ITRM20130199A1 - Peptidi per uso dermatologico e/o cosmetico - Google Patents

Description

DESCRIZIONE

“PEPTIDI PER USO DERMATOLOGICO E/O COSMETICOâ€

CAMPO DELL’INVENZIONE

La presente invenzione concerne peptidi in grado di aumentare la quantità e/o la stabilità di collagene o molecole collagene simili in cellule eucariote, in particolare cellule del derma e/o dell’epidermide, più in particolare fibroblasti umani. Tali peptidi trovano applicazione in una varietà di applicazioni dermatologiche, quali il trattamento di ustioni, ferite, ulcere cutanee, ferite croniche e piaghe da decubito. Gli stessi peptidi sono utilizzati anche in campo cosmetico per prevenire o ridurre la formazione di segni di invecchiamento cutaneo.

TECNICA ANTERIORE

La pelle (o cute) à ̈ il rivestimento più esterno del corpo di un vertebrato. Essa à ̈ costituita da una serie di tessuti di origine ectodermica e mesodermica e può avere varia colorazione, struttura fisiologica e organica, andando incontro anche a processi di invecchiamento più o meno visibili.

Come mediatore tra l’organismo e il mondo esterno, la pelle nei vertebrati svolge diverse funzioni. In particolare la cute ha una funzione protettiva poichà ̈, essendo una barriera anatomica, costituisce la prima linea di difesa dell’organismo contro le aggressioni esterne. Inoltre, la cute ha un ruolo fondamentale nella sensibilità, attraverso la presenza di termocettori, pressocettori e algocettori, nella regolazione termica e nel controllo della evaporazione.

La cute à ̈ costituita in superficie da un tessuto epiteliale, detto epidermide, e in profondità da un connettivo, detto derma. La cute contiene poi una serie di annessi che ne completano la struttura e la funzione: peli, unghie e ghiandole di vario genere.

L’epidermide à ̈ un epitelio di rivestimento pavimentoso composto cheratinizzato ed à ̈ costituita da vari strati, ciascuno formato da uno o più piani di cellule. Detti strati, procedendo dal derma verso la superficie, sono: lo strato basale, spinoso, granuloso e corneo. I cheratinociti sono il tipo cellulare più abbondante nell’epidermide.

 

Il derma à ̈ la componente connettivale della pelle, costituita da cellule e matrice extracellulare o sostanza fondamentale. I tipi cellulari comprendono le cellule fisse, come i fibroblasti, i mastociti, gli istiociti o macrofagi e cellule adipose, e le cellule mobili provenienti dal sangue. I fibroblasti rappresentano il tipo cellulare più abbondante e importante del derma, in quanto hanno la funzione di produrre le strutture fibrose – il collagene – ed i componenti macromolecolari della sostanza fondamentale.

La matrice extracellulare consiste di fibre e di componente amorfa. Le fibre costituiscono l’impalcatura di sostegno del derma e ne garantiscono la resistenza alle tensioni/trazioni e l’elasticità. Le fibre di collagene sono di gran lunga la categoria di fibre più abbondanti, rappresentando circa il 75% del peso secco del derma; dal punto di vista biochimico sono costituite da collagene, una proteina fibrosa la cui sintesi inizia nei fibroblasti e si completa nella matrice extracellulare. La molecola di collagene à ̈ formata da unità proteiche semplici dette tropocollagene, organizzate in tre catene di amminoacidi, che formano una spirale tripla a forma di corda: ciò conferisce rigidità e robustezza alle fibre, responsabili così della funzione di sostegno e tenuta del derma. Nel processo di formazione delle fibre collagene, le unità elementari si associano tra loro negli spazi intercellulari a formare strutture filamentose via via più complesse dette microfibrille e fibrille, le quali a loro volta si organizzano in un fine reticolo tridimensionale e prendono il nome di fibre reticolari. Per assemblaggio di più fasci di fibrille, si formano le vere e proprie fibre collagene, che decorrono parallelamente alla superficie cutanea, intersecandosi tra loro ad angolo retto.

Il collagene rappresenta una famiglia di proteine inerti ma caratterizzata da un turnover continuo. L’organizzazione fibrosa delle proteine dermiche ed il tipo di interazioni molecolari determinano le proprietà biomeccaniche (elasticità, resistenza) della cute.

Proteasi aspecifiche trasformano il collagene polimerico in monomerico, la cui degradazione à ̈ dovuta poi ad una collagenasi specifica. I frammenti collagenici vengono successivamente degradati a livello lisosomiale da proteasi specifiche dette catepsine, dopo essere stati fagocitati dai macrofagi.

Con l’età, il collagene subisce delle modificazioni sia qualitative (strutturali e fisiche, per cui le fibre diventano meno estensibili e insolubili) che quantitative (diminuzione della quantità e aumento della grandezza o ispessimento di ogni fibra), determinando una riduzione di elasticità cutanea. La perdità di elasticità della cute à ̈ la principale responsabile della formazione di rughe. L’invecchiamento cutaneo à ̈ quindi un processo di degradazione dei tessuti cutanei che necessita di una vera e propria ricostruzione. In maniera analoga, la cicatrizzazione cutanea à ̈ il processo di ricostruzione del tessuto cutaneo, danneggiato in

 

seguito ad una lesione di qualsiasi natura. Pertanto, la correzione dell’invecchiamento cutaneo e la cicatrizzazione dermica sono accomunate dagli stessi siti di azione a livello dermico. La cicatrizzazione si attiva attraverso due fasi: la sintesi di nuove fibre collagene in grado di andare a riempire la lesione, e la riorganizzazione e la specializzazione di tali cellule. La cicatrizzazione à ̈ quindi il risultato della riparazione di un tessuto cutaneo. I segni dell’invecchiamento vengono trattati come lesioni cutanee a lungo termine che necessitano di una vera e propria ricostruzione dei tessuti, attraverso un processo di cicatrizzazione in grado di agire sui meccanismi di sintesi di collagene e sulla loro organizzazione.

E’ noto che peptidi naturali svolgono un ruolo importante nel coordinare processi biochimici e sono in grado di stimolare la sintesi del collagene. Per questa ragione numerosi peptidi rappresentano ingredienti importanti per la preparazione di agenti in grado migliorare lo stato generale della pelle.

Con il termine matrichine vengono definiti peptidi ottenuti mediante scissione proteolitica dei costituenti della matrice extracellulare. E’ noto che un frammento C-terminale del collagene di tipo I, avente la sequenza Lys-Thr-Thr-Lys-Ser, à ̈ in grado di stimolare la sintesi di collagene e fibronectina in maniera dose-dipendente (Katayama K. Et al., J. Biol. Chem.

1993, 259, 9941-9944).

WO2000/015188 descrive l’uso di peptidi di formula X-Thr-Thr-Lys-Y in composizioni cosmetiche o dermofarmaceutiche. Questi peptidi sono modificati chimicamente per aumentarne la lipolificità mediante l’introduzione di una catena di acido grasso sull’N-terminale di X o mediante esterificazione o amidazione del C-terminale di Y.

WO91/12014 descrive l’attività biologica del tripeptide Gly-His-Lys in complesso con il rame (GHK-Cu) nel favorire l’attecchimento di trapianti di tessuto umano. Questo peptide à ̈ presente nel plasma, nella saliva e nell’urina in quantità fisiologicamente attiva e svolge due funzioni principali: agisce come agente antiinfiammatorio che limita il danno ossidativo dopo una lesione del tessuto e come segnale che da inizio all’attività rimodellante del tessuto. Il GHK-Cu collega i processi di rimozione del tessuto cicatriziale danneggiato ed il deposito di nuovo tessuto (Methods in Enzymology, Vol 147, 1987, pp 314-328, Academic Press).

WO01/43701 descrive l’uso di N-palmitoil-Gly-His-Lys (Palm-GHK) in composizioni cosmetiche o dermofarmaceutiche in grado di prevenire o contrastare i segni dell’invecchiamento cutaneo.

WO00/43417 descrive l’uso di particolari peptidi e derivati in composizioni cosmetiche o farmaceutica per il trattamento della cute. Tra questi, viene descritto in particolare N-Palm-Gly-Gln-Pro-Arg (Palm-GQPR). Palm-GQPR in combinazione con Palm-GHK viene

 

prodotto da Sederma con il marchio Matrixyl™ 3000. L’effetto sinergico svolto dai due peptidi in combinazione viene descritto in WO2005/048968.

Ulteriori peptidi in grado di legare il rame e complessi rame-peptide utili per favorire la cicatrizzazione e migliorare lo stato della pelle sono descritti ad esempio in EP0189182; EP0190736; US 4,877,770; EP0314755; EP0288278. Alcuni complessi rame-peptide si sono dimostrati efficaci anche come agenti in grado di favorire la crescita dei capelli. Alcuni esempi sono descritti in US 5,177,061; US 5,120,831; US 5,214,032; US 5,538,945; US 6,017,888.

L’angiogenina à ̈ un polipeptide a singola catena di 14 KDa appartenente alla superfamiglia delle ribonucleasi pancreatiche, in grado di promuovere la formazione di nuovi vasi sanguigni. A livello fisiologico, l’angiogenina mostra proprietà cicatrizzanti durante i processi infiammatori (Tello-Montoliu A et al, J. Thromb. Haemost.2006, 4, 1864-1874). EP622071 descrive una composizione cosmetica contenente angiogenina, in grado di inibire la produzione di melanina, utile per il trattamento delle macchie cutanee.

JP2004331566 descrive un agente in grado di stimolare la produzione di collagene, contenente angiogenina o idrolisati derivanti da trattamento enzimatico dell’angiogenina. In particolare, à ̈ descritta una bevanda in grado di promuovere la formazione di collagene cutaneo, comprendente angiogenina ottenuta da latte scremato.

La Mendola et al. (Dalton Trans, 2010, 39, 10678-10684) descrivono la capacità dell’angiogenina di chelare il rame e identificano il minimo frammento peptidico in grado di chelare il rame. In questo lavoro, gli autori caratterizzano i complessi tra Cu(II) e i frammenti peptidici Ac-PHREN-NH2e Ac-KNGNPHREN-NH2, mostrando che le caratteristiche di coordinazione di entrambi i peptidi sono paragonabili. In particolare, gli autori dimostrano che Ac-PHREN-NH2rappresenta la minima reale sequenza amminoacidica responsabile del legame con il rame.

DESCRIZIONE DELL’INVENZIONE

Nel corso della presente invenzione à ̈ stato scoperto che il peptide Ac-PHREN-NH2e peptidi da esso derivati comprendenti da quattro a sei amminoacidi sono altamente efficaci nel promuovere la rigenerazione del collagene di tipo I in colture cellulari di fibroblasti umani, mentre sono privi di tossicità cellulare quando testati a concentrazioni elevate. Tali composti risultano particolarmente utili per migliorare situazioni cutanee che trovano beneficio da una accresciuta produzione di collagene. Pertanto i composti dell’invenzione trovano applicazione nella preparazione di composizioni dermofarmaceutiche e/o cosmetiche utili ad

 

esempio nel favorire la cicatrizzazione di ferite di varia natura, nel trattamento della ustioni, nel prevenire e ridurre i segni dell’invecchiamento e fotoinvecchiamento cutaneo .

Gli autori della presente invenzione hanno sorprendentemente identificato una classe di peptidi in grado di indurre, a concentrazioni prive di tossicità cellulare, la produzione di collagene di tipo I in colture cellulari di fibroblasti umani.

Costituisce oggetto della presente invenzione un peptide di formula generale (I):

R1

O O O OH

N C NH C NH C NH C N X

A O

yy z

<N>NH NH O OHONH2

m

HN NH

n 2<p>q (I)  in cui:

m, n, p, q = 0, 1 e se uno di m, n, p o q à ̈ 0, tutti gli altri sono 1;

y = 0, 1, 2; z = 0, 1;

R1= H, OH;

A = H, R2CO, in cui R2Ã ̈ un gruppo alchilico contenente da 1 a 22 atomi di carbonio, lineare, ramificato o ciclico, saturo o insaturo, idrossilato o no, contenente un atomo di zolfo o no, contenente un atomo di ossigeno o no;

X à ̈ selezionato tra un amminoacido, un derivato di amminoacido, OR3, NR3R4in cui R3e R4sono ciascuno indipendentemente scelti tra H, C1-22alchile lineare o ramificato, saturo o insaturo; sali farmaceuticamente accettabili, isomeri, stereoisomeri e tautomeri relativi, con l’esclusione dei composti in cui:

R1= H; m = n = p = q = 1; y = 1; z = 0; X = NH2.

Preferibilmente A Ã ̈ scelto tra acetile e palmitoile.

Preferibilmente il peptide di formula generale (I) Ã ̈ scelto nel gruppo consistente in:

- Acetil-Pro-His-Arg-Glu-Asn-Lys-(N ε-Palmitoile) ;

- Acetil-Pro-His-Arg-Glu-Gln ;

- Acetil-Pro-His-Arg-Glu ;

- His-Arg-Glu-Asn;

- Acetil-Pro-Arg-Glu-Asn;

- Acetil-Hyp-His-Arg-Glu-Asn;

- Acetil-Pro-His-Glu-Asn.

 

Forma ulteriore oggetto della presente invenzione il peptide di formula generale (I), come sopra definito, senza l’esclusione di alcun composto, per uso nel trattamento di patologie che trovano beneficio dalla stimolazione della produzione di collagene, preferibilmente per uso nel favorire la cicatrizzazione delle ferite e nel trattamento delle ustioni, più preferibilmente per uso topico.

In una formula di realizzazione preferita, il peptide di formula generale (I) Ã ̈ scelto nel gruppo consistente in:

- Acetil-Pro-His-Arg-Glu-Asn-Lys-(N ε-Palmitoile) (SEQ ID NO: 1);

- Acetil-Pro-His-Arg-Glu-Gln (SEQ ID NO: 2);

- Acetil-Pro-His-Arg-Glu (SEQ ID NO: 3);

- His-Arg-Glu-Asn (SEQ ID NO: 4);

- Acetil-Pro-Arg-Glu-Asn (SEQ ID NO: 5);

- Acetil-Hyp-His-Arg-Glu-Asn (SEQ ID NO: 6);

- Acetil-Pro-His-Glu-Asn (SEQ ID NO: 7).

- Acetil-Pro-His-Arg-Glu-Asn (SEQ ID No: 8);

- Palm-Pro-His-Arg-Glu-Asn (SEQ ID No: 9).

Costituisce ulteriore oggetto della presente invenzione l’uso cosmetico di un peptide di formula generale (I), senza l’esclusione di alcun composto, preferibilmente per prevenire e/o ridurre i segni dell’invecchiamento cutaneo.

E’ altresì oggetto dell’invenzione una composizione comprendente almeno un peptide di formula generale (I) e un veicolo accettabile per applicazioni topiche.

Preferibilmente il peptide di formula generale (I) Ã ̈ presente in una concentrazione compresa tra compresa tra 0.0005% p/p e 0.5% p/p. In una ulteriore forma preferita di realizzazione, la composizione comprende almeno un ingrediente aggiuntivo, preferibilmente scelto tra vitamina C, derivati della vitamina C, vitamina E, derivati della vitamina E, tocoferoli, vitamina A, derivati della vitamina A, retinale, acido retinoico.

Forma oggetto della presente invenzione una composizione comprendente almeno un peptide di formula generale (I) che si presenta in una formulazione selezionata tra crema, emulsione, dispersione, gel, pomata, unguento, siero. Preferibilmente detta composizione à ̈ per uso nel trattamento di patologie cutanee che trovano beneficio dalla stimolazione della produzione di collagene. Forma ulteriore oggetto dell’invenzione l’uso di detta composizione per uso cosmetico, preferibilmente per prevenire e/o ridurre i segni dell’invecchiamento cutaneo.

 

Come qui utilizzati, i termini “peptidi†o “polipeptidi†si riferiscono a peptidi di origine naturale o di sintesi che possono contenere solo amminoacidi naturali, solo amminoacidi non naturali, o combinazioni di amminoacidi naturali e non naturali. Come qui utilizzato, il termine “polipeptide†comprende oligopeptide, peptide, polipeptide e derivati relativi, analoghi di peptidi e derivati relativi, così come sali farmaceuticamente accettabili di tali composti. Come qui utilizzato, il termine “peptidi†include anche complessi con altre specie, quali ioni metallici (ad es. rame, zinco, manganese, magnesio e simili). Risultano di particolare interesse complessi con il rame dato che Ac-PHREN-NH2rappresenta la sequenza amminoacidica responsabile del legame dell’angiogenina con il rame.

Il termine “amminoacido†come qui utilizzato include e comprende tutti gli amminoacidi naturali e non naturali, se otticamente attivi in conformazione sia D che L.

Le abbreviazioni utilizzate per gli amminoacidi seguono le regole della Commissione sulla Nomenclatura Biochimica IUPAC-IUB specificate in Eur. J. Biochem. (1984) 138, 9-37 e in J. Biol. Chem. (1989) 264, 633-673.

Ai fini della presente invenzione, gli amminoacidi non naturali includono, tra gli altri, la idrossiprolina (Hyp), l’acido L-1,2,3,4-tetraidroisochinolin-3-carbossilico (Tic), azetidina (Azt), D-prolina (pro), homo-prolina (hPro), tienilalanina (Tha), tiazolidinalanina (Thz), l’ornitina (Orn), nor-arginina (Agb).

Allo scopo di incrementare la biodisponibilità e la capacità dei peptidi dell’invenzione di oltrepassare le barriere cutanee la loro lipofilicità o carattere lipofilico possono essere aumentati sia mediante acilazione del gruppo NH2N-terminale del peptide, sia mediante esterificazione del gruppo carbossilico con un alcol, lineare o ramificato, saturo o insaturo, idrossilato o no, sia mediante entrambe le suddette modifiche chimiche.

In un ambito di applicazione preferito, i gruppi N-acile utilizzati sono acetile, lauroile, miristoile, palmitoile, steroile, oleoile, lineoile. Particolarmente preferiti sono i gruppi N-acetile e N-palmitoile.

Quando utilizzato all’estremità N-terminale di una sequenza, “Ac†indica un N-acil derivato (indicato anche come acil-derivato). In maniera analoga, “Palm†si riferisce ad un derivato N-Palmitoile. Quando utilizzato sull’estremità C-terminale di una sequenza, “OAlk†indica un gruppo estere attaccato al carbonile C-terminale.

I polipeptidi della presente invenzione possono essere ottenuti mediante sintesi chimica o enzimatica a partire dagli amminoacidi che li costituiscono o da loro derivati; in alternativa, possono essere ottenuti da idrolisi in condizioni blande di proteine naturali, o mediante biotecnologia. Ad esempio, possono essere impiegate metodologie note di sintesi peptidica,

 

quale ad esempio il metodo Fmoc/tBu in fase solida. Altre metodologie chimiche utilizzabili comprendono Boc/bzl o chimica in fase liquida. Metodiche sintetiche di riferimento sono descritte ad esempio in: Solid Phase Peptide Synthesis (1984), Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois; The Practice of Peptide Synthesis (1984), Springer Verlach, New York; Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins (1997), CRC, Boca Raton, FL; J. Biol. Chem. (1980), 255, 8234-8238.

I polipeptidi dell’invenzione possono formare sali omogenei o misti con acidi mono- o polivalenti, preferibilmente con acidi inorganici o con opportuni acidi carbossilici alifatici saturi o insaturi, o con acidi carbossilici aromatici, o con acidi solfonici alifatici o aromatici, preferibilmente con acido acetico, acido lattico e/o acido cloridrico.

Gli amminoacidi menzionati nella formula (I) possono avere configurazione L o D, o essere una miscela di entrambe le configurazioni. I composti sono presenti come forme isomeriche e miscele relative, e come miscele di rotameri. Possono essere presenti derivati di amminoacidi, comprendenti derivati acilati o alchilati.

I composti dell’invenzione stimolano le funzioni metaboliche delle cellule della pelle. I composti dell’invenzione aumentano la quantità di proteine costitutive della matrice extracellulare, incrementando la loro sintesi e/o la loro stabilità. In particolare i composti di formula generale (I) sono in grado di aumentare la quantità di collagene di tipo I in colture cellulari di fibroblasti umani e hanno una azione positiva sulla rigenerazione dei tessuti.

I polipeptidi dell’invenzione possono pertanto essere usati come principi attivi nella preparazione di composizioni preferibilmente per uso in dermatologico e/o cosmetico. Tali composizioni possono essere utilizzate ad esempio per prevenire o ridurre il fenomeno dell’invecchiamento cutaneo, in particolare le rughe, e/o per migliorare l’aspetto della pelle. I composti dell’invenzione e le composizioni che li comprendono sono utili nel favorire la cicatrizzazione delle ferite di qualsiasi natura e nel trattamento di disturbi della cicatrizzazione. Per disturbi nella cicatrizzazione si intendono ad esempio le ulcerazione delle ferite negli anziani defedati, in corso di coagulopatie e vasculopatie, durante la terapia con glicocorticoidi e con agenti immunosoppressivi, e in corso di diabete e di avitaminosi C. Le composizioni dell’invenzione comprendono uno o più peptidi di formula generale I e altri componenti aggiuntivi dematologicamente accettabili.

La definizione “dermatologicamente accettabile†come qui utilizzata indica che le composizioni o i componenti descritti sono adatti ad essere applicati sulla pelle umana senza rischio di tossicità, incompatibilità, instabilità, risposta allergica, e simili.

 

I peptidi di formula generale (I) possono essere utilizzati in composizioni opportunamente formulate in un veicolo accettabile dal punto di vista dermatologico. Il veicolo accettabile dal punto di vista dermatologico può essere una soluzione acquosa o idroalcoolica, una emulsione acqua in olio, una emulsione olio in acqua, una microemulsione, un gel acquoso, un gel anidro, un siero o una dispersione di vescicole. Le composizioni possono includere vari ingredienti aggiuntivi, che possono essere principi attivi, agenti funzionali o agenti di normale uso in prodotti cosmetici, prodotti per la cura della persona o per utilizzo farmaceutico di tipo topico o transdermico. La decisione di includere un ingrediente aggiuntivo e la scelta dello specifico ingrediente da aggiungere dipende dalla specifica applicazione e dalla formulazione del prodotto. Un’ampia varietà di ingredienti aggiuntivi che possono essere aggiunti nelle composizioni dell’invenzione sono menzionati in CTFA Cosmetic Ingredient Handbook, 10<th>edition, 2004 (pubblicato da Cosmetic, Toiletry and Fragrance Association, Inc, Washinghton, D.C.).

Ingredienti aggiuntivi includono amminozuccheri, derivati della Vitamina B3, acido deidroacetico (DHA), fitosteroli, acido salicilico, acido ascorbico e derivati, filtri solari, agenti cheratolitici, anti-ossidanti e anti-radicali, agenti antimicrobici, antibatterici e antifungini, agenti inspessenti, antiodoranti e acidi grassi.

Le composizioni dell’invenzione comprendono almeno un veicolo accettabile dal punto di vista dermatologico, scelto in base alla formulazione finale del prodotto. Il veicolo à ̈ presente in una concentrazione compresa tra il 50% e il 99.99%, preferibilmente tra il 60% ed il 99.9%, più preferibilmente tra il 70% ed il 98% in peso della composizione.

Le composizioni dell’invenzione sono generalmente preparate mediante metodi convenzionali noti nell’arte delle preparazioni per uso dermatologico e/o cosmetico. Dette composizioni possono essere in formulazioni diverse, comprendenti creme, lozioni, unguenti, latti, gel, emulsioni, sospensioni, preparazioni anidre, lozioni per il trattamento del cuoio capelluto, creme o lozioni per la cura della pelle o dei capelli, creme solari, cerotti transdermici, formulazioni spray e saponi. Dette composizioni possono anche essere nella forma di stick per labbra o, in generale, di prodotti adatti per il trucco del viso.

ESEMPI MATERIALI E METODI

Sintesi chimica dei peptidi

Tutti i peptidi descritti sono stati sintetizzati con una chimica Fmoc/tBu usando sia resina polistirenica (PS) che resina PEG-PS derivatizzate con rink-ammide per la produzione di

 

peptidi carbossiamidi al C-terminale. La strategia di sintesi prevede l’elongazione del peptide a partire dall’estremità C-terminale, attraverso una serie di reazioni successive di deprotezione dell’ α-ammino gruppo e di acilazione con la componente carbossilica dell’amminoacido opportunamente attivata. La funzionalità α-amminica degli amminoacidi utilizzata à ̈ protetta con il gruppo Fmoc, mentre le catene laterali sono protette, quando necessario, con gruppi protettori acido labili, come Boc per lisina (Lys(Boc)), ornitina (Orn(Boc)), nor-arginina (Agb(Boc)), Pbf per arginina (Arg(Pbf)), Trt per istidina (His(Trt)) e asparagina (Asn(Trt), t-butile per aspartico (Asp(tBu)), glutammico (Glu(tBu)) e idrossiprolina (Hyp(tBu)). Tutte le sintesi sono state fatte attraverso l’uso di un sintetizzatore automatico di peptidi con tempi di 60 minuti, mediante l’attivazione dei singoli ammino acidi con 2-(1H-7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametil uronio esafluorofosfato metanamminio (HATU) in presenza di diisopropiletilammina (DIPEA) in dimetilformammide (DMF).

Alla fine della sintesi, qualora richiesto, il gruppo acetile, palmitoile, o altri gruppi, sono stati introdotti usando i protocolli descritti usando o le rispettive anidridi simmetriche o un processo di acilazione con attivazione in presenza di 1-idrossi-7-azabenzotriazolo (HOAt) e diisopropilcarbodiimmide (DIPC) in DMF. La completezza della reazione à ̈ monitorata usando il Kaiser Test in presenza di ninidrina per la valutazione delle ammine libere.

La rimozione del peptide dalla resina e la contemporanea rimozione dei gruppi protettori dalle catene laterali dei singoli amminoacidi à ̈ stata effettuata mediante trattamento con la miscela di cleavage acido trifluoroacetico: H2O: fenolo: triisopropilsilano = 87.5:5:5:2.5 per 60-90 minuti, a seconda dei gruppi protettori. I peptidi sono stati precipitati in terbutilmetiletere a freddo e centrifugati per 30 minuti a 4<o>C a 3600rpm. Il precipitato peptidico viene lavato 3 volte e infine liofilizzato con una miscela H2O/CH3CN contenente 0.1 % acido trifluoroacetico.

Tutti i peptidi sono stati purificati con cromatografia liquida ad alta pressione in fase inversa (RP-HPLC) usando una pompa cromatografica della WATERS 2489 o alternativamente Waters 600/E accoppiato con un rivelatore Waters 2545 o alternativamente ad un rivelatore JASCO UV-975 usando colonne cromatografiche X-Bridge BEH130 Perp C18 10 Î1⁄4m (19x150 mm) o alternativamente una colonna X-Bridge BEH130 Perp C18 5 Î1⁄4m (30x150 mm). Tutti i peptidi sono stati caratterizzati prima e dopo la purificazione usando un sistema LC/MS della Waters UPLC/MS ACQUITY equipaggiato con spettrometro di massa Waters SQ. Tutti i peptidi sono stati liofilizzati e ottenuti con una purezza > 95%.

 

Lo scambio del controione trifluoroacetato segue modalità che dipendono dal controione scelto (acetato, cloruro, etc). Ad esempio, la preparazione dei peptidi con controione acetato viene fatta attraverso uno scambio ionico su resina ToyoPeral DEAE 650C, condizionando la resina con acido acetico ed eluendo i peptidi precedentemente caricati in acqua con un eccesso di resina/DEAE di 40 volte rispetto agli equivalenti di peptide. I peptidi così eluiti sono direttamente liofilizzati.

La preparazione dei peptidi cloroidrati viene fatta sciogliendo i peptidi liofili dopo purificazione con una soluzione 1mM HCl e liofilizzando. L’operazione può essere ripetuta più volte. La completezza dello scambio viene verificata attraverso una analisi F<19>-NMR. Tutti i peptidi vengono conservati come liofili a -20ºC.

I peptidi sintetizzati sono descritti in Tabella 1.

Tabella 1

Peptide  Peso Molecolare M+1 

Ac†PHREN   693.71 

Palm†PHREN   890.08 

Ac†PHREN†K†Palm   1060.29 

Ac†PHRE   579.61 

Ac†PHREQ   707.74 

Ac†Hyp†HREN   709.71 

Ac†Tic†HREN   755.78 

Ac†Azt†HREN   679.68 

Ac†P†Tha†REN   709.77 

HREN   554.56 

Ac†PHEN   537.52 

Ac†PREN   556.57 

Ac†Pro†HREN  693.71 

Ac†hPro†HREN  707.74 

Ac†P†Thz†REN  710.76 

Ac†PH†Orn†EN  651.68 

Ac†PHRDN  679.68 

Ac†PHKEN  665.70 

Ac†PH†Agb†EN  679.30 

 

Saggio di induzione di Collagene I in fibroblasti umani

Sistema di saggio

Fibroblasti umani primari di 2 diversi lotti, derivanti dal derma di adulti, sono stati ottenuti da Lonza. Le cellule sono state coltivate in Fibroblast Growth Media (FGM-2 Bullet Kit) e utilizzate a passaggio p2-p6. Un giorno prima del saggio di induzione di collagene, le cellule sono state piastrate (10,000 cellule/pozzetto) in piastre da 96 pozzetti (µClear, Greiner) in Dulbecco’ Modified Eagle’s Medium (DMEM) contenente 5% siero bovino fetale, 100 UI/ml di penicillina, 100 µg/ml di streptomicina, 1% acido ascorbico. Le cellule sono state incubate per 72 ore con diverse dosi di peptidi.

Diluizioni seriali dei peptidi sono state fatte in DMSO e poi diluite direttamente nel saggio in modo da avere una percentuale di DMSO uguale a 0.1.

Dopo rimozione del terreno di saggio, le cellule sono state lavate 3 volte con Phosphatebuffered saline (PBS) e il monostrato e’ stato fissato incubandolo per 15 minuti con etanolo al 95%. Dopo altri 3 lavaggi in PBS contenente 1% di Triton X-100, le cellule sono state incubate per due ore con PBS addizionato di 1% albumina bovina e poi per altre due ore con un anticorpo monoclonale murino, diretto contro il collagene di tipo I (Ab 90395, Abcam) diluito 1:1000 (v/v). Dopo tre lavaggi in PBS con 1% Triton X-100, sono stati aggiunti un anticorpo secondario coniugato al fluoroforo Alexafluor 488 (1:3000) insieme al colorante nucleare Hoechst, per due ore in PBS con 1% albumina bovina. Dopo ulteriori 3 lavaggi in PBS ed 1% Triton X-100, sono stati aggiunti 50 µl/pozzetto di PBS e la piastra e’ stata analizzata tramite high throughput laser scanner imager  (Acumen eX3 TTP Labtech, IN Cell Analyzer 1000 GE Healthcare).

Analisi dei risultati

I campioni sono stati analizzati su micropiastra mediante microscopi a fluorescenza automatizzati. Le tecniche applicate sono state di due tipi:

- citometria per individuare i composti più efficaci;

- microscopia a fluorescenza per quantificare e visualizzare l’aumentata quantità di collagene a seguito del trattamento.

Nel caso della citometria su piastra à ̈ stato impiegato un lettore Acumen Explorer (TTP Labtech Ltd, UK). L’inviduazione di ogni oggetto nei pozzetti della micropiastra avviene nel caso il segnale associato ad un pixel superi la media più due volte la deviazione standard di tutti i pixel del pozzetto. La luce emessa dai campioni à ̈ registrata tramite un fotomoltiplicatore. La scansione dei campioni à ̈ avvenuta con due sorgenti laser. La prima,

 

con lunghezza d’onda 408 nm, causa l’eccitazione del marker nucleare Hoechst 33348 (Life Technologies, US). La luce emessa da tale marker, registrata tramite un filtro 460 nm in uscita, permette di quantificare il numero di nuclei. Tale valore viene utilizzato per compensare le fluttuazioni di segnale dovute alla variabilità sperimentale. Il segnale relativo all’immunocolorazione del collagene di tipo I à ̈ stato ottenuto mediante eccitazione con una sorgente laser a 488 nm e filtrato in uscita a 540 nm. Sono state considerate come cellule solo gli oggetti di dimensioni superiori alla media. La somma del segnale dei singoli oggetti per ogni campione à ̈ stata poi normalizzata per la conta dei nuclei descritta in precedenza. Il valore così ottenuto rappresenta, in unità di fluorescenza relativa per cellule, l’induzione di collagene di tipo I causata dal trattamento.

L’utilizzo della microscopia a fluorescenza à ̈ invece stato impiegato per quantificare e visualizzare la localizzazione cellulare del collagene di tipo I indotto. A questo scopo à ̈ stato impiegato un InCell 1000 (GE Healthcare, USA). L’eccitazione dei fluorofori, sia quello nucleare che quello dell’immunocolorazione del collagene, à ̈ avvenuta tramite una lampada allo xenon. La luce à ̈ stata filtrata sia in entrata che in uscita da un set di filtri analogo a quello descritto per il citometro. Per ciascun campione sono state acquisite due immagini tramite CCD camera: una derivante dall’eccitazione del marker nucleare e una derivante dall’eccitazione del fluoroforo utilizzato dell’immunocolorazione del collagene di tipo I. La quantificazione di quest’ultimo per singola cellula à ̈ avvenuto tramite analisi delle immagini (obiettivo di acquisizione: 10x) effettuata tramite il software InCell Investigator (GE Healthcare, USA). Il segnale relativo al collagene di tipo I si trova in vescicole citoplasmatiche, infatti tale proteina viene secreta. Il protocollo di analisi prevede i seguenti passaggi:

- segmentazione dei nuclei tramite l’apposito strumento fornito dal software;

- segmentazione delle vescicole contenenti il collagene di tipo I tramite l’apposito strumento fornito dal software;

- associazione delle vescicole con i relativi nuclei tramite sovrapposizione delle immagini;

- quantificazione del segnale di immunocolorazione del collagene di tipo I associato ad ogni cellula.

La media del segnale per ciascun campione rappresenta il livello di induzione del collagene di tipo I per cellule determinato del trattamento.

RISULTATI

 

I risultati ottenuti sono riportati in Tabella 2. L’induzione di collagene di tipo I à ̈ misurata mediante citometria su piastra come descritto nella sezione Materiali e Metodi.

Tabella 2

< >Induzione di Collagene I (volte sopra il controllo non trattato) 

Concentrazione   0.3  Î1⁄4M  1  Î1⁄4M  3  Î1⁄4M  10  Î1⁄4M  30  Î1⁄4M  Peptide 

Palm†GQPR (n= 10)  1.6 ± 0.21  1.5 ± 0.14  2.0 ± 0.33  1.7 ± 0.20  2.0 ± 0.51  Palm†GHK (n= 10)  1.8 ± 0.04  1.6 ± 0.19  1.9 ± 0.23  2.0 ± 0.36  1.8 ± 0.11  Ac†GHK (n= 3)  1.4 ± 0.12  1.6 ± 0.10  1.9 ± 0.18  1.8 ± 0.31  1.4 ± 0.07  Ac†PHREN (n = 10)  1.4 ± 0.18  1.5 ± 0.13  1.6 ± 0.11  2.1 ± 0.58  2.6 ± 0.65  Palm†PHREN (n = 4)  1.2 ± 0.16  1.3 ± 0.10  1.5 ± 0.23  1.2 ± 0.12  2.0 ± 0.54  Ac†PHREN†K†Palm (n = 5)  1.7 ± 0.27  1.8 ± 0.20  2.0 ± 0.19  1.6 ± 0.30  1.4 ± 0.36  Ac†PHRE (n = 3)  2.0 ± 0.14  1.8 ± 0.36  1.9 ± 0.45  1.7 ± 0.33  1.8 ± 0.31  Ac†PHREQ (n = 3)  1.5 ± 0.48  1.5 ± 0.30  1.6 ± 0.27  1.4 ± 0.31  1.6 ± 0.51  Ac†Hyp†HREN (n = 3)  2.0 ± 0.54  1.9 ± 0.34  2.5 ± 0.60  1.9 ± 0.59  1.8 ± 0.31  Ac†Tic†HREN (n = 3)  1.0 ± 0.36  1.2 ± 0.13  1.3 ± 0.28  1.1 ± 0.23  1.0 ± 0.39  Ac†Azt†HREN (n = 4)  1.2 ± 0.26  1.2 ± 0.27  1.3 ± 0.30  1.2 ± 0.23  1.4 ± 0.29  Ac†P†Tha†REN (n = 3)  1.0 ± 0.30  1.0 ± 0.30  1.2 ± 0.27  0.9 ± 0.26  0.9 ± 0.29  HREN (n = 3)  2.0 ± 0.56  1.7 ± 0.26  2.1 ± 0.56  1.6 ± 0.39  2. 0 ± 0.30  Ac†PHEN (n = 4)  1.6  ± 0.44  1.5 ± 0.35  1.8 ± 0.52  1.4 ± 0.32  1.6 ± 0.47  Ac†PREN (n = 4)  1.8 ± 0.21  2.0 ± 0.14  2.4 ± 0.30  1.9 ± 0.12  1.9 ± 0.17 

I risultati descritti in Tabella 2 mostrano che i peptidi dell’invenzione producono un incremento significativo di Collagene I quando testati a concentrazioni comprese tra 0.3Î1⁄4M e 30Î1⁄4M. L’incremento misurato ad esempio con AcPHREN, AcPHRE, HREN, AcPREN à ̈ paragonabile o superiore a quello osservato utilizzando alle stesse concentrazione i peptidi della tecnica anteriore : PalmGQPR, PalmGHK, AcGHK.

 

Claims (16)

1. RIVENDICAZIONI 1. Peptide di formula generale (I): R1 O O O OH N C NH C NH C NH C N X A O yy z <N>NH NH O OHONH2 m HN NH n 2<p>q (I)  in cui: m, n, p, q = 0, 1 e se uno di m, n, p o q à ̈ 0, tutti gli altri sono 1; y = 0, 1, 2; z = 0, 1; R1= H, OH; A = H, R2CO in cui R2à ̈ un gruppo alchilico contenente da 1 a 22 atomi di carbonio, lineare, ramificato o ciclico, saturo o insaturo, idrossilato o no, contenente un atomo di zolfo o no, contenente un atomo di ossigeno o no; X à ̈ selezionato tra un amminoacido, un derivato di amminoacido, OR3, NR3R4in cui R3e R4sono ciascuno indipendentemente scelti tra H, C1-22alchile lineare o ramificato, saturo o insaturo; sali farmaceuticamente accettabili, isomeri, stereoisomeri e tautomeri relativi, con l’esclusione dei composti in cui: R1= H; m = n = p = q = 1; y = 1; z = 0; X = NH2.
2. 2. Peptide secondo la rivendicazione 1 in cui A Ã ̈ scelto tra acetile e palmitoile.
3. 3. Peptide secondo la rivendicazione 1 selezionato nel gruppo consistente in: - Acetil-Pro-His-Arg-Glu-Asn-Lys-(N ε-Palmitoile) ; - Acetil-Pro-His-Arg-Glu-Gln ; - Acetil-Pro-His-Arg-Glu ; - His-Arg-Glu-Asn; - Acetil-Pro-Arg-Glu-Asn ; - Acetil-Hyp-His-Arg-Glu-Asn ; - Acetil-Pro-His-Glu-Asn.  
4. 4. Peptide di formula (I), R1 O O O OH N C NH C NH C NH C N X A O z yy <N>NH NH O OHONH2 m HN NH n 2<p>q (I) in cui: m, n, p, q = 0, 1 e se uno di m, n, p o q à ̈ 0, tutti gli altri sono 1; y = 0, 1, 2; z = 0, 1; R1= H, OH; A = H, R2CO in cui R2à ̈ un gruppo alchilico contenente da 1 a 22 atomi di carbonio, lineare, ramificato o ciclico, saturo o insaturo, idrossilato o no, contenente un atomo di zolfo o no, contenente un atomo di ossigeno o no; X à ̈ selezionato tra un amminoacido, un derivato di amminoacido, OR3, NR3R4in cui R3e R4sono ciascuno indipendentemente scelti tra H, C1-22alchile lineare o ramificato, saturo o insaturo; sali farmaceuticamente accettabili, isomeri, stereoisomeri e tautomeri relativi, per uso medico.
5. 5. Peptide secondo la rivendicazione 4 per uso nel trattamento di patologie cutanee e/o dermatologiche che trovano beneficio dall’ aumento della quantità di collagene.
6. 6. Peptide secondo la rivendicazione 4 per uso nel trattamento della cicatrizzazione delle ferite e delle ustioni.
7. 7. Peptide secondo le rivendicazioni da 4 a 6 in cui A Ã ̈ scelto tra acetile e palmitoile.
8. 8. Peptide per uso secondo le rivendicazioni da 4 a 6 selezionato nel gruppo consistente in: - Acetil-Pro-His-Arg-Glu-Asn-Lys-(N ε-Palmitoile); - Acetil-Pro-His-Arg-Glu-Gln; - Acetil-Pro-His-Arg-Glu ; - His-Arg-Glu-Asn;   - Acetil-Pro-Arg-Glu-Asn; - Acetil-Hyp-His-Arg-Glu-Asn ; - Acetil-Pro-His-Glu-Asn ; - Acetil-Pro-His-Arg-Glu-Asn; - Palm-Pro-His-Arg-Glu-Asn .
9. 9. Uso cosmetico di un peptide come descritto in una qualsiasi delle rivendicazioni 4, 7 o 8.
10. 10. Uso cosmetico di un peptide secondo la rivendicazione 9 per prevenire e/o ridurre i segni dell’invecchiamento cutaneo.
11. 11. Composizione comprendente almeno un peptide secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti e un veicolo accettabile per uso topico.
12. 12. Composizione secondo la rivendicazione 11 in cui detto peptide à ̈ presente in una concentrazione compresa tra 0.0005% p/p e 0.5% p/p.
13. 13. Composizione secondo le rivendicazioni 11 o 12 ulteriormente comprendente almeno un ingrediente aggiuntivo scelto tra vitamina C, derivati della vitamina C, vitamina E, derivati della vitamina E, tocoferoli, vitamina A, derivati della vitamina A, retinale, acido retinoico.
14. 14. Formulazione comprendente la composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 11 a 13 selezionata dal gruppo di: crema, emulsione, dispersione, gel, pomata, lozione, siero.
15. 15. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 11 a 13 per uso nel trattamento di patologie cutanee e/o dermatologiche che trovano beneficio dall’aumento della quantità di collagene.
16. 16. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 11 a 13 per uso cosmetico e/o per prevenire o ridurre i segni dell’invecchiamento cutaneo.