JP6389492B2 - トリプタンスリン含有藍葉溶液製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、藍葉に含まれるトリプタンスリンを抽出するためのトリプタンスリン含有藍葉溶液製造方法に関するものである。

従来から特許文献１に開示されたトリプタンスリン含有藍葉エキス製造方法が知られている。当該製造方法では、タデ藍の天日乾燥葉にエタノールを加えてこれを２時間還流し、室温まで自然冷却した後、メッシュ状のフィルタにより葉を濾過する。このようにして得た濾液（藍葉エタノール抽出液）をロータリーエバポレーターにより減圧蒸留し、所定総量まで濃縮する。そして、当該濃縮濾液にブチレングリコールを加えて当該エキスを溶解させトリプタンスリン含有藍葉エキスを得る。

再表２０１２／１２４７４３

しかしながら、上記従来のトリプタンスリン含有藍葉エキス製造方法では、エタノールによりトリプタンスリンの抽出を行うため、藍葉からクロロフィルが溶出してしまい、トリプタンスリン含有藍葉エキスが黒緑色に着色してしまう問題点があった。本発明は、係る問題点を解決するためになされたものである。

本発明に係るトリプタンスリン含有藍葉溶液製造方法によれば、藍葉に対して、液体状のリモネンを一定時間接触させ、トリプタンスリンを含む溶液を得る。この場合、前記藍葉とリモネンとの接触は、液体状のリモネンに前記藍葉を３０時間以内で行うようにするのが好ましい。更に、液体状の前記リモネンにアスコルビン酸を添加するのが好ましい。

冷浸開始後１，５，１０，１５，２０，２５，３０時間までの抽出液中トリプタンスリン濃度を示す図表である。 リモネン抽出によるトリプタンスリン抽出液の測定結果を示すクロマトグラムである。 エタノール抽出によるトリプタンスリン抽出液の測定結果を示すクロマトグラムである。

本発明に使用できる藍草は、例えば、蓼藍（タデ科）、琉球藍（キツネノマゴ科）、蝦夷藍（ウォード；アブラナ科）、山藍（トウダイグサ科）、インド藍（マメ科）等の含藍植物である。特に、タデ科に属する一年生植物である蓼藍は、入手しやすく且つ特有の成分であるトリプタンスリンを豊富に含んでいることから、使用するに当たり好ましいものとなる。

また、本発明で使用する藍草は、その起源や栽培方法に特に制限はなく、天然に自生する藍草でも、栽培されているものでもよく、これらを常法により育種して得られる変異株などでもよい。また、本発明で使用する藍草は、組織培養、カルス培養、細胞培養等により得ることのできる培養物であってもよい。植物体を抽出の原料として用いる場合、その植物体の一部又は全部を用いることができる。また、植物体は、水分を含む状態、凍結状態、乾燥状態のいずれであってもよいし、これらの混合物であってもよい。取り扱いの容易さからは、乾燥状態のものを用いるのが望ましい。

加熱乾燥工程では、上記のように収穫した藍草から藍葉のみを採取し、加熱乾燥させる。加熱乾燥は、乾燥装置の乾燥室内に藍葉を入れる。そして、バーナーで加熱した高温の風を送り込みながら、藍葉を撹拌する。風量は、藍葉が乾燥室内で飛ぶ程度に設定し、藍葉全体に均一に風が当たるようにする。

次に、上記加熱乾燥させた藍葉を容器内に所定量投入し、この容器内にｄ−リモネンの溶液を入れる。ｄ−リモネンの溶液は、藍葉が完全に浸漬される程度に当該容器に入れるのが好ましい。そして、容器内をゆっくりと撹拌した後、一定時間、常温で保持する。温度が高いとｄ−リモネンが揮発するため、常温以下に保持するのが好ましい。

浸漬時間は、２０時間以上３０時間以下とするのが好ましい。実験例にて後述するが、２０時間、２４時間、３０時間で十分にトリプタンスリンを抽出可能であり、これらの時間による抽出量は４８時間、７２時間の場合に比較して大きな差がないことが判った。換言すれば、ｄ−リモネンによれば、短時間でトリプタンスリンを十分な量まで抽出可能である。そして、２０時間以上３０時間以下の短時間での抽出であれば、クロロフィルが溶出することは殆どなく、抽出液の着色は肉眼では認められず、無色透明と評価できるものであった。

これに対し、エタノールによる抽出の場合、２４時間の抽出ではｄ−リモネンよりもトリプタンスリンの抽出量が少なかった。また、エタノールによる抽出の場合、クロロフィルによる着色の度合いが強く、抽出液が黒緑色になった。

[抽出効率と着色]
新藍の藍葉に対してｄ−リモネンとエタノールとによる抽出実験を行った。実験条件として、乾燥させた新藍葉１００ｇにｄ−リモネン溶液（和光純薬工業，試薬特級）を１．２Ｌ加えてすべての藍葉をｄ−リモネン溶液に浸漬させ、これを撹拌しつつ、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間で常温保持し、各抽出時間におけるトリプタンスリンの抽出量を測定した。

比較例として、乾燥させた新藍葉１００ｇにエタノール溶液（和光純薬工業，試薬特級）１．２Ｌを加えてすべての藍葉を浸漬させ、撹拌しつつ常温保持し、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間でのトリプタンスリンの抽出量を測定した。

この結果、ｄ−リモネンによる抽出において、その抽出時間が２４時間の場合、抽出液のトリプタンスリンの含有量は８１μｇ/ｇであった。抽出時間が４８時間、７２時間の場合では、抽出液のトリプタンスリンの含有量は、９８μｇ/ｇ前後である。この実験結果から、４８時間、７２時間と抽出時間を倍増しても、トリプタンスリンの抽出量は比例して増大することはなく、２４時間の抽出時間の場合と大差がないことが判った。この実験結果より、２４時間程度でトリプタンスリンを所定量まで急速に抽出できることが判った。また、抽出時間が２４時間の抽出液は無色透明であり、クロロフィルの出現は目視では確認できなかった。

一方、エタノールによる抽出では、抽出時間が２４時間でトリプタンスリンの含有量が７３μｇ/ｇであり、ｄ−リモネンの場合よりも若干少ない抽出量となった。また、４８時間では１３７μｇ/ｇ、７２時間では２３２μｇ/ｇと時間に比例してトリプタンスリンの抽出量が増えたが、２４時間〜７２時間の抽出時間のすべての場合において、クロロフィルの出現が極めて強く、抽出液が黒緑色になった。

以上の実験結果から、ｄ−リモネンにより藍葉の２４時間の抽出を行うことで、クロロフィルの出現を抑えて効率的にトリプタンスリンを抽出できることが判った。

次の実験では、１，５，１０，１５，２０，２５，３０時間の短時間でトリプタンスリンの抽出量の変化を測定した。この実験では、抽出溶媒としてｎ−ヘキサン（和光純薬工業，試薬特級），上記エタノール，上記ｄ−リモネンの３種の溶媒を用いトリプタンスリンの抽出量を比較した。具体的には、藍葉０．５ｇに抽出溶媒を５ｍＬ加え，日本薬局方通則１５の冷浸法に従い，室温暗所にて冷浸した。その後、継時的に１，５，１０，１５，２０，２５，３０時間で抽出液を採取し，メンブレンフィルターでろ過し，ＨＰＬＣ用の試料とした。

ＨＰＬＣ装置および分析条件
検出器：ＳＰＤ−２０A （ＳＨＩＭＡＤＺＵ）
送液ポンプ：ＬＣ−２０ＡＤ （ＳＨＩＭＡＤＺＵ）
脱気ユニット：ＤＧＵ−２０Ａ３Ｒ(ＳＨＩＭＡＤＺＵ)
カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５ＰＥ−ＭＳ ４．６×２５０ｍｍ (nacalai tesque)
移動相：４０％アセトニトリル(Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ)
流速：０．７ ｍｌ／ｍｉｎ
検出波長：２５０ｎｍ

図１に、冷浸開始後１，５，１０，１５，２０，２５，３０時間までの抽出液中のトリプタンスリン濃度を示す。冷浸開始５時間後ではｎ−ヘキサン抽出液、ｄ−リモネン抽出液およびエタノール抽出液中のトリプタンスリン含量は、それぞれ１８．０１８８μｇ／ｍｌ，３６．２２６６μｇ／ｍｌ及び３８．６００７μｇ／ｍｌであった。ｄ−リモネンおよびエタノールによる抽出量はｎ−ヘキサンによる抽出量の約２倍となった。

ｎ−ヘキサン抽出液中のトリプタンスリン含量は、開始３０時間後には開始１時間後の含量（１６．２８３６μｇ／ｍｌ）に比較し、３１．１３３８μｇ／ｍｌと約２倍に上昇したが、その時点ではエタノール抽出液およびリモネン抽出液では顕著な含量の上昇が認められ、ヘキサン抽出液（３１．１３３８μｇ／ｍｌ）に比較し、エタノール抽出液では７３．０４４４μｇ／ｍｌ、リモネン抽出液では９６．９９７６μｇ／ｍｌとそれぞれ２．３５倍および３．１２倍の抽出効率が得られることが判った。

一方、エタノール抽出液とｄ−リモネン抽出液との比較では、冷浸開始１０時間後からその抽出効率に変化が認められ、冷浸開始２０時間後にはエタノール抽出液で５８．３８２６μｇ／ｍｌ、ｄ−リモネン抽出液で７２．２４２２μｇ／ｍｌであり、約１．３倍の抽出効率の差異が認められた。

更に、上記各抽出液には、色調に大きな差異が認められた。３０時間後の抽出液の色調は、ｎ−ヘキサン抽出液で黄緑褐色、エタノール抽出液で淡緑黒色の強い着色が見られた。ｄ−リモネン抽出液では無色に近い淡黄色であった。また、短時間抽出においては、ｎ−ヘキサン抽出液及びエタノール抽出液に比較して、ｄ−リモネン抽出液のトリプタンスリン含量が多くなることが判った。すなわち、ｄ−リモネンによれば、短時間でトリプタンスリンを効率的に抽出し且つ無色の抽出液が得られることが判った。

[静菌活性]
藍葉トリプタンスリンのｄ−リモネン抽出液によれば、高い静菌活性が得られる。本来、トリプタンスリンもｄ−リモネンも単独で同作用を有することが知られている。また、トリプタンスリンとｄ−リモネンを混合して用いることも考えられる。しかしながら、ｄ−リモネンにより藍葉からトリプタンスリンを抽出した抽出液は、これらの単独使用又は混合使用に比べて、顕著なる静菌作用を発揮することが実験の結果、判った。

静菌活性の測定は以下のように行った。
パールコア（登録商標）ミューラーヒントンＳ寒天培地（栄研化学）３８ｇを精製水１０００ｍｌに溶解し、１１５℃で３０分オートクレーブ（ＥＳ−２４５、ＴＯＭＹ）処理し、1シャーレ（Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｄｉｓｈ １００ｍｍ×２０ｍｍ Ｓｔｙｌｅ、ＮＥＳＴ者）に２０ｍＬ〜２５ｍＬ分注しこれを培地とした。試験菌として酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を用いた。菌数は血球計算盤（Ｃ−Ｃｈｉｐ ＤＨＣ−Ｎ０１ ＮａｎｏＥｎＴｅｋ ｉｎｃ.）を用いてカウントし１０７ＣＦＵとした。

被験液として、（１）トリプタンスリンのＤＭＳＯ溶液、（２）ｄ−リモネン単独液 、（３）トリプタンスリンのＤＭＳＯ溶液＋ｄ−リモネン単独液、 （４）藍葉トリプタンスリンのｄ−リモネン抽出液（あおもり藍産業協同組合乾燥藍葉８．３３ ｗ／ｖ ％）の４種を（１）〜（３）は１０μＭ〜０．００１μＭまでの濃度に、（４）は抽出液原液から１０−６希釈液までＤＭＳＯにて希釈して調製した。９６穴マイクロプレート１ｗｅｌｌにつき液体培地１８０μＬ（ブランク１８５μＬ）、菌液５μＬ、サンプル５μＬを分注し３８℃で３ｈインキュベートした。各被験液の静菌活性は微生物比色検出キット (ＭｉｃｒｏｂｉａｌＶｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓｓａｙ Ｋｉｔ−ＷＳＴ 同人化学)を用い測定した。すなわち、上記培養液に発色試薬ＷＳＴ−８を１０μＬ ／ｗｅｌｌ添加し、さらに１時間インキュベート後の４５０ｎｍの吸光度を測定し静菌活性値とし、その濃度依存性からＭＩＣ５０値を算出した。試験菌としてＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを用いるため、発色試薬はＤＭＳＯで８倍希釈したものを用事調製とし用いた。

実験結果１
被験液（１）〜（４）のそれぞれの阻害率から求めたＭＩＣ５０値（ｎｇ /μＬ）を以下に示す。
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに対する静菌作用
（１）トリプタンスリンＤＭＳＯ溶液 ４６０
（２）ｄ−リモネン ３００
（３）トリプタンスリンＤＭＳＯ溶液＋ｄ−リモネン ５６０
（４）藍葉トリプタンスリンのｄ−リモネン抽出液 ３

被験液（１）と（２）の単独溶液においては、（１）のトリプタンスリン単独溶液のＭＩＣ５０値は４６０ ｎｇ／μＬであり，ｄ−リモネン単独溶液のＭＩＣ５０値は３００ ｎｇ／μＬであった。この（１）と（２）の等量混合溶液を使用した（３）においては、それぞれを単独で用いたＭＩＣ５０値よりもその値は高く５６０ ｎｇ／μＬであった。この実験結果から、トリプタンスリン溶液とｄ−リモネン溶液を混合して用いても、その静菌効果の増強は認められなかった。

一方、ｄ−リモネンで藍葉からトリプタンスリンを抽出した（４）を用いた場合、そのＭＩＣ５０値は３ｎｇ／μＬであり単独使用の（１）または（２）に比較し，その効果は約１００倍近く強く、著しくその効果が増強したことから、藍葉トリプタンスリンのｄ−リモネン抽出液の静菌作用はそれぞれの単独使用時よりもその作用が大きく増加することが判った。

図２は、リモネン抽出によるトリプタンスリン抽出液の測定結果を示すクロマトグラムである。図３は、エタノール抽出によるトリプタンスリン抽出液の測定結果を示すクロマトグラムである。上記ＨＰＬＣ装置により測定したチャートによれば、ｄ−リモネンの抽出液では、トリプタンスリンの付近（図中矢印で示す）に複数の化合物が測定されており、これらの化合物が静菌作用に好影響を及ぼしているものと推測される。これに対し、エタノールにより抽出では、ｄ−リモネンの場合とは異なる分で多数の化合物が測定された。これらの化合物は、静菌作用に貢献しないうえに、着色の原因物質になると推定される。この結果より、静菌作用については、エタノール抽出よりもリモネン抽出によるトリプタンスリン抽出液が優れていることが判る。

また、上記リモネンの抽出時に、アスコルビン酸を加えても良い。アスコルビン酸の添加量は、ｄ−リモネンに対する溶解度が０．０１％以下であるため、アスコルビン酸の結晶が沈殿する０．０１％以上とし、飽和状態を保つものとする。また、アスコルビン酸の添加は、藍葉の添加と同時に行うのが好ましい。なお、実験の結果、上記２４時間の抽出では、トリプタンスリンの抽出量には影響を及ぼさないことが判った。

本発明において、ｄ−リモネンに殆ど溶けないアスコルビン酸を添加したのは、次の理由による。リモネンには光反応・酸化変性や自動酸化が生じるところ、アスコルビン酸は、空気中では酸化型のデヒドロアスコルビン酸として存在する量が多く、共存するリモネンや藍葉の成分等よりもヒドロキシラジカルとの反応性が高いため、共存する化合物の酸化変性を抑制する抗酸化剤として機能する。

また、トリプタンスリン抽出液を布の染に用いる場合において当該染の後に日光下で風乾するとき、アスコルビン酸の光反応によるラジカルの産生が染における「染むら」の原因となる色素に対して分解作用を示し、退色を誘発する。即ち、アスコルビン酸が漂白剤として機能する。

更に、上記日光下での風乾において、前記リモネンも酸化・光反応により揮発性の生成物やジカルボニル等の不安定な反応性の高い生成物を生じさせるが、これらのリモネン酸化物は、アスコルビン酸により分解され得る。

なお、トリプタンスリン等の有効成分であるアルカロイド類よりも、リモネンからの生成物の方がラジカルとの反応性が極めて高いため、アスコルビン酸の光反応によるトリプタンスリンの分解については殆ど考慮しなくても良い。すなわち、アスコルビン酸の添加による藍葉の抗菌有効成分への影響は低い。

このように、トリプタンスリン抽出時にアスコルビン酸を添加することで、トリプタンスリン抽出液に対して極めて有用な作用効果をもたらすことが判った。

なお、上記実施の形態では、藍葉をリモネン溶液に浸漬することでトリプタンスリンを抽出したが、藍葉に対してリモネン容器を点滴又は噴霧することで、当該藍葉に対してリモネン溶液を接触させ、この滴を循環させながらトリプタンスリンの抽出を行うようにしても良い。即ち、リモネン溶液が藍葉に接触することで抽出が行われることから、このような状態を形成する接触方法であれば、これらに限定されるものではない。

Claims (3)

1. 藍葉に対して、液体状のリモネンを一定時間接触させ、トリプタンスリンを含む溶液を得ることを特徴とするトリプタンスリン含有藍葉溶液製造方法。
2. 前記藍葉とリモネンとの接触は、液体状のリモネンに前記藍葉を３０時間以内で行うことを特徴とする請求項１に記載のトリプタンスリン含有藍葉溶液製造方法。
3. 更に、液体状の前記リモネンにアスコルビン酸を添加することを特徴とする請求項１又は２に記載のトリプタンスリン含有藍葉溶液製造方法。

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