KR101901491B1 - 밤꽃으로부터 추출된 앱솔루트 또는 신나밀 알코올을 포함하는 항비만 조성물 - Google Patents
밤꽃으로부터 추출된 앱솔루트 또는 신나밀 알코올을 포함하는 항비만 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 밤꽃으로부터 추출한 앱솔루트 및 신나밀 알코올을 포함하는 항비만 조성물 및 이를 포함하는 건강기능성 식품에 관한 것으로, 지방세포 분화 억제 활성 및 지방세포 분화 관련 단백질의 발현 억제 활성이 뛰어나 우수한 항비만 효과를 제공한다.
Description
본 발명은 밤꽃(Castanea crenata var. dulcis flower)으로부터 추출된 앱솔루트 또는 앱솔루트의 구성성분 중 하나인 신나밀 알코올(cinnamyl alcohol)을 유효성분으로 포함하는 항비만 조성물 및 이를 포함하는 건강기능성 식품에 대한 것이다.
비만은 한 가지 원인으로 발생하는 질병이 아니라 유전적, 환경-사회적, 정신적인 여러 가지 요인들이 복합적으로 작용하여 발생하기 때문에 어느 한 가지 방법으로 치료하기는 어렵다. 현재 비만을 치료하기 위한 방법은 식사요법, 운동요법, 행동요법 등 생활 습관을 교정하는 방법과 약물 치료 또는 수술적 치료 등으로 나눌 수 있다.
약물이나 수술적 치료에 앞서 생활습관을 교정하기 위한 적극적인 노력이 선행되어야 하지만, 생활습관을 교정하는 일이 쉽지 않을 뿐 아니라 생활습관 교정만으로 감소시킬 수 있는 체중은 한계가 있다. 따라서 많은 경우에 생활습관 교정과 함께 약물 치료가 필요하다. 이러한 비만의 약물 치료를 위해 매년 많은 항비만 제제들이 개발되고 있지만 현재 사용 가능한 비만 치료 약물은 많지 않으며, 대부분 소화나 식욕을 억제시키는 제제에 국한되어 있다. 소화나 식욕을 조절하는 제제의 경우, 습관성 때문에 향정신성 약물로 분류되며, 소화억제제는 설사, 변비 등의 부작용을 나타낸다. 2010년까지 미국 FDA가 장기사용을 승인한 대표적 비만치료 약물은 노르에피네프린(norepinephrine)과 세로토닌(serotonin)의 재흡수를 억제하는 작용을 가진 시부트라민(sibutramine; Reductil)과 췌장 및 소화기계에서 분비되는 리파제(lipase)를 억제하여 효과를 나타내는 오르리스타트(orlistat; Xenical)가 있었다.
밤나무 (Castanea crenata var. dulcis)는 참나무과에 속하는 낙엽교목으로 1년생 가지에 꽃이 피고 전분과 탄수화물을 다량 함유한 열매를 맺는다. 수꽃을 따서 음지에서 건조한 것을 율화라 하고, 밤 껍질을 말린 것을 건율이라 하며, 한방에서 율화는 목구멍에 생긴 연주창 치료에 효능을 가지고 있고, 건율은 강근, 보신, 익기 등에 쓰이는 것으로 알려져 있다. 최근에는 잎과 꽃을 대상으로 하여 항산화, 항염 및 항균활성에 대한 효능이 있는 것으로 알려져 있다. 특히, 밤꽃의 개화전과 개화 후 수꽃을 이용한 용매별 추출물이 높은 항균활성을 나타내는 것으로 밝혀졌고, 꽃의 향기성분은 1-phenyl ethyl alcohol을 비롯한 aromatic alcohol이 주요 구성성분으로 밝혀졌다.
현대 사회에 생활수준의 향상과 소비자들의 인식 변화 등으로 기존에 사용되어온 합성향료가 인체에 대한 높은 독성과 호르몬 교란 등의 문제가 인식되면서 천연 향료가 다시금 주목을 받고 있다. 특히 천연 향료는 향기뿐만 아니라 항균 및 항염 작용과 아로마테라피 효과까지 알려지면서 천연물 유래 천연 향료에 대한 연구가 더욱 중요해지고 있다.
천연 향료는 추출물, 추출법, 용도 및 목적에 따라 다양하게 분류되며, 식물유래 천연향료는 추출법에 따라 에센셜 오일(essential oil), 앱솔루트(absolute), 콘크리트(concrete) 등으로 분류된다.
식물유래 천연 향료는 식물의 2차 대사 산물 중 인체에 약리효과를 나타내는 휘발성 화학물질로, 주로 테르펜, 알코올, 알데하이드, 에스테르, 케톤 등의 여러 가지 유기화합물로 구성되어 있다. 이러한 천연 향료의 방향성 성분이 피부, 순환계, 후각계를 통해 스트레스 해소, 피로 회복, 근육 이완 등의 효과를 나타낼 뿐만 아니라 항균작용, 면역 증진, 항알러지 작용 등의 치료효과를 나타내어 오래전부터 질병의 치료와 예방에 활용되어왔다.
하지만 식물유래 천연 향료를 이용한 기능성 식품 소재 개발 및 제약소재로써의 연구는 부족하며, 기능성 중에서 특히, 항비만에 관한 연구가 필요한 실정이다.
상기와 같은 문제를 해소하기 위해, 본 발명은 유기용매 추출법으로 밤꽃으로부터 추출하여 얻어진 앱솔루트 향료 및 이의 구성성분인 신나밀 알코올이 항비만 소재로써의 효능을 가지고 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 밤꽃(Castanea crenata var. dulcis flower)으로부터 추출된 앱솔루트(Absolute) 또는 신나밀 알코올(Cinnamyl alcohol)을 유효성분으로 포함하는 항비만 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 항비만 조성물은 앱솔루트 단독, 신나밀 알코올 단독 또는 앱솔루트와 신나밀 알코올 둘 다를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 앱솔루트 또는 신나밀 알코올은 용매 추출법(solvent extraction)에 의해 밤꽃으로부터 추출될 수 있다. 예를 들어, 상기 앱솔루트 또는 신나밀 알코올은 헥산(n-hexane)과 에틸알코올(ethyl alcohol) 용매를 이용하여 추출될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 앱솔루트는 유기용기 추출과정에서 왁스(wax)와 콘크리트(concrete) 성분을 제거한 후 추출된 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 앱솔루트는 1-페닐에탄올(1-Phenylethanol), 2-페닐에탄올(2-Phenylethanol), 신나밀 알코올(Cinnamyl alcohol), 헤네이코산(Heneicosane), 트리코산(Tricosane), [E]-5-에이코센([E]-5-Eicosene), 싸이클로테트라코산(Cyclotetracosane), 감마-시토스테롤(γ-Sitosterol), 베타-아미린(β-Amyrin) 및 알파-아미린(α-Amyrin)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 앱솔루트 또는 신나밀 알코올은 지방세포 분화 억제 활성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 앱솔루트는 25 ~ 100 μg/mL의 농도, 예를 들어, 25 ~ 80 μg/mL, 25 ~ 60 μg/mL, 25 ~ 40 μg/mL, 50 ~ 100 μg/mL 또는 70 ~ 100 μg/mL의 농도로 포함될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 신나밀 알코올은 0.1 ~ 10 μg/mL의 농도, 예를 들어, 0.5 ~ 10 μg/mL, 1 ~ 10 μg/mL, 3 ~ 10 μg/mL, 5 ~ 10 μg/mL, 7 ~ 10 μg/mL, 0.1 ~ 8 μg/mL, 0.1 ~ 6 μg/mL로, 0.1 ~ 4 μg/mL 또는 0.1 ~ 2 μg/mL의 농도로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 항비만 조성물을 포함하는 항비만 건강기능성 식품을 제공한다.
본 발명은 밤꽃 유리 향료의 항비만 효과를 최초로 입증한 것으로, 밤꽃으로부터 앱솔루트를 추출하고 상기 앱솔루트 및 이의 구성성분인 신나밀 알코올의 우수한 지방세포 분화 억제 활성 및 지방세포 분화 관련 단백질의 발현 억제 활성을 규명함으로써, 효과적인 항비만 조성물 및 이를 포함하는 건강기능성 식품을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 밤꽃에서 앱솔루트를 추출하는 과정을 나타내는 흐름도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 밤꽃에서 분리한 앱솔루트의 성분분석 결과 도표이다.
도 3는 본 발명의 일 실시예에 따라 밤꽃에서 분리한 앱솔루트의 지방세포의 분화에 미치는 효과를 나타낸 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 밤꽃에서 분리한 신나밀 알코올의 지방세포의 분화에 미치는 효과를 나타낸 결과이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 신나밀 알코올이 지방세포분화와 관련된 단백질 발현에 미치는 효과를 나타낸 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 밤꽃에서 분리한 앱솔루트의 성분분석 결과 도표이다.
도 3는 본 발명의 일 실시예에 따라 밤꽃에서 분리한 앱솔루트의 지방세포의 분화에 미치는 효과를 나타낸 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 밤꽃에서 분리한 신나밀 알코올의 지방세포의 분화에 미치는 효과를 나타낸 결과이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 신나밀 알코올이 지방세포분화와 관련된 단백질 발현에 미치는 효과를 나타낸 결과이다.
이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들을 상세히 설명한다. 이하의 설명에 있어, 당업자에게 주지 저명한 기술에 대해서는 그 상세한 설명을 생략할 수 있다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다.
따라서 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명은 밤꽃에서 추출한 앱솔루트 또는 신나밀 알코올을 유효성분으로 포함하는 항비만 조성물 및 이 조성물을 포함하는 항비만 건강기능성 식품에 관한 것이다.
상기 앱솔루트 성분은 건조하지 않은 밤꽃으로부터 얻는 것이 바람직하며, 유기용매 추출법에 의해 추출된 콘크리트(concrete)를 알코올로 추출하여 불용성 왁스(wax)를 제거한 앱솔루트(absolute)인 것을 특징으로 한다.
구체적으로, 상기 앱솔루트는 밤꽃을 휘발성 용제를 이용한 유기용매 추출법으로 추출하여 콘크리트(concrete)를 얻는 단계; 및 상기 얻은 콘크리트를 알코올로 추출하여 불용성 왁스(wax)를 제거하고 앱솔루트(absolute)를 얻는 단계에 의해 추출될 수 있다.
일 예로서, 상기 앱솔루트는 도 1의 흐름도와 같이 추출할 수 있다. 우선, 건조하지 않은 밤꽃을 헥산(n-hexane)에 침전시킨 뒤, 얻은 추출물을 회전식 증발기(rotary evaporation)를 이용하여 농축시켜서 콘크리트를 얻은 다음, 상기 얻은 콘크리트에 에틸알코올(ethyl alcohol)을 넣고 영하 20℃에서 12시간 동안 보관하여 용해시킨 후, 진공 냉각 필터(vacuum cooling filtration) 및 회전식 증발기를 이용하여 분리/정제함으로써, 본 발명에 따른 밤꽃 앱솔루트를 제조할 수 있다.
상기 유기용매 추출법과 추출물로부터 앱솔루트를 분리하는 방법은 이 기술 분야에서 보통의 지식을 가진 자가 변형할 수 있는 모든 방법을 포함하는 것이 가능하다.
밤꽃에서 추출한 상기 앱솔루트는 다양한 생리활성을 나타내는 성분을 함유하고 있는데, 보다 구체적으로 1-페닐에탄올(1-Phenylethanol), 2-페닐에탄올(2-Phenylethanol), 신나밀 알코올(Cinnamyl alcohol), 헤네이코산(Heneicosane), 트리코산(Tricosane), [E]-5-에이코센([E]-5-Eicosene), 싸이클로테트라코산(Cyclotetracosane), 감마-시토스테롤(γ-Sitosterol), 베타-아미린(β-Amyrin) 및 알파-아미린(α-Amyrin)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 성분을 포함하는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 앱솔루트와 구성성분인 신나밀 알코올은 우수한 지방세포 분화 억제 활성을 나타낸다.
본 발명의 상기 앱솔루트는 항비만 조성물로 사용하는 경우 앱솔루트는 25 ~ 100 μg/mL의 농도로 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 50 ~ 100 μg/mL의 농도로 사용할 수 있다. 밤꽃 앱솔루트를 25 μg/mL 이하의 농도로 사용할 경우에는 지방세포 분화 억제 효과가 미미하며, 앱솔루트를 100 μg/mL 이상의 농도로 사용할 경우에는 지방세포 분화 억제 효과보다 다른 이유에 의해 분화가 억제되기 때문에 항비만 효과가 없으므로 바람직하지 않다.
본 발명의 상기 신나밀 알코올은 항비만 조성물로 사용하는 경우 0.1 ~ 10 μg/mL의 농도로 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 5 ~ 10 μg/mL의 농도로 사용할 수 있다. 신나밀 알코올을 0.1 μg/mL 이하의 농도로 사용할 경우에는 지방세포 분화 억제 효과가 미미하며, 신나밀 알코올을 10 μg/mL 이상의 농도로 사용할 경우에는 지방세포 분화 억제 효과보다 다른 이유에 의해 분화가 억제되기 때문에 항비만 효과가 없으므로 바람직하지 않다.
본 발명에 따른 밤꽃에서 추출한 앱솔루트 및 신나밀 알코올을 유효성분으로 포함하는 항비만 조성물은 약학적 조성물로 사용될 수 있으며, 약학적으로 유효한 양의 밤꽃에서 추출한 앱솔루트 및/또는 신나밀 알코올을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.
상기에서 "약학적으로 유효한 양"이란 상기 생리활성성분이 동물 또는 사람에게 투여되어 목적하는 생리학적 또는 약리학적 활성을 나타내기에 충분한 양을 말한다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.
또한, 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있으며, 경구 또는 비경구 투여를 위한 다양한 형태로 제형화 될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캡슐, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 목적하는 효과를 상승시킬 수 있는 공지의 화합물과도 병행하여 투여할 수 있다.
나아가 본 발명에 따른 항비만 조성물은 상기 기술한 바와 같이 약학적 조성물로 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 건강기능식품으로도 사용할 수 있다. 예컨대, 식품의 주원료, 부원료, 식품 첨가제, 기능성 식품 또는 음료로 용이하게 활용할 수 있다.
상기 “식품”이란, 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 식품, 식품 첨가제, 기능성식품 및 음료를 모두 포함하는 것을 말한다.
상기 식품용 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합체, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 특수영양식품(예, 조제유류, 영, 유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 빵류, 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스낵류), 캔디류, 쵸코렛류, 껌류, 아이스크림류, 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실음료, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면스프 등)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.
또한, 상기 “기능성 식품”또는 “건강기능성 식품”이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물 공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체내조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미하며, 구체적으로는 건강 기능성 식품일 수 있다. 상기 기능성 식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
상기 건강보조식품의 종류로는 이에 제한되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료 형태 일 수 있다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예들은 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 밤꽃 앱솔루트 제조
도 1에 도시된 공정에 따라 밤꽃 앱솔루트를 제조하였다.
본 실시예에서 밤꽃은 호서대학교(아산, 한국) 실습지 인근에서 자생된 밤꽃을 6월에 채취하여 사용하였다. 밤꽃이 피기 직전의 꽃망울 전체를 채취하여 세척 후, 생초 3 kg를 유기용매 추출법을 이용하여 추출하였다.
우선, 건조하지 않은 밤꽃을 헥산(n-hexane)에 상온으로 60분 동안 침전시켰고, 이렇게 얻은 침전물을 회전식 증발기(rotary evaporation)에서 25℃로 90분간 증발시켜서 농축시킴으로서 고형의 콘크리트(concrete)를 획득하였다. 그 다음, 상기 콘크리트를 에틸알코올(ethyl alcohol)를 넣어서 용해시키고 영하20℃에서 12시간 동안 보관한 후, 영하 20℃의 진공 냉각 필터(vacuum cooling filtration)를 거쳐서 불용성 왁스(wax)를 제거하였으며, 다시 회전식 증발기에서 30℃로 90분간 증발시켜서 분리/정제함으로써 밤꽃 앱솔루트(1 mL)를 제조하였다. 그리고 상기 제조한 밤꽃 앱솔루트는 4℃의 저온고에서 보관하였다.
실시예 2. 밤꽃 앱솔루트 성분 분석
밤꽃 앱솔루트의 성분 분석은 KBSI(Korea Basic Science Institute, Seoul Center)에 의뢰하였다. 가스 크로마토그래피/질량분석계(6890N GC/5975i MS, Agilent, USA)를 사용하였고, GC/MS의 컬럼(column)은 DB5-MS (30 m×50 μm, 0.25 μm)를 사용하였으며, 캐리어 가스(carrier gas)는 헬륨을 사용하여 1 mL/분으로 흐르게 하여 분석하였다. 오븐의 온도는 40℃-2℃/분-230℃-5℃/분-300℃(5분)으로 유지하였으며, injection의 온도는 280℃에서 분석하였다. 또한 Interface의 온도는 300℃, ion source의 온도는 230℃, analyzer의 온도는 150℃에서 분석하였으며, Mass range는 40~800 m/z에서 분석하였다.
밤꽃 앱솔루트 성분의 확인은 휘발성분의 지체시간(retention indices, RI)과 표준물질의 지체시간과 일치하거나 휘발물질의 질량 스펙트럼과 Wiley 7Nist 05 library의 질량 스펙트럼을 비교하여 물질을 확인하였다. RI는 C6 ~ C24 (nalkane)를 이용하여 시료와 동일 조건에서 결정하였다. 그 결과, 총 10개의 성분으로 구성되어 있음을 확인할 수 있었으며, 알파-아미린(α-Amyrin), 베타-아미린(β-Amyrin), 헤네이코산(Heneicosane), 싸이클로테트라코산(Cyclotetracosane), [E]-5-에이코센([E]-5-Eicosene), 감마-시토스테롤(γ-Sitosterol), 트리코산(Tricosane), 1-페닐에탄올(1-Phenylethanol), 2-페닐에탄올(2-Phenylethanol), 신나밀 알코올(Cinnamyl alcohol) 순으로 높은 함량을 나타내었다(도 2).
실시예 3. 밤꽃 앱솔루트가 전지방세포의 분화에 미치는 효과
마우스 embryo 3T3-L1 전구지방세포주는 KCLB (Korean Cell Line Bank)에서 구입하여 10%의 송아지혈청(Newborn Calf Serum)이 첨가된 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지에 2×105 cells/mL 농도로 부유시켜 48시간 동안 배양하여 융합 상태가 되게 37℃, CO2 배양기에서 배양 하였다. 분화배지(10% FBS, 5 μg/mL 인슐린, 1 μM 덱사메타손, 0.5 mM 3-이소부틸-1-메틸잔틴)로 교체하여 2일간 배양하였고, 배양 시에 밤꽃 앱솔루트를 25, 50 및 100 μg/mL 농도로 같이 처리하였다. 2일간 배양 후, 지방세포로의 분화를 촉진하기 위해, 5 μg/mL 인슐린이 포함된 DMEM 배지와 밤꽃 앱솔루트를 25, 50 및 100 μg/mL 농도로 같이 처리하였다. 2일간 배양 후 밤꽃 앱솔루트만 25, 50 및 100 μg/mL 농도로 처리하였고, 2일 후 똑같이 밤꽃 앱솔루트만 처리하였다. 배양 중에 세포의 모양은 광학현미경(Olympus, Japan)을 이용하여 관찰하였다. 3T3-L1 세포의 분화 정도는 Oil-red O를 이용하여 염색하였다. 분화된 세포를 관찰하기 위해서는 배양 후 세포 표면을 차가운 PBS로 2회 씻어준 다음 4% 포르말린(in PBS)으로 60분간 고정하고 물로 씻어준 60% 이소프로필알코올을 이용해 1번 세척한 후 충분히 건조하였다. 건조한 세포에 Oil-red O염색약을 300 μL를 넣고 실온에서 1시간 염색한 다음, 세포를 물로 충분히 씻어준 다음 현미경으로 관찰 후 사진 촬영을 하였다. 사진 촬영 후 100% 이소프로필알코올을 이용하여 세포에 염색된 Oil-red O를 탈색한 후 520 nm에서 흡광도를 측정 한 후 계산하였다. 그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 3T3-L1 지방세포에서 밤꽃 앱솔루트의 세포독성을 조사한 결과, 100 μg/mL의 농도에서 세포독성이 없는 것으로 나타났다(도 3의 (A)).
그리고 도 3의 (B)에서 나타낸 바와 같이 밤꽃 앱솔루트를 처리한 실험군의 경우 25 μg/mL의 농도에서는 1.72±5.39%의 지방세포분화억제 활성을 나타내었으며, 50 μg/mL의 농도에서는 37.98±9.81%의 지방세포분화억제 활성을 나타내었으며, 특히 100 μg/mL의 농도에서는 79.91±0.97%의 지방세포분화억제 활성이 나타내어 농도 의존적으로 분화가 억제되는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 밤꽃 앱솔루트의 첨가가 3T3-L1 지방세포의 지방구 생성에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위해 Oil-red O로 염색을 한 후 현미경으로 관찰한 결과(도 3의 (C)), 양성대조군은 지방 분화촉진인자인 MDI를 배양액에 첨가하지 않고 DMEM만을 처리한 대조군으로 세포 내에 지방구가 전혀 형성되지 않았고, MDI군의 경우 지방분화 촉진인자인 MDI를 첨가한 DMEM을 처리하여 3T3-L1 세포의 분화를 유도한 것으로 확인되었다.
실시예 4. 신나밀 알코올이 전지방세포의 분화에 미치는 효과
마우스 embryo 3T3-L1 전구지방세포주는 KCLB (Korean Cell Line Bank)에서 구입하여 10%의 송아지혈청(Newborn Calf Serum)이 첨가된 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지에 2×105 cells/mL 농도로 부유시켜 48시간 동안 배양하여 융합 상태가 되게 37℃, CO2 배양기에서 배양하였다. 분화배지(10% FBS, 5 μg/mL 인슐린, 1 μM 덱사메타손, 0.5 mM 3-이소부틸-1-메틸잔틴)로 교체하여 2일간 배양하였고, 배양 시에 신나밀 알코올을 0.1, 1, 5 및 10 μg/mL 농도로 같이 처리하였다. 2일간 배양 후, 지방세포로의 분화를 촉진하기 위해, 5 μg/mL 인슐린이 포함된 DMEM 배지와 신나밀 알코올을 0.1, 1, 5 및 10 μg/mL 농도로 같이 처리하였다. 2일간 배양 후 신나밀 알코올을 0.1, 1, 5 및 10 μg/mL 농도로 처리하였고, 2일 후 똑같이 신나밀 알코올만 처리하였다. 배양 중에 세포의 모양은 광학현미경(Olympus, Japan)을 이용하여 관찰하였다. 3T3-L1 세포의 분화 정도는 Oil-red O를 이용하여 염색하였다. 분화된 세포를 관찰하기 위해서는 배양 후 세포 표면을 차가운 PBS로 2회 씻어준 다음 4% 포르말린(in PBS)으로 60분간 고정하고 물로 씻어준 60% 이소프로필알코올을 이용해 1번 세척한 후 충분히 건조하였다. 건조한 세포에 Oil-red O 염색약을 300 μL를 넣고 실온에서 1시간 염색한 다음, 세포를 물로 충분히 씻어준 다음 현미경으로 관찰 후 사진 촬영을 하였다. 사진 촬영 후 100% 이소프로필알코올을 이용하여 세포에 염색된 Oil-red O를 탈색한 후 520 nm에서 흡광도를 측정 한 후 계산하였다. 그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 3T3-L1 지방세포에서 신나밀 알코올의 세포독성을 조사한 결과, 10 μg/mL의 농도에서 세포독성이 없는 것으로 나타났다(도 4의 (A)).
그리고 도 4의 (B)에서 나타낸 바와 같이, 신나밀 알코올을 처리한 실험군의 경우 0.1 과 1 μg/mL의 농도에서는 지방세포분화억제 활성을 나타나지 않았으며, 5 μg/mL의 농도에서는 29.71±1.50%의 지방세포분화억제 활성을 나타내었으며, 특히 10 μg/mL의 농도에서는 71.06±1.76%의 지방세포분화억제 활성이 나타내어 농도 의존적으로 분화가 억제되는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 신나밀 알코올의 첨가가 3T3-L1 지방세포의 지방구 생성에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위해 Oil-red O로 염색을 한 후 현미경으로 관찰한 결과(도 3의 (C)), 양성대조군은 지방 분화촉진인자인 MDI를 배양액에 첨가하지 않고 DMEM만을 처리한 대조군으로 세포 내에 지방구가 전혀 형성되지 않았고, MDI군의 경우 지방분화 촉진인자인 MDI를 첨가한 DMEM을 처리하여 3T3-L1 세포의 분화를 유도한 것으로 확인되었다.
실시예
5.
신나밀
알코올이 지방세포분화와 관련된 단백질 발현에 미치는 효과
상기 실시예 1에 의해 얻은 밤꽃 앱솔루트에서 분리한 신나밀 알코올이 지방세포분화와 관련된 주요 단백질인 Peroxisome proliferator-activated receptor gamma(PPARγ), CCAAT/enhancer-binding protein alpha(C/EBPα), Sterol regulatory element binding protein-1(SREBP-1) 및 Fatty acid synthase(FAS)의 발현 억제에 미치는 효과를 측정하기 위해서, 상기 실시예 1에서 제시된 밤꽃 앱솔루트에서 분리한 신나밀 알코올을 실시예 4와 같은 농도로 처리하고, 각각의 특이항체를 이용하여 면역블롯 (Immuno Blot)법을 활용하였다.
도 5은 본 발명의 신나밀 알코올이 지방분화와 관련된 단백질의 발현 억제에 미치는 영향을 나타낸 결과로서, 양성 대조군은 지방 분화촉진인자인 MDI를 배양액에 첨가하지 않고 DMEM만을 처리한 대조군이고, 음성 대조군은 지방 분화촉진인자인 MDI를 배양액에 첨가하여 처리한 대조군이다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 신나밀 알코올은 농도 의존적으로 지방세포분화의 주요 단백질인 Peroxisome proliferator-activated receptor gamma(PPARγ), CCAAT/enhancer-binding protein alpha(C/EBPα), Sterol regulatory element binding protein-1(SREBP-1) 및 Fatty acid synthase(FAS)의 발현을 억제하였으며, 특히, 신나밀 알코올은 PPARγ의 발현을 0.1 μg/mL 농도에서부터 28.09±1.04% 억제하였고, C/EBPα의 발현은 1 μg/mL 농도에서부터 28.90±6.91% 억제하였고, SREBP-1의 발현은 5 μg/mL 농도에서부터 31.77±14.13% 억제하였고, 마지막으로 FAS의 발현은 1 μg/mL 농도에서부터 23.94±4.18% 억제하였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (8)
- 밤꽃(Castanea crenata var. dulcis flower)으로부터 추출된 앱솔루트(Absolute)를 유효성분으로 포함하고,
상기 앱솔루트는 밤꽃의 유기용매 추출물에서 불용성 왁스(wax)를 제거한 것을 특징으로 하는 항비만용 조성물. - 밤꽃(Castanea crenata var. dulcis flower)으로부터 추출된 신나밀 알코올(Cinnamyl alcohol)을 유효성분으로 포함하는 항비만용 조성물.
- 제 1 항에 있어서,
상기 앱솔루트는 1-페닐에탄올(1-Phenylethanol), 2-페닐에탄올(2-Phenylethanol), 신나밀 알코올(Cinnamyl alcohol), 헤네이코산(Heneicosane), 트리코산(Tricosane), [E]-5-에이코센([E]-5-Eicosene), 싸이클로테트라코산(Cyclotetracosane), 감마-시토스테롤(γ-Sitosterol), 베타-아미린(β-Amyrin) 및 알파-아미린(α-Amyrin)을 포함하는 것인 항비만용 조성물 - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제 1 항의 항비만용 조성물을 포함하는 항비만용 건강기능성 식품.
- 제 2 항의 항비만용 조성물을 포함하는 항비만용 건강기능성 식품.
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| KR1020160108297A KR101901491B1 (ko) | 2016-08-25 | 2016-08-25 | 밤꽃으로부터 추출된 앱솔루트 또는 신나밀 알코올을 포함하는 항비만 조성물 |
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| KR102342058B1 (ko) * | 2020-02-07 | 2021-12-22 | 대한민국 | 헤네이코산을 포함하는 당뇨 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이를 포함하는 식품 조성물 |
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
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| Biosci.Biotechnol.Biochem. 74(12), 2418-2425, 2010년 |
| LWT - Food Science and Technology 제44권제4호, 1042-1051쪽, 2011년 05월(온라인 공개일: 2010년 10월 12일.) |
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