CN110849993A - 一种油茶籽油皂苷类化合物分类及结构推测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种油茶籽油皂苷类化合物分类及结构推测方法，包括按照皂苷元骨架结构差异分成三种不同类型；总结油茶籽油不同类型皂苷类化合物在质谱中的裂解特征；对油茶籽油样品进行皂苷类化合物提取和检测基础上，结合裂解特征，根据皂苷元骨架结构、m/z差值以及现有茶皂苷的官能团位点，推测未知皂苷类化合物的结构。本发明提供的分类方法快速、准确，是一种系统的质谱解析方法，可为油茶籽油茶皂苷类化合物的定性分析提供理论指导，为油茶籽油的进一步深入分析和开发提供了参考。

Description

一种油茶籽油皂苷类化合物分类及结构推测方法
技术领域
本发明涉及分析方法技术领域，尤其是一种油茶籽油皂苷类化合物分类及结构推测方法。
背景技术
油茶作为世界四大木本油料之一，是我国的特色木本油料，在湖南、广西、江西等十多个省(市)广泛栽培，不与粮食争田地，属于我国重要国家战略资源。油茶籽油是一种高级本木植物油，不饱和脂肪酸可达90％左右，脂肪酸组成与橄榄油类似。油茶籽油还富含酚类化合物、维生素E以及角鲨烯等。另外油茶籽中还含有丰富的皂苷类化合物，榨油后的饼粕可开发茶皂素产品，但是油茶籽油中的皂苷类化合物分析报道较少。目前，油茶籽油皂苷类化合物基础数据几乎空白。然而，脂溶性皂苷类化合物作为油茶籽油特有的活性成分，对其开展研究可为油茶籽油质量标准及应用开发提供基础数据。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术中油茶籽油皂苷类化合物分析数据的不足，提供一种油茶籽油皂苷类化合物分类及结构推测方法，为其定性定量工作奠定科学基础。
具体方案如下：
一种油茶籽油皂苷类化合物分类及结构推测方法，包括：
步骤1：按照皂苷元骨架结构差异分成三种不同类型，分别如下：
步骤2：根据上述皂苷元骨架结构，列出茶皂苷糖基逐步丢失以及茶皂苷的官能团丢失的路径，总结出油茶籽油皂苷类化合物在质谱中的裂解特征；
步骤3：对油茶籽油样品进行皂苷类化合物提取和检测，所述检测包括：采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱技术，获取色谱信息和质谱信息，结合步骤2中的油茶籽油皂苷类化合物在质谱中的裂解特征，根据皂苷元骨架结构、m/z差值以及现有茶皂苷的官能团位点，推测未知皂苷类化合物的结构。
进一步的，所述步骤2中，裂解特征包括：Camelliagenin B类型的茶皂苷在二级质谱中有特征碎片451.32，计算出的化学式为C30H44O3；Camelliagenin A类型的茶皂苷在二级质谱中有特征碎片437.34，计算出的化学式为C30H46O2；Theasapogenol F类型的茶皂苷在二级质谱中特征碎片为497.32，计算出的化学式为C31H46O5。
进一步的，所述步骤2中，茶皂苷糖基逐步丢失以及茶皂苷的官能团丢失的路径包括：①苷元骨架烷基链基团丢失②糖基逐步丢失③糖基链与皂苷元分离。
进一步的，所述步骤2中，茶皂苷在质谱中有以下特征二级碎片：
①苷元骨架烷基链基团丢失：茶皂苷中苷元骨架上的烷基链，包括Ang，Tig，MB，Isov，Hex或Butyryl，易丢失形成大于1100Da的特征碎片。
②糖基逐步丢失：对茶皂苷施加适当的碰撞电压，四个糖基均可能丢失，且每丢失一个糖基后可能形成两种碎片：其中一种是断裂处脱水形成双键，另一种是加氢形成羟基，两者相差18Da，该裂解规律可能形成7种碎片。
③糖基链与皂苷元分离：糖基除了一个一个丢失之外，也可能以糖基链，例如三个糖的形式整体丢失，形成451Da的特征碎片，其最外侧的糖为五碳糖；或481Da的特征碎片，其最外侧的糖为六碳糖的特征碎片。
进一步的，所述步骤3中，对油茶籽油样品进行油皂苷类化合物提取的方法，以2.5g油茶籽油样品为例，各试剂用量对应于2.5g油茶籽油样品，则油茶籽油皂苷类化合物提取的方法为：准确称取2.5g油茶籽油样品于离心管中，加入3-7mL正己烷，加入20-30mL乙醇水混合溶液，涡旋3-7min，3000-4000rmp离心8-12min后收集下层，旋蒸干燥后加入8-12mL蒸馏水溶解，将提取液移至离心管中，加入8-12mL正丁醇，涡旋振荡2-5min后离心分离，重复2-4次，合并正丁醇提取液旋蒸至干，用甲醇水重溶得到提取液。
进一步的，所述步骤3中，油茶籽油皂苷类化合物提取的方法，以2.5g油茶籽油样品为例，各试剂用量对应于2.5g油茶籽油样品，则油茶籽油皂苷类化合物提取的方法为：准确称取2.5g油茶籽油样品于离心管中，加入5mL正己烷，加入20-30mL乙醇水混合溶液，其中乙醇含量为65-85％，涡旋5min，3500rmp离心10min后收集下层，旋蒸干燥后加入10mL蒸馏水溶解，将提取液移至离心管中，加入10mL正丁醇，涡旋振荡3min后离心分离，重复3次，合并正丁醇提取液旋蒸至干，用250μl 50％甲醇水重溶得到提取液，提取液过孔径为0.2-0.3μm的滤膜，收集过滤液备用；上述％皆为体积分数。
进一步的，所述步骤3中，采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱技术，其中：
色谱条件为：色谱柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18，流动相A：0.1％甲酸水，流动相B：0.1％甲酸乙腈，梯度洗脱，流速：0.2-0.4mL/min，柱温：30±5℃，进样量：4±0.5μL；色谱条件中的％皆为体积分数；
质谱条件为：离子化模式：ESI-，干燥气温度300±10℃，干燥器流速7±2L/min，毛细管电压3.5±0.5kV，雾化器压力35±5psig，鞘气温度350±10℃，鞘气流速10±2L/min，碎裂电压120±10V，一级质谱碰撞电压45±5V，二级质谱碰撞电压65±5V，离子扫描范围m/z＝100-1500。
进一步的，色谱条件为：色谱柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18(3.0mm×100mm，2.7μm)，流动相A：0.1％甲酸水，流动相B：0.1％甲酸乙腈，梯度洗脱(0-2min，90％A，10％B；2-6min，90％A→65％A，10％B→35％B；6-16min，65％A→35％A，35％B→65％B；16-18min，35％A→5％A，65％B→95％B；18-19.9min，5％A，95％B；19.9-20min，5％A→90A，95％B→10％B)，流速：0.3mL/min，柱温：30℃，进样量：4μL；色谱条件中的％皆为体积分数。
进一步的，质谱条件为：离子化模式：ESI-，干燥气温度300℃，干燥器流速7L/min，毛细管电压3.5kV，雾化器压力35psig，鞘气温度350℃，鞘气流速10L/min，碎裂电压120V，一级质谱碰撞电压45V，二级质谱碰撞电压65V，离子扫描范围m/z＝100-1500。
进一步的，所述步骤3中，采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱技术，包括：利用Q-TOF/MS质谱分析器的四极杆选择色谱峰对应的分子离子，在碰撞池中对其进行碰撞诱导解离，裂解所得的碎片离子通过TOF扫描得到二级质谱图。
有益效果：
本发明提供的油茶籽油皂苷类化合物分类及结构推测方法，可用于指导分析油茶籽油样品中茶皂苷的种类及结构。由于茶皂苷类化合物在质谱中裂解的规律性强，可根据茶皂苷骨架结构、m/z差值以及现有茶皂苷的官能团位点来对其结构进行合理推测。本发明提供的方法快速、准确，是一种相对较好的鉴定思路，可作为油茶籽油茶皂苷类化合物的分析方法，为油茶籽油的进一步深入分析和开发提供了参考。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅涉及本发明的一些实施例，而非对本发明的限制。
图1是本发明一个实施例6提供的油茶籽油茶皂苷裂解示意图；
图2是本发明一个实施例6提供的油茶籽油茶皂苷官能团结构图；
图3是本发明一个实施例6提供的茶皂苷二级质谱图；
图4是本发明一个实施例7提供的茶皂苷元骨架结构图。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。在下面的实施例中，如未明确说明，“％”均指体积百分比。
以下使用的仪器与设备包括：
高效液相色谱仪(Agilent 1290)、高分辨飞行时间质谱仪(Agilent 6540)、四元泵、在线脱气系统、柱温箱、自动进样系统、dual JetStream ESI电喷雾离子源、MassHunterData Acquisition(B.07.00)实时采集工作站、Qualitative Analysis(B.07.00)离线分析软件均为美国安捷伦公司；分析天平(BSM220.4)购自上海卓精电子科技有限公司；旋转蒸发仪(R215)、恒温水浴锅(B491)、真空泵(V700)购自瑞士BUCHI公司；电热鼓风干燥箱(101)购自上海叶拓仪器仪表有限公司；离心机(TGL-16M)购自湖南湘仪仪器有限公司；涡旋混合器(QL-861)购自海门其林贝尔仪器制造公司；超纯水系统(Milli-Q)为美国Millipore公司。
以下使用的主要试剂包括：
油茶籽毛油采自福建省油脂生产企业。
乙腈(4L HPLC)、甲酸(100ml HPLC)购自美国sigma公司；乙醇(500ml AR)、甲醇(500ml AR)、正己烷(500ml AR)、正丁醇(500ml AR)购自国药集团化学试剂有限公司；实验室用水为自制超纯水；样品瓶(2ml)购自安捷伦科技有限公司；有机滤膜(0.22μm)购自英国Whatman公司。
实施例1
提取油茶籽油皂苷类化合物：准确称取2.5g油茶籽油样品于离心管中，加入5mL正己烷，再加入20mL 85％乙醇，涡旋5min，3500rmp离心10min后收集下层，旋蒸浓缩后加入10mL蒸馏水溶解，将提取液移至离心管中，加入10mL正丁醇，涡旋振荡3min后离心分离，重复三次，合并提取液旋蒸至干后用10mL纯乙醇重溶后，采用香草醛-硫酸比色法测定皂苷类化合物含量，最后测定茶皂素含量3.18mg/g油茶籽油。
实施例2
提取油茶籽油皂苷类化合物：准确称取2.5g油茶籽油样品于离心管中，加入5mL正己烷，再加入25mL 85％乙醇，涡旋5min，3500rmp离心10min后收集下层，旋蒸浓缩后加入10mL蒸馏水溶解，将提取液移至离心管中，加入10mL正丁醇，涡旋振荡3min后离心分离，重复三次，合并提取液旋蒸至干后用10mL纯乙醇重溶后，采用香草醛-硫酸比色法测定皂苷类化合物含量，最后测定茶皂含量3.71mg/g油茶籽油。
实施例3
提取油茶籽油皂苷类化合物：准确称取2.5g油茶籽油样品于离心管中，加入5mL正己烷，再加入30mL 85％乙醇，涡旋5min，3500rmp离心10min后收集下层，旋蒸浓缩后加入10mL蒸馏水溶解，将提取液移至离心管中，加入10mL正丁醇，涡旋振荡3min后离心分离，重复三次，合并提取液旋蒸至干后用10mL纯乙醇重溶后，采用香草醛-硫酸比色法测定皂苷类化合物含量，最后测定茶皂素含量3.52mg/g油茶籽油。
实施例4
提取油茶籽油皂苷类化合物：准确称取2.5g油茶籽油样品于离心管中，加入5mL正己烷，再加入25mL65％乙醇，涡旋5min，3500rmp离心10min后收集下层，旋蒸浓缩后加入10mL蒸馏水溶解，将提取液移至离心管中，加入10mL正丁醇，涡旋振荡3min后离心分离，重复三次，合并提取液旋蒸至干后用10mL纯乙醇重溶后备用。最后测定茶皂素含量2.79mg/g油茶籽油。
实施例5
提取油茶籽油皂苷类化合物：准确称取2.5g油茶籽油样品于离心管中，加入5mL正己烷，再加入25mL75％乙醇，涡旋5min，3500rmp离心10min后收集下层，旋蒸浓缩后加入10mL蒸馏水溶解，将提取液移至离心管中，加入10mL正丁醇，涡旋振荡3min后离心分离，重复三次，合并提取液旋蒸至干后用10mL纯乙醇重溶后备用。最后测定茶皂素含量3.03mg/g油茶籽油。
对比例1
现有技术中提取油茶籽油皂苷类化合物的方法为：准确称取2.5g油茶籽油样品于离心管中，加入27.5mL纯乙醇，于60℃下水浴搅拌1.25h，3500rmp离心10min后收集下层，旋蒸浓缩后加入10mL蒸馏水溶解，将提取液移至离心管中，加入10mL正丁醇，涡旋振荡3分钟后离心分离，重复3次，合并正丁醇提取液旋蒸至干，用10mL纯乙醇重溶后备用。最后测定茶皂素含量3.46mg/g油茶籽油。
实施例1-5中提供的提取方法可以避免加热处理，较低能耗，避免皂苷类受热后降解，保持其活性；另外该方法将处理时间大幅缩短，用旋涡振荡5分钟代替了传统水浴加热处理，提高了工作效率。另外实施例1-5中提供的提取方法采用正丁醇洗脱的方法富集皂苷类物质，不涉及化学方法，避免了提取过程对皂苷类化合物化学结构的影响。
试验中发现，以实施例1-5中获得的提取物进行，与其他提取预处理相比，能够收集到种类较为全面而且丰度更高的试验数据。
实施例6
分析油茶籽油皂苷类化合物，包括以下步骤：
步骤1：
准确称取2.5g油茶籽油样品于离心管中，加入5ml正己烷，混匀后加入25ml80％乙醇，涡旋5min，3500rmp离心10min后收集乙醇层，旋蒸浓缩后加入10ml蒸馏水溶解，将提取液移至离心管中，加入10ml正丁醇，涡旋振荡3min后离心分离，重复三次，合并正丁醇层旋蒸至干后，用250μl 50％甲醇水重溶后过0.22μm滤膜备用。
步骤2：将步骤1获得的过滤液分别送入高效液相色谱仪和高分辨飞行时间质谱仪，其中：
色谱条件：
色谱柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18(3.0mm×100mm，2.7μm)，流动相A：0.1％甲酸水，流动相B：0.1％甲酸乙腈，梯度洗脱(0-2min，90％A，10％B；2-6min，90％A→65％A，10％B→35％B；6-16min，65％A→35％A，35％B→65％B；16-18min，35％A→5％A，65％B→95％B；18-19.9min，5％A，95％B；19.9-20min，5％A→90A，95％B→10％B)，流速：0.3mL/min，柱温：30℃，进样量：4μL。
质谱条件：
离子化模式：ESI-，干燥气温度300℃，干燥器流速7L/min，毛细管电压3.5kV，雾化器压力35psig，鞘气温度350℃，鞘气流速10L/min，碎裂电压120V，一级质谱碰撞电压45V，二级质谱碰撞电压65V，离子扫描范围m/z＝100-1500。
步骤3：
采用UHPLC-Q-TOF/MS在上述色谱和质谱条件下对油茶籽油茶皂苷提取物进行分析，为了从中提取有效的、与皂苷相关的化合物信息，通过查阅参考文献(参见文献1、Guo，N.；Tong，T.T.；Ren，N.；Tu，Y.Y.；Li，B.，Saponins from seeds of Genus Camellia：Phytochemistry and bioactivity.Phytochemistry 2018，149，42-55；文献2、Cui，C.J.；Zong，J.F.；Sun，Y.；Zhang，L.；Ho，C.T.；Wan，X.C.；Hou，R.Y.，Triterpenoid saponinsfrom the genus Camellia：structures，biological activities，and molecularsimulation for structure-activity relationship.Food Funct2018，9，3069-3091.)收集了油茶籽中茶皂苷化合物的名称及分子式，并精确计算相对分子质量，利用MassHunterPCDL Manager软件建立含有这些茶皂苷化合物的数据库。通过MassHunter定性软件结合自建的皂苷类化合物数据库检索采集到的原始数据，得到提取液中含有的与茶皂苷化合物库中精确相对分子质量一致的色谱峰(每种m/z下的提取离子色谱图见附录)。然后，利用Q-TOF/MS质谱分析器的四极杆选择这些色谱峰对应的分子离子，在碰撞池中对其进行碰撞诱导解离，裂解所得的碎片离子通过TOF扫描得到二级质谱图。然后根据离子的裂解情况并结合文献进一步比对，初步推断出油茶籽油正丁醇提取物中的21种茶皂苷(见表1)，其裂解示意图见图1，官能团结构见图2。
茶皂苷裂解规律参考之前的相关报道(参见：Feng，M.X.；Zhu，Z.L.；Zuo，L.M.；Chen，L.；Yuan，Q.P.；Shan，G.Z.；Luo，S.Z.，A strategy for rapid structuralcharacterization of saponins and flavonoids from the testa of Camelliaoleifera Abel seeds by ultra-high-pressure liquid chromatography combinedwith electrospray ionization linear ion trap-orbitrap mass spectrometry.AnalMethods-Uk 2015，7，5942-5953.)并加以完善。在定性出的21种茶皂苷中，有15种茶皂苷(1，2，3，5，6，7，12，13，14，15，16，17，18，19，20号)的结构已有文献报道，这15种均符合图1的裂解示意图，而3号茶皂苷(Rt＝10.345)的响应最高，二级信息最为丰富，因此以3号茶皂苷(Rt＝10.345)为例来揭示这15种茶皂苷化合物在质谱中的裂解途径。
3号茶皂苷(Rt＝10.345)的二级质谱图如图3所示，该峰对应准分子离子峰[M-H]-为1201.5673，经定性软件分析其元素组成为C58H90O26。在二级质谱中，母离子有三种裂解途径：①母离子经碰撞诱导解离丢失Ang或Tig基团后脱水([C58H90O26-H-C5H7O-O]-)生成m/z＝1101.5114([C53H80O24]-)的碎片离子。②母离子经碰撞诱导解离丢失五碳糖基团([C58H90O26-H-C5H9O5]-or[C58H90O26-H-C5H7O4]-)生成m/z＝1051.5097([C53H80O21]-)或m/z＝1069.5222([C53H82O22]-)碎片离子；[C53H82O22]-离子进一步碰撞诱导解离丢失六碳糖基团([C53H82O22-H-C6H9O5]-or[C53H82O22-H-C6H11O6]-)生成m/z＝907.4665([C47H72O17]-)或m/z＝889.4606([C47H70O16]-)碎片离子；[C47H70O16]-离子继续丢失六碳糖基团和羧基([C47H70O16-H-C6H11O6-CO2]-)生成m/z＝665.4027([C40H58O8]-)碎片离子，[C40H58O8]-离子进一步丢失残余糖基([C40H58O8-H-C5H5O3]-or[C40H58O8-H-C5H3O2]-)生成m/z＝551.3746([C35H52O5]-)或m/z＝569.3847([C35H54O6]-)碎片离子。③母离子经碰撞诱导解离丢失六碳糖基团([C58H90O26-H-C6H9O5]-or[C58H90O26-C6H11O5-HO]-)生成m/z＝1039.5129([C52H80O21]-)或m/z＝1021.5019([C52H78O20]-)碎片离子；[C52H78O20]-离子脱去糖苷配基后生成451.1090([C17H24O14]-)碎片离子。上述质谱信息与文献报道的Isomer of camelliasaponin B1二级质谱信息一致，因此鉴定该化合物为Isomer of camelliasaponin B1。
其余6种(4，8，9，10，11，21号)茶皂苷结构未见文献报道。由于茶皂苷类化合物在质谱中的裂解具有一定的规律，因此可基于已报道的茶皂苷结构对这6种茶皂苷结构进行合理推测。具体如下：
将4号茶皂苷(m/z＝1205)碎片信息与6号茶皂苷Isomer of camelliasaponin C1(m/z＝1203)比较可知，除了最后代表糖基的451Da碎片外，两种茶皂苷在每个裂解阶段的碎片均相差2Da，可推测它的皂苷元上某个官能团比6号茶皂苷多两个氢，且R2基团和G基团与6号茶皂苷相同。此外，Isomer of camelliasaponin C1茶皂苷的R1，R3，R4基团均为氢，无法满足再加两个氢的条件，因此只有R5基团有满足条件的可能。而茶皂苷R5基团可以为CH2OH，刚好满足条件，因此推测4号茶皂苷R5基团为CH2OH。由于其余结构与Isomer ofcamelliasaponin C1均相同，可将其视为Isomer of camelliasaponin C1的衍生物，并将4号茶皂苷命名为Isomer of camelliasaponin C1derivative。
将10号茶皂苷碎片与7号茶皂苷对比可知，糖基碎片与7号茶皂苷相差30Da，表明10号茶皂苷在7号茶皂苷结构基础之上用五碳糖代替了G基团的六碳糖。对比其他裂解途径的碎片可知，当丢失G基团后，两者碎片信息一致，表明两者仅有G基存在差异，故将10号茶皂苷命名为Camelliaoilsaponin7derivative。
8，9，11号茶皂苷可根据12号茶皂苷Theasaponin F3推测它们可能的结构。由于11号皂苷元上比8号多两个氢，8号皂苷元上比Theasaponin F3多两个氢，而11号和8号茶皂苷经过第一种裂解途径后生成的碎片相同，表明11号和8号仅在R2基团上有差异，11号的R2基团应为MB(Isov)，8号的R2基团应为Ang(Tig)。8号与Theasaponin F3经过第一种裂解途径后碎片相差2Da，表明12号的长烷基链基团应为Ang(Tig)。考虑到12号茶皂苷皂苷元上其余基团加氢的可能性，首先对R5基团进行推测。由于茶皂苷R5基团共有4种可能，分别为CH3、CHO、CH2OH和COOCH3。为满足加氢的条件，8号R5基团氢应尽可能多，因此排除CHO。若为CH3，则还需从其他R位加两个氧，对比现有的茶皂苷文献未能找到合适的官能团。若8号的R5基团为CH2OH，则需从其他R位加一个氧、一个碳和两个氢，满足条件的官能团为CH2OH，据文献报道，茶皂苷R1基团可以为CH2OH，刚好满足条件，因此推测8号茶皂苷R1基团是CH2OH，R2基团是Ang(Tig)，R5基团是CH2OH，其余基团与Theasaponin F3茶皂苷相同，并将8号茶皂苷命名为Theasaponin F3derivative A。根据8号和11号茶皂苷的碎片信息，很容易推测出11号茶皂苷R2基团变为了MB(Isov)，其余均与8号相同，将11号茶皂苷命名为TheasaponinF3derivative B。而9号茶皂苷则是在11号的基础之上将G1变成了G2，将9号茶皂苷命名为Theasaponin F3derivative C。
将21号茶皂苷碎片与20号茶皂苷Isomer of teaseedsaponin D对比可知，糖基碎片与Isomer of teaseedsaponin D相差30Da，表明21号茶皂苷在Isomer ofteaseedsaponin D结构基础之上用六碳糖代替了G基团的五碳糖，而丢失G基团后两者碎片信息一致，表明两者仅G基团存在差异，故将21号茶皂苷命名为Isomer of teaseedsaponinD derivative。
Figure BDA0002281946590000141
Figure BDA0002281946590000151
实施例7
将实施例6推断的21种茶皂苷化合物可基于其皂苷元结构(如图4)分成三种不同类型，如表2所示。其中，Type I型茶皂苷包含10种化合物(1，2，3，4，5，6，13，16，17，19号)，它们的皂苷元骨架为Camelliagenin B。Type II型茶皂苷包含7种化合物(7，10，14，15，18，20，21号)，它们的皂苷元骨架为CamelliageninA。Type III型茶皂苷包含4种化合物(8，9，11，12号)，它们的皂苷元骨架为Theasapogenol F。
表2茶皂苷化合物的分类
Figure BDA0002281946590000161
根据上述分类列出它们在不同裂解途径及相同裂解途径的不同阶段对应的质谱信息(如表3)，观察到一定的规律性，这些规律可以反映茶皂苷在质谱中的裂解特征。以Type I为例，当茶皂苷以①途径裂解时，若其碎片m/z相同，则说明这些茶皂苷结构差异来源于R2基团。例如，2、3、6、17号茶皂苷母离子虽然不同，但碎片m/z均为1101，表明它们的结构中仅有R2基团不同(按m/z从小到大依次为Butyryl、Ang(or Tig)、MB(or Isov)、Hex)。当茶皂苷以②途径裂解时，若相同裂解阶段碎片相同，表明两个茶皂苷之间仅有G基团存在差异(表中已用相同颜色标出)，G基团丢失后，后续裂解生成的碎片信息完全相同。当茶皂苷以③途径裂解时，若生成451Da碎片，则表明其G基团为五碳糖；若生成481Da碎片，则表明其G基团为六碳糖，且G基团为六碳糖的茶皂苷的碎片信息理论上要比五碳糖茶皂苷少两种。当用质谱信息推测茶皂苷的结构时，可先观察是否有451Da或481Da来确定G基团，再观察是否有与母离子相差88Da、100Da、102Da或114Da的碎片来确定R2基团，最后再搜集m/z处于上述两种碎片中间的质谱信息，将它们归入表3后与已报道的茶皂苷在相同裂解阶段碎片信息进行对比，并合理替换不同位置的官能团来对结构进行推测。
表3各类茶皂苷在不同裂解途径及相同裂解途径的不同阶段的质谱信息
Figure BDA0002281946590000171
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (10)

1.一种油茶籽油皂苷类化合物分类及结构推测方法，其特征在于：包括：
步骤1：按照皂苷元骨架结构差异分成三种不同类型，分别如下：
Figure FDA0002281946580000011
步骤2：根据上述皂苷元骨架结构，列出茶皂苷糖基逐步丢失以及茶皂苷的官能团丢失的路径，总结出油茶籽油皂苷类化合物在质谱中的裂解特征；
步骤3：对油茶籽油样品进行皂苷类化合物提取和检测，所述检测包括：采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱技术，获取色谱信息和质谱信息，结合步骤2中的油茶籽油皂苷类化合物在质谱中的裂解特征，根据皂苷元骨架结构、m/z差值以及现有茶皂苷的官能团位点，推测未知皂苷类化合物的结构。
2.根据权利要求1所述油茶籽油皂苷类化合物分类及结构推测方法，其特征在于：所述步骤2中，裂解特征包括：Camelliagenin B类型的茶皂苷在二级质谱中有特征碎片451.32，计算出的化学式为C30H44O3；Camelliagenin A类型的茶皂苷在二级质谱中有特征碎片437.34，计算出的化学式为C30H46O2；Theasapogenol F类型的茶皂苷在二级质谱中特征碎片为497.32，计算出的化学式为C31H46O5。
3.根据权利要求1所述油茶籽油皂苷类化合物分类及结构推测方法，其特征在于：所述步骤2中，茶皂苷糖基逐步丢失以及茶皂苷的官能团丢失的路径包括：①苷元骨架烷基链基团丢失②糖基逐步丢失③糖基链与皂苷元分离。
4.根据权利要求3所述油茶籽油皂苷类化合物分类及结构推测方法，其特征在于：所述步骤2中，茶皂苷在质谱中有以下特征二级碎片：
①苷元骨架烷基链基团丢失：茶皂苷中苷元骨架上的烷基链，包括Ang，Tig，MB，Isov，Hex或Butyryl，易丢失形成大于1100Da的特征碎片；
②糖基逐步丢失：对茶皂苷施加适当的碰撞电压，四个糖基均可能丢失，且每丢失一个糖基后可能形成两种碎片：其中一种是断裂处脱水形成双键，另一种是加氢形成羟基，两者相差18Da，该裂解规律可能形成7种碎片；
③糖基链与皂苷元分离：糖基除了一个一个丢失之外，也可能以糖基链，例如三个糖的形式整体丢失，形成451Da的特征碎片，其最外侧的糖为五碳糖；或481Da的特征碎片，其最外侧的糖为六碳糖的特征碎片。
5.根据权利要求1所述油茶籽油皂苷类化合物分类及结构推测方法，其特征在于：所述步骤3中，对油茶籽油样品进行油皂苷类化合物提取的方法，以2.5g油茶籽油样品为例，各试剂用量对应于2.5g油茶籽油样品，则油茶籽油皂苷类化合物提取的方法为：准确称取2.5g油茶籽油样品于离心管中，加入3-7mL正己烷，加入20-30mL乙醇水混合溶液，涡旋3-7min，3000-4000rmp离心8-12min后收集下层，旋蒸干燥后加入8-12mL蒸馏水溶解，将提取液移至离心管中，加入8-12mL正丁醇，涡旋振荡2-5min后离心分离，重复2-4次，合并正丁醇提取液旋蒸至干，用甲醇水重溶得到提取液。
6.根据权利要求4所述油茶籽油皂苷类化合物分类及结构推测方法，其特征在于：所述步骤3中，油茶籽油皂苷类化合物提取的方法，以2.5g油茶籽油样品为例，各试剂用量对应于2.5g油茶籽油样品，则油茶籽油皂苷类化合物提取的方法为：准确称取2.5g油茶籽油样品于离心管中，加入5mL正己烷，加入20-30mL乙醇水混合溶液，其中乙醇含量为65-85％，涡旋5min，3500rmp离心10min后收集下层，旋蒸干燥后加入10mL蒸馏水溶解，将提取液移至离心管中，加入10mL正丁醇，涡旋振荡3min后离心分离，重复3次，合并正丁醇提取液旋蒸至干，用250μl 50％甲醇水重溶得到提取液，提取液过孔径为0.2-0.3μm的滤膜，收集过滤液备用；其中％皆为体积分数。
7.根据权利要求1所述油茶籽油皂苷类化合物分类及结构推测方法，其特征在于：所述步骤3中，采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱技术，其中：
色谱条件为：色谱柱：Agilent Poroshell 120EC-C18，流动相A：0.1％甲酸水，流动相B：0.1％甲酸乙腈，梯度洗脱，流速：0.2-0.4mL/min，柱温：30±5℃，进样量：4±0.5μL；色谱条件中的％皆为体积分数；
质谱条件为：离子化模式：ESI-，干燥气温度300±10℃，干燥器流速7±2L/min，毛细管电压3.5±0.5kV，雾化器压力35±5psig，鞘气温度350±10℃，鞘气流速10±2L/min，碎裂电压120±10V，一级质谱碰撞电压45±5V，二级质谱碰撞电压65±5V，离子扫描范围m/z＝100-1500。
8.根据权利要求6所述油茶籽油皂苷类化合物分类及结构推测方法，其特征在于：色谱条件为：色谱柱：Agilent Poroshell 120EC-C18(3.0mm×100mm，2.7μm)，流动相A：0.1％甲酸水，流动相B：0.1％甲酸乙腈，梯度洗脱(0-2min，90％A，10％B；2-6min，90％A→65％A，10％B→35％B；6-16min，65％A→35％A，35％B→65％B；16-18min，35％A→5％A，65％B→95％B；18-19.9min，5％A，95％B；19.9-20min，5％A→90A，95％B→10％B)，流速：0.3mL/min，柱温：30℃，进样量：4μL；色谱条件中的％皆为体积分数。
9.根据权利要求6所述油茶籽油皂苷类化合物分类及结构推测方法，其特征在于：质谱条件为：离子化模式：ESI-，干燥气温度300℃，干燥器流速7L/min，毛细管电压3.5kV，雾化器压力35psig，鞘气温度350℃，鞘气流速10L/min，碎裂电压120V，一级质谱碰撞电压45V，二级质谱碰撞电压65V，离子扫描范围m/z＝100-1500。
10.根据权利要求1所述油茶籽油皂苷类化合物分类及结构推测方法，其特征在于：所述步骤3中，采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱技术，包括：利用Q-TOF/MS质谱分析器的四极杆选择色谱峰对应的分子离子，在碰撞池中对其进行碰撞诱导解离，裂解所得的碎片离子通过TOF扫描得到二级质谱图。
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