；
KH275其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第451位S突变P，且其他氨基酸残基保持不变；
KH276其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第665位Q突变K，且其他氨基酸残基保持不变；
KH277其氨基酸序列为将序列1的第480位D突变为S，且将第451位S突变Q，且其他氨基酸残基保持不变；
KH278其氨基酸序列为将序列1的第474位I突变为T，且将第478位L突变C，且其他氨基酸残基保持不变；
KH279其氨基酸序列为将序列1的第676位K突变为H，且将第680位M突变T，且其他氨基酸残基保持不变；
KH280其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第347位S突变V，且其他氨基酸残基保持不变；
KH281其氨基酸序列为将序列1的第480位D突变为N，且将第453位L突变V，且其他氨基酸残基保持不变；
KH282其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第666位I突变A，且其他氨基酸残基保持不变；
KH283其氨基酸序列为将序列1的第676位K突变为V，且将第680位M突变I，且其他氨基酸残基保持不变；
KH284其氨基酸序列为将序列1的第676位K突变为I，且将第680位M突变L，且其他氨基酸残基保持不变；
KH285其氨基酸序列为将序列1的第676位K突变为M，且将第680位M突变A，且其他氨基酸残基保持不变；
KH286其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第470位T突变S，且其他氨基酸残基保持不变；
KH287其氨基酸序列为将序列1的第676位K突变为L，且将第680位M突变A，且其他氨基酸残基保持不变；
KH288其氨基酸序列为将序列1的第379位R突变为K，且将第380位R突变E，且其他氨基酸残基保持不变；
KH201其氨基酸序列为将序列1的第480位D突变为N，且将第680位M突变I，且其他氨基酸残基保持不变；
KH202其氨基酸序列为将序列1的第474位I突变为T，且将第478位L突变N，且其他氨基酸残基保持不变；
KH203其氨基酸序列为将序列1的第474位I突变为T，且将第478位L突变H，且其他氨基酸残基保持不变；
KH204其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第484位R突变K，且其他氨基酸残基保持不变；
KH205其氨基酸序列为将序列1的第493位Y突变为H，且将第497位Y突变F，且其他氨基酸残基保持不变；
KH206其氨基酸序列为将序列1的第493位Y突变为F，且将第497位Y突变M，且其他氨基酸残基保持不变；
KH207其氨基酸序列为将序列1的第514位T突变为A，且将第584位K突变T，且其他氨基酸残基保持不变；
KH208其氨基酸序列为将序列1的第474位I突变为T，且将第478位L突变G，且其他氨基酸残基保持不变；
KH209其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第665位Q突变C，且其他氨基酸残基保持不变；
KH210其氨基酸序列为将序列1的第465位K突变为Q，且将第584位K突变T，且其他氨基酸残基保持不变；
KH211其氨基酸序列为将序列1的第676位K突变为M，且将第680位M突变L，且其他氨基酸残基保持不变；
KH212其氨基酸序列为将序列1的第493位Y突变为H，且将第497位Y突变L，且其他氨基酸残基保持不变；
KH213其氨基酸序列为将序列1的第457位L突变为M，且将第461位Q突变A，且其他氨基酸残基保持不变；
KH214其氨基酸序列为将序列1的第676位K突变为S，且将第680位M突变A，且其他氨基酸残基保持不变；
KH125其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为F，且将第486位I突变K，且其他氨基酸残基保持不变；
KH126其氨基酸序列为将序列1的第480位D突变为N，且将第584位K突变T，且其他氨基酸残基保持不变；
KH217其氨基酸序列为将序列1的第375位K突变为E，且将第378位A突变K，且其他氨基酸残基保持不变；
KH218其氨基酸序列为将序列1的第493位Y突变为F，且将第497位Y突变I，且其他氨基酸残基保持不变；
KH219其氨基酸序列为将序列1的第474位I突变为K，且将第478位L突变H，且其他氨基酸残基保持不变；
KH220其氨基酸序列为将序列1的第353位V突变为D，且将第496位Y突变T，且其他氨基酸残基保持不变；
KH221其氨基酸序列为将序列1的第379位R突变为Q，且将第380位R突变D，且其他氨基酸残基保持不变；
QH349其氨基酸序列为将序列1的第676位K突变为A，且将第680位M突变L，且其他氨基酸残基保持不变；
QH350其氨基酸序列为将序列1的第480位D突变为N，且将第482位R突变K，且其他氨基酸残基保持不变；
QH351其氨基酸序列为将序列1的第451位S突变为Q，且将第453位L突变V，且其他氨基酸残基保持不变；
QH352其氨基酸序列为将序列1的第474位I突变为K，且将第478位L突变Y，且其他氨基酸残基保持不变；
QH353其氨基酸序列为将序列1的第480位D突变为N，且将第267位T突变D，且其他氨基酸残基保持不变；
QH354其氨基酸序列为将序列1的第676位K突变为L，且将第680位M突变T，且其他氨基酸残基保持不变；
QH355其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第454位G突变Q，且其他氨基酸残基保持不变；
QH356其氨基酸序列为将序列1的第676位K突变为V，且将第682位V突变M，且其他氨基酸残基保持不变；
QH357其氨基酸序列为将序列1的第465位K突变为Q，且将第707位S突变G，且其他氨基酸残基保持不变；
QH358其氨基酸序列为将序列1的第676位K突变为I，且将第680位M突变I，且其他氨基酸残基保持不变；
QH359其氨基酸序列为将序列1的第474位I突变为K，且将第478位L突变G，且其他氨基酸残基保持不变；
QH360其氨基酸序列为将序列1的第379位R突变为E，且将第380位R突变S，且其他氨基酸残基保持不变；
QH361其氨基酸序列为将序列1的第375位K突变为I，且将第378位A突变Q，且其他氨基酸残基保持不变；
QH362其氨基酸序列为将序列1的第493位Y突变为H，且将第497位Y突变M，且其他氨基酸残基保持不变；
QH363其氨基酸序列为将序列1的第676位K突变为A，且将第680位M突变I，且其他氨基酸残基保持不变；
QH329其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第484位R突变G，且其他氨基酸残基保持不变；
QH364其氨基酸序列为将序列1的第676位K突变为I，且将第680位M突变T，且其他氨基酸残基保持不变；
QH365其氨基酸序列为将序列1的第474位I突变为K，且将第478位L突变V，且其他氨基酸残基保持不变；
QH366其氨基酸序列为将序列1的第379位R突变为K，且将第380位R突变G，且其他氨基酸残基保持不变；
QH367其氨基酸序列为将序列1的第379位R突变为Q，且将第380位R突变S，且其他氨基酸残基保持不变；
QH368其氨基酸序列为将序列1的第379位R突变为Q，且将第380位R突变N，且其他氨基酸残基保持不变；
QH369其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第451位S突变Q，且其他氨基酸残基保持不变；
QH370其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第666位I突变Q，且其他氨基酸残基保持不变；
QH371其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第666位I突变R，且其他氨基酸残基保持不变；
其中，将所述KOD DNA聚合酶GH78氨基酸序列中267、326、347、349、353、375、378、379、380、385、451、452、453、454、457、461、465、470、474、477、478、479、480、482、484、485、486、493、496、497、514、574、584、605、610、630、665、666、667、674、676、680、682、698、707、718、723和729这48位中至少3位的氨基酸残基进行修饰，其他氨基酸序列不变，得到具有DNA聚合酶活性的蛋白；举例如下：
QH303其氨基酸序列为将序列1的第676位K突变为L；且将第680位M突变T；且将第689位V突变I，且其他氨基酸残基保持不变；
QH304其氨基酸序列为将序列1的第457位L突变为M；且将第461位Q突变A；且将第267位T突变D，且其他氨基酸残基保持不变；
QH305其氨基酸序列为将序列1的第465位K突变为Q；且将第584位K突变T；且将第485位E突变I，且其他氨基酸残基保持不变；
QH306其氨基酸序列为将序列1的第465位K突变为Q；且将第718位D突变Q；且将第485位E突变I，且其他氨基酸残基保持不变；
QH307其氨基酸序列为将序列1的第457位L突变为M；且将第461位Q突变A；且将第485位E突变I，且其他氨基酸残基保持不变；
QH308其氨基酸序列为将序列1的第676位K突变为S；且将第680位M突变I；且将第485位E突变I，且其他氨基酸残基保持不变；
QH309其氨基酸序列为将序列1的第493位Y突变为F；且将第497位Y突变L；且将第485位E突变I，且其他氨基酸残基保持不变；
QH310其氨基酸序列为将序列1的第480位D突变为N；且将第451位S突变Q；且将第718位D突变Q，且其他氨基酸残基保持不变；
QH311其氨基酸序列为将序列1的第480位D突变为N；且将第674位K突变M；且将第680位M突变I，且其他氨基酸残基保持不变；
QH312其氨基酸序列为将序列1的第480位D突变为N；且将第451位S突变Q；且将第485位E突变I，且其他氨基酸残基保持不变；
QH313其氨基酸序列为将序列1的第480位D突变为N；且将第465位K突变Q；且将第718位D突变Q，且其他氨基酸残基保持不变；
QH314其氨基酸序列为将序列1的第480位D突变为N；且将第451位S突变Q；且将第461位Q突变A，且其他氨基酸残基保持不变；
其中，将所述KOD DNA聚合酶GH78氨基酸序列中267、326、347、349、353、375、378、379、380、385、451、452、453、454、457、461、465、470、474、477、478、479、480、482、484、485、486、493、496、497、514、574、584、605、610、630、665、666、667、674、676、680、682、698、707、718、723和729这48位中至少4位的氨基酸残基进行修饰，其他氨基酸序列不变，得到具有DNA聚合酶活性的蛋白；举例如下：
QH315其氨基酸序列为将序列1的第465位K突变为Q；且将第718位D突变Q；且将第457位L突变M；且将第461位Q突变A，且其他氨基酸残基保持不变；
QH316其氨基酸序列为将序列1的第465位K突变为Q；且将第718位D突变Q；且将第480位D突变N；且将第485位E突变I，且其他氨基酸残基保持不变；
其中，将所述KOD DNA聚合酶GH78氨基酸序列中267、326、347、349、353、375、378、379、380、385、451、452、453、454、457、461、465、470、474、477、478、479、480、482、484、485、486、493、496、497、514、574、584、605、610、630、665、666、667、674、676、680、682、698、707、718、723和729这48位中至少3位的氨基酸残基进行修饰，其他氨基酸序列不变，得到具有DNA聚合酶活性的蛋白；举例如下：
QH317其氨基酸序列为将序列1的第480位D突变为N；且将第451位S突变Q；且将第379位R突变Y，且其他氨基酸残基保持不变；
QH318其氨基酸序列为将序列1的第457位L突变为M；且将第461位Q突变A；且将第465位K突变Q，且其他氨基酸残基保持不变；
QH319其氨基酸序列为将序列1的第480位D突变为N；且将第674位K突变Q；且将第680位M突变I，且其他氨基酸残基保持不变；
QH320其氨基酸序列为将序列1的第480位D突变为N；且将第674位K突变R；且将第680位M突变I，且其他氨基酸残基保持不变；
QH321其氨基酸序列为将序列1的第480位D突变为N；且将第451位S突变Q；且将第465位K突变Q，且其他氨基酸残基保持不变；
QH322其氨基酸序列为将序列1的第680位M突变为I；且将第676位K突变H；且将第485位E突变I，且其他氨基酸残基保持不变；
QH323其氨基酸序列为将序列1的第465位K突变为Q；且将第718位D突变Q；且将第267位T突变D，且其他氨基酸残基保持不变；
QH324其氨基酸序列为将序列1的第451位S突变为Q；且将第452位L突变V；且将第453位L突变V，且其他氨基酸残基保持不变；
QH325其氨基酸序列为将序列1的第451位S突变为Q；且将第674位K突变M；且将第676位K突变T，且其他氨基酸残基保持不变；
QH326其氨基酸序列为将序列1的第465位K突变为Q；且将第718位D突变Q；且将第379位R突变Y，且其他氨基酸残基保持不变；
QH326其氨基酸序列为将序列1的第465位K突变为Q；且将第718位D突变Q；且将第453位L突变V，且其他氨基酸残基保持不变；
QH328其氨基酸序列为将序列1的第480位D突变为N；且将第674位K突变I；且将第680位M突变I，且其他氨基酸残基保持不变；
QH331其氨基酸序列为将序列1的第465位K突变为Q；且将第584位K突变T；且将第453位L突变V，且其他氨基酸残基保持不变；
QH332其氨基酸序列为将序列1的第465位K突变为Q；且将第718位D突变Q；且将第707位S突变G，且其他氨基酸残基保持不变；
QH333其氨基酸序列为将序列1的第465位K突变为Q；且将第584位K突变T；且将第379位R突变Y，且其他氨基酸残基保持不变；
QH334其氨基酸序列为将序列1的第451位S突变为Q；且将第482位R突变K；且将第676位K突变T，且其他氨基酸残基保持不变；
QH335其氨基酸序列为将序列1的第465位K突变为Q；且将第584位K突变T；且将第267位T突变D，且其他氨基酸残基保持不变；
QH336其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I；且将第676位K突变L；且将第680位M突变L，且其他氨基酸残基保持不变；
其中，将所述KOD DNA聚合酶GH78氨基酸序列中267、326、347、349、353、375、378、379、380、385、451、452、453、454、457、461、465、470、474、477、478、479、480、482、484、485、486、493、496、497、514、574、584、605、610、630、665、666、667、674、676、680、682、698、707、718、723和729这48位中至少4位的氨基酸残基进行修饰，其他氨基酸序列不变，得到具有DNA聚合酶活性的蛋白；举例如下：
QH338其氨基酸序列为将序列1的第480位D突变为N；且将第667位T突变R；且将第674位K突变Q；且将第680位M突变I，且其他氨基酸残基保持不变；
QH339其氨基酸序列为将序列1的第480位D突变为N；且将第667位T突变N；且将第674位K突变M；且将第680位M突变I，且其他氨基酸残基保持不变；
QH340其氨基酸序列为将序列1的第480位D突变为N；且将第667位T突变S；且将第674位K突变M；且将第680位M突变I，且其他氨基酸残基保持不变；
QH341其氨基酸序列为将序列1的第451位S突变为Q；且将第480位D突变N；且将第674位K突变Q；且将第680位M突变I，且其他氨基酸残基保持不变；
QH342其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I；且将第676位K突变L；且将第680位M突变T；且将第698位V突变I，且其他氨基酸残基保持不变；
QH343其氨基酸序列为将序列1的第480位D突变为N；且将第667位T突变N；且将第674位K突变Q；且将第680位M突变I，且其他氨基酸残基保持不变；
QH344其氨基酸序列为将序列1的第676位K突变为S；且将第680位M突变I；且将第493位Y突变F；且将第497位Y突变L，且其他氨基酸残基保持不变；
QH345其氨基酸序列为将序列1的第451位S突变为Q；且将第482位R突变K；且将第674位K突变Q；且将第680位M突变L，且其他氨基酸残基保持不变；
其中，将所述KOD DNA聚合酶GH78氨基酸序列中267、326、347、349、353、375、378、379、380、385、451、452、453、454、457、461、465、470、474、477、478、479、480、482、484、485、486、493、496、497、514、574、584、605、610、630、665、666、667、674、676、680、682、698、707、718、723和729这48位中至少5位的氨基酸残基进行修饰，其他氨基酸序列不变，得到具有DNA聚合酶活性的蛋白；举例如下：
QH346其氨基酸序列为将序列1的第451位S突变为Q；且将第482位R突变K；且将第674位K突变M；且将第680位M突变L；且将第479位L突变M，且其他氨基酸残基保持不变；
QH347其氨基酸序列为将序列1的第451位S突变为Q；且将第453位L突变I；且将第480位D突变N；且将第674位K突变Q；且将第680位M突变I，且其他氨基酸残基保持不变；
其中，将所述KOD DNA聚合酶GH78氨基酸序列中267、326、347、349、353、375、378、379、380、385、451、452、453、454、457、461、465、470、474、477、478、479、480、482、484、485、486、493、496、497、514、574、584、605、610、630、665、666、667、674、676、680、682、698、707、718、723和729这48位中至少6位的氨基酸残基进行修饰，其他氨基酸序列不变，得到具有DNA聚合酶活性的蛋白；举例如下：
QH348其氨基酸序列为将序列1的第451位S突变为Q；且将第482位R突变K；且将第674位K突变Q；且将第680位M突变L；且将第452位L突变V；且将第480位D突变N，且其他氨基酸残基保持不变。
编码上述蛋白的核酸分子也是本发明保护的范围。
上述核酸分子为如下B所示的DNA分子或其衍生物：
B)所示的DNA分子为所述KOD DNA聚合酶突变体GH78编码基因的核苷酸序列按照其对应的氨基酸序列1中第267、326、347、349、353、375、378、379、380、385、451、452、453、454、457、461、465、470、474、477、478、479、480、482、484、485、486、493、496、497、514、574、584、605、610、630、665、666、667、674、676、680、682、698、707、718、723和729位中至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个、至少27个、至少28个、至少29个、至少30个、至少31个、至少32个、至少33个、至少34个、至少35个、至少36个、至少37个、至少38个、至少39个、至少40个、至少41个、至少42个、至少43个、至少44个、至少45个、至少46个、至少47个或全部48个氨基酸密码子进行氨基酸密码子置换，得到的核酸；
所述KOD DNA聚合酶突变体GH78编码基因的核苷酸序列为序列表中序列2；
所述B)所示的DNA分子的衍生物为将B)所示DNA分子的核苷酸序列末端添加标签序列且编码具有DNA聚合酶活性蛋白的核酸分子。
含有上述DNA分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系也是本发明保护的范围。
上述蛋白在如下1)-5)中至少一种中的应用也是本发明保护的范围：
1)作为DNA聚合酶；
2)催化DNA复制和/或催化DNA扩增；
3)进行核酸测序；
4)制备用于催化DNA复制和/或催化DNA扩增的产品；
5)制备用于进行核酸测序的产品。
上述DNA分子或上述表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在如下1)-6)中至少一种中的应用也是本发明保护的范围：
1)制备DNA聚合酶；
2)催化DNA复制和/或催化DNA扩增；
3)进行核酸测序；
4)制备DNA聚合酶的产品；
5)制备用于催化DNA复制和/或催化DNA扩增的产品；
6)制备用于进行核酸测序的产品。
上述应用中，所述测序为SBS测序；
所述核酸为DNA或RNA或全基因组。
上述应用中，所述产品为试剂盒。
图1为重组型KOD DNA聚合酶结构示意图,其中，1为信号肽pelB；2为融合蛋白纯化标签His；3为KOD DNA聚合酶GH78。
图2为野生型KOD DNA聚合酶融合蛋白纯度检测。
实施发明的最佳方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、KOD DNA聚合酶突变体的制备
在本发明中，将KOD DNA聚合酶及其突变体采用DNA 2.0的Electra
TM Cloning Reagents Kit试剂盒进行表达载体的构建，并且利用His标签进行Ni柱亲和纯化。
一、KOD DNA聚合酶GH78的制备
KOD DNA聚合酶GH78的氨基酸序列为如下序列表中的序列1，其编码基因序列为如下序列表中序列2。
1、GH78表达载体pD441-WT的构建
重组表达载体pD441-78为将融合his标签的KOD DNA聚合酶GH78编码基因按Electra
TM Cloning Reagents Kit(DNA2.0,EKT-02)试剂盒说明书操作步骤重组到载体pD441-pelB(DNA2.0,pD441-pelB)上，得到的载 体，融合His标签的KOD DNA聚合酶GH78编码基因，通过载体pD441-pelB上的信号肽引导表达。
融合His标签的KOD DNA聚合酶GH78编码基因的核苷酸序列为在序列2的3’端连接有6个His标签密码子得到的序列。
KOD DNA聚合酶GH78融合蛋白的氨基酸序列为将序列1所示的氨基酸的N端连接6个His标签得到，如下图1，1为信号肽pelB；2为融合蛋白纯化标签His；3为KOD DNA聚合酶GH78(序列1)。
2、重组菌的构建
将重组表达载体pD441-78导入大肠杆菌BL21感受态细胞(购自全式金生物科技有限公司)中，涂抹在含有卡那霉素50μg/ml的平板上来筛选阳性菌落。挑选阳性菌落3-5个，利用引物Cloning-F和Cloning-R对所挑选的阳性菌落进行PCR鉴定。得到与预计的理论值基本一致的2800bp大小的片段，经测序结果比对判定为阳性克隆，命名为BL21/pD441-78。
Cloning-F：5’GGTTTTTTTATGGGGGGAGTTTAGG 3’(序列3)
Cloning-R：5’CATCTCATCTGTAACATCATTGGCA 3’(序列4)
3、KOD DNA聚合酶GH78融合蛋白的表达和纯化
挑取BL21/pD441-78单菌落，于50ml LB液体培养基中(含Kan50μg/ml)中，37℃，220rpm/min，过夜培养。第二天按1:100稀释量，转接于1L的LB液体培养基中(含Kan50μg/ml)，37℃，220rpm/min摇床培养至OD600为0.8，加入IPTG终浓度为0.5mM，25℃过夜诱导表达融合蛋白，获得诱导后BL21/pD441-78菌液。空白对照组菌液不加IPTG。
将上述BL21/pD441-78菌液于转速为8000rpm/min离心10min，弃上清，收集沉淀菌体，重悬细胞于buffer(50mM KPO
4，500Mm NaCl，10mM imidazole，5％(体积百分含量)Glycerol，PH 7.0，余量为水)中，另加入PMSF(终浓度0.5mM)。然后使用超声破碎仪进行菌体破碎，工作时间40min，功率200W，超声1S停2S,报警温度15℃。超声破碎完成后，将细胞破碎液于80℃水浴20min，期间注意定时混匀，使受热均匀；12000rpm/min，4℃离心30min，将上清用0.22um滤膜过滤，收集滤液即为细胞粗提物。
将细胞粗提物以适当流速进行Ni柱亲和层析(亲和层析预装柱 HisTrap FF，5ml，GE healthcare)上样，上样结束后利用buffer1平衡5CV；3％buffer 2(50mMKPO4，1M NaCl，5％Glycerol，PH 7.0)洗脱5CV；50％buffer 2洗脱5CV，收集大于等于100mAU峰值对应的Ni柱亲和层析洗脱液。
将大于等于100mAU峰值对应的洗脱液按一定的流速进行离子交换层析(离子交换预装柱HiTrap Q HP，5ml，GE healthcare)上样，上样结束后利用buffer2平衡5CV，0％buffer 2-60％buffer 2线性洗脱，收集大于等于100mAU峰值对应的离子交换层析洗脱液。
将大于等于100mAU峰值对应的离子交换层析洗脱液进行凝胶层析(HiTrap SP HP，5ml,GE healthcare)，先用20％乙醇洗3CV，水洗3CV，利用100％buffer 3(20mMTris，200mMKCl，0.2mM EDTA，10％Glycerol，PH7.4)平衡3CV后上样，再用buffer 3洗脱1.5CV，收集洗脱液即为纯化后KOD DNA聚合酶GH78融合蛋白。
将纯化后KOD DNA聚合酶GH78融合蛋白进行SDS-PAGE(浓缩胶为5％分离胶为12％)，蛋白样品与loadingbuffer(5X)进行混合，95℃处理5min，进行上样。
结果如图2所示，1为蛋白Marker(PageRulerPrestained Protein Ladder，26616，Thermo Scientific)，2为10μl 1mg/ml纯化后KOD DNA聚合酶GH78融合蛋白，3为10μl稀释20倍后的0.05mg/ml纯化后KOD DNA聚合酶GH78融合蛋白。从蛋白电泳结果可以看出，泳道2和泳道3中蛋白大小约91.5KDa，与文献报道分子量一致。
对电泳后的蛋白胶利用Quantity one软件分析蛋白纯度，纯化后KOD DNA聚合酶GH78融合蛋白纯度能达到95％或以上。
未诱导BL21/pD441-78菌液未得到约91.5KDa大小的目的蛋白。
对照组将空载体pD441-pelB导入大肠杆菌BL21中，得到BL21/pD441-pelB。采用上述方法进行表达和纯化蛋白，也未得到约91.5KDa大小的目的蛋白。
二、KOD DNA聚合酶突变体融合蛋白的制备
KOD DNA聚合酶突变体为将GH78的氨基酸序列(序列1)第267、326、347、349、353、375、378、379、380、385、451、452、453、454、457、 461、465、470、474、477、478、479、480、482、484、485、486、493、496、497、514、574、584、605、610、630、665、666、667、674、676、680、682、698、707、718、723和729位中至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个、至少27个、至少28个、至少29个、至少30个、至少31个、至少32个、至少33个、至少34个、至少35个、至少36个、至少37个、至少38个、至少39个、至少40个、至少41个、至少42个、至少43个、至少44个、至少45个、至少46个、至少47个或全部48个氨基酸进行氨基酸置换，得到的蛋白；若只有一个氨基酸置换所到的是KOD DNA聚合酶单点突变体，若有两个氨基酸置换所得到的是KOD DNA聚合酶两点组合突变体，若有三个氨基酸置换所得到的是KOD DNA聚合酶三点组合突变体，依次类推。
KOD DNA聚合酶突变体编码基因为将KOD DNA聚合酶突变体GH78编码基因的核苷酸序列(序列2)按照其对应的氨基酸序列1中第267、326、347、349、353、375、378、379、380、385、451、452、453、454、457、461、465、470、474、477、478、479、480、482、484、485、486、493、496、497、514、574、584、605、610、630、665、666、667、674、676、680、682、698、707、718、723和729位中至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个、至少27个、至少28个、至少29个、至少30个、至少31个、至少32个、至少33个、至少34个、至少35个、至少36个、至少37个、至少38个、至少39个、至少40个、至少41个、至少42个、至少43个、至少44个、至少45个、至少46个、至少47个或全部48个氨基酸密码子进行氨基酸密码子置换，得到的核酸。
KOD DNA聚合酶单点突变体的突变位置及突变信息举例如表1所示。
表1为KOD DNA聚合酶单点突变体的突变位置及突变信息
举例上述表1中突变位置及突变信息描述如下：KOD DNA聚合酶突变体GH101为将KOD DNA聚合酶GH78的氨基酸序列(序列1)第480的天冬氨酸(D)突变为天冬酰胺(N)，得到的蛋白。
KOD DNA聚合酶突变体GH101编码基因为将KOD DNA聚合GH78酶编码基因的核苷酸序列(序列2)中按照其对应的氨基酸序列1第480位的天冬氨酸(D)的密码子突变为天冬酰胺(N)的密码子，得到的核苷酸。
KOD型DNA聚合酶GH78基础上进行两个位置突变为双点组合突变体， 双点组合突变体具体突变位置及方式如下：
KH222的氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I；且将第451位S突变L，且保持其他氨基酸残基不变；
KH223的氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I；且将第451位丝氨酸突变苏氨酸，且保持其他氨基酸残基不变；
KH224的氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I；且将第484位D突变半胱氨酸，且保持其他氨基酸残基不变；
KH225的氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I；且将第480位D突变苏氨酸，且保持其他氨基酸残基不变；
KH226的氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I；且将第451位丝氨酸突变甘氨酸，且保持其他氨基酸残基不变；
KH227的氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I；且将第453位L突变A，且保持其他氨基酸残基不变；
KH228的氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为C；且将第484位R突变V，且保持其他氨基酸残基不变；
KH229的氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为C；且将第451位S突变N，且保持其他氨基酸残基不变；
KH230的氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为C；且将第480位D突变N，且保持其他氨基酸残基不变；
KH232的氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为C；且将第484位R突变I，且保持其他氨基酸残基不变；
KH233的氨基酸序列为将序列1的第676位K突变为S；且将第680位M突变I，且保持其他氨基酸残基不变；
KH234的氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为C；且将第486位I突变R，且保持其他氨基酸残基不变；
KH235的氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I；且将第480位D突变S；
KH236的氨基酸序列为将序列1的第493位Y突变为F；且将第497位Y突变L，且保持其他氨基酸残基不变；
KH237的氨基酸序列为将序列1的第676位K突变为L；且将第680 位M突变I，且保持其他氨基酸残基不变；
KH238的氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I；且将第480位D突变Q，且保持其他氨基酸残基不变；
KH239的氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I；且将第480位D突变M，且保持其他氨基酸残基不变；
KH240的氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I；且将第451位S突变K，且保持其他氨基酸残基不变；
KH241的氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I；且将第480位D突变R，且保持其他氨基酸残基不变；
KH242的氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I；且将第453位L突变N，且保持其他氨基酸残基不变；
KH243的氨基酸序列为将序列1的第676位K突变为R；且将第680位M突变I，且保持其他氨基酸残基不变；
KH244的氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I；且将第451位S突变M，且保持其他氨基酸残基不变；
KH245的氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I；且将第477位K突变E，且保持其他氨基酸残基不变；
KH246的氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I；且将第480位D突变W，且保持其他氨基酸残基不变；
KH247的氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I；且将第480位D突变K，且保持其他氨基酸残基不变；
KH248的氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I；且将第451位S突变R，且保持其他氨基酸残基不变；
KH249的氨基酸序列为将序列1的第676位K突变为L；且将第680位M突变L，且保持其他氨基酸残基不变；
KH250的氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I；且将第665位Q突变R，且保持其他氨基酸残基不变；
KH251的氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I；且将第665位Q突变S，且保持其他氨基酸残基不变；
KH252的氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I；且将第480 位D突变E，且保持其他氨基酸残基不变；
KH253的氨基酸序列为将序列1的第676位K突变为H；且将第680位M突变I，且保持其他氨基酸残基不变；
KH254的氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I；且将第461位Q突变A，且保持其他氨基酸残基不变；
KH255的氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I；且将第451位S突变A，且保持其他氨基酸残基不变；
KH256的氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I；且将第451位S突变Q，且保持其他氨基酸残基不变；
KH257的氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I；且将第666位I突变Q，且保持其他氨基酸残基不变；
KH258的氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I；且将第666位I突变T，且保持其他氨基酸残基不变；
KH259的氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I；且将第605位T突变W，且保持其他氨基酸残基不变；
KH260的氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I；且将第379位R突变Y，且保持其他氨基酸残基不变；
KH261的氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I；且将第453位L突变T，且保持其他氨基酸残基不变；
KH262的氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I；且将第480位D突变C，且保持其他氨基酸残基不变；
KH263的氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I；且将第605位T突变V，且保持其他氨基酸残基不变；
KH264的氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I；且将第480位D突变N，且保持其他氨基酸残基不变；
KH266的氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I；且将第480位D突变G，且保持其他氨基酸残基不变；
KH267的氨基酸序列为将序列1的第465位K突变为Q；且将第718位D突变Q，且保持其他氨基酸残基不变；
KH268的氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I；且将第379 位R突变H，且保持其他氨基酸残基不变；
KH269的氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I；且将第465位K突变Q，且保持其他氨基酸残基不变；
KH270的氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I；且将第480位D突变P，且保持其他氨基酸残基不变；
KH271的氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I；且将第480位D突变F，且保持其他氨基酸残基不变；
KH272的氨基酸序列为将序列1的第676位K突变为V；且将第680位M突变L，且保持其他氨基酸残基不变；
KH273的氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I；且将第453位L突变V，且保持其他氨基酸残基不变；
KH274的氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I；且将第480位D突变H，且保持其他氨基酸残基不变；
KH275的氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I；且将第451位S突变P，且保持其他氨基酸残基不变；
KH276的氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I；且将第665位Q突变K，且保持其他氨基酸残基不变；
KH277的氨基酸序列为将序列1的第480位D突变为S；且将第451位S突变Q，且保持其他氨基酸残基不变；
KH278的氨基酸序列为将序列1的第474位I突变为T；且将第478位L突变C，且保持其他氨基酸残基不变；
KH279的氨基酸序列为将序列1的第676位K突变为H；且将第680位M突变T，且保持其他氨基酸残基不变；
KH280的氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I；且将第347位S突变V，且保持其他氨基酸残基不变；
KH281的氨基酸序列为将序列1的第480位D突变为N；且将第453位L突变V，且保持其他氨基酸残基不变；
KH282的氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I；且将第666位I突变A，且保持其他氨基酸残基不变；
KH283的氨基酸序列为将序列1的第676位K突变为V；且将第680 位M突变I，且保持其他氨基酸残基不变；
KH284的氨基酸序列为将序列1的第676位K突变为I；且将第680位M突变L，且保持其他氨基酸残基不变；
KH285的氨基酸序列为将序列1的第676位K突变为M；且将第680位M突变A，且保持其他氨基酸残基不变；
KH286的氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I；且将第470位T突变S，且保持其他氨基酸残基不变；
KH287的氨基酸序列为将序列1的第676位K突变为L；且将第680位M突变A，且保持其他氨基酸残基不变；
KH288的氨基酸序列为将序列1的第379位R突变为K；且将第380位R突变E，且保持其他氨基酸残基不变；
KH201的氨基酸序列为将序列1的第480位D突变为N；且将第680位M突变I，且保持其他氨基酸残基不变；
KH202的氨基酸序列为将序列1的第474位I突变为T；且将第478位L突变N，且保持其他氨基酸残基不变；
KH203的氨基酸序列为将序列1的第474位I突变为T；且将第478位L突变H，且保持其他氨基酸残基不变；
KH204的氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I；且将第484位R突变K，且保持其他氨基酸残基不变；
KH205的氨基酸序列为将序列1的第493位Y突变为H；且将第497位Y突变F，且保持其他氨基酸残基不变；
KH206的氨基酸序列为将序列1的第493位Y突变为F；且将第497位Y突变M，且保持其他氨基酸残基不变；
KH207的氨基酸序列为将序列1的第514位T突变为A；且将第584位K突变T，且保持其他氨基酸残基不变；
KH208的氨基酸序列为将序列1的第474位I突变为T；且将第478位L突变G，且保持其他氨基酸残基不变；
KH209的氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I；且将第665位Q突变C，且保持其他氨基酸残基不变；
KH210的氨基酸序列为将序列1的第465位K突变为Q；且将第584 位K突变T，且保持其他氨基酸残基不变；
KH211的氨基酸序列为将序列1的第676位K突变为M；且将第680位M突变L，且保持其他氨基酸残基不变；
KH212的氨基酸序列为将序列1的第493位Y突变为H；且将第497位Y突变L，且保持其他氨基酸残基不变；
KH213的氨基酸序列为将序列1的第457位L突变为M；且将第461位Q突变A，且保持其他氨基酸残基不变；
KH214的氨基酸序列为将序列1的第676位K突变为S；且将第680位M突变A，且保持其他氨基酸残基不变；
KH125的氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为F；且将第486位I突变K，且保持其他氨基酸残基不变；
KH126的氨基酸序列为将序列1的第480位D突变为N；且将第584位K突变T，且保持其他氨基酸残基不变；
KH217的氨基酸序列为将序列1的第375位K突变为E；且将第378位A突变K，且保持其他氨基酸残基不变；
KH218的氨基酸序列为将序列1的第493位Y突变为F；且将第497位Y突变I，且保持其他氨基酸残基不变；
KH219的氨基酸序列为将序列1的第474位I突变为K；且将第478位L突变H，且保持其他氨基酸残基不变；
KH220的氨基酸序列为将序列1的第353位V突变为D；且将第496位Y突变T，且保持其他氨基酸残基不变；
KH221的氨基酸序列为将序列1的第379位R突变为Q；且将第380位R突变D，且保持其他氨基酸残基不变；
QH349的氨基酸序列为将序列1的第676位K突变为A；且将第680位M突变L，且保持其他氨基酸残基不变；
QH350的氨基酸序列为将序列1的第480位D突变为N；且将第482位R突变K，且保持其他氨基酸残基不变；
QH351的氨基酸序列为将序列1的第451位S突变为Q；且将第453位L突变V，且保持其他氨基酸残基不变；
QH352的氨基酸序列为将序列1的第474位I突变为K；且将第478 位L突变Y，且保持其他氨基酸残基不变；
QH353的氨基酸序列为将序列1的第480位D突变为N；且将第267位T突变D，且保持其他氨基酸残基不变；
QH354的氨基酸序列为将序列1的第676位K突变为L；且将第680位M突变T，且保持其他氨基酸残基不变；
QH355的氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I；且将第454位G突变Q，且保持其他氨基酸残基不变；
QH356的氨基酸序列为将序列1的第676位K突变为V；且将第682位V突变M，且保持其他氨基酸残基不变；
QH357的氨基酸序列为将序列1的第465位K突变为Q；且将第707位S突变G，且保持其他氨基酸残基不变；
QH358的氨基酸序列为将序列1的第676位K突变为I；且将第680位M突变I，且保持其他氨基酸残基不变；
QH359的氨基酸序列为将序列1的第474位I突变为K；且将第478位L突变G，且保持其他氨基酸残基不变；
QH360的氨基酸序列为将序列1的第379位R突变为E；且将第380位R突变S，且保持其他氨基酸残基不变；
QH361的氨基酸序列为将序列1的第375位K突变为I；且将第378位A突变Q，且保持其他氨基酸残基不变；
QH362的氨基酸序列为将序列1的第493位Y突变为H；且将第497位Y突变M，且保持其他氨基酸残基不变；
QH363的氨基酸序列为将序列1的第676位K突变为A；且将第680位M突变I，且保持其他氨基酸残基不变；
QH329的氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I；且将第484位R突变G，且保持其他氨基酸残基不变；
QH364的氨基酸序列为将序列1的第676位K突变为I；且将第680位M突变T，且保持其他氨基酸残基不变；
QH365的氨基酸序列为将序列1的第474位I突变为K；且将第478位L突变V，且保持其他氨基酸残基不变；
QH366的氨基酸序列为将序列1的第379位R突变为K；且将第380 位R突变G，且保持其他氨基酸残基不变；
QH367的氨基酸序列为将序列1的第379位R突变为Q；且将第380位R突变S，且保持其他氨基酸残基不变；
QH368的氨基酸序列为将序列1的第379位R突变为Q；且将第380位R突变N，且保持其他氨基酸残基不变；
QH369的氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I；且将第451位S突变Q，且保持其他氨基酸残基不变；
QH370的氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I；且将第666位I突变Q，且保持其他氨基酸残基不变；
QH371的氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I；且将第666位I突变R，且保持其他氨基酸残基不变。
KOD型DNA聚合酶GH78基础上进行三个位置突变为三点组合突变体，三点组合突变体具体突变位置及方式如下：
QH303的氨基酸序列为将序列1的第676位K突变为L；且将第680位M突变T；且将第689位V突变I，且保持其他氨基酸残基不变；
QH304的氨基酸序列为将序列1的第457位L突变为M；且将第461位Q突变A；且将第267位T突变D，且保持其他氨基酸残基不变；
QH305的氨基酸序列为将序列1的第465位K突变为Q；且将第584位K突变T；且将第485位E突变I，且保持其他氨基酸残基不变；
QH306的氨基酸序列为将序列1的第465位K突变为Q；且将第718位D突变Q；且将第485位E突变I，且保持其他氨基酸残基不变；
QH307的氨基酸序列为将序列1的第457位L突变为M；且将第461位Q突变A；且将第485位E突变I，且保持其他氨基酸残基不变；
QH308的氨基酸序列为将序列1的第676位K突变为S；且将第680位M突变I；且将第485位E突变I，且保持其他氨基酸残基不变；
QH309的氨基酸序列为将序列1的第493位Y突变为F；且将第497位Y突变L；且将第485位E突变I，且保持其他氨基酸残基不变；
QH310的氨基酸序列为将序列1的第480位D突变为N；且将第451位S突变Q；且将第718位D突变Q，且保持其他氨基酸残基不变；
QH311的氨基酸序列为将序列1的第480位D突变为N；且将第674 位K突变M；且将第680位M突变I，且保持其他氨基酸残基不变；
QH312的氨基酸序列为将序列1的第480位D突变为N；且将第451位S突变Q；且将第485位E突变I，且保持其他氨基酸残基不变；
QH313的氨基酸序列为将序列1的第480位D突变为N；且将第465位K突变Q；且将第718位D突变Q，且保持其他氨基酸残基不变；
QH314的氨基酸序列为将序列1的第480位D突变为N；且将第451位S突变Q；且将第461位Q突变A，且保持其他氨基酸残基不变；
QH315的氨基酸序列为将序列1的第465位K突变为Q；且将第718位D突变Q；且将第457位L突变M；且将第461位Q突变A，且保持其他氨基酸残基不变；
KOD型DNA聚合酶GH78基础上进行4个位置突变为4点组合突变体，4点组合突变体具体突变位置及方式如下：
QH316的氨基酸序列为将序列1的第465位K突变为Q；且将第718位D突变Q；且将第480位D突变N；且将第485位E突变I，且保持其他氨基酸残基不变；
KOD型DNA聚合酶GH78基础上进行3个位置突变为3点组合突变体，3点组合突变体具体突变位置及方式如下：
QH317的氨基酸序列为将序列1的第480位D突变为N；且将第451位S突变Q；且将第379位R突变Y，且保持其他氨基酸残基不变；
QH318的氨基酸序列为将序列1的第457位L突变为M；且将第461位Q突变A；且将第465位K突变Q，且保持其他氨基酸残基不变；
QH319的氨基酸序列为将序列1的第480位D突变为N；且将第674位K突变Q；且将第680位M突变I，且保持其他氨基酸残基不变；
QH320的氨基酸序列为将序列1的第480位D突变为N；且将第674位K突变R；且将第680位M突变I，且保持其他氨基酸残基不变；
QH321的氨基酸序列为将序列1的第480位D突变为N；且将第451位S突变Q；且将第465位K突变Q，且保持其他氨基酸残基不变；
QH322的氨基酸序列为将序列1的第680位M突变为I；且将第676位K突变H；且将第485位E突变I，且保持其他氨基酸残基不变；
QH323的氨基酸序列为将序列1的第465位K突变为Q；且将第718 位D突变Q；且将第267位T突变D，且保持其他氨基酸残基不变；
QH324的氨基酸序列为将序列1的第451位S突变为Q；且将第452位L突变V；且将第453位L突变V，且保持其他氨基酸残基不变；
QH325的氨基酸序列为将序列1的第451位S突变为Q；且将第674位K突变M；且将第676位K突变T，且保持其他氨基酸残基不变；
QH326的氨基酸序列为将序列1的第465位K突变为Q；且将第718位D突变Q；且将第379位R突变Y，且保持其他氨基酸残基不变；
QH326的氨基酸序列为将序列1的第465位K突变为Q；且将第718位D突变Q；且将第453位L突变V，且保持其他氨基酸残基不变；
QH328的氨基酸序列为将序列1的第480位D突变为N；且将第674位K突变I；且将第680位M突变I，且保持其他氨基酸残基不变；
QH331的氨基酸序列为将序列1的第465位K突变为Q；且将第584位K突变T；且将第453位L突变V，且保持其他氨基酸残基不变；
QH332的氨基酸序列为将序列1的第465位K突变为Q；且将第718位D突变Q；且将第707位S突变G，且保持其他氨基酸残基不变；
QH333的氨基酸序列为将序列1的第465位K突变为Q；且将第584位K突变T；且将第379位R突变Y，且保持其他氨基酸残基不变；
QH334的氨基酸序列为将序列1的第451位S突变为Q；且将第482位R突变K；且将第676位K突变T，且保持其他氨基酸残基不变；
QH335的氨基酸序列为将序列1的第465位K突变为Q；且将第584位K突变T；且将第267位T突变D，且保持其他氨基酸残基不变；
QH336的氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I；且将第676位K突变L；且将第680位M突变L，且保持其他氨基酸残基不变；
KOD型DNA聚合酶GH78基础上进行四个位置突变为四点组合突变体，四点组合突变体具体突变位置及方式如下：
QH338的氨基酸序列为将序列1的第480位D突变为N；且将第667位T突变R；且将第674位K突变Q；且将第680位M突变I，且保持其他氨基酸残基不变；
QH339的氨基酸序列为将序列1的第480位D突变为N；且将第667位T突变N；且将第674位K突变M；且将第680位M突变I，且保持其他 氨基酸残基不变；
QH340的氨基酸序列为将序列1的第480位D突变为N；且将第667位T突变S；且将第674位K突变M；且将第680位M突变I，且保持其他氨基酸残基不变；
QH341的氨基酸序列为将序列1的第451位S突变为Q；且将第480位D突变N；且将第674位K突变Q；且将第680位M突变I，且保持其他氨基酸残基不变；
QH342的氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I；且将第676位K突变L；且将第680位M突变T；且将第698位V突变I，且保持其他氨基酸残基不变；
QH343的氨基酸序列为将序列1的第480位D突变为N；且将第667位T突变N；且将第674位K突变Q；且将第680位M突变I，且保持其他氨基酸残基不变；
QH344的氨基酸序列为将序列1的第676位K突变为S；且将第680位M突变I；且将第493位Y突变F；且将第497位Y突变L，且保持其他氨基酸残基不变；
QH345的氨基酸序列为将序列1的第451位S突变为Q；且将第482位R突变K；且将第674位K突变Q；且将第680位M突变L，且保持其他氨基酸残基不变。
KOD型DNA聚合酶GH78基础上进行五个位置突变为五点组合突变体，五点组合突变体具体突变位置及方式如下：
QH346的氨基酸序列为将序列1的第451位S突变为Q；且将第482位R突变K；且将第674位K突变M；且将第680位M突变L；且将第479位L突变M，且保持其他氨基酸残基不变；
QH347的氨基酸序列为将序列1的第451位S突变为Q；且将第453位L突变I；且将第480位D突变N；且将第674位K突变Q；且将第680位M突变I，且保持其他氨基酸残基不变。
KOD型DNA聚合酶GH78基础上进行六个位置突变为六点组合突变体， 六点组合突变体具体突变位置及方式如下：
QH348的氨基酸序列为将序列1的第451位S突变为Q；且将第482位R突变K；且将第674位K突变Q；且将第680位M突变L；且将第452位L突变V；且将第480位D突变N，且保持其他氨基酸残基不变。
可以将KOD型DNA聚合酶GH78用定点突变的方式获得KOD DNA聚合酶突变体，也可以用别的现有方法获得。
1、表达KOD型DNA聚合酶突变体的重组载体的制备
表达不同KOD型DNA聚合酶突变体的重组载体为将融合His标签的的不同KOD型DNA聚合酶突变体蛋白编码基因按Electra
TM Cloning Reagents Kit(DNA2.0,EKT-02)试剂盒说明书操作步骤重组到载体pD441-pelB上，得到的载体，融合His标签的不同点突变体蛋白编码基因，通过载体pD441-pelB上的信号肽引导表达。
每个KOD型DNA聚合酶突变体融合蛋白的氨基酸序列为将KOD型DNA聚合酶突变体氨基酸序列的N端连接6个His标签得到的序列。
融合His标签的不同KOD型DNA聚合酶突变体蛋白编码基因的核苷酸序列为将不同KOD型DNA聚合酶突变体蛋白编码基因的3'端连接6个His标签密码子得到的序列。
2、重组菌的构建
与上述一中的2方法相同，将上述1制备的表达不同KOD型DNA聚合酶突变体重组载体导入BL21中，得到表达不同KOD型DNA聚合酶突变体融合蛋白的重组菌。
3、突变体的表达和纯化
与上述一野生型KOD型DNA聚合酶融合蛋白表达和纯化方法相同，将上述2制备的表达不同KOD型DNA聚合酶突变体融合蛋白的重组菌进行表达纯化，得到不同的KOD型DNA聚合酶突变体融合蛋白。
将不同的KOD型DNA聚合酶突变体融合蛋白进行SDS-PAGE(浓缩胶为5％分离胶为12％)检测，得到目的蛋白。对电泳后的蛋白胶图对于用Quantity one软件分析蛋白纯度，不同的KOD型DNA聚合酶突变体融合蛋白纯度均得到能达到95％或以上。
实施例2、重组型KOD DNA聚合酶突变体融合蛋白的性能检测
重组型KOD DNA聚合酶突变体融合蛋白的对修饰单碱基掺入的聚合活性检测，聚合酶活性检测参照Nishioka,M.,et al.(2001.J.Biotechnol.88)文献方法进行，一个酶活单位定义为:单位酶在50μl的反应体系中于75°反应30min聚合10nmol dNTP生成酸不溶性物质的量。
本实施例利用Cy3荧光染料标记(5'末端标记)的dATP(modified)和Cy5荧光染料标记(5'末端标记)的DNA链(DNA-Cy5)，该DNA链是由序列5所示的单链DNA分子和序列6所示的单链DNA分子退火得到(序列5和6是部分反向互补的，25个bp是互补的)；模拟SBS测序过程中掺入修饰核苷酸，利用酶标仪来检测重组型KOD DNA聚合酶突变体的相对反应速率，近似描绘各突变体的米氏动力学曲线，计算Kcat/Km,具体实验方法如下：
反应Buffer：20mMTris-HCl、10mM(NH4)2SO4、10mMKCl、2mM MgSO4，余量为水，pH 8.5。
反应体系为：1μg KOD聚合酶突变体融合蛋白,2μM dATP(modified)，不同浓度的(0.2μM至4μM)DNA-Cy5和反应Buffer进行混合。
反应温度：40℃
反应时间：1h。
反应完成后可直接导出数据表格和酶活性曲线，可近似计算其相对荧光值的反应速率，再根据米氏方程再进行拟合动力学曲线，计算Vmax和Km。
以KOD DNA聚合酶融合蛋白GH78为对照。
KOD DNA聚合酶突变体融合蛋白的动力学参数如下表2所示，可以看出KOD DNA聚合酶突变体突变体相对GH78具有较高的聚合活性。突变体相对GH78有较大的潜力。而在测序过程中，酶反应的催化效率越快，Kcat/km的值就越大，从而可以在一定程度上加快反应完成，缩短测序反应时间。从实验结果中，可以看出，在酶催化效率方面，KOD DNA聚合酶突变体KH222、KH223和KH224聚合酶都有更显著的提升。
表2 KOD DNA聚合酶突变体的动力学测试结果
Relative Kcat/km:Compare to GH78(突变体的Kcat/km值比GH78的Kcat/km值)Kcat/km二者的比值越大，说明酶转化底物的速率越快。
工业应用
本发明的实验证明，本发明针对进一步延长测序读长，缩短反应时间等改进目标，在此前工作的基础上对KOD DNA聚合酶进行了更加深入的改造,对DNA聚合酶B family在此区域涉及到的原有功能位点进行了保护，确保其仍然能够完成原有的基本功能，提高在测序中DNA聚合酶的反应速率，增加反应读长。重组性的DNA聚合酶相比KOD DNA聚合酶GH78在催化方面，展示了较强的反应速率，更好的催化效率，更好的亲和力等优点，提高在测序中DNA聚合酶的反应速率，增加反应读长。
Claims (11)
- 一种蛋白,为如下A所示的蛋白或其衍生物：A)所示的蛋白为将KOD DNA聚合酶GH78氨基酸序列中第267、326、347、349、353、375、378、379、380、385、451、452、453、454、457、461、465、470、474、477、478、479、480、482、484、485、486、493、496、497、514、574、584、605、610、630、665、666、667、674、676、680、682、698、707、718、723和729这48位中至少一位的氨基酸残基进行修饰，其他氨基酸序列不变，得到具有DNA聚合酶活性的蛋白；所述KOD DNA聚合酶GH78的氨基酸序列为序列表中序列1；所述A)所示的蛋白的衍生物为将A)所示蛋白的氨基酸序列末端添加标签序列且具有DNA聚合酶活性的由A)衍生的蛋白质。
- 根据权利要求1所述的蛋白，其特征在于：所述A)所示的蛋白为将KOD DNA聚合酶GH78氨基酸序列中267、326、347、349、353、375、378、379、380、385、451、452、453、454、457、461、465、470、474、477、478、479、480、482、484、485、486、493、496、497、514、574、584、605、610、630、665、666、667、674、676、680、682、698、707、718、723和729这48位中至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个、至少27个、至少28个、至少29个、至少30个、至少31个、至少32个、至少33个、至少34个、至少35个、至少36个、至少37个、至少38个、至少39个、至少40个、至少41个、至少42个、至少43个、至少44个、至少45个、至少46个、至少47个或全部48个氨基酸残基进行修饰，得到具有DNA聚合酶活性的蛋白。
- 根据权利要求1或2所述的蛋白，其特征在于：所述修饰为氨基酸置换。
- 根据权利要求1-3中任一所述的蛋白，其特征在于：所述各个氨基酸置换的方式如下：第267位的T置换为D；第326位的F置换为L；第347位的S置换为D或V；第349位的T置换为G；第353位的V置换为D；第375位的K胺置换为I、A或E；第378位的A置换为E、Q或K；第379位的R置换为K、Q、E、H或Y；第380位的R置换为E、D、S、G、N或Y；第385位的E置换为F或R；第451位的S置换为N、T、G、H、M、L、P、R、A、Q或K；第452位的L置换为V；第453位的L置换为A、T、V或I；第454位的G置换为Q；第457位的L置换为M；第461位的Q置换为A或S；第465位的K置换为Q；第470位的T置换S；第474位的L置换为K、V、A或T；第477位的K置换为E；第478位L突变为I、V、Y、M、C、N、H或G；第479位的L突变为M；第480位的D突变为S、R、T、N、G、F、H或E；第482位的R突变为K；第484位的R突变为C、D、I、V、K或G；第485位的E突变为I、C或F；第486位的I突变为K或R；第493位的Y突变为F、H或L；第496位的Y突变为T或M；第497位的Y突变为L、F、M、I或W；第514位的T突变为A；第574位的A突变为L；第584位的K突变为T；第605位的T突变为W或V；第610位的I突变为L或M；第630位的L突变为F；第665位的谷氨酸突变为R、S、K或C；第666位的天冬酰胺突变为A、N、Q、T或K；第667位的T突变为R、N或S；第674位的K突变为Q、M、I、E或R；第676位的K突变为S、L、R、H、V、I、M、A或T；第680位的M突变为I、L、T或A；第682位的V突变为M；第698位的V突变为I；第707位的S突变为G、T或K；第718位的D突变为Q；第723位的T突变为V、C、G、I或F；第729位的A突变为T。
- 根据权利要求1-4中任一所述的蛋白，其特征在于：所述蛋白为如下任一种KOD DNA聚合酶突变体：所述KOD DNA聚合酶突变体的名称及其突变位置如下：GH101其氨基酸序列为将序列1的第480的D突变为N，且其他氨基酸残基保持不变；GH102其氨基酸序列为将序列1的第676的K突变为H，且其他氨基酸残基保持不变；GH103其氨基酸序列为将序列1的第485的E突变为I，且其他氨基酸残基保持不变；GH104其氨基酸序列为将序列1的第497的Y突变为L，且其他氨基酸残基保持不变；GH105其氨基酸序列为将序列1的第451的S突变为Q，且其他氨基酸残基保持不变；GH106其氨基酸序列为将序列1的第482的R突变为K，且其他氨基酸残基保持不变；GH107其氨基酸序列为将序列1的第453的L突变为V，且其他氨基酸残基保持不变；GH108其氨基酸序列为将序列1的第474的I突变为T，且其他氨基酸残基保持不变；GH109其氨基酸序列为将序列1的第267的T突变为D，且其他氨基酸残基保持不变；GH110其氨基酸序列为将序列1的第723的T突变为V，且其他氨基酸残基保持不变；GH111其氨基酸序列为将序列1的第379的R突变为Y，且其他氨基酸残基保持不变；GH112其氨基酸序列为将序列1的第453的L突变为I，且其他氨基酸残基保持不变；GH113其氨基酸序列为将序列1的第474的I突变为K，且其他氨基酸残基保持不变；GH114其氨基酸序列为将序列1的第353的V突变为D，且其他氨基酸残基保持不变；GH115其氨基酸序列为将序列1的第347的S突变为D，且其他氨基酸残基保持不变；GH116其氨基酸序列为将序列1的第465的K突变为Q，且其他氨基酸残基保持不变；GH117其氨基酸序列为将序列1的第380的R突变为D，且其他氨基酸残基保持不变；GH118其氨基酸序列为将序列1的第461的Q突变为A，且其他氨基酸残基保持不变；GH119其氨基酸序列为将序列1的第610的I突变为L，且其他氨基酸残基保持不变；GH120其氨基酸序列为将序列1的第723的T突变为G，且其他氨基酸残基保持不变；GH121其氨基酸序列为将序列1的第496的Y突变为M，且其他氨基酸残基保持不变；GH122其氨基酸序列为将序列1的第375的K突变为A，且其他氨基酸残基保持不变；GH123其氨基酸序列为将序列1的第497的Y突变为I，且其他氨基酸残基保持不变；GH124其氨基酸序列为将序列1的第474的I突变为A，且其他氨基酸残基保持不变；GH125其氨基酸序列为将序列1的第707的S突变为G，且其他氨基酸残基保持不变；GH126其氨基酸序列为将序列1的第379的R突变为E，且其他氨基酸残基保持不变；GH127其氨基酸序列为将序列1的第723的T突变为I，且其他氨基酸残基保持不变；GH128其氨基酸序列为将序列1的第461的Q突变为S，且其他氨基酸残基保持不变；GH129其氨基酸序列为将序列1的第718的D突变为Q，且其他氨基酸残基保持不变；GH131其氨基酸序列为将序列1的第452的L突变为V，且其他氨基酸残基保持不变；GH132其氨基酸序列为将序列1的第380的R突变为Y，且其他氨基酸残基保持不变；GH133其氨基酸序列为将序列1的第478的L突变为V，且其他氨基酸残基保持不变；GH134其氨基酸序列为将序列1的第478的L突变为Y，且其他氨基酸残基保持不变；GH135其氨基酸序列为将序列1的第385的E突变为R，且其他氨基酸残基保持不变；GH136其氨基酸序列为将序列1的第474的I突变为V，且其他氨基酸残基保持不变；GH137其氨基酸序列为将序列1的第479的L突变为M，且其他氨基酸残基保持不变；GH138其氨基酸序列为将序列1的第680的M突变为L，且其他氨基酸残基保持不变；GH139其氨基酸序列为将序列1的第478的L突变为I，且其他氨基酸残基保持不变；GH140其氨基酸序列为将序列1的第723的T突变为C，且其他氨基酸残基保持不变；GH141其氨基酸序列为将序列1的第478的L突变为M，且其他氨基酸残基保持不变；GH142其氨基酸序列为将序列1的第729的A突变为T，且其他氨基酸残基保持不变；GH143其氨基酸序列为将序列1的第610的I突变为M，且其他氨基酸残基保持不变；GH144其氨基酸序列为将序列1的第353的V突变为D，且其他氨基酸残基保持不变；GH145其氨基酸序列为将序列1的第676的K突变为S，且其他氨基酸残基保持不变；GH146其氨基酸序列为将序列1的第326的F突变为L，且其他氨基酸残基保持不变；GH147其氨基酸序列为将序列1的第574的A突变为L，且其他氨基酸残基保持不变；GH148其氨基酸序列为将序列1的第630的L突变为F，且其他氨基酸残基保持不变；GH149其氨基酸序列为将序列1的第349的T突变为G，且其他氨基酸残基保持不变；KH222其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第451位S突变L，且其他氨基酸残基保持不变；KH223其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第451位丝氨酸突变苏氨酸，且其他氨基酸残基保持不变；KH224其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第484位D突变半胱氨酸，且其他氨基酸残基保持不变；KH225其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第480位D突变苏氨酸，且其他氨基酸残基保持不变；KH226其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第451位丝氨酸突变甘氨酸，且其他氨基酸残基保持不变；KH227其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第453位L突变A，且其他氨基酸残基保持不变；KH228其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为C，且将第484位R突变V，且其他氨基酸残基保持不变；KH229其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为C，且将第451位S突变N，且其他氨基酸残基保持不变；KH230其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为C，且将第480位D突变N，且其他氨基酸残基保持不变；KH232其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为C，且将第484位R突变I，且其他氨基酸残基保持不变；KH233其氨基酸序列为将序列1的第676位K突变为S，且将第680位M突变I，且其他氨基酸残基保持不变；KH234其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为C，且将第486位I突变R，且其他氨基酸残基保持不变；KH235其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第480位D突变S，且其他氨基酸残基保持不变；KH236其氨基酸序列为将序列1的第493位Y突变为F，且将第497位Y突变L，且其他氨基酸残基保持不变；KH237其氨基酸序列为将序列1的第676位K突变为L，且将第680位M突变I，且其他氨基酸残基保持不变；KH238其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第480位D突变Q，且其他氨基酸残基保持不变；KH239其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第480位D突变M，且其他氨基酸残基保持不变；KH240其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第451位S突变K，且其他氨基酸残基保持不变；KH241其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第480位D突变R，且其他氨基酸残基保持不变；KH242其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第453位L突变N，且其他氨基酸残基保持不变；KH243其氨基酸序列为将序列1的第676位K突变为R，且将第680位M突变I，且其他氨基酸残基保持不变；KH244其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第451位S突变M，且其他氨基酸残基保持不变；KH245其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第477位K突变E，且其他氨基酸残基保持不变；KH246其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第480位D突变W，且其他氨基酸残基保持不变；KH247其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第480位D突变K，且其他氨基酸残基保持不变；KH248其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第451位S突变R，且其他氨基酸残基保持不变；KH249其氨基酸序列为将序列1的第676位K突变为L，且将第680位M突变L，且其他氨基酸残基保持不变；KH250其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第665位Q突变R，且其他氨基酸残基保持不变；KH251其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第665位Q突变S，且其他氨基酸残基保持不变；KH252其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第480位D突变E，且其他氨基酸残基保持不变；KH253其氨基酸序列为将序列1的第676位K突变为H，且将第680位M突变I，且其他氨基酸残基保持不变；KH254其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第461位Q突变A，且其他氨基酸残基保持不变；KH255其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第451位S突变A，且其他氨基酸残基保持不变；KH256其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第451位S突变Q，且其他氨基酸残基保持不变；KH257其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第666位I突变Q，且其他氨基酸残基保持不变；KH258其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第666位I突变T，且其他氨基酸残基保持不变；KH259其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第605位T突变W，且其他氨基酸残基保持不变；KH260其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第379位R突变Y，且其他氨基酸残基保持不变；KH261其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第453位L突变T，且其他氨基酸残基保持不变；KH262其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第480位D突变C，且其他氨基酸残基保持不变；KH263其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第605位T突变V，且其他氨基酸残基保持不变；KH264其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第480位D突变N，且其他氨基酸残基保持不变；KH266其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第480位D突变G，且其他氨基酸残基保持不变；KH267其氨基酸序列为将序列1的第465位K突变为Q，且将第718位D突变Q，且其他氨基酸残基保持不变；KH268其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第379位R突变H，且其他氨基酸残基保持不变；KH269其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第465位K突变Q，且其他氨基酸残基保持不变；KH270其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第480位D突变P，且其他氨基酸残基保持不变；KH271其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第480位D突变F，且其他氨基酸残基保持不变；KH272其氨基酸序列为将序列1的第676位K突变为V，且将第680位M突变L，且其他氨基酸残基保持不变；KH273其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第453位L突变V，且其他氨基酸残基保持不变；KH274其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第480位D突变H，且其他氨基酸残基保持不变；KH275其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第451位S突变P，且其他氨基酸残基保持不变；KH276其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第665位Q突变K，且其他氨基酸残基保持不变；KH277其氨基酸序列为将序列1的第480位D突变为S，且将第451位S突变Q，且其他氨基酸残基保持不变；KH278其氨基酸序列为将序列1的第474位I突变为T，且将第478位L突变C，且其他氨基酸残基保持不变；KH279其氨基酸序列为将序列1的第676位K突变为H，且将第680位M突变T，且其他氨基酸残基保持不变；KH280其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第347位S突变V，且其他氨基酸残基保持不变；KH281其氨基酸序列为将序列1的第480位D突变为N，且将第453位L突变V，且其他氨基酸残基保持不变；KH282其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第666位I突变A，且其他氨基酸残基保持不变；KH283其氨基酸序列为将序列1的第676位K突变为V，且将第680位M突变I，且其他氨基酸残基保持不变；KH284其氨基酸序列为将序列1的第676位K突变为I，且将第680位M突变L，且其他氨基酸残基保持不变；KH285其氨基酸序列为将序列1的第676位K突变为M，且将第680位M突变A，且其他氨基酸残基保持不变；KH286其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第470位T突变S，且其他氨基酸残基保持不变；KH287其氨基酸序列为将序列1的第676位K突变为L，且将第680位M突变A，且其他氨基酸残基保持不变；KH288其氨基酸序列为将序列1的第379位R突变为K，且将第380位R突变E，且其他氨基酸残基保持不变；KH201其氨基酸序列为将序列1的第480位D突变为N，且将第680位M突变I，且其他氨基酸残基保持不变；KH202其氨基酸序列为将序列1的第474位I突变为T，且将第478位L突变N，且其他氨基酸残基保持不变；KH203其氨基酸序列为将序列1的第474位I突变为T，且将第478位L突变H，且其他氨基酸残基保持不变；KH204其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第484位R突变K，且其他氨基酸残基保持不变；KH205其氨基酸序列为将序列1的第493位Y突变为H，且将第497位Y突变F，且其他氨基酸残基保持不变；KH206其氨基酸序列为将序列1的第493位Y突变为F，且将第497位Y突变M，且其他氨基酸残基保持不变；KH207其氨基酸序列为将序列1的第514位T突变为A，且将第584位K突变T，且其他氨基酸残基保持不变；KH208其氨基酸序列为将序列1的第474位I突变为T，且将第478位L突变G，且其他氨基酸残基保持不变；KH209其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第665位Q突变C，且其他氨基酸残基保持不变；KH210其氨基酸序列为将序列1的第465位K突变为Q，且将第584位K突变T，且其他氨基酸残基保持不变；KH211其氨基酸序列为将序列1的第676位K突变为M，且将第680位M突变L，且其他氨基酸残基保持不变；KH212其氨基酸序列为将序列1的第493位Y突变为H，且将第497位Y突变L，且其他氨基酸残基保持不变；KH213其氨基酸序列为将序列1的第457位L突变为M，且将第461位Q突变A，且其他氨基酸残基保持不变；KH214其氨基酸序列为将序列1的第676位K突变为S，且将第680位M突变A，且其他氨基酸残基保持不变；KH125其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为F，且将第486位I突变K，且其他氨基酸残基保持不变；KH126其氨基酸序列为将序列1的第480位D突变为N，且将第584位K突变T，且其他氨基酸残基保持不变；KH217其氨基酸序列为将序列1的第375位K突变为E，且将第378位A突变K，且其他氨基酸残基保持不变；KH218其氨基酸序列为将序列1的第493位Y突变为F，且将第497位Y突变I，且其他氨基酸残基保持不变；KH219其氨基酸序列为将序列1的第474位I突变为K，且将第478位L突变H，且其他氨基酸残基保持不变；KH220其氨基酸序列为将序列1的第353位V突变为D，且将第496位Y突变T，且其他氨基酸残基保持不变；KH221其氨基酸序列为将序列1的第379位R突变为Q，且将第380位R突变D，且其他氨基酸残基保持不变；QH349其氨基酸序列为将序列1的第676位K突变为A，且将第680位M突变L，且其他氨基酸残基保持不变；QH350其氨基酸序列为将序列1的第480位D突变为N，且将第482位R突变K，且其他氨基酸残基保持不变；QH351其氨基酸序列为将序列1的第451位S突变为Q，且将第453位L突变V，且其他氨基酸残基保持不变；QH352其氨基酸序列为将序列1的第474位I突变为K，且将第478位L突变Y，且其他氨基酸残基保持不变；QH353其氨基酸序列为将序列1的第480位D突变为N，且将第267位T突变D，且其他氨基酸残基保持不变；QH354其氨基酸序列为将序列1的第676位K突变为L，且将第680位M突变T，且其他氨基酸残基保持不变；QH355其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第454位G突变Q，且其他氨基酸残基保持不变；QH356其氨基酸序列为将序列1的第676位K突变为V，且将第682位V突变M，且其他氨基酸残基保持不变；QH357其氨基酸序列为将序列1的第465位K突变为Q，且将第707位S突变G，且其他氨基酸残基保持不变；QH358其氨基酸序列为将序列1的第676位K突变为I，且将第680位M突变I，且其他氨基酸残基保持不变；QH359其氨基酸序列为将序列1的第474位I突变为K，且将第478位L突变G，且其他氨基酸残基保持不变；QH360其氨基酸序列为将序列1的第379位R突变为E，且将第380位R突变S，且其他氨基酸残基保持不变；QH361其氨基酸序列为将序列1的第375位K突变为I，且将第378位A突变Q，且其他氨基酸残基保持不变；QH362其氨基酸序列为将序列1的第493位Y突变为H，且将第497位Y突变M，且其他氨基酸残基保持不变；QH363其氨基酸序列为将序列1的第676位K突变为A，且将第680位M突变I，且其他氨基酸残基保持不变；QH329其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第484位R突变G，且其他氨基酸残基保持不变；QH364其氨基酸序列为将序列1的第676位K突变为I，且将第680位M突变T，且其他氨基酸残基保持不变；QH365其氨基酸序列为将序列1的第474位I突变为K，且将第478位L突变V，且其他氨基酸残基保持不变；QH366其氨基酸序列为将序列1的第379位R突变为K，且将第380位R突变G，且其他氨基酸残基保持不变；QH367其氨基酸序列为将序列1的第379位R突变为Q，且将第380位R突变S，且其他氨基酸残基保持不变；QH368其氨基酸序列为将序列1的第379位R突变为Q，且将第380位R突变N，且其他氨基酸残基保持不变；QH369其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第451位S突变Q，且其他氨基酸残基保持不变；QH370其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第666位I突变Q，且其他氨基酸残基保持不变；QH371其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I，且将第666位I突变R，且其他氨基酸残基保持不变；QH303其氨基酸序列为将序列1的第676位K突变为L；且将第680位M突变T；且将第689位V突变I，且其他氨基酸残基保持不变；QH304其氨基酸序列为将序列1的第457位L突变为M；且将第461位Q突变A；且将第267位T突变D，且其他氨基酸残基保持不变；QH305其氨基酸序列为将序列1的第465位K突变为Q；且将第584位K突变T；且将第485位E突变I，且其他氨基酸残基保持不变；QH306其氨基酸序列为将序列1的第465位K突变为Q；且将第718位D突变Q；且将第485位E突变I，且其他氨基酸残基保持不变；QH307其氨基酸序列为将序列1的第457位L突变为M；且将第461位Q突变A；且将第485位E突变I，且其他氨基酸残基保持不变；QH308其氨基酸序列为将序列1的第676位K突变为S；且将第680位M突变I；且将第485位E突变I，且其他氨基酸残基保持不变；QH309其氨基酸序列为将序列1的第493位Y突变为F；且将第497位Y突变L；且将第485位E突变I，且其他氨基酸残基保持不变；QH310其氨基酸序列为将序列1的第480位D突变为N；且将第451位S突变Q；且将第718位D突变Q，且其他氨基酸残基保持不变；QH311其氨基酸序列为将序列1的第480位D突变为N；且将第674位K突变M；且将第680位M突变I，且其他氨基酸残基保持不变；QH312其氨基酸序列为将序列1的第480位D突变为N；且将第451位S突变Q；且将第485位E突变I，且其他氨基酸残基保持不变；QH313其氨基酸序列为将序列1的第480位D突变为N；且将第465位K突变Q；且将第718位D突变Q，且其他氨基酸残基保持不变；QH314其氨基酸序列为将序列1的第480位D突变为N；且将第451位S突变Q；且将第461位Q突变A，且其他氨基酸残基保持不变；QH315其氨基酸序列为将序列1的第465位K突变为Q；且将第718位D突变Q；且将第457位L突变M；且将第461位Q突变A，且其他氨基酸残基保持不变；QH316其氨基酸序列为将序列1的第465位K突变为Q；且将第718位D突变Q；且将第480位D突变N；且将第485位E突变I，且其他氨基酸残基保持不变；QH317其氨基酸序列为将序列1的第480位D突变为N；且将第451位S突变Q；且将第379位R突变Y，且其他氨基酸残基保持不变；QH318其氨基酸序列为将序列1的第457位L突变为M；且将第461位Q突变A；且将第465位K突变Q，且其他氨基酸残基保持不变；QH319其氨基酸序列为将序列1的第480位D突变为N；且将第674位K突变Q；且将第680位M突变I，且其他氨基酸残基保持不变；QH320其氨基酸序列为将序列1的第480位D突变为N；且将第674位K突变R；且将第680位M突变I，且其他氨基酸残基保持不变；QH321其氨基酸序列为将序列1的第480位D突变为N；且将第451位S突变Q；且将第465位K突变Q，且其他氨基酸残基保持不变；QH322其氨基酸序列为将序列1的第680位M突变为I；且将第676位K突变H；且将第485位E突变I，且其他氨基酸残基保持不变；QH323其氨基酸序列为将序列1的第465位K突变为Q；且将第718位D突变Q；且将第267位T突变D，且其他氨基酸残基保持不变；QH324其氨基酸序列为将序列1的第451位S突变为Q；且将第452位L突变V；且将第453位L突变V，且其他氨基酸残基保持不变；QH325其氨基酸序列为将序列1的第451位S突变为Q；且将第674位K突变M；且将第676位K突变T，且其他氨基酸残基保持不变；QH326其氨基酸序列为将序列1的第465位K突变为Q；且将第718位D突变Q；且将第379位R突变Y，且其他氨基酸残基保持不变；QH326其氨基酸序列为将序列1的第465位K突变为Q；且将第718位D突变Q；且将第453位L突变V，且其他氨基酸残基保持不变；QH328其氨基酸序列为将序列1的第480位D突变为N；且将第674位K突变I；且将第680位M突变I，且其他氨基酸残基保持不变；QH331其氨基酸序列为将序列1的第465位K突变为Q；且将第584位K突变T；且将第453位L突变V，且其他氨基酸残基保持不变；QH332其氨基酸序列为将序列1的第465位K突变为Q；且将第718位D突变Q；且将第707位S突变G，且其他氨基酸残基保持不变；QH333其氨基酸序列为将序列1的第465位K突变为Q；且将第584位K突变T；且将第379位R突变Y，且其他氨基酸残基保持不变；QH334其氨基酸序列为将序列1的第451位S突变为Q；且将第482位R突变K；且将第676位K突变T，且其他氨基酸残基保持不变；QH335其氨基酸序列为将序列1的第465位K突变为Q；且将第584位K突变T；且将第267位T突变D，且其他氨基酸残基保持不变；QH336其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I；且将第676位K突变L；且将第680位M突变L，且其他氨基酸残基保持不变；QH338其氨基酸序列为将序列1的第480位D突变为N；且将第667位T突变R；且将第674位K突变Q；且将第680位M突变I，且其他氨基酸残基保持不变；QH339其氨基酸序列为将序列1的第480位D突变为N；且将第667位T突变N；且将第674位K突变M；且将第680位M突变I，且其他氨基酸残基保持不变；QH340其氨基酸序列为将序列1的第480位D突变为N；且将第667位T突变S；且将第674位K突变M；且将第680位M突变I，且其他氨基酸残基保持不变；QH341其氨基酸序列为将序列1的第451位S突变为Q；且将第480位D突变N；且将第674位K突变Q；且将第680位M突变I，且其他氨基酸残基保持不变；QH342其氨基酸序列为将序列1的第485位E突变为I；且将第676位K突变L；且将第680位M突变T；且将第698位V突变I，且其他氨基酸残基保持不变；QH343其氨基酸序列为将序列1的第480位D突变为N；且将第667位T突变N；且将第674位K突变Q；且将第680位M突变I，且其他氨基酸残基保持不变；QH344其氨基酸序列为将序列1的第676位K突变为S；且将第680位M突变I；且将第493位Y突变F；且将第497位Y突变L，且其他氨基酸残基保持不变；QH345其氨基酸序列为将序列1的第451位S突变为Q；且将第482位R突变K；且将第674位K突变Q；且将第680位M突变L，且其他氨基酸残基保持不变；QH346其氨基酸序列为将序列1的第451位S突变为Q；且将第482位R突变K；且将第674位K突变M；且将第680位M突变L；且将第479位L突变M，且其他氨基酸残基保持不变；QH347其氨基酸序列为将序列1的第451位S突变为Q；且将第453位L突变I；且将第480位D突变N；且将第674位K突变Q；且将第680位M突变I，且其他氨基酸残基保持不变；QH348其氨基酸序列为将序列1的第451位S突变为Q；且将第482位R突变K；且将第674位K突变Q；且将第680位M突变L；且将第452位L突变V；且将第480位D突变N，且其他氨基酸残基保持不变。
- 编码权利要求1-5中任一所述蛋白的DNA分子。
- 根据权利要求6所述的DNA分子，其特征在于：所述DNA分子为如下B所示的DNA分子或其衍生物：B)所示的DNA分子为KOD DNA聚合酶突变体GH78编码基因的核苷酸序列按照其对应的氨基酸序列1中第267、326、347、349、353、375、378、379、380、385、451、452、453、454、457、461、465、470、474、477、478、479、480、482、484、485、486、493、496、497、514、574、584、605、610、630、665、666、667、674、676、680、682、698、707、718、723和729位中至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个、至少27个、至少28个、至少29个、至少30个、至少31个、至少32个、至少33个、至少34个、至少35个、至少36个、至少37个、至少38个、至少39个、至少40个、至少41个、至少42个、至少43个、至少44个、至少45个、至少46个、至少47个或全部48个 氨基酸密码子进行氨基酸密码子置换，得到的核酸；所述KOD DNA聚合酶突变体GH78编码基因的核苷酸序列为序列表中序列2；所述B)所示的DNA分子的衍生物为将B)所示DNA分子的核苷酸序列末端添加标签序列且编码具有DNA聚合酶活性蛋白的核酸分子。
- 含有权利要求6或7所述DNA分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。
- 权利要求1-4中任一所述蛋白在如下1)-5)中至少一种中的应用：1)作为DNA聚合酶；2)催化DNA复制和/或催化DNA扩增；3)进行核酸测序；4)制备用于催化DNA复制和/或催化DNA扩增的产品；5)制备用于进行核酸测序的产品。
- 权利要求6或7所述DNA分子或权利要求8所述表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在如下1)-6)中至少一种中的应用：1)制备DNA聚合酶；2)催化DNA复制和/或催化DNA扩增；3)进行核酸测序；4)制备DNA聚合酶的产品；5)制备用于催化DNA复制和/或催化DNA扩增的产品；6)制备用于进行核酸测序的产品。
- 根据权利要求9或10所述的应用，其特征在于：所述测序为SBS测序；所述核酸为DNA或RNA或全基因组。
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