CN105273991B - 用于在纳米孔中操作分子的系统和方法 - Google Patents

用于在纳米孔中操作分子的系统和方法 Download PDF

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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing

Abstract

本发明阐述了用于在嵌入脂质双层的纳米孔中操作分子的技术。在一个实例中，跨越脂质双层施加获取性电刺激水平，其中含有纳米孔的脂质双层区域由电阻来表征，其中所述获取性电刺激水平趋于将分子从周围流体中拉进所述纳米孔；检测到因获得分子的至少一部分进入纳米孔而导致的所述脂质双层电阻的变化，改变所述获取性电刺激水平为保持性电刺激水平，其中当所述获取性电刺激水平改变为保持性电刺激水平时，所述分子的所述部分仍保留在纳米孔中。

Description

用于在纳米孔中操作分子的系统和方法
本申请是申请日2011年2月4日，申请号201180016647.8、发明名称“用于在纳米孔中操作分子的系统和方法”的中国专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及用于在纳米孔中操作分子的系统和方法。
发明背景
具有大约1纳米内径孔径的纳米孔膜装置在快速核苷酸测序中已经显示有前途。当跨越在浸于导电液体中的纳米孔施加电势时，可观察到因跨越纳米孔的离子传导而产生的微弱离子电流。电流大小对孔径敏感。当诸如DNA或RNA分子等分子穿过纳米孔时，会部分地或完全地阻塞纳米孔，这引起通过纳米孔的电流量值改变。业已显示离子电流阻塞可能与DNA分子的碱基对序列相关。
然而，该技术仍然面对各种挑战，其至今还不能鉴别至单个碱基对。具体而言，在纳米孔中吸引ssDNA分子所需的电位往往使ssDNA分子非常快速穿过纳米孔，这使分析变得困难。为了解决这个问题，试图把ssDNA栓到珠粒以阻止ssDNA分子穿过纳米孔的移动。然而，所述方法可能涉及大量样品制备，可能不适合于小的样本大小。需要改进的用于使用纳米孔膜装置的DNA分析的技术。
附图说明
在以下详述和附图中揭示了本发明各种实施方案。注意附图意欲阐明本发明各种实施方案，不必按比例画图。
图1是包含含纳米孔的脂质双层的纳米孔装置实施方案的示意图。
图2是在用于控制电刺激并用于检测分析物分子的电特征(electricalsignature)的纳米孔装置中所用电路实施方案的示意图。
图3A是包括纳米孔装置阵列的芯片实施方案示意图的透视图。
图3B是图3A中所示的芯片的横断面视图。
图4是描述用于在固体基质上形成脂质双层的过程的实施方案的示意图。
图5是用于将纳米孔插入脂质双层的过程的实施方案的示意图。
图6是阐明用于在纳米孔中操作、检测、表征、关联、分析分子和/或对分子进行测序的过程的实施方案的示意图。
如先前所述，图7A-D阐明除倒“V”形前进电刺激(progression electricalstimulus)外的前进电刺激的不同实施方案。
图8是阐明用于在纳米孔中逆转分子前进的过程的实施方案的示意图。
图9是被驱动通过纳米孔的分子的电阻曲线实施方案。
具体实施方式
本发明可以以多种方式实施，所述方式包括如：方法；设备；系统；组合物；呈现在计算机可读储存介质上的计算机程序产品；和/或处理器，例如配置用于执行储存在与处理器耦合的存储器上的指令和/或由与处理器耦合的存储器提供的指令的处理器。在本说明书中，可将这些实施或本发明可采用的其它任何形式称为技术。一般而言，在本发明范围内可改变所揭示方法的步骤的次序。除非另有说明，否则描述为配置用于执行任务的元件例如处理器或存储器，可作为暂时配置用于在特定时间执行该任务的通用元件来实施，或作为制造用于执行该任务的特殊元件来实施。本发明所用术语“处理器”指配置用于处理数据的一种或多种装置、电路和/或处理核心，所述数据例如计算机程序指令。
本发明包括以下技术方案：
技术方案1. 一种在嵌入脂质双层的纳米孔中操作分子的方法，所述方法包括：
跨越脂质双层施加获取性电刺激水平，其中含有纳米孔的脂质双层的区域由电阻表征，其中所述获取性电刺激水平趋于将所述分子从周围流体中拉进所述纳米孔；
检测因获得分子的至少一部分进入所述纳米孔而导致的所述脂质双层电阻的改变；
改变所述获取性电刺激水平到保持性电刺激水平，其中当所述获取性电刺激水平改变至所述保持性电刺激水平时，所述分子的所述部分仍保留在所述纳米孔中。
2. 技术方案1的方法，其中所述纳米孔为α-溶血素纳米孔。
3. 技术方案1的方法，其中所述纳米孔为嵌入在二植烷酰基磷脂酰胆碱(DPhPC)脂质双层中的α-溶血素纳米孔。
4. 技术方案1的方法，其中所述获取性电刺激和所述保持性电刺激各自包含施加的电压(V)水平。
5. 技术方案1的方法，其中改变所述获取性电刺激水平到保持性电刺激水平包括降低所述获取性电刺激水平到所述保持性电刺激水平。
6. 技术方案5的方法，其中降低所述获取性电刺激水平到所述保持性电刺激水平，包括在检测到因获得所述分子的至少一部分进入所述纳米孔而导致的所述双层的电阻的变化后10毫秒内降低所述获取性电刺激水平。
7. 技术方案1的方法，其中所述分子包括带电或极性聚合物。
8. 技术方案1的方法，其中所述分子包括核酸分子。
9. 技术方案1的方法，其中所述分子包括脱氧核糖核酸(DNA)分子。
10. 技术方案1的方法，其中所述分子包括双链脱氧核糖核酸(dsDNA)分子。
11. 技术方案1的方法，其中所述获取性电刺激水平范围从100到400 mV。
12. 技术方案1的方法，其中所述保持性电刺激水平范围从50到150 mV。
13. 技术方案1的方法，其进一步包括施加可变前进电刺激以移动所述分子穿过所述纳米孔。
14. 技术方案13的方法，其中所述前进电压水平范围从100 mV到200 mV。
15. 技术方案13的方法，其中施加以移动所述分子穿过所述纳米孔的可变前进电刺激，辨别所述分子的结构组分。
16. 技术方案13的方法，其中所述分子是核酸分子，施加所述前进电刺激以辨别所述核酸分子的核苷酸碱基。
17. 技术方案13的方法，其中所述可变前进电刺激包括一系列相继更强烈的电脉冲。
18. 技术方案13的方法，其中所述前进电刺激模式包括不对称的倒“V”时间曲线。
19. 技术方案13的方法，其中所述分子是双链DNA，所述前进电刺激解开所述双链DNA，拉动所述DNA的单条链穿过所述纳米孔。
20. 技术方案13的方法，其进一步包括对所述含有纳米孔的脂质双层的区域施加逆向前进电刺激，以允许所述分子逆向穿过所述纳米孔。
21. 技术方案20的方法，其中所述逆向前进电刺激与所述获取性电刺激具有相同极性，其中所述逆向前进电刺激的量值比所述获取性电刺激的量值小，但比所述保持性电刺激的量值大。
22. 技术方案20的方法，其中所述逆向前进电刺激具有与所述获取性电刺激相反的极性。
23. 技术方案20的方法，其中所述分子是双链DNA分子，所述前进电刺激解开所述双链DNA，拉动所述DNA的单条链穿过所述纳米孔，当所述DNA逆向通过所述纳米孔时，所述单链DNA重新退火为双链。
24. 技术方案20的方法，其中在所述分子逆向前进期间记录所述分子的电特征。
25. 一种用于在嵌入脂质双层的纳米孔中操作分子的系统，其包括：
可变电压电源，其配置以跨越脂质双层施加获取性电刺激水平，其中含有所述纳米孔的脂质双层区域由电阻表征，其中所述获取性电刺激水平趋于将所述分子从周围流体中拉进所述纳米孔；
传感电路，其配置以检测因获得分子的至少一部分进入所述纳米孔而导致的所述脂质双层电阻的变化；
其中当所述获取性电刺激水平改变到保持性电刺激水平时，进一步配置所述可变电压电源以改变所述获取性电刺激水平到保持性电刺激水平，其中所述分子的所述部分仍保留在所述纳米孔中。
26. 技术方案25的系统，其中所述纳米孔为α-溶血素纳米孔。
27. 技术方案25的系统，其中所述纳米孔为嵌入二植烷酰基磷脂酰胆碱(DPhPC)脂质双层中的α-溶血素纳米孔。
28. 技术方案25的系统，其中所述获取性电刺激和所述保持性电刺激各自包含施加的电压(V)水平。
29. 技术方案25的系统，其中改变所述获取性电刺激水平到保持性电刺激水平包括降低所述获取性电刺激水平到所述保持性电刺激水平。
30. 技术方案29的系统，其中降低所述获取性电刺激水平到所述保持性电刺激水平，包括在检测到因获得所述分子的至少一部分进入所述纳米孔而导致的所述双层的电阻的改变后10毫秒内降低所述获取性电刺激水平。
31. 技术方案25的系统，其中所述分子包括带电或极性聚合物。
32. 技术方案25的系统，其中所述分子包括核酸分子。
33. 技术方案25的系统，其中所述分子包括脱氧核糖核酸(DNA)分子。
34. 技术方案25的系统，其中所述分子包括双链脱氧核糖核酸(dsDNA)分子。
35. 技术方案25的系统，其中所述获取性电刺激水平范围从100到400 mV。
36. 技术方案25的系统，其中所述保持性电刺激水平范围从50到150 mV。
37. 技术方案25的系统，其进一步包括施加可变前进电刺激以移动所述分子穿过所述纳米孔。
38. 技术方案37的系统，其中所述前进电压水平范围从100到200 mV。
39. 技术方案37的系统，其中施加以移动所述分子穿过所述纳米孔的可变前进电刺激，辨别所述分子的结构组分。
40. 技术方案37的系统，其中所述分子是核酸分子，施加所述前进电刺激以辨别所述核酸分子的核苷酸碱基。
41. 技术方案37的系统，其中所述可变前进电刺激包括一系列相继更强烈的电脉冲。
42. 技术方案37的系统，其中所述前进电刺激模式包括不对称的倒“V”时间曲线。
43. 技术方案37的系统，其中所述分子是双链DNA分子，所述前进电刺激解开所述双链DNA，拉动所述DNA的单条链穿过所述纳米孔。
44. 技术方案37的系统，其进一步包括对含有纳米孔的脂质双层区域施加逆向前进电刺激以允许所述分子逆向穿过所述纳米孔。
45. 技术方案44的系统，其中所述逆向前进电刺激与所述获取性电刺激具有相同极性，其中所述逆向前进电刺激的量值比所述获取性电刺激的量值小，但比所述保持性电刺激的量值大。
46. 技术方案44的系统，其中所述逆向前进电刺激具有与所述获取性电刺激相反的极性。
47. 技术方案44的系统，其中所述分子是双链DNA分子，所述前进电刺激解开所述双链DNA，拉动所述DNA的单条链穿过所述纳米孔，当所述DNA逆向通过所述纳米孔时，所述单链DNA重新退火为双链。
48. 技术方案44的系统，其中在所述分子逆向前进期间记录所述分子的电特征。
49. 一种在嵌入脂质双层的纳米孔中操作分子的系统，其包括：
用于跨越脂质双层施加获取性电刺激水平的工具，其中含有所述纳米孔的脂质双层的区域由电阻表征，其中所述获取性电刺激水平趋于将分子从周围流体中拉进所述纳米孔；
用于检测因获得分子的至少部分进入所述纳米孔而导致的所述脂质双层的电阻变化的工具；
用于改变所述获取性电刺激水平到保持性电刺激水平的工具，其中当所述获取性电刺激水平改变到所述保持性电刺激水平时，所述分子的所述部分仍保留在所述纳米孔中。
50. 技术方案49的系统，其中所述纳米孔为α-溶血素纳米孔。
51. 技术方案49的系统，其中所述纳米孔为嵌入在二植烷酰基磷脂酰胆碱(DPhPC)脂质双层中的α-溶血素纳米孔。
52. 技术方案49的系统，其中所述获取性电刺激和所述保持性电刺激各自包含施加的电压(V)水平。
53. 技术方案49的系统，其中改变所述获取性电刺激水平到保持性电刺激水平包括降低所述获取性电刺激水平到所述保持性电刺激水平。
54. 技术方案53的系统，其中降低所述获取性电刺激水平到所述保持性电刺激水平，包括在检测到因获得所述分子的至少一部分进入所述纳米孔而导致的所述双层的电阻的改变后10毫秒内降低所述获取性电刺激水平。
55. 技术方案49的系统，其中所述分子是带电或极性聚合物。
56. 技术方案49的系统，其中所述分子是核酸分子。
57. 技术方案49的系统，其中所述分子是脱氧核糖核酸(DNA)分子。
58. 技术方案49的系统，其中所述分子是双链脱氧核糖核酸(dsDNA)分子。
59. 技术方案49的系统，其中所述获取性电刺激水平范围从100到400 mV。
60. 技术方案49的系统，其中所述保持性电刺激水平范围从50到150 mV。
61. 技术方案49的系统，其进一步包括用于施加可变前进电刺激以移动所述分子穿过所述纳米孔的工具。
62. 技术方案61的系统，其中所述前进电压水平范围从100 mV到200 mV。
63. 技术方案61的系统，其中施加以移动所述分子穿过所述纳米孔的可变前进电刺激，辨别所述分子的结构组分。
64. 技术方案61的系统，其中所述分子是核酸分子，施加所述前进电刺激以辨别所述核酸分子的核苷酸碱基。
65. 技术方案61的系统，其中所述可变前进电刺激包括一系列相继更强烈的电脉冲。
66. 技术方案61的系统，其中所述前进电刺激模式包括不对称的倒“V”时间曲线。
67. 技术方案61的系统，其中所述分子是双链DNA，所述前进电刺激解开所述双链DNA，拉动所述DNA的单条链穿过所述纳米孔。
68. 技术方案61的系统，其进一步包括用于对含有纳米孔的脂质双层区域施加逆向前进电刺激以允许所述分子逆向穿过所述纳米孔的工具。
69. 技术方案68的系统，其中所述逆向前进电刺激与所述获取性电刺激具有相同极性，其中所述逆向前进电刺激的量值比所述获取性电刺激的量值小，但比所述保持性电刺激的量值大。
70. 技术方案68的系统，其中所述逆向前进电刺激具有与所述获取性电刺激相反的极性。
71. 技术方案68的系统，其中所述分子是双链DNA分子，所述前进电刺激解开所述双链DNA，拉动所述DNA的单条链穿过所述纳米孔，当所述DNA逆向通过所述纳米孔时，所述单链DNA重新退火为双链。
72. 技术方案68的系统，其中在所述分子逆向前进期间记录所述分子的电特征。
73. 一种鉴别分子的一部分的方法，所述方法包括：
获取与分子相关的多种电测量结果，其中所述多种电测量结果中的每一种与纳米孔内的所述分子的离散位置相对应；
让所述多种电测量结果与对应于所述分子的可能结构的电测量结果的一个或多个序列相关联；
基于所述关联确定分子的所述部分包括分子的可能结构。
74. 技术方案73的方法，其中所述电测量结果包括电阻测量结果。
75. 技术方案73的方法，其中所述电测量结果包括电容测量结果。
76. 技术方案73的方法，其中所述分子包括聚合物分子。
77. 技术方案73的方法，其中所述分子包括核苷酸分子。
78. 技术方案73的方法，其中所述分子包括DNA分子。
79. 技术方案73的方法，其中所述分子包括dsDNA分子。
80. 技术方案73的方法，其中所述分子包括RNA分子。
81. 技术方案73的方法，其中所述分子包括双链DNA分子，所述方法进一步包括：
获取与扯开所述DNA分子的碱基对有关的电测量结果；
将所述电测量结果与已知DNA碱基对相关联。
82. 技术方案73的方法，其中所述电测量结果包含所述分子的一种或多种电模式。
83. 技术方案73的方法，获取多种电测量结果包括在通过改变一种或多种以下环境变量获得的不同的环境条件下获取多种电测量结果：盐浓度、甘油浓度、尿素浓度、甜菜碱浓度、甲酰胺浓度、温度和二价阳离子浓度。
84. 技术方案73的方法，其中所述分子与杂交标记杂交。
85. 技术方案73的方法，其中获取与所述分子相关的多种电测量结果包括在所述分子的某区域中获取较其它区域更好的电测量结果。
86. 技术方案85的方法，其中所述分子包括核苷酸分子，所述区域包括下列之一：SNP位点、拷贝数变化位点、甲基化位点、蛋白结合位点、酶结合位点、重复序列位点、限制酶位点、miRNA位点、siRNA位点、tRNA位点、转座子位点、着丝粒微点、端粒位点、易位位点、插入位点和缺失位点。
87. 技术方案73的方法，其中获取与所述分子相关的多种电测量结果包括获取所述分子单个区域的重复电测量结果。
88. 技术方案87的方法，其中获取与所述分子相关的重复电测量结果包括对所述分子的所述区域的两个或更多个重叠框进行采样。
89. 技术方案88的方法，其中获取重复电测量结果进一步包括组合来自重叠框的信息。
90. 技术方案87的方法，其中在对同一分子的单次实验中实施所述分子单个区域的重复测量。
91. 技术方案87的方法，其中通过在所述纳米孔中倒回所述分子来实施重复测量。
92. 技术方案87的方法，其进一步包括基于重复测量计算当所述分子被拉过所述纳米孔时所述分子的旋转。
93. 一种用于鉴别分子的一部分的系统，其包括：
传感电路，其配置以获取与分子相关的多种电测量结果，其中所述多种电测量结果中的每一种与纳米孔内的所述分子的离散位置相对应；
储存对应于所述分子的可能结构的电测量结果的一个或多个序列的存储器；
处理器，其配置以：
将多种电测量结果与对应于所述分子的可能结构的电测量结果的一个或多个序列相关联；和
基于所述关联确定所述分子的所述部分包括所述分子的可能结构。
94. 技术方案93的系统，其中所述电测量结果包括电阻测量结果。
95. 技术方案93的系统，其中所述电测量结果包括电容测量结果。
96. 技术方案93的系统，其中所述分子包括聚合物分子。
97. 技术方案93的系统，其中所述分子包括核苷酸分子。
98. 技术方案93的系统，其中所述分子包括DNA分子。
99. 技术方案93的系统，其中所述分子包括dsDNA分子。
100. 技术方案93的系统，其中所述分子包括RNA分子。
101. 技术方案93的系统，其中所述分子包括双链DNA分子；
其中进一步配置所述传感电路以获取与扯开所述DNA分子的碱基对相关的电测量结果；
其中进一步配置所述处理器以将所述电测量结果与已知DNA碱基对相关联。
102. 技术方案93的系统，其中所述电测量结果包含所述分子的一种或多种电模式。
103. 技术方案93的系统，获取多种电测量结果包括在通过改变一种或多种以下环境变量获得的不同的环境条件下获取多种电测量结果：盐浓度、甘油浓度、尿素浓度、甜菜碱浓度、甲酰胺浓度、温度和二价阳离子浓度。
104. 技术方案93的系统，其中所述分子与杂交标记杂交。
105. 技术方案93的系统，其中获取与所述分子相关的多种电测量结果包括在所述分子的某区域中获取较其它区域更好的电测量结果。
106. 技术方案105的系统，其中所述分子包括核苷酸分子，所述区域包括下列之一：单核苷酸多态性(SNP)位点、拷贝数变化位点、甲基化位点、蛋白结合位点、酶结合位点、重复序列位点和限制酶位点。
107. 技术方案93的系统，其中获取与所述分子相关的多种电测量结果包括获取所述分子单个区域的重复电测量结果。
108. 技术方案107的系统，其中获取与所述分子相关的重复电测量结果包括对所述分子所述区域的两个或更多个重叠框进行采样。
109. 技术方案108的系统，其中获取重复电测量结果进一步包括组合来自所述重叠框的信息。
110. 技术方案107的系统，其中在对同一分子的单次实验中实施所述分子单个区域的重复测量。
111. 技术方案107的系统，其中通过在所述纳米孔中倒回所述分子来实施重复测量。
112. 技术方案107的系统，其中进一步配置所述处理器以基于重复测量计算当所述分子被拉过所述纳米孔时所述分子的旋转。
113. 一种用于鉴别分子的一部分的系统，其包括：
用于获取与分子相关的多种电测量结果的工具，其中所述多种电测量结果中的每一种与纳米孔内的所述分子的离散位置相对应；
用于将所述多种电测量结果与对应于所述分子的可能结构的电测量结果的一个或多个序列相关联的工具；
用于基于所述关联确定所述分子的所述部分包括所述分子的可能结构的工具。
114. 技术方案113的系统，其中所述电测量结果包括电阻测量结果。
115. 技术方案113的系统，其中所述电测量结果包括电容测量结果。
116. 技术方案113的系统，其中所述分子包括聚合物分子。
117. 技术方案113的系统，其中所述分子包括核苷酸分子。
118. 技术方案113的系统，其中所述分子包括DNA分子。
119. 技术方案113的系统，其中所述分子包括dsDNA分子。
120. 技术方案113的系统，其中所述分子包括RNA分子。
121. 技术方案113的系统，其中所述分子包括双链DNA分子，所述系统进一步包括：
用于获取与扯开所述DNA分子的碱基对相关的电测量结果的工具；
用于将所述电测量结果与已知DNA碱基对相关联的工具。
122. 技术方案113的系统，其中所述电测量结果包含所述分子的一种或多种电模式。
123. 技术方案113的系统，获取多种电测量结果包括在通过改变一种或多种以下环境变量获得的不同的环境条件下获取多种电测量结果：盐浓度、甘油浓度、尿素浓度、甜菜碱浓度、甲酰胺浓度、温度和二价阳离子浓度。
124. 技术方案113的系统，其中所述分子与杂交标记杂交。
125. 技术方案113的系统，其中获取与所述分子相关的多种电测量结果包括在所述分子的某区域中获取较其它区域更好的电测量结果。
126. 技术方案125的系统，其中所述分子包括核苷酸分子，所述区域包括下列之一：SNP位点、拷贝数变化位点、甲基化位点、蛋白结合位点、酶结合位点、重复序列位点和限制酶位点。
127. 技术方案113的系统，其中获取与所述分子相关的多种电测量结果包括获取所述分子单个区域的重复电测量结果。
128. 技术方案127的系统，其中获取与所述分子相关的重复电测量结果包括对所述分子区域的两个或更多个重叠框进行采样。
129. 技术方案128的系统，其中获取重复电测量结果进一步包括组合来自所述重叠框的信息。
130. 技术方案127的系统，其中在对同一分子的单次实验中实施所述分子单个区域的重复测量。
131. 技术方案127的系统，其中通过在所述纳米孔中倒回所述DNA分子来实施重复测量。
132. 技术方案127的系统，其进一步包括基于重复测量计算当所述分子被拉过所述纳米孔时所述分子的旋转的工具。
133. 一种表征分子的方法，所述方法包括：
在纳米孔中陷入所述分子的一部分；
跨越所述纳米孔施加可变电压直至在所述纳米孔内移动所述分子的陷入部分；
基于影响所述分子陷入部分的至少一部分在所述纳米孔内的移动所需的电刺激来表征所述分子。
134. 技术方案133的方法，其中所述分子包括聚合物分子。
135. 技术方案133的方法，其中所述分子包括核苷酸分子。
136. 技术方案133的方法，其中所述分子包括DNA分子。
137. 技术方案133的方法，其中所述分子包括RNA分子。
138. 技术方案133的方法，其中所述分子包括dsDNA分子，表征所述分子包括鉴别GC碱基对和/或AT碱基对。
139. 技术方案133的方法，其进一步包括基于所述分子当移动通过所述纳米孔时的电信号来表征所述分子。
140. 技术方案139的方法，其中所述电信号包含当所述分子移动通过所述纳米孔时所述纳米孔的电阻信息。
141. 技术方案139的方法，其中所述电信号包含当所述分子移动通过所述纳米孔时所述纳米孔的电阻对时间的曲线。
142. 技术方案139的方法，其中所述电信号包含当所述分子移动通过所述纳米孔时所述纳米孔的电流对时间的曲线。
143. 技术方案139的方法，其中所述电信号包含当所述分子移动通过所述纳米孔时所述纳米孔的电压对时间的曲线。
144. 技术方案139的方法，其中所述分子的电信号包含组合所述分子多个区域的电信号的组合电信号。
145. 技术方案139的方法，其中基于所述分子当移动通过所述纳米孔时的电信号来表征所述分子，包括基于以下信息中的一种或多种来表征所述分子：所述电信号的振幅、频率、边缘上升时间和边缘下降时间信息。
146. 技术方案133的方法，其中所述分子包括核苷酸分子，其中表征所述分子包括表征所述分子的至少一部分的碱基序列。
147. 一种用于表征分子的系统，其包括：
纳米孔装置，其配置以：
在纳米孔中陷入所述分子的一部分；
跨越所述纳米孔施加可变电压直至在所述纳米孔内移动所述分子的陷入部分；
处理器，其配置以基于影响所述分子陷入部分的至少一部分在所述纳米孔内的移动所需的电刺激来表征所述分子；和
存储器，其配置以将指令提供给处理器。
148. 技术方案147的系统，其中所述分子包括聚合物分子。
149. 技术方案147的系统，其中所述分子包括核苷酸分子。
150. 技术方案147的系统，其中所述分子包括DNA分子。
151. 技术方案147的系统，其中所述分子包括RNA分子。
152. 技术方案147的系统，其中所述分子包括dsDNA分子，表征所述分子包括鉴别GC碱基对和/或AT碱基对。
153. 技术方案147的系统，其中进一步配置所述纳米孔装置以检测所述分子当移动通过所述纳米孔时的电信号；和
其中进一步配置所述处理器以基于所述分子当移动通过所述纳米孔时的电信号来表征所述分子。
154. 技术方案153的系统，其中所述电信号包含当所述分子移动通过所述纳米孔时所述纳米孔的电阻信息。
155. 技术方案153的系统，其中所述电信号包含当所述分子移动通过所述纳米孔时所述纳米孔的电阻对时间的曲线。
156. 技术方案153的系统，其中所述电信号包含当所述分子移动通过所述纳米孔时所述纳米孔的电流对时间的曲线。
157. 技术方案153的系统，其中所述电信号包含当所述分子移动通过所述纳米孔时所述纳米孔的电压对时间的曲线。
158. 技术方案153的系统，其中所述分子的电信号包含组合所述分子多个区域的电信号的组合电信号。
159. 技术方案153的系统，其中基于所述分子当移动通过所述纳米孔时的电信号来表征所述分子，包括基于以下信息中的一种或多种来表征所述分子：所述电信号的振幅、频率、边缘上升时间和边缘下降时间信息。
160. 技术方案147的系统，其中所述分子包含核苷酸分子，其中表征所述分子包括表征所述分子的至少一部分的碱基序列。
161. 一种用于表征分子的系统，其包括：
用于在纳米孔中陷入所述分子的一部分的工具；
用于跨越纳米孔施加可变电压直至在所述纳米孔内移动所述分子的陷入部分的工具；
用于基于影响所述分子的陷入部分的至少一部分在所述纳米孔内移动所需的电刺激来表征所述分子的工具。
162. 技术方案161的系统，其中所述分子包括聚合物分子。
163. 技术方案161的系统，其中所述分子包括核苷酸分子。
164. 技术方案161的系统，其中所述分子包括DNA分子。
165. 技术方案161的系统，其中所述分子包括RNA分子。
166. 技术方案161的系统，其中所述分子包括dsDNA分子，表征所述分子包括鉴别GC碱基对和/或AT碱基对。
167. 技术方案161的系统，其进一步包括用于基于所述分子当移动通过所述纳米孔时的电信号来表征所述分子的工具。
168. 技术方案167的系统，其中所述电信号包含当所述分子移动通过所述纳米孔时所述纳米孔的电阻信息。
169. 技术方案167的系统，其中所述电信号包含当所述分子移动通过所述纳米孔时所述纳米孔的电阻对时间的曲线。
170. 技术方案167的系统，其中所述电信号包含当所述分子移动通过所述纳米孔时所述纳米孔的电流对时间的曲线。
171. 技术方案167的系统，其中所述电信号包含当所述分子移动通过所述纳米孔时所述纳米孔的电压对时间的曲线。
172. 技术方案167的系统，其中所述分子的电信号包含组合所述分子多个区域的电信号的组合电信号。
173. 技术方案167的系统，其中基于所述分子当移动通过所述纳米孔时的电信号来表征所述分子，包括基于以下信息中的一种或多种来表征所述分子：所述电信号的振幅、频率、边缘上升时间和边缘下降时间信息。
174. 技术方案161的系统，其中所述分子包括核苷酸分子，其中表征所述分子包括表征所述分子的至少一部分的碱基序列。
175. 一种在基本上平坦的固体表面上组装脂质双层的方法，所述方法包括：
在邻近所述固体表面处沉积脂质材料；
在所述固体表面上形成用快速扩散气体分子充满的泡沫；
允许所述气体分子扩散出所述泡沫以在所述固体表面上形成脂质双层。
176. 技术方案175的方法，其中所述固体表面包含脂质双层相容表面。
177. 技术方案175的方法，其中所述固体表面包含电极表面。
178. 技术方案175的方法，其中所述固体表面由选自以下的材料形成：银-氯化银、银-金合金、银-铂合金、掺杂硅和其它半导体材料。
179. 技术方案175的方法，其中所述固体表面包括吸附水分子层，并在所述吸附水分子上形成所述脂质双层。
180. 技术方案175的方法，其中形成泡沫包括启动甲酸盐分解以产生气体分子。
181. 技术方案180的方法，其中通过在所述电极表面施加泡沫起始电刺激来实现启动甲酸盐分解。
182. 技术方案181的方法，其中所述起始电刺激是具有1.4 V-3.0 V范围和持续时间为100毫秒-1秒的泡沫起始电压水平。
183. 技术方案182的方法，其进一步包括通过检测所述泡沫的电参数来检测所述泡沫的形成。
184. 技术方案183的方法，其中所述电参数包含所述泡沫的电阻。
185. 技术方案175的方法，其进一步包括通过检测所述脂质双层的电参数来监测所述脂质双层的完整性。
186. 技术方案185的方法，其中所述电参数包含在交流电(AC)下测量的所述脂质双层的电容。
187. 技术方案185的方法，其中所述电参数包含在交流电下测量的所述脂质双层的阻抗。
188. 技术方案185的方法，其进一步包括施加清除性电刺激水平以清除检测到具有不充分的结构完整性的脂质双层。
189. 技术方案188的方法，其中使一个或多个步骤自动化。
190. 一种用于在平坦固体表面上组装脂质双层的系统，其包括：
分配器，其配置以在邻近平坦的亲水固体表面处沉积脂质材料；
可变电压电源，其配置以对脂质悬浮液施加刺激以导致在所述固体表面上形成用快速扩散气体分子充满的泡沫；
传感电路，其配置以检测所述气体分子已扩散出所述泡沫，从而在所述固体表面上形成脂质双层。
191. 技术方案190的系统，其中所述固体表面包含脂质双层相容表面。
192. 技术方案190的系统，其中所述固体表面包含电极表面。
193. 技术方案190的系统，其中所述固体表面由选自以下的材料形成：银-氯化银、银-金合金、银-铂合金、掺杂硅和其它半导体材料。
194. 技术方案190的系统，其中所述固体表面包括吸附水分子层，在所述吸附水分子上形成所述脂质双层。
195. 技术方案190的系统，其中进一步配置刺激促动器以施加泡沫起始刺激，设计所述泡沫起始刺激以启动甲酸盐分解来产生气体分子。
196. 技术方案195的系统，其中泡沫起始刺激包含电刺激。
197. 技术方案196的系统，其中所述起始电刺激包含具有1.4 V-3.0 V范围和持续时间为100毫秒-1秒的泡沫起始电压水平。
198. 技术方案197的系统，其中进一步配置所述传感电路以通过检测所述泡沫的电参数来检测所述泡沫的形成。
199. 技术方案198的系统，其中所述电参数包含所述泡沫的电阻。
200. 技术方案196的系统，进一步配置所述传感电路以监测所述脂质双层的完整性。
201. 技术方案200的系统，进一步配置所述传感电路以通过检测所述脂质双层的电参数来监测所述脂质双层的完整性。
202. 技术方案201的系统，其中所述电参数包含在交流电(AC)下测量的所述脂质双层的电容。
203. 技术方案201的系统，其中所述电参数包含在交流电(AC)下测量的所述脂质双层的阻抗。
204. 技术方案201的系统，进一步配置所述可变电压电源，以施加清除性电刺激水平来清除检测到具有不充分的结构完整性的脂质双层。
205. 技术方案204的系统，其中使所述系统自动化。
206. 一种用于在平坦固体表面上组装脂质双层的系统，其包括：
用于在邻近平坦的亲水固体表面处沉积脂质材料的工具；
用于对脂质悬浮液施加刺激以导致在所述固体表面是形成用快速扩散气体分子充满的泡沫的工具；
用于检测所述气体分子扩散出所述泡沫以在所述固体表面上形成脂质双层的工具。
207. 技术方案206的系统，其中所述固体表面包含脂质双层相容表面。
208. 技术方案206的系统，其中所述固体表面包含电极表面。
209. 技术方案206的系统，其中所述固体表面由选自以下的材料形成：银-氯化银、银-金合金、银-铂合金、掺杂硅和其它半导体材料。
210. 技术方案206的系统，其中所述固体表面包括吸附水分子层，在所述吸附水分子上形成所述脂质双层。
211. 技术方案206的系统，其进一步包括用于递送泡沫起始刺激的工具，所述泡沫起始刺激用于启动甲酸盐分解以产生气体分子。
212. 技术方案211的系统，其中泡沫起始刺激包含电刺激。
213. 技术方案212的系统，其中所述起始电刺激包含具有1.4 V-3.0 V范围和持续时间为100毫秒-1秒的泡沫起始电压水平。
214. 技术方案206的系统，其进一步包括用于通过检测所述泡沫的电参数来检测所述泡沫的形成的工具。
215. 技术方案214的系统，其中所述电参数包含所述泡沫的电阻。
216. 技术方案206的系统，其进一步包括用于监测所述脂质双层的完整性的工具。
217. 技术方案206的系统，其进一步包括用于通过检测所述脂质双层的电参数来监测所述脂质双层的完整性的工具。
218. 技术方案217的系统，其中所述电参数包含在交流电(AC)下测量的所述脂质双层的电容。
219. 技术方案去217的系统，其中所述电参数包含在交流电(AC)下测量的所述脂质双层的阻抗。
220. 技术方案217的系统，其进一步包括用于施加清除性电刺激水平以清除检测到具有不充分的结构完整性的脂质双层的工具。
221. 技术方案220的系统，其中使所述系统自动化。
222. 一种在脂质双层中形成纳米孔的方法，所述方法包括：
对脂质双层施加搅动刺激水平，其中所述搅动刺激水平趋于促进在所述脂质双层中形成纳米孔。
223. 技术方案222的方法，其中所述搅动刺激选自电刺激、机械刺激、声刺激、化学光刺激和热刺激。
224. 技术方案222的方法，其中所述搅动刺激包含电压(V)水平。
225. 技术方案222的方法，其中所述搅动刺激水平趋于促进在所述脂质双层中插入α-溶血素纳米孔。
226. 技术方案222的方法，其进一步包括：
检测因在所述脂质双层中形成纳米孔而导致的所述脂质双层电特性的变化；
基于所检测的所述脂质双层电特性的变化来确定已在所述脂质双层中形成纳米孔。
227. 技术方案226的方法，其中使一个或多个步骤自动化。
228. 技术方案226的方法，其中检测所述脂质双层电特性的变化包括检测所述脂质双层电阻的变化。
229. 技术方案226的方法，确定形成纳米孔包括基于所述双层电特性变化的大小来确定所形成的纳米孔的数量。
230. 技术方案229的方法，其进一步包括当确定在所述脂质双层中形成不止一个纳米孔时施加清除性电刺激以清除所述脂质双层。
231. 技术方案229的方法，其进一步包括当确定在所述脂质双层中未形成纳米孔时，对脂质双层施加另一个搅动电刺激水平，其中所述搅动电刺激水平趋于促进在所述脂质双层中形成纳米孔。
232. 技术方案222的方法，其中检测因在所述脂质双层中形成纳米孔而导致的所述双层电特性的变化包括检测所述双层电阻的降低。
233. 技术方案222的方法，其中在基本上平坦的脂质双层相容固体表面上形成所述脂质双层。
234. 技术方案222的方法，其中在基本上平坦的亲水固体表面上形成所述脂质双层。
235. 技术方案222的方法，其中在基本上平坦的电极表面上形成所述脂质双层。
236. 一种用于在由电阻表征的脂质双层中形成纳米孔的系统，其包括：
来源，其配置以对脂质双层施加搅动刺激水平，其中所述搅动刺激水平趋于促进在所述脂质双层中形成纳米孔。
237. 技术方案236的系统，其中所述搅动刺激选自电刺激、机械刺激、声刺激、化学光刺激和热刺激。
238. 技术方案236的系统，其中所述搅动刺激包含搅动电刺激，所述来源包含电压电源，其配置以对所述脂质双层施加搅动电刺激水平，其中所述搅动电刺激水平趋于促进在所述脂质双层中形成纳米孔。
239. 技术方案236的系统，其中所述搅动刺激水平趋于促进在所述脂质双层中插入α-溶血素纳米孔。
240. 技术方案236的系统，其进一步包含：
传感电路，其配置以检测因在所述脂质双层中形成纳米孔而导致的所述脂质双层电特性的变化；和
处理器，其配置以基于检测到的所述脂质双层电特性的变化来确定在所述脂质双层中已形成纳米孔。
241. 技术方案240的系统，其中检测所述脂质双层电特性的变化包括检测所述脂质双层电阻的变化。
242. 技术方案240的系统，确定形成纳米孔包括基于所述双层电特性变化的大小来确定形成的纳米孔的数量。
243. 技术方案242的系统，进一步配置可变电压电源以当确定在所述脂质双层中形成不止一个纳米孔时施加清除性电刺激以清除所述脂质双层。
244. 技术方案242的系统，进一步配置可变电压电源以当确定在所述脂质双层中未形成纳米孔时，对脂质双层施加另一个搅动电刺激水平，其中所述搅动电刺激水平趋于促进在所述脂质双层中形成纳米孔。
245. 技术方案240的系统，其中检测因在所述脂质双层中形成纳米孔而导致的所述双层电特性的变化包括检测所述双层电阻的降低。
246. 技术方案236的系统，其中在基本上平坦的脂质双层相容固体表面上形成所述脂质双层。
247. 技术方案236的系统，其中在基本上平坦的亲水固体表面上形成所述脂质双层。
248. 技术方案236的系统，其中在基本上平坦的电极表面上形成所述脂质双层。
249. 技术方案236的系统，其中使所述系统自动化。
250. 一种用于在由电阻表征的脂质双层中形成纳米孔的系统，其包括：
用于对脂质双层施加搅动刺激水平的工具，其中所述搅动刺激水平趋于促进在所述脂质双层中形成纳米孔。
251. 技术方案250的系统，其中所述搅动刺激选自电刺激、机械刺激、声刺激、化学光刺激和热刺激。
252. 技术方案250的系统，其中所述搅动刺激包含电搅动刺激。
253. 技术方案250的系统，其中所述搅动刺激水平趋于促进在所述脂质双层中插入α-溶血素纳米孔。
254. 技术方案250的系统，其进一步包括：
用于检测因在所述脂质双层中形成纳米孔而导致的所述脂质双层电特性的变化的工具；和
用于基于所检测到的所述脂质双层电特性的变化来确定所述脂质双层中已形成纳米孔的工具。
255. 技术方案254的系统，其中检测所述脂质双层电特性的变化包括检测所述脂质双层电阻的变化。
256. 技术方案254的系统，确定形成纳米孔包括基于所述双层电特性变化的大小来确定所形成的纳米孔的数量。
257. 技术方案256的系统，其进一步包括用于当确定在所述脂质双层中形成超过一个纳米孔时施加清除性电刺激以清除所述脂质双层的工具。
258. 技术方案256的系统，其进一步包括用于当确定脂质双层中未形成纳米孔时，对所述脂质双层施加另一个搅动电刺激水平的工具，其中所述搅动电刺激水平趋于促进在所述脂质双层中形成纳米孔。
259. 技术方案254的系统，其中检测因在所述脂质双层中形成纳米孔而导致的所述双层电特性的变化包括检测所述双层电阻的降低。
260. 技术方案250的系统，其中在基本上平坦的脂质双层相容固体表面上形成所述脂质双层。
261. 技术方案250的系统，其中在基本上平坦的亲水固体表面上形成所述脂质双层。
262. 技术方案250的系统，其中在基本上平坦的电极表面上形成所述脂质双层。
263. 技术方案250的系统，其中使所述系统自动化。
以下连同阐明本发明原理的附图一起提供本发明的一个或多个实施方案的详述。联系所述实施方案阐述本发明，但本发明不限于任何实施方案。本发明范围仅受权利要求限制，并且本发明包括多种备选、修改和等同物。在以下阐述中陈述多种具体细节，以提供对本发明的全面的了解。提供这些细节为了举例目的，本发明可根据权利要求在没有这些具体细节中的一些或全部的情况下实施。为了清晰起见，未详细阐述与本发明相关的技术领域中已知的技术资料，以便本发明不必多余地晦涩难懂。
本文阐述用纳米孔装置操作、检测、表征、关联和/或测定分子的技术。在一个实例中，跨越由电阻和电容表征的含有纳米孔的脂质双层施加获取性电刺激，其中获取性电刺激具有趋于将分子从周围流体拉到纳米孔内的水平。检测到因获得分子的至少一部分进入纳米孔而产生的脂质双层的电特性方面的变化。作为回应，电刺激水平改变为保持性电刺激水平。趋于把分子从周围流体拉到纳米孔中的获取性电刺激的水平通常也趋于引起分子太快地通过纳米孔。为了让分子陷在纳米孔中以进一步详细表征，电刺激水平通常需要在检测到因获得分子的至少一部分进入纳米孔而产生的含纳米孔的脂质双层的电特性方面的变化后，迅速降低至较低的保持性电刺激水平。
分子陷入纳米孔之后，再跨越含纳米孔的脂质双层施加前进电刺激(例如可变的电刺激)，直至分子通过纳米孔。前进电刺激水平为这样的水平，其使得允许分子以允许记录用于表征的分子的有用电特征的方式通过纳米孔。在一些实施方案中，前进电刺激水平低于获取性电刺激水平且高于保持性电刺激水平。随着分子通过纳米孔，记录了分子的一个或多个电特征。然后可基于检测的电特征来表征分子。
亦可施加逆向前进电刺激以使分子穿过纳米孔逆向前进或倒回。可在前进电刺激之前、之后和/或穿插其间施加逆向前进电刺激。通过循环前进电刺激和逆向前进电刺激，可在分子穿过纳米孔前进和/或逆向前进期间获得分子的重复测量结果。在一些实施方案中，将所述循环施于分子的经选择的区域，例如SNP位点、拷贝数变化位点、甲基化位点、蛋白结合位点、酶结合位点、重复序列位点和限制酶位点，以使分子的所选择的区域的测量结果更好和准确度更佳。在一个实例中，可以首先施加前进电刺激，接着施加逆向前进电刺激，而后是另一次前进电刺激。通过重复测量分子同一部分，可获得改善的测量信噪比。在一个实例中，多个逆向前进电刺激穿插在多个前进电刺激中，其中多个前进电刺激的每一个后接着逆向前进电刺激。在一些实施方案中，与前进电刺激相比，逆向电刺激水平的极性是相反的，逆向电刺激朝逆向前进方向牵引分子。在一些实施方案中，与前进电刺激相比，逆向电刺激具有相同的极性但量值较小(或0量值)，分子穿过纳米孔逆向前进的天然趋向朝逆向前进方向牵引分子。在所述情况中，逆向电刺激可以起减慢分子通过纳米孔逆向前进的作用。在逆向前进期间检测到的电特征也可用于表征分子。在某些情况下，当分子通过纳米孔逆向前进时，分子可以更可预测的和/或更慢的速度移动，所记录的电特征可以具有更高的质量和更好的信噪比。在一个实例中，正在表征的分子是dsDNA分子，当施加逆向前进电刺激时，解链的ssDNA分子随着其逆向通过纳米孔而重新退火形成dsDNA分子。在该实例中，逆向前进电刺激与前进电刺激相比具有相同的极性但是量值较小。解链的ssDNA分子重新退火以形成dsDNA分子的天然趋向朝逆向前进方向驱动分子。逆向前进电刺激充当减低DNA分子逆向通过纳米孔的速度的作用。在逆向前进电刺激与前进电刺激具有相同极性的情况下，逆向前进电刺激量值的增加减慢分子的逆向前进。在逆向前进电刺激与前进电刺激具有相反极性的情况下，逆向前进电刺激量值的增加加速分子的逆向前进。在其中ssDNA随着DNA分子逆向通过纳米孔而重新退火形成dsDNA的实例中，ssDNA分子重新退火形成dsDNA的趋向(例如当ssDNA分子重新退火形成dsDNA时释放的能量)，可影响逆向前进电刺激的极性和/或量值。在其中随着分子逆向通过纳米孔，分子与杂交标记重新杂交的其它实例中，分子与杂交标记重新杂交的趋向(例如当分子与杂交标记重新杂交时释放的能量)，可影响逆向前进电刺激的极性和/或量值。
用本文所述技术表征的分子可具有不同的类型，包括带电或极性分子，例如带电或极性聚合物分子。具体实例包括核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)分子。DNA可为单链DNA (ssDNA)或双链DNA (dsDNA)分子。其它实例包括多肽链或蛋白。
分子可在分析之前进行修饰。例如，分子可在分析之前与杂交标记杂交。杂交标记可以是可与待表征的分子结合的任何物质。杂交标记可以起更改使分子移动通过纳米孔所需的能量(例如电压水平)的作用，和/或可通过例如影响以下方面来改变分子穿过纳米孔时的电特征：待表征分子的构象；扯开待表征分子与杂交标记以使该分子穿过纳米孔所需的能量；当分子与杂交标记重新杂交时释放的能量。应该注意的是，杂交标记可以与或可以不必与待表征分子一起移动通过纳米孔。杂交标记的实例包括DNA、RNA、修饰的DNA、修饰的RNA、配体、聚合物、维生素、荧光分子、珠粒。例如，在待表征分子包含核苷酸分子(例如DNA分子)的情况下，杂交标记可包括与整个待表征核苷酸分子或待表征核苷酸分子的目的区域互补的核苷酸序列(例如DNA或RNA序列)链或修饰的核苷酸序列(例如修饰的DNA或RNA序列)链。例如，杂交标记可包括与以下位点的核苷酸序列互补的核苷酸序列：单核苷酸多态性(SNP)位点、拷贝数变化位点、甲基化位点、蛋白结合位点、酶结合位点、重复序列位点、限制酶位点、miRNA位点、siRNA位点、tRNA位点、转座子位点、着丝粒位点、端粒位点、易位位点、插入位点或缺失位点。
本文所述电刺激可为不同的电刺激，例如施加的电流和施加的电压。电流可为直流电(DC)和/或交流电(AC)。电刺激可构成一系列的电脉冲。
电特征可以包括纳米孔、脂质双层或纳米孔-脂质双层系统的任何可测量的电特性，所述电特性随着分子通过纳米孔而改变，其表明所述分子的性质或结构。例如，DNA分子的不同单独碱基对或碱基对序列可以引起纳米孔具有不同的离子电流或电阻。此外，由于DNA分子的不同碱基对之间不同的键合强度所致，可能需要更多或更少的电压来使陷入的DNA分子移动通过纳米孔。通过DNA分子与不同杂交标记杂交，可以使DNA分子的不同碱基对之间的键合强度更大或更小。因此，在不同的实施方案中，电特征可以包括瞬时的测量，或随时间对跨越脂质双层的电压、电阻和/或电流概况进行的测量。例如，电特征可包括影响分子通过纳米孔所需的可变电刺激的量值。电特征也可以是组合电特征，所述组合电特征联合分子通过纳米孔时不同离散部分或框(frame)的电特征。例如，可以基于组合电特征来表征DNA分子，所述组合电特征联合了DNA分子的多种框的电特征，每一框对应于DNA分子在施加电刺激下穿过纳米孔时的DNA分子区域(例如1-20个碱基的序列)的电特征。在一些实施方案中，可将分子的一个或多个重叠框的电特征组合并解卷积，以产生分子的电特征。使取样框重叠可允许更准确地表征分子。
在一些实施方案中，为了收集更多可以用于表征分子的数据，可以在相同的或不同的化学或环境条件下获得分子的多种电测量结果。可通过在相同或不同条件下让分子重复穿过纳米孔倒回并重复电测量，来获得同一分子的多种电测量结果。在一些实施方案中，可以通过改变一种或多种不同的环境变量来达到不同的化学或环境条件，所述环境变量例如pH、盐浓度、甘油浓度、尿素浓度、甜菜碱浓度、甲酰胺浓度、温度、二价阳离子浓度和其它环境变量。可在单个实验中对同一分子或在不同实验中对相同分子或不同分子实施重复测量。可通过在施加逆向前进电刺激下让分子在纳米孔中倒回来实施重复测量。在一些实施方案中，可以对分子的一个或多个目标区域实施重复测量，所述目标区域例如DNA分子的单核苷酸多态性(SNP)位点和甲基化位点。在一些实施方案中，随着待表征的分子被拉过纳米孔，其可呈现不同的构象和/或取向，这导致所测量的同一分子的电特征因实验不同而不同，造成难以表征该分子。通过通常在相同条件下重复测量同一分子的电特征，并自重复测量中获得所述分子的独特电特征文库，可将来自所述分子的不同构象和/或取向的不同的特征，用于反复核对并提高在鉴别特殊生物标记时的置信度。
分子表征可包括测定导致可测量电特征方面的变化的分子的任何特性。例如，DNA分子的碱基序列可以源自对随着DNA分子通过纳米孔在通过纳米孔的离子电流(或电阻)方面的变化的测量，和/或源自对在分子的不同点牵引分子的至少一部分(例如dsDNA分子的单条链)通过纳米孔所需要的电压的测量。如果待表征的分子是dsDNA，表征分子可以包括鉴别dsDNA分子的一个或多个GC和/或AT碱基对。表征分子亦可包括测定分子的特性以获得分子的可能结构，这通过对所测量的分子的电特征与已知的分子的电特征进行比较和关联来实现。例如，可通过对所测量的DNA分子的电特征与已知的DNA区段的电特征进行比较和关联，来测定该DNA分子区段的碱基序列。在一些实施方案中，待表征分子是基因的DNA区段。可将用本文所述技术测定的DNA区段的序列用于基因的从头测序。在一个实例中，可用一种或多种限制性内切酶将待测序的基因断裂为较短的核苷酸序列(例如50-10,000个碱基对)。可以通过让所检测的DNA区段的电特征与已知DNA序列的电特征关联，来测定单独DNA区段的序列。然后可通过比对断裂的DNA区段的重叠部分，来重建基因组的完整序列。
本文所述的用于操作和表征分子的技术可以是高度灵敏的，且可以不需要大量的样品处理，例如扩增、分离和衍生，因此可需要非常小量的样品。这使本文所述技术尤其适合需要高灵敏度和/或提供受限样本大小的应用。所述应用的实例包括癌生物标记筛查、传染病检测、新生儿筛查和生物恐怖剂筛查。
另外，本文阐述了用于在基本上平坦的固体表面上组装脂质双层的技术。可通过不适合形成脂质双层的一个或多个脂质双层不相容表面，来隔离脂质双层相容表面。脂质双层不相容表面可限制所形成的脂质双层的大小到脂质双层相容表面的边缘，因为脂质双层仅在脂质双层相容表面上形成，不在脂质双层不相容表面上形成。在一个实例中，将脂质悬浮液(例如含有悬浮脂质胶体的水性电解质溶液)沉积于脂质双层相容表面以及邻近的脂质双层不相容表面上。在一些实施方案中，脂质双层相容表面包含亲水材料。可以使用任何趋于允许形成脂质双层的材料。在一些实施方案中，脂质双层不相容表面包含亲脂材料。可以使用任何趋于抑制形成脂质双层的材料。然后在脂质双层相容表面上形成用快速扩散气体分子充满的脂质泡沫。本文中将该泡沫称为脂质双层起始泡沫。使气体分子扩散出该泡沫，该泡沫合拢或破裂以在固体表面形成脂质双层。
可使用很多技术来形成上述脂质双层起始泡沫。例如，沉积于脂质双层相容表面(例如电极表面)上的脂质悬浮液，可以包括可起反应或分解以形成快速扩散气体分子的化学制品。快速扩散气体分子可以是可快速地扩散通过脂质层的任何气态分子。一般而言，较大分子或离子的气态分子不能很好地扩散通过脂质双层，而较小的非极性分子可迅速地扩散通过脂质双层。快速扩散的气态分子实例包括O2 和CO2。在一个实例中，脂质悬浮液包括甲酸钾分子，将具有0.3 V - 3.0 V范围的泡沫起始电刺激施于脂质悬浮液100毫秒-1秒，以引起甲酸盐分子分解形成快速扩散C2O。在另一实例中，可将具有0.5 V - 3.0 V范围的泡沫起始电刺激施于脂质悬浮液，以氧化H2O形成快速扩散的O2气体分子。
可用不同的技术检查脂质双层的结构完整性和/或电特性，以保证其具有必须的结构和/或电特性。在一个实例中，可跨越脂质双层施予交流电(AC)，以检测脂质双层的电容。在一些实施方案中，如果检测的电容大于约5 fF/μm2，则认为脂质双层得以适当形成，并具有必要的结构和电特性，否则没有适当地形成脂质双层，可施予清除性电刺激以清除所述脂质双层，因此可再次开始在脂质双层相容表面组装脂质双层的过程。
此外，本文阐述了用于向脂质双层中插入纳米孔的技术。在一个实例中，将含有纳米孔形成分子的溶液沉积于脂质双层上，跨越脂质双层施加搅动刺激以破坏脂质双层，促进纳米孔插入到脂质双层。搅动刺激可以是可引起脂质双层破坏(优选暂时破坏)以便于纳米孔插入的任何种类的刺激。它可以是电、热、化学、声(音频)、机械和/或光刺激。在一个实例中，搅动刺激是具有100 mV-1.0 V范围持续50毫秒-1秒的搅动电压水平。
在一些实施方案中，意外地或有意地使用具有300 mV -3V (或-300 mV到-3 V)范围的破坏性电刺激来损坏或毁灭脂质双层或含有纳米孔的脂质双层，以便可在平坦固体表面上形成新的含有纳米孔的脂质双层。脂质双层的破坏可以引起脂质双层下面的表面氧化或还原。在这种情况下，可施加具有50 mV -300 mV量值的清洗性电刺激，以逆转固体表面的氧化或还原。
可监测脂质双层以保证已经插入需要数量的纳米孔，并在该过程期间没有损坏脂质双层。在一个实例中，跨越脂质双层施加测量性电刺激，并测量脂质双层的电阻(或离子电流)。脂质双层电阻的量值表明是否有任何纳米孔已经插入脂质双层，如果纳米孔已经插入则插入了多少纳米孔，以及在该过程期间脂质双层是否遭到损坏。如果确定已经插入需要数量的纳米孔并且在此过程中脂质双层没有损坏，则可将该脂质双层用于利用本文所述技术表征分子。如果确定没有插入纳米孔，可以施加另一次搅动电刺激。如果确定已插入多于需要数量的纳米孔或脂质双层已经遭到损坏，则可跨越脂质双层施加清除性电刺激清除脂质双层，以便重新开始构建脂质双层和插入纳米孔的过程。
图1是纳米孔装置100的示意图，该装置可如上述实例所述用于表征分子，其中含有纳米孔的脂质双层由电阻和电容表征。纳米孔装置100包括在导电固体基底106的脂质双层相容表面104上形成的脂质双层102，其中脂质双层相容表面104可以由脂质双层不相容表面105隔开，导电固体基底106可以由绝缘材料107电隔离，其中脂质双层102可以由在脂质双层不相容表面105上形成的无定形脂质103包围。脂质双层102嵌有单个纳米孔结构108，纳米孔结构108具有大到足以让待表征的分子112的至少一部分和/或脂质双层102的两侧之间的小离子(例如Na+、K+、Ca2+、Cl-)通过的纳米孔110。可将水分子层114吸附于脂质双层相容表面104上，夹在脂质双层102和脂质双层相容表面104之间。吸附于亲水脂质双层相容表面104上的水膜114可以促进脂质分子的有序化，并促进在脂质双层相容表面104上形成脂质双层。可在脂质双层102上提供含有分子112的溶液的样品室116，用于引入分子112以表征。所述溶液可以是含有电解质的水溶液，可将其缓冲至最适离子浓度，维持最适pH以保持纳米孔110开放。所述装置包括一对电极118 (包括负极118a和正极118b)，其与可变电压电源120耦合以提供跨业脂质双层的电刺激(例如偏压)，并传感所述脂质双层电特性(例如电阻、电容和离子电流)。负正电极118b的表面是或形成脂质双层相容表面104的一部分。导电固体基底106可以耦合或形成电极118之一的一部分。装置100也可以包括用于控制电刺激和用于处理所检测的信号的电路122。在一些实施方案中，可变电压电源120作为电路122的一部分包括在内。电路122可以包括放大器、积分器、噪声滤波器、反馈控制逻辑和/或各种其它元件。电路122可以是在硅基底128内集成的集成电路，可进一步与耦合了存储器126的电脑处理器124耦合。
可自适合于离子转导和气体形成以促进脂质双层形成的各种材料形成脂质双层相容表面104。在一些实施方案中，优选与绝缘亲水材料相反的导电或半导电的亲水材料，因为它们可允许更好地检测脂质双层电特性的改变。材料实例包括Ag-AgCl、Ag-Au合金、Ag-Pt合金或掺杂硅或其它半导体材料。
可自不适合于脂质双层形成的各种材料形成脂质双层不相容表面105，它们通常疏水。在一些实施方案中，优选不导电的疏水材料，因为其除了将脂质双层区域彼此分离外，还在电学上使脂质双层区域绝缘。脂质双层不相容材料实例包括例如氮化硅(例如Si3N4)和特氟隆(Teflon)。
在一个特殊实例中，图1的纳米孔装置100是α-溶血素(αHL)纳米孔装置，其具有嵌入于二植烷酰基磷脂酰胆碱(DPhPC)脂质双层102中的单个αHL蛋白108，所述脂质双层102在涂覆于铜材料106上的脂质双层相容性银-金合金表面104上形成。脂质双层相容性银-金合金表面104由脂质双层不相容氮化硅表面105隔离，铜材料106由氮化硅材料107电绝缘。铜106与集成于硅基底128的电路122耦合。置于芯片上或从盖板128向下延伸的银-氯化银电极与含有dsDNA分子的水溶液接触。
αHL纳米孔是七个单独的肽的装配体。αHL纳米孔入口或前庭(vestible)的直径大约26 Å，其宽度足以容纳dsDNA分子的一部分。从前庭开始，αHL纳米孔首先加宽然后变窄为具有约15 Å直径的桶，其宽度足以允许单个ssDNA分子通过但不足以使dsDNA分子通过。在给定时间，大约1-20个DNA碱基可占据αHL纳米孔的桶。
除了DPhPC外，纳米孔装置的脂质双层还可自不同的其它适合的两性分子材料组装，所述材料基于以下各种考虑而选择：例如所用的纳米孔的类型；待表征的分子的类型；和所形成的脂质双层的不同的物理、化学和/或电特性，例如所形成的脂质双层的稳定性和通透性、电阻和电容。两性分子材料的实例包括各种磷脂类，例如棕榈酰基-油酰基-磷脂酰胆碱(POPC)和二油酰基-磷脂酰甲酯(DOPME)、二植烷酰基磷脂酰胆碱(DPhPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油和鞘磷脂。
除了上文所示αHL纳米孔之外，纳米孔还可以是各种其它类型的纳米孔。实例包括γ-溶血素、杀白细胞素、蜂毒肽和各种其它天然存在的纳米孔、经修饰天然纳米孔和合成的纳米孔。可以基于分析物分子的不同特性挑选适合的纳米孔，例如相对于纳米孔的孔径的分析物分子的大小。例如，αHL纳米孔具有大约15 Å的限制性孔径。其适合于分析DNA分子，因为它允许单链DNA (ssDNA)通过而限制双链DNA (dsDNA)。
图2是纳米孔阵列单室的实例电路122的示意图。电路122用于控制跨越含有纳米孔的脂质双层102施加的电刺激，并用于检测通过纳米孔的分子的电特征或电模式。粗线代表模拟信号水平，细线代表逻辑信号水平。如此处所示，电路122包括跨越含有纳米孔的脂质双层102放置的一对电极118a、118b。正极118b的表面形成脂质双层相容表面104，邻近的氮化硅107表面形成脂质双层不相容表面105。通过在多路调制器204处自多种输入源202选择输入源，来控制由电极跨越脂质双层施加的输入电压。多种电压电源中的每一种都可提供DC、AC、脉冲、斜坡AC和/或斜坡DC信号。通过放大器206放大信号，然后由比较器212与设定值214比较，比较器212在放大信号达到设定值214时输出信号。
在恒定输入电压下放大信号达到设定值214的时间可与脂质双层电阻和穿过脂质双层的离子电流相关。较长时间与较大电阻和穿过脂质双层的较小离子电流相对应。在调制输入电压(例如用正弦波调制)下由比较器检测的放大信号的峰之间的振幅可同样地与脂质双层电容相关。较大的峰间振幅与较高电容相对应。
电路122进一步包括用于降低噪音水平的电容器216和用于使电容器208复位的开关210。提供逻辑控制器218来控制电路不同元件的操作，并处理比较器的信号输出。
应该注意的是，以上电路设计仅仅是一个实例，其它适合的电路设计也可以用于控制跨越脂质双层施加的电刺激，并用于测量电极上的表面的电特性或特征，例如以下物质的电特性或特征：脂质悬浮液、脂质双层、含纳米孔的脂质双层和/或穿过脂质双层中含有的纳米孔的分析物分子。
图3A是纳米孔芯片300的实施方案示意图的俯视图，所述纳米孔芯片300具有单独可寻址纳米孔装置100的阵列302，所述纳米孔装置100具有由脂质双层不相容表面105隔离的脂质双层相容表面104。每个纳米孔装置100包括集成在硅基底128上的控制电路122。在一些实施方案中，可包括侧壁136以分开纳米孔装置100的组群，使得各组群可接收不同的样品用于表征。在一些实施方案中，纳米孔芯片300可包括盖板128。纳米孔芯片300亦可包括多个插头304以与电脑处理器接口连接。在一些实施方案中，纳米孔芯片300可以与纳米孔工作站306耦合(例如对接)，纳米孔工作站306可包括用于执行(例如自动执行)本发明过程的不同实施方案的各种元件，包括例如分析物递送机构(例如用于递送脂质悬浮液、分析物溶液和/或其它液体、悬浮液或固体的移液管)、机器臂、电脑处理器和存储器。图3B是纳米孔芯片300的横断面视图。
图4是描述用于在脂质双层相容表面104上组装脂质双层的实例过程400A的示意图。可用图1和3的纳米孔装置100实施过程400A。图4B、4C和4D图解在该过程中纳米孔装置100的不同阶段。
回顾图4A，在本实例中，脂质双层是二植烷酰基磷脂酰胆碱(DPhPC)脂质双层。脂质双层相容表面104是由一个或多个脂质双层不相容氮化硅表面隔离的Ag-Au合金表面。可用电路、计算机硬件和/或计算机软件自动实施该处理的一个或多个步骤。顶端迹线402代表跨越脂质双层施加的电压曲线。底部迹线404代表跨越脂质双层检测到的电阻曲线。
在时间t0时，将含有溶于癸烷中的10 mg/mL胶质二植烷酰基磷脂酰胆碱(DPhPC)和溶入1 M KCl的0.1 M甲酸钾的水性脂质悬浮液沉积于Ag-Au合金电极表面。例如可以用诸如移液管等液体分配器来沉积脂质悬浮液。在一些实施方案中，可以用各种硬件(例如机器臂)和软件使液体分配器自动化。Ag-Au合金是亲水的，其引起脂质分子在其表面以促进脂质双层形成的方式自我组织。在t0–t1时间，纳米孔装置处于阶段I (在图4B中阐明)。在阶段I，无定形脂质103集中在脂质双层不相容表面105上，并且几乎不存在于脂质双层相容表面104上。将测量性电压(约50 mV) 406施予电极。电极的电阻对时间的曲线408表明电阻相对低(约10KΩ-10 MΩ)，电极短路。
在时间t1时，在电极间施加具有约1.4 V -约3.0 V范围、持续时间为约100毫秒到约1秒的泡沫起始刺激410。泡沫起始刺激410引起甲酸盐分解以形成气体CO2，我们认为甲酸盐大部分存在于亲水的脂质双层相容性银-金合金表面而不在疏水的脂质双层不相容性氮化硅表面，气体CO2引起在固体银-金合金电极表面形成泡沫130。纳米孔装置处于阶段II(在图4C中阐明)。泡沫覆盖电极，当其接触到脂质双层相容表面104边缘的无定形脂质材料103时停止。在脂质双层相容表面上形成电密封和机械密封。在时间t1-t2时的电阻对时间的曲线412表明由于泡沫形成所致的电阻的显著增加(例如>10 GΩ)。
在时间t2-t3 (约100毫秒-1秒)时，CO2快速扩散出泡沫，引起泡沫崩解并逐步形成脂质双层。纳米孔装置处于固体电极表面104上的阶段II (在图4C中阐明) 102。脂质双层由聚集在脂质双层不相容氮化硅表面105上的无定形脂质103包围。在所施加的测量性电压(约50 mV) 414下跨越纳米孔装置416的电阻由于脂质双层102的存在依然高。
在时间t3-t4 (约50毫秒-500毫秒)时，业已形成脂质双层102，纳米孔装置处于阶段III (在图4D中阐明)。跨越脂质双层施加交流电418以检查适当的脂质双层电阻420和/或电容(未显示)。如果所测量的电容具有大于大约5 fF/µm2的值并且如果测量的电阻具有大于大约10 GΩ的值，那么确定已经形成具有完好的结构完整性的适当形成的脂质双层。否则，确定脂质双层具有差的结构完整性。如果确定脂质双层具有完好的结构完整性，则纳米孔装置100准备好插入纳米孔，其如参考图5所阐明。如果确定脂质双层具有差的结构完整性，则跨越脂质双层施加破坏性或清除性电刺激(例如约2 V)以清除所述脂质双层。纳米孔装置100返回到阶段I (在图4B中所阐明)。
图5A是将纳米孔插入脂质双层的过程500实施方案的示意图。所述过程可用图1或3的纳米孔装置100来执行。可以用硬件(例如集成电路)和/或计算机编码来使所述过程的一个或多个步骤自动化。用图1的纳米孔装置100来监控双层形成过程。迹线A代表跨越脂质双层施加的电压。迹线B代表跨越脂质双层检测到的电阻。图5B-E阐明纳米孔装置100在该过程中的不同阶段。
回顾图5A，在时间t0–t1时，纳米孔装置包括结构完好的脂质双层膜，纳米孔装置处于阶段III (在图5B中阐明)。含有纳米孔形成肽α-溶血素的溶液在脂质双层上。跨越脂质双层施加测量性刺激(例如约50 mV)502，返回落入期需范围(约10 GΩ)内的电阻值504，这表明缺乏通过脂质双层的离子电流。
在时间t1–t2时，跨越脂质双层膜施加搅动电刺激506 (约100 mV-1.0 V，持续50毫秒-1秒)，导致脂质双层破坏，启动α-溶血素纳米孔插入脂质双层。
在时间t2–t3及紧接着搅动电刺激506后，施加负电刺激508。负脉冲意在逆转可由脂质双层意外破裂引起的任何氧化(例如电极的氧化)。
在时间t3–t4时，施加测量性电刺激(约50 mV)510以检查适当的纳米孔插入。检测的电阻512的量值给出以下指示：纳米孔是否已插入；如果插入纳米孔，则插入了多少纳米孔；以及脂质双层在该过程中是否遭破坏或毁坏。512显示随着纳米孔插入而电阻下降的实例。例如，未插入纳米孔的脂质双层具有范围为10 GΩ的电阻，插入有单个纳米孔的脂质双层(阶段IV，图5C中阐明)具有范围为1 GΩ的电阻，插入有两个或更多个纳米孔的脂质双层(阶段V，图5D中阐明)具有范围为约500 MΩ电阻的，破坏或毁坏的脂质双层具有范围小于大约10 MΩ的电阻。如果确定脂质双层中没有插入纳米孔，可以施加另一次搅动电刺激。如果表明插入了单个纳米孔，并且脂质双层结构上完好，所述过程结束，纳米孔装置准备好用于分析分析物分子。如果检测到多于一个纳米孔已插入或脂质双层破坏，可施加清除性或破坏性电刺激(约300 mV -3 V) 514以清除脂质双层。脂质双层电极再一次短路，纳米孔装置处于阶段I (在图5E中阐明)。破坏性电刺激可后接清洗性电刺激(50 mV-300 mV)，以逆转可由于脂质双层破坏所致而发生在电极表面的氧化。可以再次启动组装脂质双层(例如图4)和插入纳米孔(例如图5)的整个过程。
图6A是阐明用于用纳米孔装置在纳米孔中操作、检测、关联、表征、分析分子和/或测定分子序列的过程600的实施方案的示意图。可以经由硬件(例如集成电路)和/或计算机编码的执行使所述过程的一个或多个步骤自动化。在所阐明的实例中，用在纳米孔装置上形成的脂质双层例如DPhPC脂质双层中插入的αHL纳米孔来表征dsDNA分子，所述纳米孔装置如在图1或3中所阐明。图6B-C阐明在该过程期间纳米孔装置所处的不同阶段。
回顾6A，迹线A代表跨越含有纳米孔的脂质双层施加的电压。迹线B代表跨越含有纳米孔的脂质双层检测到的电阻。在时间t0时，通过例如在脂质双层附近沉积分析物溶液，来将含有双链DNA (dsDNA)分子的分析物溶液呈提给脂质双层。在该实例中分析物溶液为缓冲到适当的pH 7.5-8.0的含有分析物分子和小电解质(例如Na+、K+、Ca+、Cl-)的水溶液。纳米孔具有开放通道，含有纳米孔的脂质双层的电阻具有大约1GΩ的电阻(阶段IV，在图6A中阐明)。
在时间t0–t1时，跨越纳米孔装置的脂质双层施加获取性电刺激(约100 mV-400mV)602，这引起单个dsDNA分子被纳米孔捕获(阶段V，在图6A中阐明)。电阻对时间的曲线表明电阻604急剧增加到6 GΩ，这与纳米孔被dsDNA分子部分阻塞的孔阻塞状态(阶段V，在图6C中阐明)相对应。
在时间t1–t2时，电阻604的急剧增加触发调控机构(例如图2中电路122的反馈调控机构)，以在快速反应时间(例如<10毫秒) 606内降低所述电刺激到保持性电刺激(约50mV-150 mV)608，以便将dsDNA保持在纳米孔内用于检测、表征和/或分析。所述短反应时间允许分析物分子陷于纳米孔以表征，而不是通过纳米孔并在另一端离去。
在时间t2–t3时，用保持性电刺激使dsDNA分子保持在纳米孔内，记录电阻对时间的曲线的第一框(first frame)(f1)。
随后从t3–t7，将多系列的可变前进电刺激609施予陷入纳米孔中的DNA分子，其中可变前进电刺激的每一系列610包含相继较高的或更强烈的电脉冲613。如图所阐明，每一个电脉冲613包含斜坡上升阶段615、斜坡下降阶段617，其类似倒“V”，具有大约100 mV-200mV的范围。每一个电脉冲613之后接着是保持阶段619。如图所阐明，起始斜坡上升阶段615的斜坡比随后的斜坡下降阶段617的斜坡陡。每一系列电脉冲610可以导致dsDNA分子的框(例如1-20个碱基对)解链，解链的dsDNA分子框的单链在所施加的前进电刺激下牵引过纳米孔。在每一个保持阶段619期间测量分子框的电模式或特征。细节如下：
在时间t3–t4时，跨越脂质双层施加一系列相继较高的前进电刺激(例如不对称电脉冲) 610以驱使dsDNA通过纳米孔。在每次电脉冲613后，在电脉冲613后紧接着的保持阶段619期间监测电阻对时间的曲线。如果所检测的电阻对时间的曲线与前述框f1的一样，则表明电刺激水平未高到足以驱使DNA分子通过纳米孔，施加较高电刺激水平。重复相继施加较高电刺激水平的过程，直至不同的电阻对时间的曲线表明业已获得新的框f2，记录新的框。
在时间t4–t5时，重复先前的施加相继较高的前进电刺激以牵引DNA分子的过程，直到获得新的框f3。
在时间t5–t6时，重复先前的施加可变且相继较高的前进电刺激以牵引DNA分子的过程，以获得新的框f4并记录。
在时间t6–t7时，重复先前的施加相继较高的前进电刺激的过程，以获得新的框f5。可以重复施加相继较高的前进电刺激以获得新的框的该过程。
在超过t7的时间时，电阻对时间的曲线可以达到与纳米孔(阶段IV，图6B中阐明)612的开放状态相对应的水平。这表明DNA分子已逃离纳米孔，纳米孔中的离子流动不受DNA分子阻碍。
当DNA分子的特殊区域羁绊于纳米孔的狭窄通道时，各框(f1到f5)中的每一个对应于电阻信息。随着分析物分子穿过纳米孔，可将各框单独地或组合地用于阐明、检测、关联、测定、表征、测序和/或鉴别该分析物分子的不同结构和化学特征。在一些实施方案中，分子的一个或多个框可以重叠。取样框的重叠可允许更准确地表征DNA分子。例如，dsDNA分子的单条链穿过纳米孔，ssDNA具有序列5’TGACTCATTAGCGAGG…3’。分子的第一个框是对区段TGACT检测到的电特征，第二个框是对ACTCA检测到的电特征，第三个框是对TCATT检测到的电特征，第四个框是对ATTAG检测到的电特征，如此等等。可将不同的重叠框的电特征组合和解卷积，以产生分子的更准确的电特征。
尽管在本实例中，使用具有起始斜坡上升阶段615和随后的斜坡下降阶段617的倒“V”形前进电刺激脉冲613，但可以使用其它类型的前进电刺激脉冲。在一些实施方案中，前进电刺激脉冲可以像矩形波(如图7A中阐明)、平滑波(如图7B中阐明)或具有平坦中心的倒“U” (如图7C中阐明)。在一些实施方案中，前进电刺激不具有斜坡上升阶段615和斜坡下降阶段617，例如，前进电刺激包括稳定恒定的前进电刺激610 (如图7D中阐明)。
尽管在本实例中，在每一个前进电刺激脉冲613之后有保持阶段619，且在每一保持阶段619期间测量分子的电特征，但是在其它实施方案中，可以消除保持阶段619，可以在施加前进电刺激时和在所施加的电刺激下分子移动通过纳米孔时测量(例如连续地)分子的电特征。在一个实例中，施加倒“V”形前进电刺激脉冲613，而没有保持阶段619，当前进电刺激斜坡上升和斜坡下降(例如施加在电极的电压斜坡上升或斜坡下降)时测量分子的电特征。在所述情况下，可作为变化的前进电刺激水平(例如变化的电压水平)的函数来测定分子的电特征(例如分子的电阻曲线)，可将所述信息用于区别待表征的不同的分子(例如不同DNA框)。在另一实例中，施加恒定前进电刺激而无保持阶段，在施加恒定前进电刺激时和在恒定前进电刺激下分子移动通过纳米孔时测量分子的电特征。
如先前所讨论，图7A-D阐明除了倒“V”形前进电刺激之外的前进电刺激的各种实施方案。
图8是阐明用于在纳米孔装置的纳米孔中逆转分子的前进的过程800的实施方案的示意图。在所阐明的实例中，用αHL纳米孔分析dsDNA。使用恒定前进电刺激和逆向前进电刺激，当施加恒定前进电刺激和逆向前进电刺激时和当分子移动通过纳米孔时连续记录分子的电特征。
尽管在本实例中使用恒定前进电刺激，但可使用各种其它类型的前进电刺激。在图6和8中阐明各种前进电刺激实例。尽管在本实施例中使用恒定的逆向前进电刺激，但可使用各种其它类型的逆向前进电刺激。逆向前进电刺激可包括斜坡上升和/或斜坡下降，可包括与前进电刺激相似的平滑、矩形、“V”和/或“U”形曲线。
迹线A代表跨越含有纳米孔的脂质双层施加的电压。迹线B代表跨越含有脂质纳米孔的双层检测的电阻。可用硬件(例如集成电路)和/或计算机编码的执行使所述过程的一个或多个步骤自动化。
在时间t0–t1时，跨越纳米孔装置的脂质双层施加前进电刺激802，这引起dsDNA分子朝所施加的电力805方向移动(阶段V，在图8B中阐明)，同时记录脂质双层的电阻对时间的曲线804。
在时间t1-t2时，跨越脂质双层施加逆向前进电刺激806。在本实例中，逆向前进电刺激806是具有约-50 mV到100 mV范围的所施加的电压水平。ssDNA分子再结合以形成dsDNA的天然趋向朝逆方向807驱动DNA分子(阶段VI，在图8C中阐明)。随着朝逆方向807穿过纳米孔推回DNA分子，ssDNA再结合形成dsDNA。
在超过t2的时间时，再次跨越脂质双层施加前进电刺激810，这恢复DNA分子向前前进(阶段V，在图8B中阐明)。
图9是当用本文所述技术使dsDNA分子的单条链通过αHL纳米孔时检测到的电阻对时间的曲线902的实例。在所示实例中，对含有纳米孔的脂质双层施加恒定的前进电刺激，在施加恒定前进电刺激时和在DNA分子移动通过纳米孔时，连续记录陷于纳米孔的DNA分子的电特征。可通过对所检测的电阻曲线与已知DNA序列的电阻曲线进行比较，来测定DNA分子的碱基序列。例如，如果电阻对时间的曲线匹配，则可确定该DNA分子的碱基序列为已知DNA分子的碱基序列。可将曲线的各种特征例如振幅、频率、边缘上升(例如边缘上升时间)和/或边缘下降(例如边缘下降时间)，用于鉴别特殊DNA序列。
阐述了用于在嵌入于脂质双层的纳米孔中操作分子的技术。在一个实例中，跨越脂质双层施加获取性电刺激水平，其中含有纳米孔的脂质双层区域由电阻表征，其中获取性电刺激水平趋于把分子从周围流体拉进纳米孔中，检测到因获得分子的至少一部分进入纳米孔而产生的脂质双层电阻的变化，将获取性电刺激水平改变到保持性电刺激水平，其中当获取性电刺激水平改变到保持性电刺激水平时该分子的该部分仍保留在纳米孔中。
本文阐述了用于鉴别分子的一部分的技术。在一个实例中，获得了与分子相关的多种电测量结果，其中多种电测量结果中的每一种与纳米孔中分子的离散位置相对应。所述多种电测量结果与对应于分子的可能结构的电测量结果的一个或多个序列相关联。基于所述关联来确定分子的该部分包括分子的可能结构。
本文阐述了用于表征分子的技术。在一个实例中，该分子的一部分陷入纳米孔中，跨越纳米孔施加可变电压直到在纳米孔内移动分子的陷入部分，基于影响纳米孔内分子的陷入部分的至少一部分移动所需的电刺激来表征分子。
本文阐述用于在基本上平坦的固体表面上组装脂质双层的技术。在一个实例中，将脂质材料例如脂质悬浮液沉积在基本上平坦的固体表面上，在所述固体表面上形成用快速扩散气体分子充满的泡沫，允许所述气体分子扩散出泡沫以在所述固体表面上形成脂质双层。
本文阐述了用于在脂质双层中形成纳米孔的技术。在一个实例中，对脂质双层施加搅动刺激水平例如电搅动刺激，其中搅动刺激水平趋于促进在脂质双层中形成纳米孔。在一些实施方案中，检测到因在脂质双层中形成纳米孔而导致的脂质双层电特性的变化，基于所检测到的脂质双层电特性的变化确定脂质双层中已经形成纳米孔。
尽管为了清楚地理解的目的，业已相当细节地阐述了前述实施方案，但本发明不限于所提供的细节。有许多实现本发明的备选方式。所揭示实施方案为阐明性而非限制性的。
尽管在本文所述不同实施方案中依照电阻对时间的曲线表示电特征，但应该注意的是，在其它实施方案中电特征也可依照电压对时间的曲线和/或电流对时间的曲线来表示。同样应该注意的是，可直接或间接测量电特性。例如，可通过电压和/或电流直接或间接测量电阻，可通过电阻和/或电压直接或间接测量电流。对于本文所述的纳米孔系统的具体实例，给出所有范围的电刺激。在化学性质不同的其它纳米孔系统中，可施加不同范围的电刺激。

Claims (15)

1.一种在脂质双层中形成纳米孔的方法，所述方法包括：
基于来自传感电路的第一测量，确定脂质双层形成；
响应于该脂质双层形成的确定并且在形成纳米孔的分子沉积在该脂质双层上之后，对该脂质双层施加100 mV-1.0 V的搅动刺激水平50毫秒-1秒的预定时间，其中所述搅动刺激水平促进在所述脂质双层中形成纳米孔；以及
在搅动刺激水平后，对所述脂质双层施加测量性电刺激水平并且基于从响应于所述测量性电刺激水平传感的传感电路接收的第二测量确定已经形成纳米孔，其中所述搅动刺激水平的量比所述测量性电刺激水平的量大。
2.权利要求1的方法，其中所述搅动刺激趋于促进在所述脂质双层中插入α-溶血素纳米孔。
3.权利要求1的方法，其进一步包括：
检测因在所述脂质双层中形成纳米孔而导致的所述脂质双层电特性的变化；
基于所检测的所述脂质双层电特性的变化来确定已在所述脂质双层中形成纳米孔。
4.一种用于在由电阻表征的脂质双层中形成纳米孔的系统，其包括：
来源；
与该来源耦合的传感电路；和
处理器，其中该处理器被编程以：
基于来自传感电路的第一测量，确定脂质双层形成；
响应于该脂质双层形成的确定并且在形成纳米孔的分子沉积在该脂质双层上之后，控制该来源以向该脂质双层施加100 mV-1.0 V的搅动刺激水平50毫秒-1秒的预定时间，其中所述搅动刺激水平趋于促进在所述脂质双层中形成纳米孔；以及
在搅动刺激水平后，对所述脂质双层施加测量性电刺激水平并且基于从响应于所述测量性电刺激水平传感的传感电路接收的第二测量确定已经形成纳米孔，其中所述搅动刺激水平的量比所述测量性电刺激水平的量大。
5.权利要求4的系统，其中该传感电路被配置以检测因在所述脂质双层中形成纳米孔而导致的所述脂质双层电特性的变化；和
其中该处理器被配置以基于检测到的所述脂质双层电特性的变化来确定在所述脂质双层中已形成纳米孔。
6.权利要求3的方法，其中检测所述脂质双层电特性的变化包括检测所述脂质双层电阻的变化。
7.权利要求3的方法，其中确定形成纳米孔包括基于所述脂质双层电特性变化的大小来确定所形成的纳米孔的数量。
8.权利要求7的方法，其中响应于确定在所述脂质双层中形成不止一个纳米孔时施加清除性电刺激以清除所述脂质双层。
9.权利要求7的方法，其中当确定在所述脂质双层中未形成纳米孔时，对所述脂质双层施加另一个搅动电刺激水平，其中所述另一个搅动电刺激水平趋于促进在所述脂质双层中形成纳米孔。
10.权利要求3的方法，其中检测因在所述脂质双层中形成纳米孔而导致的所述脂质双层电特性的变化包括检测所述脂质双层电阻的降低。
11.权利要求5的系统，其中检测在所述脂质双层电特性的变化包括检测所述脂质双层电阻的变化。
12.权利要求5的系统，其中确定形成纳米孔包括基于所述脂质双层电特性变化的大小来确定形成的纳米孔的数量。
13.权利要求12的系统，其中该处理器被进一步编程以响应于确定在所述脂质双层中形成不止一个纳米孔时控制该来源从而施加清除性电刺激以清除所述脂质双层。
14.权利要求12的系统，其中该处理器被进一步编程以控制该来源从而当确定在所述脂质双层中未形成纳米孔时，对该脂质双层施加另一个搅动电刺激水平，其中所述另一个搅动电刺激水平趋于促进在所述脂质双层中形成纳米孔。
15.权利要求5的系统，其中检测因在所述脂质双层中形成纳米孔而导致的所述脂质双层电特性的变化包括检测所述脂质双层电阻的降低。
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