SE465154B - Tillvaextfaktor i samband med artificiella transplantat - Google Patents

Description

465 154 2 I European Patent Application 0190736 användes GHK-Cu2* med modifierad karboxcylterminal som en salva för snabbare läkning av sår.

GHK-Cu2+ har visat en signifikant superoxiddismutasaktivitet g som uppgår till omkring 25% av den aktivitet som enzymet y kopparzinksuperoxiddismutas har (räknat per mol). Efter sår eller skadad vävnad invaderar celler från immunsystemet det skadade området och stora mängder giftiga syreradikaler utsändes för att döda invaderande bakterier. Radikalerna förstör också intakt vävnad och en ond cirkel uppkommer då mera syreradikaler tillföres och läkningen försenas.

GHK-Cu2* superoxiddismutasaktivitet avgiftar de Vävnads- förstörande superoxidanjonerna.

Aggregation av blodplättar utgör begynnelsestadium till trombosbildning. GHK-Cu2* inhiberar denna aggregering samt inhiberar hormonet tromboxan som är trombosframkallande.

Strukturen av tripeptiden GHK-Cu2* framgår av Fig 1.

Peptidens affinitet för koppar är mycket stark med ett pK för dissociationskonstanten omkring 16. För den biologiska aktiviteten är det nödvändigt att lysinets E-aminogrupp är fri. 2. Artificiella transplantat inom kirurgin Konstgjorda material användes i allt större omfattning inom kirurgin. Inom ortopedisk kirurgi användes transplantät för mjukdelar såsom muskler, senor och ledband. När det gäller ledband har man företrädevis använt sig av icke resorberbara M material. I dag användes nästan uteslutande polypropylenband ~ som ej är resorberbara, varför resultaten på lång sikt ej är ; tillfredsställande. När det gäller artificiella ledband som är nedbrytbara i human vävnad, måste dessa vara biokompa- tibla. Polymerer av mjölksyra och glykolsyra bryts ner av kroppen. De är icke toxiska och tolereras bra av levande 465 15-4 vävnad. I human organism hydrolyseras de till monomerer av mjölksyra och glykolsyra. I citronsyracykeln metaboliseras mjölksyra till koldioxid och vatten. Glykolsyra utsöndras med urinen eller oxideras av glykoloxidas till puruvat via glycin och serin och i analogi med mjölksyra i citronsyracykeln blir slutprodukten_koldioxid och vatten. Dessa biologiskt helt oskadliga nedbrytningsprodukter skiljer sig mycket förmånligt från nedbrytningsprodukter från andra polymerer, Polymerer av mjölk och glykolsyra har sedan lång tid använts som resorberbart suturmaterial. Problemet när det gäller artificiella ledband av dessa polymerer är att de bryts ner för snabbt och att kroppen inte har hunnit ersätta dem med egen vävnad där kollagen ingår som en huvudbeståndsdel. Den snabba nedbrytningen skulle kunna kompenseras om man kunde öka hastigheten av kollagensyntesen.

NYHET Uppfinningen består i att material, vilka används som trans- plantat, inkorporeras med kopparkomplexet av tripeptiden glycyl-L-histidyl-L-lysin. Som framgår av Fig l är lysinets karboxylgrupp inte involverad i kopparbindningen och är därför lämplig för att kovalent binda peptiden till ett transplantat.

Med känd peptidsyntes kopplas peptidens fria karboxylgrupp till en polymer som innehåller fria primära aminogrupper eller till en polymer som kan modifieras så att den innehåller fria primära aminogrupper. Öå peptiden har maximal aktivitet för att närmast fördubbla fibroblasternas kollagen- syntes redan vid en koncentration av l0"9M, räcker det mer än väl att en peptidmolekyl kopplas till en polymermolekyl, med en molvikt av 500000. Genom kemoattraktiv verkan, och vid frisättning av peptiden GHK-Cu2* då transplantatet löses upp 465 154 genom hydrolys i vävnaden, startas mycket specifika biolo- giska processer. Dessa innehåller många nära koordinerade reaktioner vilka måste vara i balans för att läkning skall kunna ske. Detta innebär en ökning av kollagensyntesen, ökning av vävnadsskyddande superoxiddismutasaktivitet och kemoattrativ verkan på bland annat mastceller och kapillära endotelceller} vilka stegrar en ackumulering av dessa celler runt skadan och stimulerar nybildningen av kärl och flödet av näring till skadan. ' SYNTESBESKRIVNING 1. Poly-L-mjölksyrans fria karboxylgrupp aktiveras med karbodiimid, och får sedan reagera med överskott av en diamin NH2-(CH2)n-NH=, där n = 2-6 beroende på längden av önskad "space" arm. Karbodiimiden kan vara dicyklo- hexylkarbodiimid om reaktionen sker i organiskt lös- ningsmedel eller l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl-) karbodiimid om reaktionen skall ske i vattenhaltigt lösningsmedel. 2. Tripeptiden NH2Gly-L-His-L-Lys-COOH blockeras på glycinets aminogrupp, histidinets imidazolgrupp och lysinets E-aminogrupp med 9-fluorenylmetylkloroformiat (FMOC-Cl). Lysinets fria karboxylgrupp aktiveras som under punkt 1 ovan med karbodiimid och får sedan reagera med poly-L-mjölksyra- derivatets fria aminogrupp [poly- L-mjölksyra-C-NH-(CH2)n-NH2].

Beträffande karbodiimid gäller detsamma som under 1. Efter borttagande av de skyddande FMOC-grupperna med piperidin och tillsats av koppar(II)-acetat, erhålles den önskade pro- dukten, vars struktur framgår av Fig 2. I produkten i Fig 2 har diaminen NH2(CH2)2NH2 använts. fl 465 154 Väteatomerna på kväve och kol i strukturformeln är ej ut- satta. Samma syntesmetod gäller också för poly-DL-mjölksyra, för polyglykolsyra och för sampolymerer av dessa.

I syntesbeskrivningen under punkt 1 ovan har FMOC-Cl använts för blockering av amino- och imidazolgrupper och deblockering sedan skett med en bas. Ett annat blockeringsreagens för dessa grupper är tert-butoxykarbonylgruppen. Peptidsyntesen sker också här med karbodiimid. Deblockering efter syntesen göres här med utspädd syra (25% trifluorättiksyra).

Peptiden glycyl-L-histidyl-L-lysin finns kommersiellt till- gänglig.

En annan syntesväg är att efter koppling av diaminen till polyestern medelst peptidsyntes koppla i ordning amino- blockerade L-lysin, L-histidin och glycin, som efter de- blockering och tillsats av koppar ger produkten i Fig 2. Om man vill öka antalet karboxylgrupper per polymermolekyl, kan man behandla polymeren med mild hydrolys då antalet karboxyl- grupper ökar och därmed också antalet GHK-Cuz* molekyler.

Mjölksyra och glykolsyra är båda a-hydroxykarboxylsyror. Ett flertal andra a-hydroxykarboxylsyror är lämpliga att homo- eller sampolymerisera. Exempel på sådana är a-hydroxy- smörsyra, a-hydroxyisosmörsyra, a-hydroxyvaleriansyra, a-hydroxyiso- valeriansyra. Av ß-hydroxykarboxylsyror har D-ß-hydroxysmörsyra som polymer använts i transplantat (British Paptent 1034123). Som transplantat användes polymerer baserade på p-dioxanon uppvisande enheter med formeln _ R R' -OïIH-ÉI-O-EH-C- I H RR O n 465 154 vari R och R' betecknar individuellt väte, metyl eller etyl och n polymeriseringsgraden. Syntetiska bioabsorberbara poly(ester-amider) har beskrivits av T H Barrows et al., vid 3M Center, St. Paul, Minnesota, USA. Dessa polymerer uppvisar enheter med formeln f! - - H -c-NH- CH -NH-c-CH -o-c~ CH -c- 002!! (QX u 2 n(2)>'n O O 0 O n Alla dessa polymerer kan med samma syntes som beskrivits under l och 2 ovan kovalent kopplas med GHK-Cu2+.

Ett annat utföringsexempel är att kovalent binda GHK-Cu=* till andra biokompatibla polymermaterial, både resorberbara och icke resorberbara, vilka innehåller aminogrupper eller där en sådan kan introduceras. Exempelvis kan glas silyleras med 3-aminopropyl- trietoxysilan vars fria aminogrupp sedan , kopplas till lysinets karboxylgrupp. I detta fall skulle ett ¿ stort antal GHK-Cuz* kunna bindas till glaset.

-CH Glas í -o-sl-(cuz)ïnn-c-L-Lys-L-His-cly-NH -cun / C _ 2 í Him; Û 'i Vid metalliska transplantat kan metallen först beläggas med ett protein, t ex serumalbumin, vars aminogrupper bryggbindes med glutaraldehyd. Till albuminets karboxylgrupper kan sedan GHK-Cuz* bindas kovalent som beskrivits under l och 2 ovan.

Fig 1 visar rymdstrukturen av GHK-Cu2*- Lysin och histidins § sidokedjor, samt glycinets aminoterminal är nödvändiga för aktiviteten. Utan att störa konformationen av kopparkomplexet kan en av väteatomerna på glycinets d-kol bytas ut mot en annan radikall Förslag till ny tripeptid blir exempelvis 465 154 Ala-His-Lys, Val-His-Lys, Leu-His-Lys o s v. En fördel här är att vi beträffande den nya aminosyran, även kan använda oss av D-formen. Detta betyder att peptiden blir mer resistent mot proteolytisk hydrolys och kommer att vara verksam under längre tid.

Vid praktisk användning av föreliggande uppfinning kan naturligtvis armeringsmaterial användas. Sådana förstärkningsmaterial kan vara nedbrytbara eller icke- nedbrytbara.

Under det att uppfinningen beskrivits med hänvisning till vissa specifika exempel, bör observeras att uppfinningen ingalunda är inskränkt till sådana specifika särdrag, efter- som närliggande variationer och modifikationer är uppenbara för fackmannen på området.

Claims (1)

1. 465 154 PATENTKRAV Sätt att öka den naturliga kollagenbiosyntesen vid artificiella transplantat genom att ett biologiskt aktivt agens immobiliseras på transplantatet k ä n n e t e c k n a t a v att detta agens är den tillväxtfaktor för kollagen som utgöres av kopparkomplexet av tripeptiden glycyl-L-histidyl-L- lysin som immobiliseras genom att lysinets C-terminala karboxylgrupp kovalent bindes till transplantatet. Sätt enligt krav 1 k ä n n e t e c k n a t a v att transplantatet utgöres av poly-L-mjölksyra, polyglykolsyra eller en sampolymer av dessa, där polymerens karboxylgrupp först peptidbundits med en diamin, företrädesvis 1,6-hexandiamin och produktens fria aminogrupp peptidbundits med lysinets karboxylgrupp i kopparkomplexet av tripeptiden glycyl-L-histidyl-L-lysin (GHK-Cu=+)- Sätt enligt krav 2 k ä n n e t e c k n a t a v att transplantatet utgöres av co- eller sampolymerer av glykolsyra, mjölksyra, smörsyra, isosmörsyra, valeriansyra eller isovaleriansyra. Sätt enligt krav 2 k ä n n e t e c k n a t a v att transplantatet utgöres av en polymer baserad på p-dioxanon uppvisande enheter med en formel

1.* R' I -o-cH-c-o-cn-c- l I ll R R o n. vari R och R' betecknar individuellt väte, metyl eller etyl och n polymeriseringsgraden.