JPH10210979A - 耐熱性ｄｎａ合成酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ＤＮＡ鎖をＰＣＲ等により増幅するに際して
合成鎖の伸長を途中で停止させることなく、鋳型ＤＮＡ
鎖の全長を効率よく増幅することのできる新規な耐熱性
合成酵素と、この酵素の製造方法を提供する。 【解決手段】 配列番号１のアミノ酸配列を有し、１本
鎖ＤＮＡに相補的なＤＮＡ鎖の合成を触媒するに際して
合成鎖の伸長を途中で停止させることのない耐熱性ＤＮ
Ａ合成酵素と、配列番号１のアミノ酸配列をコードする
ＤＮＡ配列を含む発現ベクターにより形質転換した細胞
を培養し、培地中に産生された目的酵素を単離・精製す
ることを特徴とする耐熱性ＤＮＡ合成酵素の製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この発明は、ＤＮＡ鎖の試験
管内での合成や増幅、塩基配列の決定等に用いる新規な
耐熱性ＤＮＡ合成酵素と、この酵素をコードするＤＮＡ
配列、並びにこのＤＮＡ合成酵素の製造方法に関するも
のである。

【０００２】

【従来の技術とその課題】ＤＮＡ合成酵素（ＤＮＡ pol
ymerase）は１本鎖ＤＮＡに相補的なＤＮＡ鎖の合成を
触媒する酵素の総称である。ＤＮＡの塩基配列決定や試
験管内でのＤＮＡ増幅などには必須の酵素であるが、特
にＰＣＲ(Polymerase chain reaction) においては、そ
の一連の反応サイクルを自動化する上で「耐熱性ＤＮＡ
合成酵素」は不可欠である。

【０００３】このような耐熱性ＤＮＡ合成酵素としては
Ｔaq、Ｐfu、ＫOD等が知られており、それぞれの特性に
応じて使い分けられている。しかしながら、これら既存
の耐熱性ＤＮＡ合成酵素を用いたＰＣＲ等のＤＮＡ合成
の場合には、鋳型となるＤＮＡ鎖によっては、合成され
るＤＮＡ鎖の伸長が途中で停止してしまい、鋳型ＤＮＡ
鎖の全領域の増幅や、その塩基配列の決定が困難もしく
は不可能となるという問題を有していた。また、合成停
止による不完全なＤＮＡ断片がＰＣＲ産物中に混入する
場合には、目的とする増幅断片を精製しなけらばならな
いという不都合も存在した。

【０００４】この発明は、以上のとおりの事情に鑑みて
なされたものであって、ＤＮＡ鎖をＰＣＲ等により合
成、増幅するに際して、合成鎖の伸長を途中で停止させ
ることなく、鋳型ＤＮＡ鎖の全長を効率よく増幅するこ
とのできる新規な耐熱性ＤＮＡ合成酵素を提供すること
を目的としている。またこの発明は、この耐熱性ＤＮＡ
合成酵素をコードするＤＮＡ配列と、このＤＮＡ配列の
発現産物として耐熱性ＤＮＡ合成酵素を製造する方法を
提供することを目的としてもいる。

【０００５】

【課題を解決するための手段】この発明は、上記の課題
を解決するものとして、配列番号１のアミノ酸配列を有
し、１本鎖ＤＮＡに相補的なＤＮＡ鎖の合成を触媒する
に際して合成鎖の伸長を途中で停止させることのない耐
熱性ＤＮＡ合成酵素（請求項１）を提供する。またこの
発明は、配列番号１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
配列（請求項２）と、このＤＮＡ配列を含むクローニン
グベクター（請求項３）を提供する。このようなクロー
ニングベクターとしては、大腸菌ＨＭＳ174(ＤＥ3)/pＤ
Ｐ320(FERM P- 16052)が保有する組換え体プラスミドp
ＤＰ320（請求項４）をも提供する。

【０００６】さらにまた、この発明は、上記請求項２の
ＤＮＡ配列を含む発現ベクターにより形質転換した細胞
を培養し、培地中に産生された目的酵素を単離・精製す
ることを特徴とする耐熱性ＤＮＡ合成酵素の製造方法
（請求項５）を提供する。

【０００７】

【発明の実施の形態】この発明の耐熱性ＤＮＡ合成酵素
は、具体的には、ピロコッカスフリオサス（Pyrococcus
furiosus）由来のＰfuＤＮＡ合成酵素を公知の変異遺
伝子作成法 (Strategies, vol 9, p3-4,1996) によって
遺伝子工学的に改変した酵素である（以下、この発明の
耐熱性ＤＮＡ合成酵素を「改変型ＰfuＤＮＡ合成酵素」
と記載することがある）。この酵素の作成は以下のとお
りに行なった。すなわち、ＰfuＤＮＡ合成酵素の遺伝子
は塩基配列が公知であるため、その両端に相補的なオリ
ゴヌクレオチドを合成し、これをプライマーとして、上
記細菌のゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法によりＰfu
ＤＮＡ合成酵素の遺伝子を調製した。この遺伝子ＤＮＡ
断片をベクターにクローニングし、上記文献に記載の方
法により変異させた。遺伝子の変異は、ＰfuＤＮＡ合成
酵素のアミノ酸配列の一部がＫODＤＮＡ合成酵素のアミ
ノ酸配列に置き変わるように塩基を置換させた。ＰfuＤ
ＮＡ合成酵素とＫODＤＮＡ合成酵素は、アミノ酸配列が
約８０％相同であり、ＰＣＲの際に同様の合成停止を生
じさせるが（図１）、ＫODＤＮＡ合成酵素の伸長速度は
ＰfuＤＮＡ合成酵素のそれの６〜10倍である。そこで、
ＰfuＤＮＡ合成酵素のアミノ酸残基をＫODＤＮＡ合成酵
素のアミノ酸残基に置換することによって、合成鎖の伸
長停止が改善され、しかも伸長速度の速い酵素が得られ
る可能性があるからである。そして、このようにして変
異させた遺伝子を大腸菌で発現させ、その発現産物を回
収し、精製することによってこの発明の改変型ＰfuＤＮ
Ａ合成酵素を得た。

【０００８】実際には、この発明の発明者等は、上記の
方法により数多くの改変型ＰfuＤＮＡ合成酵素を作成
し、それぞれについてＤＮＡ合成実験をおこない、伸長
したＤＮＡ鎖を電気泳動的に解析することによって、従
来酵素に比べて合成鎖の伸長停止が著しく改善されたＤ
ＮＡ合成酵素を得、この発明を完成させた。このＤＮＡ
合成酵素は、配列番号１に示したアミノ酸配列を有して
おり、このアミノ酸配列は、従来公知のＰfuＤＮＡ合成
酵素のアミノ酸配列のうち、表１に示すアミノ酸残基が
置換された新規な配列である。そして、この新規酵素を
用いてＰＣＲ等のＤＮＡ合成を行なった場合には、下記
の実施例に示すように、従来のＤＮＡ合成酵素を用いた
場合に生じる合成停止がほぼ完全に解消される。もちろ
ん従来酵素によって効率よく増幅されるＤＮＡ鎖は同様
に効率良く増幅することができる。

【０００９】

【表１】

【００１０】また、この改変型ＰfuＤＮＡ合成酵素をコ
ードするＤＮＡ配列としては、上記の酵素作成過程で得
られたＰfuＤＮＡ合成酵素遺伝子の変異遺伝子を例示す
ることができる。この変異遺伝子は組換え体プラスミド
pＤＰ320にクローニングされており、このpＤＰ320は大
腸菌ＨＭＳ174(ＤＥ3)に導入され、工業技術院生命工学
工業技術研究所に寄託されている (寄託番号FERM P- 16
052)。ただし、この発明のＤＮＡ合成酵素はそのアミノ
酸配列が配列番号１であることを必要かつ充分な要件と
するものであり、そのような酵素をコードする遺伝子
は、配列番号１の各アミノ酸残基に対応する塩基コドン
をつなぎ合わせたＤＮＡ配列として適宜にデザインする
ことができる。

【００１１】以下、実施例を示し、この発明のＤＮＡ合
成酵素についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、こ
の発明は以下の例に限定されるものではない。

【００１２】

【実施例】

実施例１：改変型ＰfuＤＮＡ合成酵素遺伝子の作成 （１）ＰfuＤＮＡ合成酵素遺伝子のクローニング ＰfuＤＮＡ合成酵素遺伝子の塩基配列（Nucleic Acids
Research, vol.21, p259-265, 1993) に従ってＰＣＲプ
ライマーを合成し、ピロコッカスフリオサス (P. furio
sus)のゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲによって目的遺
伝子を増幅し、これを大腸菌用の発現ベクターにクロー
ニングした。詳細は以下のとおりである。

【００１３】P.furiosus DSM3638を上記文献に記載され
た方法で培養した。先ず、文献記載の培地を調製し、高
温加圧滅菌ののち、蜜素ガスを吹き込み、植菌して95℃
で15時間静置培養した。200mlの培養掖から遠心分離に
より約0.5mgの菌体を得た。集菌体を緩衝液Ａ（10mMト
リス−ＨＣＬ，pH8.0, 1mMＥＤＴＡ, 100mM Ｎacl ）に
懸濁し、10% ＳＤＳを１ml加え、撹拌の後、プロテイナ
ーゼＫを0.5mg 加えて55℃で60分反応させた。反応液を
順次フェノ一ル抽出、フェノ一ル／クロロホルム抽出、
クロロホルム抽出し、エタノールを加えてＤＮＡを不溶
化し、回収した。得られたＤＮＡを１mlのＴＥバッファ
ー（10mMトリス−ＨＣｌ，pH8.0，１mMＥＤＴＡ）に溶
解し、0.5mgのＲＮase Ａを加えて37℃で60分反応させ
たのち、再度フェノール抽出、フェノ一ル／クロロホル
ム抽出、クロロホルム抽出し、エタノ一ル沈殿でＤＮＡ
を回収してＴＥバッファ−に溶解させ、約0.3mgのＤＮ
Ａを得た。

【００１４】次いで、目的のＤＮＡ合成酵素遺伝子をＰ
ＣＲ増幅するために、既知の配列データをもとに配列番
号２および３に示す２種のプライマ−ＤＮＡを合成し
た。すなわち、フォアードプライマー配列中には目的遺
伝子の開始コドンＡＴＧおよび制限酵素ＮcoＩ配列(5'-
CCATGG-3')を導入し、リバースプライマーは終止コドン
の下流の適当な位置に結合するように設計した。ＰＣＲ
は、P.furiosusＤＮＡ２μgとプライマー各10pmolを用
い、ＬＡＴaq（宝酒造）と添付のバッファー条件で、50
μlの反応系で行った。サイクル条件は、酵素を加える
前に93℃／３分を行い、94℃／0.5 分、55℃／0.5 分、
72℃／1.0 分を３０サイクルした。増幅したＤＮＡ断片
を精製し、ＮcoＩで処理した後、同じくＮcoＩで切断後
に平滑末端化し、さらにＮcoＩ処理した発現ベクターｐ
ＥＴ15−ｂのＴ７プロモーター下流に組み込んだ。この
発現ベクターをｐＤＰＷＴ100とし、挿入遣伝子の塩基
配列を確認した。 （２）ＰfuＤＮＡ合成酵素遺伝子の改変 クローン化したＰfuＤＮＡ合成酵素遺伝子を組み込んだ
発現ベクターｐＤＰＷＴ100に対して、期待する変異を
含んだオリゴヌクレオチド（配列番号４および５）とプ
ロメガ社の突然変異導入キットを用い、公知の方法 (St
rategies, vol9, p3-4,1996) に従って改変型ＰfuＤＮ
Ａ合成酵素の遺伝子を、発現ベクターｐＤＰＷＴ100上
で作成し、発現ベクターｐＤＰ320 を構築した。なお、
この改変型遺伝子の塩基配列を決定することにより、改
変型ＰfuＤＮＡ合成酵素のアミノ酸配列（配列番号１）
を確認した。 実施例２：改変型ＰｆｕＤＮＡ合成酵素の大腸菌での発
現と精製 実施例１（２）で作成した改変型ＰｆｕＤＮＡ合成酵素
の遺伝子を次のとおりに大腸菌で発現させ、精製した。

【００１５】実施例１（２）で作成した改変型ＰｆｕＤ
ＮＡ合成酵素遺伝子をもつ発現ベクターｐＤＰ320 を大
腸菌ＨＭＳ173(ＤＥ３）株に導入し、終濃度0.1mMのＩ
ＰＴＧを含んだＬＢ培地で14時間培養し、酵素を大腸菌
体内に発現誘導した。遠心して菌体を集めた後、150mM
Ｔris/ＨＣl(pH7.5)、2mM ＥＤＴＡ、0.24mM ＡＰＭＳ
Ｆおよび0.2%のＴween20を含む緩衝液で超音波処理を行
いながら、改変型ＰｆｕＤＮＡ合成酵素を抽出した。こ
の粗抽出液を80℃、15分の熱処理を行うことで大腸菌由
来のＤＮＡ合成酵素を失活させると共に、この発明のＤ
ＮＡ合成酵素の部分精製を行なった。部分精製画分は50
mMＴris/ＨＣl(pH7.5)、１mMＥＤＴＡ、0.2%Ｔween20、
7mM 2-mercaptoethanol および10% glycerolの緩衝液に
対し透析した。この段階で改変型ＰfuＤＮＡ合成酵素に
特異的なＤＮＡ合成活性を検出した。 実施例３：改変型ＰfuＤＮＡ合成酵素によるプライマー
伸長反応 実施例２で部分精製した改変型ＰfuＤＮＡ合成酵素を用
い、鋳型ＤＮＡに相補的なＤＮＡ鎖のプライマー伸長反
応を試験した。

【００１６】20mMＴris/ＨＣl(pH8.0)、２mM ＭgＣl₂、
50μg/mlＢＳＡ、0.1%Ｔriton Ｘ-100、１mMの各cold d
NTPs(0.1mM for dCTP)、[α-³²P] dCTPの10μCiとＭ13
(-21)のプライマーをアニールさせた0.63μgのpBLUESCR
IPT プラスミドを含む反応液20μlに、上記の部分精製
酵素画分１μgを入れ、75℃で１分および３分間反応さ
せた。伸長したＤＮＡ鎖を８M ureaを含んだポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動で分離した後、イメージアナライ
ザ−によりそのパターンを解析した。また、対照とし
て、従来の野性型ＰfuＤＮＡ合成酵素を用いて、同様の
ＤＮＡ合成を行なった。

【００１７】結果は図２に示したとおりである。従来の
野性型ＰfuＤＮＡ合成酵素を用いた場合には、合成停止
による不完全はＤＮＡ鎖の存在を示すバンドが少なくと
も１０個観察されたが、この発明の改変型ＰfuＤＮＡ合
成酵素によるＤＮＡ合成では、これらのバンドは消失し
た。一方、1000ベース近傍の良く伸長したＤＮＡ鎖の蓄
積には差は見られなかった。

【００１８】

【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この発明に
よって、ＤＮＡ鎖をＰＣＲ等によって増幅するに際し
て、合成鎖の伸長を途中で停止させることなく、鋳型Ｄ
ＮＡ鎖の全長を効率よく合成、増幅することのできる新
規な耐熱性合成酵素が提供される。これによって、ＤＮ
Ａ鎖の試験管内での合成や増幅、塩基配列の決定等を簡
便かつ高精度で行なうことが可能となる。

【００１９】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：775 配列の型：アミノ酸 配列の種類：タンパク質 配列 Met Val Leu Asp Val Asp Tyr Ile Thr Glu Glu Gly Lys Pro Val Ile 1 5 10 15 Arg Leu Phe Lys Lys Glu Asn Gly Lys Phe Lys Ile Glu His Asp Arg 20 25 30 Thr Phe Arg Pro Tyr Ile Tyr Ala Leu Leu Arg Asp Asp Ser Lys Ile 35 40 45 Glu Glu Val Lys Lys Ile Thr Gly Glu Arg His Gly Lys Ile Val Arg 50 55 60 Ile Val Asp Val Glu Lys Val Glu Lys Lys Phe Leu Gly Lys Pro Ile 65 70 75 80 Thr Val Trp Lys Leu Tyr Leu Glu His Pro Gln Asp Val Pro Thr Ile 85 90 95 Arg Glu Lys Val Arg Glu His Pro Ala Val Val Asp Ile Phe Glu Tyr 100 105 110 Asp Ile Pro Phe Ala Lys Arg Tyr Leu Ile Asp Lys Gly Leu Ile Pro 115 120 125 Met Glu Gly Glu Glu Glu Leu Lys Ile Leu Ala Phe Asp Ile Glu Thr 130 135 140 Leu Tyr His Glu Gly Glu Glu Phe Gly Lys Gly Pro Ile Ile Met Ile 145 150 155 160 Ser Tyr Ala Asp Glu Asn Glu Ala Lys Val Ile Thr Trp Lys Asn Ile 165 170 175 Asp Leu Pro Tyr Val Glu Val Val Ser Ser Glu Arg Glu Met Ile Lys 180 185 190 Arg Phe Leu Arg Ile Ile Arg Glu Lys Asp Pro Asp Ile Ile Val Thr 195 200 205 Tyr Asn Gly Asp Ser Phe Asp Phe Pro Tyr Leu Ala Lys Arg Ala Glu 210 215 220 Lys Leu Gly Ile Lys Leu Thr Ile Gly Arg Asp Gly Ser Glu Pro Lys 225 230 235 240 Met Gln Arg Ile Gly Asp Met Thr Ala Val Glu Val Lys Gly Arg Ile 245 250 255 His Phe Asp Leu Tyr His Val Ile Thr Arg Thr Ile Asn Leu Pro Thr 260 265 270 Tyr Thr Leu Glu Ala Val Tyr Glu Ala Ile Phe Gly Lys Pro Lys Glu 275 280 285 Lys Val Tyr Ala Asp Glu Ile Ala Lys Ala Trp Glu Ser Gly Glu Asn 290 295 300 Leu Glu Arg Val Ala Lys Tyr Ser Met Glu Asp Ala Lys Ala Thr Tyr 305 310 315 320 Glu Leu Gly Lys Glu Phe Leu Pro Met Glu Ile Gln Leu Ser Arg Leu 325 330 335 Val Gly Gln Pro Leu Trp Asp Val Ser Arg Ser Ser Thr Gly Asn Leu 340 345 350 Val Glu Trp Phe Leu Leu Arg Lys Ala Tyr Glu Arg Asn Glu Val Ala 355 360 365 Pro Asn Lys Pro Ser Glu Glu Glu Tyr Gln Arg Arg Leu Arg Glu Ser 370 375 380 Tyr Thr Gly Gly Phe Val Lys Glu Pro Glu Lys Gly Leu Trp Glu Asn 385 390 395 400 Ile Val Tyr Leu Asp Phe Arg Ala Leu Tyr Pro Ser Ile Ile Ile Thr 405 410 415 His Asn Val Ser Pro Asp Thr Leu Asn Leu Glu Gly Cys Lys Asn Tyr 420 425 430 Asp Ile Ala Pro Gln Val Gly His Lys Phe Cys Lys Asp Ile Pro Gly 435 440 445 Phe Ile Pro Ser Leu Leu Gly His Leu Leu Glu Glu Arg Gln Lys Ile 450 455 460 Lys Thr Lys Met Lys Glu Thr Gln Asp Pro Ile Glu Lys Ile Leu Leu 465 470 475 480 Asp Tyr Arg Gln Lys Ala Ile Lys Leu Leu Ala Asn Ser Phe Tyr Gly 485 490 495 Tyr Tyr Gly Tyr Ala Lys Ala Arg Trp Tyr Cys Lys Glu Cys Ala Glu 500 505 510 Ser Val Thr Ala Trp Gly Arg Lys Tyr Ile Glu Leu Val Trp Lys Glu 515 520 525 Leu Glu Glu Lys Tyr Gly Phe Lys Val Ile Tyr Ser Asp Thr Asp Gly 530 535 540 Phe Phe Ala Thr Ile Pro Gly Gly Glu Ser Glu Glu Ile Lys Lys Lys 545 550 555 560 Ala Leu Glu Phe Val Lys Tyr Ile Asn Ser Lys Leu Pro Gly Leu Leu 565 570 575 Glu Leu Glu Tyr Glu Gly Phe Tyr Lys Arg Gly Phe Phe Val Thr Lys 580 585 590 Lys Arg Tyr Ala Val Ile Asp Glu Glu Gly Lys Val Ile Thr Arg Gly 595 600 605 Leu Glu Ile Val Arg Arg Asp Trp Ser Glu Ile Ala Lys Glu Thr Gln 610 615 620 Ala Arg Val Leu Glu Thr Ile Leu Lys His Gly Asp Val Glu Glu Ala 625 630 635 640 Val Arg Ile Val Lys Glu Val Ile Gln Lys Leu Ala Asn Tyr Glu Ile 645 650 655 Pro Pro Glu Lys Leu Ala Ile Tyr Glu Gln Ile Thr Arg Pro Leu His 660 665 670 Glu Tyr Lys Ala Ile Gly Pro His Val Ala Val Ala Lys Lys Leu Ala 675 680 685 Ala Lys Gly Val Lys Ile Lys Pro Gly Met Val Ile Gly Tyr Ile Val 690 695 700 Leu Arg Gly Asp Gly Pro Ile Ser Asn Arg Ala Ile Leu Ala Glu Glu 705 710 715 720 Tyr Asp Pro Lys Lys His Lys Tyr Asp Ala Glu Tyr Tyr Ile Glu Asn 725 730 735 Gln Val Leu Pro Ala Val Leu Arg Ile Leu Glu Gly Phe Gly Tyr Arg 740 745 750 Lys Glu Asp Leu Arg Tyr Gln Lys Thr Arg Gln Val Gly Leu Thr Ser 755 760 765 Trp Leu Asn Ile Lys Lys Ser 770 775 配列番号：２ 配列の長さ：35 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 GTGGGGAGCA CCATGGTTTT AGATGTGGAT TACAT 35 配列番号：３ 配列の長さ：35 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 GCATGCAGAT AGACCATTTC TAACGAAGGC GTTTG 35 配列番号：４ 配列の長さ：66 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 CTCGAAGAAA AGTATGGATT TAAAGTCATC TACAGTGACA CTGATGGTTT CTTTGCAACT 60 ATCCCA 66 配列番号：５ 配列の長さ：66 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 TGGGATAGTT GCAAAGAAAC CATCAGTGTC ACTGTAGATG ACTTTAAATC CATACTTTTC 60 TTCGAG 66

【図面の簡単な説明】

【図１】従来のＰfuＤＮＡ合成酵素とＫODＤＮＡ合成酵
素のプライマー伸長活性を示す電気泳動の結果である。

【図２】従来のＰfuＤＮＡ合成酵素（野性型）とこの発
明の改変型ＰfuＤＮＡ合成酵素のプライマー伸長活性を
示す電気泳動の結果である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 金井 昭夫 茨城県つくば市松代３−17−13 ヴィラ松 代301 (72)発明者 石野 良純 大阪府高槻市富田町１−19−14

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１のアミノ酸配列を有し、１本
   鎖ＤＮＡに相補的なＤＮＡ鎖の合成を触媒するに際して
   合成鎖の伸長を途中で停止させることのない耐熱性ＤＮ
   Ａ合成酵素。
2. 【請求項２】 配列番号１のアミノ酸配列をコードする
   ＤＮＡ配列。
3. 【請求項３】 請求項２のＤＮＡ配列を含むクローニン
   グベクター。
4. 【請求項４】 大腸菌ＨＭＳ174(ＤＥ3)/pＤＰ320 (FER
   M P- 16052) が保有する組換え体プラスミドpＤＰ320。
5. 【請求項５】 請求項２のＤＮＡ配列を含む発現ベクタ
   ーにより形質転換した細胞を培養し、培地中に産生され
   た目的酵素を単離・精製することを特徴とする耐熱性Ｄ
   ＮＡ合成酵素の製造方法。