CN108195972B - 一种同时测定丹七制剂中多种酚酸类化合物含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种同时测定丹七制剂中多种酚酸类化合物的方法。该法采用UPLC‑TQ MS同时测定丹七制剂中丹酚酸A，丹酚酸B，迷迭香酸，丹参素，鼠尾草酸五种活性成分。经实验验证，本发明方法快速、稳定、可靠，可为丹七制剂的质量评估提供重要的依据。

Description

一种同时测定丹七制剂中多种酚酸类化合物含量的方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及到一种同时测定丹七制剂中多种酚酸类化合物含量的方法。

背景技术

中药是中华民族和世界文明的宝贵遗产，其疗效经过了数千年的临床实践验证，为中华民族的繁衍生息发挥了不可磨灭的作用。以“君、臣、佐、使”相互制约和协调的中药制剂，强调从整体上发挥作用，多半不是针对某个靶点，也不是若干成分的简单加合，仅靠单一成分的检测降低了鉴别的准确性和专属性，不能代表中药制剂的整体功效，不能反映其内在质量。但目前中药制剂的质量标准仅选取一、二个活性成分或指标成分进行含量测定，并以其含量多少来判定质量，例如，用丹参素含量(严常开等，中国医院药学杂志，2000，20(10)：600)、原儿茶醛含量(郑末晶等，中国药事，2000，14(4)：254)或丹参酮IIA含量(林伟忠等，中成药，2000，22(11)：766)等判别复方丹参制剂的质量，用丹参酮IIA含量鉴别不同厂家生产的复方丹参片的质量(邵水娟，中国药业，2000，9(7)：27)等。上述方法均具有一定的片面性，不完善，为了更好地指导生产，使工艺控制更加严格合理，使消费者能全面认识产品质地，需要不断研究和摸索更有利于中药产品质量检测、明确更多具体有效成分种类及含量的方法。近年来，色质联用技术凭借色谱的高分离效能和质谱的结构鉴定功能的有机结合，已经逐渐成为现代中药化学成分定性与定量分析研究中的强有力手段。

丹七制剂处方全方由丹参、三七两味药组成，方中以丹参活血通络、凉血消肿、清心除烦、袪瘀止痛为君；三七甘缓温通，苦降下泄，有散瘀止血、消肿定痛之功；二药合用共奏活血散瘀消肿定痛之功效。临床上多用于淤血所致的疾患，如：胸痹心痛、淤血头痛、跌打损伤、月经不调、产后瘀阻所致小腹疼痛，创伤性血肿、痛经、恶露不尽、冠心病、心绞痛、高血压等。丹七类制剂类型除了最早的丹七片剂之外，还出现了颗粒剂、胶囊剂等。这些丹七制剂因其配方不同，或者配方比例不同，或者提取精制方法不同，或者剂型不同，治疗效果也有所差异。

三七方中的丹参属于双子叶植物唇形科鼠尾草属多年生直立草本植物，其中“鼠尾草酸”是该中草药的特有成分。另外具研究表明，鼠尾草酸具备多种药理学活性：鼠尾草酸具有抗氧化作用；对鼠3T3-L1脂肪细胞的分化及人动脉平滑肌细胞的迁移具有抑制作用；能够逆转P-糖蛋白介导的多药耐药性；同时鼠尾草酸具有抗肿瘤活性，能够抑制1,25-二羟维生素D及视黄酸诱导的白血病细胞增殖的药理学作用；鼠尾草酸对狄氏剂诱导的多巴胺能神经细胞死亡产生有利影响，CA通过提高脑源性神经营养因子和抑制细胞凋亡，可能从环境神经毒素中保护多巴胺能神经细胞。经检测分析，鼠尾草酸也是丹七制剂中重要的活性成分。

文献“基于UPLC-MS/MS-模式识别技术的丹灯通脑软胶囊中种多活性成分定量研究”(孙志等，中草药，第48卷第6期(2017年3月))采用灵敏度、选择性和精确度较高的UPLC-MS/MS技术，通过正、负离子切换扫描，MRM和SIR采集模式同时进行的方式建立了测定丹灯通脑软胶囊中丹参素、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A、丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮IIA、熊果酸共9个主要活性成分量的方法，可更加快速、高效和全面地对丹灯通脑软胶囊进行质量分析和控制。该方法虽然可以同时检测多种丹参酚酸类化合物成分，目前，还没有能够实现丹酚酸A，丹酚酸B，迷迭香酸，丹参素与鼠尾草酸等丹参酚酸类成分的同时检测技术，因此有必要开发一种适合于检测丹七制剂中丹参酚酸类化合物成分的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种采用“UPLC-TQ MS”法同时测定丹七制剂中丹酚酸A、丹酚酸B、迷迭香酸、丹参素和鼠尾草酸五种酚酸类化合物的方法，其中“UPLC-TQ MS”为“超高液相色谱串联三重四极杆质谱”。在该法中，超高液相色谱仪与质谱仪采用串联的方式，超高液相色谱仪相当于质谱仪的“进样器”，试样经色谱分离后以纯物质形式进入质谱仪；质谱仪相当于超高液相色谱仪的“检测器”。该方法可以充分发挥超高液相色谱的高分离效率以及质谱定性定量检测的专属性能力，可更好的综合评价丹七制剂的质量，指导丹七制剂的生产，使消费者更全面认识该产品质地。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种采用UPLC-TQ MS法同时测定丹七制剂中丹酚酸A、丹酚酸B、迷迭香酸、丹参素和鼠尾草酸的方法，其液相色谱条件：色谱柱为超高压色谱柱；进样量为1.0μL；流速为0.6mL/min；柱温为30℃；流动相A是水，流动相B是乙腈；进行梯度洗脱，梯度条件为：

其质谱条件：离子源为Turbo V；电离模式为ESI^-；气帘气体积流量为30L/min；喷雾电压为-4500V；雾化气体积流量为55L/min；加热辅助气体积流量为55L/min；采集方式为多反应监测模式，离子化温度为550℃；去簇电压DP，入口电压EP，碰撞能量CE，碰撞室出口电压CXP等参数为：

更进一步地，为了优化谱图峰型，一些实施方式中流动相A是体积比为0.1：99.9的甲酸和水的混合溶液，流动相B是体积比为0.1：99.9的甲酸和乙腈的混合溶液。

在一些实施方式中，本发明方法采用的超高压色谱柱为Waters Acquity HSS T3column。

在一些实施方式中，本发明方法采用的Waters Acquity HSS T3column规格为100×2.1mm，1.8μm。

在一些实施方式中，本发明方法用于同时检测丹七制剂中丹酚酸A、丹酚酸B、迷迭香酸、丹参素和鼠尾草酸的含量。

在一些实施方式中，本发明方法用于同时检测丹七制剂中丹酚酸A、丹酚酸B、迷迭香酸、丹参素和鼠尾草酸的溶出度。

在一些实施方式中，本发明方法所检测的丹七制剂包括三七丹参片、三七丹参颗粒、丹七片、丹七颗粒、丹七胶囊、丹七软胶囊。

本发明的方法与现有技术相比具有以下优点和积极效果：

(1)本发明方法能够在同一个检测条件下同时检测丹七制剂中5种酚酸类化学成分含量，避免了在检测中频繁更换液相条件，提高了工作效率，适合工业化大生产的要求。

(2)本发明方法快速、稳定、可靠，全程分析时间仅为5分钟。

附图说明

图1：实施例1对照品标准溶液的总离子流图，其中保留时间1.28min峰为丹酚酸A，1.61min的峰为丹酚酸B，1.77min的峰为迷迭香酸，0.84min的峰为丹参素，2.89min的峰为鼠尾草酸；

图2：实施例1丹七软胶囊水溶成分的总离子流图。

具体实施方案

下述是结合具体实施例，进一步阐述本发明。但这些实施例仅限于说明本发明而不是用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件。

实施例1：丹七软胶囊中酚酸类化合物含量的检测

(1)仪器

超高效液相色谱仪(UPLC，美国Waters公司)；串联API 5500三重四极杆质谱仪(美国Applied Biosystems公司)，配备Waters UPLC自动进样器，柱温箱，数据采集由Analyst软件完成。

(2)仪器操作条件

液相色谱条件：色谱柱为Waters Acquity HSS T3 column(100×2.1mm，1.8μm)；进样量为1μL；流速为0.6mL/min；柱温为30℃；流动相A是体积比为0.1：99.9的甲酸和水的混合溶液，流动相B是体积比为0.1：99.9的甲酸和乙腈的混合溶液；进行梯度洗脱，梯度条件为：

其质谱条件：离子源为Turbo V；电离模式为ESI^-；气帘气体积流量为30L/min；喷雾电压为-4500V；雾化气体积流量为55L/min；加热辅助气体积流量为55L/min；采集方式为多反应监测模式，离子化温度为550℃；去簇电压DP，入口电压EP，碰撞能量CE，碰撞室出口电压CXP等参数为：

(3)对照品贮备液的制备

分别精密称定1.0mg丹酚酸A，丹酚酸B，迷迭香酸，丹参素，鼠尾草酸，置入10mL容量瓶中，50％甲醇超声波辅助溶解，放冷后稀释至刻度，得对照品贮备液。

(4)样品的制备

取丹七制剂或胶囊内容物0.5g，置于15mL离心管中，加入50％甲醇10.0mL，密封，超声30min。然后，4000r/min离心10min，取上清液，残渣用50％甲醇洗涤3次，将洗液与上清液合并，过滤，浓缩，定容至10mL量瓶中，摇匀，0.22μm PTFE滤膜滤过，置4℃冰箱中保存备用。

(5)标准曲线的绘制

精密量取一系列体积的对照品贮备液至10mL量瓶中，加50％甲醇超声辅助溶解并稀释至刻度，得到各对照品系列标准溶液。在上述仪器操作下进样1μL，记录色谱峰面积，以对照品浓度(C)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标做图，制得各对照品标准曲线。

各目标化合物的标准曲线在相应的线性范围内线性良好(r²>0.9990)。丹酚酸A：Y＝585745X+21103(r²＝0.9997)，丹酚酸B：Y＝1,286,559.81X+607,506.21(r²＝0.9998)，迷迭香酸：Y＝135022X+6.5×107(r²＝0.9996)，丹参素：Y＝232802x+18119(r²＝0.9999)，鼠尾草酸：Y＝1.1×107X+3.5×106(r²＝0.9993)。

(6)精密度实验

取同一浓度对照品溶液，于上述仪器操作下进样1μL，重复进样6次，由标准曲线计算目标对照品的浓度，精密度由RSD值表示。精密度实验中丹酚酸A，丹酚酸B，迷迭香酸，丹参素和鼠尾草酸的RSD分别为0.22％、0.63％、0.43％、0.39％、0.58％，表明方法精密度较好。

(7)加样回收率实验

取一定量已知含量的软胶囊内容物，共9份，分成3组，分别精密加入高、中、低浓度的对照品溶液，计算加样回收率。加样回收率考察中发现丹酚酸A，丹酚酸B，迷迭香酸，丹参素，鼠尾草酸的回收率分别为101.1％、99.5％、98.2％、98.8％、98.4％，RSD分别为0.71％、0.78％、0.66％、0.82％、0.81％，结果表明了方法的准确度良好。

(8)稳定性实验

取一定量已知含量的软胶囊内容物，溶解于50％甲醇溶液中，分别在0、2、4、8、10、12、24h时过0.22μm PTFE滤膜后，进样1μL，记录色谱峰面积，稳定性由RSD表示。样品制备24h内，检测丹酚酸A，丹酚酸B，迷迭香酸，丹参素，鼠尾草酸的RSD分别为0.61％、0.72％、0.57％、0.62％、0.78％，表明方法在24h内具有较好的稳定性。

(9)重复性实验

取同一批丹七软胶囊，取出内容物，按文献中方法分别制备丹七软胶囊的水溶性及脂溶性供试品溶液各6份，测定峰面积，由RSD表示重复性。丹酚酸A，丹酚酸B，迷迭香酸，丹参素，鼠尾草酸的RSD分别为0.18％、0.45％、0.38％、0.72％、0.59％。表明方法的重复性较好。

实施例2丹七软胶囊溶出度的测定

(1)溶出度的条件及测定

量取900mL经脱气处理的溶出介质(1％SDS水溶液)，加热使介质温度升至并保持于(37±0.5)℃，取6粒丹七软胶囊(批号：15010110)，每个转篮中投入1粒，共6个重复，转速100r/min进行试验，于1，5，10，20，30，45，60，70，90min定时、定点取样2ml，同时补加同温等量的同种介质，样品中加甲醇至4mL，摇匀过0.22μm PTFE滤膜，取续滤液，采用实施例1检测方法，进样1μL，测定目标化合物的含量，计算目标物的累积溶出度。以时间为横坐标，累积溶出度为纵坐标，绘制溶出曲线。

(2)溶出均一性考察

取本品6粒，以丹参素和人参皂苷Rg1为指标性成分，按上述溶出度测定方法进行丹七软胶囊溶出均一性试验。结果表明，丹七软胶囊的溶出均一性良好。

(3)溶出重复性考察

取3批样品(批号：15010110、15030113、15050112)，按上述溶出度测定方法进行溶出重现性试验。结果表明3批丹七软胶囊的溶出重复性良好。

应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (8)

1.一种采用UPLC-TQ MS法同时测定丹七制剂中丹酚酸A、丹酚酸B、迷迭香酸、丹参素和鼠尾草酸的方法，其特征在于：

液相色谱条件：色谱柱为Waters Acquity HSS T3 column超高压色谱柱；进样量为1μL；流速为0.6mL/min；柱温为30℃；流动相A是水，流动相B是乙腈；进行梯度洗脱，梯度条件为：

质谱条件：离子源为Turbo V；电离模式为ESI^-；气帘气体积流量为30L/min；喷雾电压为-4500V；雾化气体积流量为55L/min；加热辅助气体积流量为55L/min；采集方式为多反应监测模式，离子化温度为550℃；去簇电压DP，入口电压EP，碰撞能量CE，碰撞室出口电压CXP参数为：

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述流动相A是体积比为0.1：99.9的甲酸和水的混合溶液，所述流动相B是体积比为0.1：99.9的甲酸和乙腈的混合溶液。

3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述Waters Acquity HSS T3 column的规格为100×2.1mm，1.8μm。

4.根据权利要求1、2或3所述方法，其特征在于所述方法用于同时检测丹七制剂中丹酚酸A、丹酚酸B、迷迭香酸、丹参素和鼠尾草酸的含量。

5.根据权利要求1、2或3所述方法，其特征在于所述方法用于同时检测丹七制剂中丹酚酸A、丹酚酸B、迷迭香酸、丹参素和鼠尾草酸的溶出度。

6.根据权利要求1、2或3所述方法，其特征在于，所述丹七制剂包括三七丹参片、三七丹参颗粒、丹七片、丹七颗粒、丹七胶囊、丹七软胶囊。

7.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述丹七制剂包括三七丹参片、三七丹参颗粒、丹七片、丹七颗粒、丹七胶囊、丹七软胶囊。

8.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述丹七制剂包括三七丹参片、三七丹参颗粒、丹七片、丹七颗粒、丹七胶囊、丹七软胶囊。

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