CN102030835B

CN102030835B - 一种巴戟天提取物及其制备方法和用途

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Publication number: CN102030835B
Application number: CN201010528784.7A
Authority: CN
Inventors: 黄桂兰; 王鲁明; 王楠; 王佳; 赵炎; 杨暖
Original assignee: TUOLIN MEDICINE SCI-TECH Co Ltd BEIJING
Current assignee: Tuolin Pharmaceutical (Qingdao) Co.,Ltd.
Priority date: 2010-11-03
Filing date: 2010-11-03
Publication date: 2013-04-24
Anticipated expiration: 2030-11-03
Also published as: CN102030835A

Abstract

一种巴戟天提取物及其制备方法和用途，本发明提供了中药巴戟天(Radix Morindae officinalis)提取物的制备方法；提供了该提取物中的菊糖型10～21聚糖等12个新化合物的制备方法和结构，其分子连接方式是：α-D-吡喃葡萄糖-(1→2)-[β-D-呋喃果糖-(1→2)]_8～19-β-D-呋喃果糖；提供了从菊芋(Helianthus tuberosus和菊薯(yacon)等其它植物中，制备这些化合物的方法；提供了将其制备成药物组合物的方法；提供了将其作为抗抑郁、抗焦虑药物的用途。

Description

一种巴戟天提取物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及含有菊糖型10～21聚糖化合物或含有它们的提取物。此类化合物存在于中药巴戟天(Radix Morindae officinalis)、菊芋(Helianthus tuberosus l.)和菊薯(yacon)的提取物中。进一步，将此类化合物或含有它们的提取物，配以辅料制备成药物。属于新药领域。

技术背景

近年，人们发现茜草科(Rubiaceae)巴戟天(Morinda officinalis How.)具有抗抑郁的作用。蔡兵、崔承彬等，“中药巴戟天抗抑郁作用的大小鼠模型三级组合测试评价”，解放军药学学报，2005年第21卷第五期p.321～325，报道了巴戟天的提取物对多种动物模型具有良好的抗抑郁作用；崔承彬、蔡兵等，“中药巴戟天中抗抑郁活性成分的研究”，中国中药杂志，1995年第20卷第1期p.36～39，进一步报道了，巴戟天中的3～7低聚糖是抗抑郁作用的物质；李志猛、张绍来等，“含有巴戟天寡糖的药物组合物及其制备方法”，中国发明专利，公开号CN 101306103A，公开了巴戟天寡糖的药物组合物及其制备方法，以及巴戟天中菊糖型3～9低聚糖的抗抑郁作用。

本发明人经过系统检索，没发现菊糖型10～21聚糖结构研究的报道；没有见到菊糖型10～21聚糖抗抑郁、抗焦虑作用和应用的报道；没有见到含有菊糖型10～21聚糖提取物作为抗抑郁、抗焦虑作用和应用的报道；没有见到菊糖型10～21聚糖和含有它们的提取物的药物制剂，作为治疗抑郁、焦虑疾病的报道。

发明内容

本发明的目的，是研制一类新结构类型的化合物以及含有们的提取物，作为防治抑郁和焦虑疾病的药物。

本发明首次从中药巴戟天中发现了具有式A(图一.)结构的菊糖型10～21聚糖，以及含有式A的巴戟天提取物的抗抑郁和抗焦虑疾病的应用，及它们的制剂作为抗抑郁和抗焦虑等精神疾病的应用。

本发明首次从菊科(Compositae)葵花属(Helianthus)菊芋(Helianthustuberosus l.别名：洋姜、鬼子姜)和与其同科属的菊薯(yacon别名：雪莲果)中，也得到了式A结构的菊糖型10～21聚糖化合物，它们同样具有抗抑郁和抗焦虑的作用。

本发明首次实现了将具有式A结构的菊糖型10～21聚糖化合物和提取物制备成新型抗抑郁、抗焦虑药物及其制剂的制备方法。

本发明第一部分，阐述巴戟天提取物的制备方法。

涉及，巴戟天提取物的制备过程，以及从该提取物中制备式A的过程方法，包括分离纯化和结构确证。

具体地，将干燥药材巴戟天(Radix Morindae officinalis)用1～8倍(优选6倍)

原料药用至少1倍量的0％～70％的乙醇(优选30％)热提取，提取D次(D≥1)，经活性炭柱层析，先用0％～10％(优选3％)的乙醇洗脱，再用20％～100％的乙醇(优选50％)洗脱，经浓缩、干燥制备而成。

将巴戟天提取物，经麦芽糖化学键合相填料色谱柱，以乙腈-水作为流动相，高效液相(HPLC)进行分离制备，逐个峰接收，得到了具有式A结构的一类单体化合物。这些单体化合物，经过核磁光谱(¹³C谱，¹H谱，HMBC谱，HMQC谱，DEPT谱，)、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)、红外光谱(IR)、气相色谱(GC)等分析，据确定了它们的分子结构。它们分别是菊糖型10～21聚糖，分别由端基α-D-吡喃葡萄糖连接9～20个β-D-呋喃果糖构成。其名称、分子式和分子量分别是：菊糖型10聚糖，C₆₀H₁₀₂O₅₁，MW1638；菊糖型11聚糖，C₆₆H₁₁₂O₅₆，MW1800；菊糖型12聚糖，C₇₂H₁₂₂O₆₁，MW1962；菊糖型13聚糖，C₇₈H₁₃₂O₆₆，MW＝2124；菊糖型14聚糖，C₈₄H₁₄₂O₇₁，MW＝2286；菊糖型15聚糖，C₉₀H₁₅₂O₇₆，MW＝2448；菊糖型16聚糖，C₉₆H₁₆₂O₈₁，MW＝2610；菊糖型17聚糖，C₁₀₂H₁₇₂O₈₆，MW＝2772；菊糖型18聚糖，C₁₀₈H₁₈₂O₉₁，MW＝2934；菊糖型19聚糖，C₁₁₄H₁₉₂O₉₆，MW＝3096；菊糖型20聚糖，C₁₂₀H₂₀₂O₁₀₁，MW＝3258；菊糖型21聚糖，C₁₂₆H₂₁₂O₁₀₆， MW＝3420。

本发明第二部分，阐述式A及巴戟天提取物制剂的制备方法。

具体地，式A及巴戟天提取物，辅以药用辅料，制作成药物组合物。药用辅料包括淀粉、糊精、微晶纤维素、微粉硅胶中任一或其组合。本发明的药物组合物，优选为胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂，更优选为胶囊和片剂。将式A及巴戟天提取物辅以特殊辅料制备成缓释剂型。

本发明的第三部分，阐述式A及巴戟天提取物的药理药效。

具体地，式A每个单体化合物和巴戟天提取物，在精神系统动物评价模型上进行评价，尤其是抗抑郁、抗焦虑药理模型上的作用；式A每个单体化合物及巴戟天提取物，辅以可以接受的药物载体，制成口服或注射等剂型的抗抑郁抗焦虑精神病药物。

式A每个单体化合物和提取物，按照动物和人的体表面积换算，正常人的用量范围是0.1～40毫克/公斤体重/次，优选范围是0.2～20毫克/公斤体重/次。实施例1从巴戟天中制备菊糖型10～21聚糖

取巴戟天药材粗粉500克，用6倍量(W/W)30％乙醇加热提取，提取4次，每次1小时，滤过，合并滤液，浓缩至相对密度D＝1.05～1.10(50℃)的溶液，放至室温，滤过，通过预装活性碳的层析柱(活性碳与药材之比为1/1，W/W)，先用3％乙醇洗脱，再用50％的乙醇洗脱，经过高效液相(HPLC，系统及条件见实施例2)检测，收集含有菊糖型10～21聚糖的流份，减压回收溶剂，浓缩至相对密度D＝1.15(50℃)的溶液，喷雾干燥，得到巴戟天提取物，得率为9～25％。

巴戟天提取物经高效液相(HPLC)进行分离。系统及其分离条件：岛津LC-6A型液相色谱仪，SCL-6A控制器，C-R3A和CR2AX型数据处理系统，Rheodyne 7125型六通进样阀，100ELSD9型蒸发光散射检测器(ELSD)，Click Maltose 4.6I.D.×100mm和28I.D.×300mm色谱柱，乙腈和水作为流动相。将巴戟天提取物用水溶解，滤过40μm滤膜，滤液进样，进行色谱分离，运行梯度曲线见表一，各峰名称和保留时间(min)分别是：菊糖型10聚糖(24.118)；菊糖型11聚糖(26.225)；菊糖型12聚糖(28.246)；菊糖型13聚糖(30.081)；菊糖型14聚糖(31.739)；菊糖型15聚糖(33.124)；菊糖型16聚糖(34.032)；菊糖型17聚糖(34.746)；菊糖型18聚糖(35.317)；菊糖型19聚糖(35.797)；菊糖型20聚糖(36.161)；菊糖型21聚糖(36.537)。各峰按峰收集，减压浓缩至小体积，冰冻干燥，得到12个聚糖单体化合物。见表一和图二。

表一巴戟天提取物HPLC分离条件

实施例2从菊芋和菊薯中制备菊糖型10～21聚糖

取药材菊芋干燥的粗粉500克，按照实施例1的提取条件进行提取，得到含式A的菊芋提取物，得率为10％～30％；另取菊薯干燥的粗粉500克，按照实施例1的提取条件进行提取，得到含式A的菊薯提取物，得率为8％～20％；

按照实施例1的分离条件，分别将菊芋提取物和菊薯提取对进行分离，按峰收集，同样得到了菊糖型10～21聚糖，图三和图四。

实施例3菊糖型10聚糖的结构鉴定

菊糖型10聚糖为白色固体，[α]²⁰ _D-19.5°(C＝1.0，H₂O)。IRλmax cm^-1：3425(br s，OH)，2935，2815，1463(w)，1085(s)，MALDI-TOF-MS m/z：1638。¹H-NMR(D₂O)δ：5.41(1H d，J＝3.7Hz；葡萄糖1-H)，4.18～4.28(多H，均为d峰，J＝8.2～8.3Hz，均为果糖3-H)，3.85～4.15(多H，均为dd峰，J＝9.2～9.5Hz，均为果糖4-H)。¹³C-NMR(D₂O)δ：94.2(葡萄糖1-C)，73.2(葡萄糖2-C)，74.3(葡萄糖3-C)，71.0(葡萄糖4-C)，74.2(葡萄糖5-C)，62.1(葡萄糖6-C)。经过¹H-¹H COSY，¹H-¹³C COSY，HMBC，HMQC综合解析，并将菊糖型10聚糖水解，气相色谱分析(方法见实施例5)，表明其葡萄糖与果糖的摩尔比为1∶9。参考此类化合物的结构特点(崔承彬等，“菊糖型低聚糖类 ¹HNMR及¹³CNMR研究”，中国药物化学杂志，1995年第五卷第一期，p32～p40)和生源特征，确定其连接方式为：α-D-吡喃葡萄糖-(1→2)-(β-D-呋喃果糖)-(1→2)-(β-D-呋喃果糖)-(1→2)-(β-D-呋喃果糖)-(1→2)-(β-D-呋喃果糖)-(1→2)-(β-D-呋喃果糖)-(1→2)-(β-D-呋喃果糖)-(1→2)-(β-D-呋喃果糖)-(1→2)-(β-D-呋喃果糖)-(1→2)-β-D-呋喃果糖。英文：α-D-Glcp-(1→2)-(β-D-Fruf)-(1→2)-(β-D-Fruf)-(1→2)-(β-D-Fruf)-(1→2)-(β-D-Fruf)-(1→2)-(β-D-Fruf)-(1→2)-(β-D-Fruf)-(1→2)-(β-D-Fruf)-(1→2)-(β-D-Fruf)-(1→2)-β-D-Fruf。其分子式为：C₆₀H₁₀₂O₅₁，其结构式如图五所示。

实施例4菊糖型11聚糖的结构鉴定

菊糖型11聚糖为白色固体，[α]²⁰ _D-20.3°(C＝1.0，H₂O)。IRλmax cm^-1：3411(br s，OH)，2932，2846，1475(w)，1039(s)，MALDI-TOF-MS m/z：1800。¹H-NMR(D₂O)δ：5.31(1H d，J＝3.6Hz；葡萄糖1-H)，3.69(1H dd，J＝10.6，3.7Hz；葡萄糖2-H)，3.37～3.45(4H m，葡萄糖3，4，5，6-H)，3.58～3.78和3.90～3.99及4.06～4.14有三簇峰，均为果糖H峰。¹³C-NMR(D₂O)δ：94.07(葡萄糖1-C)，74.20(葡萄糖2-C)，75.46(葡萄糖3-C)，70.81(葡萄糖4-C)，75.58(葡萄糖5-C)，63.79(葡萄糖6-C)。104.67～105.28六峰(果糖碳C)，61.71～63.78以及70.81～82.84有二簇峰(果糖碳C)。

经过¹H-¹H COSY，¹H-¹³C COSY，HMBC，HMQC综合解析，并将11聚糖水解，气相色谱分析，表明葡萄糖与果糖的摩尔比为1∶10。确定其连接方式为：α-D-吡喃葡萄糖-(12)-(β-D-呋喃果糖)-(1→2)-(β-D-呋喃果糖)-(1→2)-(β-D-呋喃果糖)-(1→2)-(β-D-呋喃果糖)-(1→2)-(β-D-呋喃果糖)-(1→2)-(β-D-呋喃果糖)-(1→2)-(β-D-呋喃果糖)-(1→2)-(β-D-呋喃果糖)-(1→2)(β-D-呋喃果糖)-(1→2)-β-D-呋喃果糖。英文：α-D-Glcp-(1→2)-(β-D-Fruf)-(1→2)-(β-D-Fruf)-(1→2)-(β-D-Fruf)-(1→2)-(β-D-Fruf)-(1-→2)-(β-D-Fruf)-(1→2)-(β-D-Fruf)-(1→2)-(β-D-Fruf)-(1→2)-(β-D-Fruf)-(1→2)-(β-D-Fruf)-(1→2)-β-D-Fruf。其分子式为：C₆₆H₁₁₂O₅₆，其结构式如图六所示。

实施例5菊糖型12～21聚糖的结构鉴定

菊糖型12～21聚糖均为白色固体，随着分子量的增大，水溶性减少，但均可溶在热水中。由于菊糖型12～21聚糖是一个系列化合物，除了具有相同的α-吡喃葡萄糖残基外，每个聚糖之间相差一个β-呋喃果糖残基。但随着聚合度的增加，核磁光谱上的的碳谱和氢谱图高度重合，给解析带来一定的困难。但时间飞行质谱(MALDI-TOF-MS)可以精确地测定其分子量，气相色谱(GC)可以精确地测定其葡萄糖和果糖的摩尔比，因而最终确证其结构。

a.时间飞行质谱分析：ULTRAFLEX TOF-TOF色谱仪器，线性方式，飞行管长1.6m，加速电压20KV，DHB作为基质，经过样品分析，各聚糖的分子量见表二；

b.气相色谱柱为VARIAN CP-Sil5CB(25m×0.53mm，液膜厚0.25μm)，FID检测温度为300℃，进样口温度为260℃。柱温采用程序升温，先在140℃保持3min，然后以7℃/min的速度升至205℃。H₂做载气兼燃气，30mL/min。N₂流速30mL/min。Ar流速300mL/min。

分别取菊糖型10～21各聚糖样品3mg，置封底玻璃管中(3mm×30mm)，加入0.4mL蒸馏水溶解，再加入等体积的4.0mol/L三氟醋酸，充氮气封管后置于100℃水解1小时。将水解液减压蒸干，加入1.5mL甲醇溶解，再减压蒸干，重复3次以除尽残余的三氟醋酸。向水解产物中加入5.0mg盐酸羟胺和3mg内标肌醇六乙酰酯，用0.5mL吡啶溶解后90℃震荡反应30min。反应完成取出后冷却至室温，再加入0.25mL醋酸酐，90℃反应30min，分别得到各聚糖乙酰化样品12个；取葡萄糖和果糖，按照摩尔比1∶9～1∶20(葡萄糖∶果糖)配置对照品液12个，并照上法进行乙酰化，分别得到对照品乙酰化样品12个。分别将样品进行气相分析，并比对，进而确证了实施例2中分离得到的12个聚糖的摩尔比值，结果见表二。

结合它们各自的核磁光谱、红外光谱、质谱光谱，确证其分子结构。分别是菊糖型12～21聚糖，(如图七所示)，其连接方式是：α-D-吡喃葡萄糖-(1→2)-[β-D-呋喃果糖-(1→2)]_10～19-β-呋喃果糖。

表二菊糖型12～21聚糖气相色谱和时间飞行质谱分析结果

实施例6巴戟天提取物和菊糖型聚糖制剂的制备

根据动物药理研究的数据(见实施例7～9)，折算出巴戟天提取物和菊糖型聚糖正常人的用量范围是0.1～40毫克/公斤体重/次，优选范围是0.2～20毫克/公斤体重/次，据此，制成相应制剂。

a.胶囊剂按表三配方，混均匀，过80目筛，制成1000粒；

b.片剂按照表四配方，湿法质粒，过40目筛，压片，制成1000片；

c.缓释片剂按照表五配方，原料药置于万能粉碎机中粉碎，过80目筛，处方量单硬脂酸甘油脂于一容器中，水浴加热使熔化，溶化完全后，向其中加入处方量原料药、乙基纤维素、肠溶包衣材料，混匀，冷却后过20目筛制粒，置于真空干燥箱中真空干燥(40℃，6小时)，取所制备的干颗粒经过20目筛整粒，取经整粒的干颗粒与处方量硬脂酸镁、滑石粉充分混匀，取适量颗粒进行含量等测定，根据所测得的含量，选择圆形浅凹片冲(Φ10mm)，参考重量差异确定所压片的范围，调试机器正常后直接压片，制成1000片。

表三巴戟天提取物和菊糖型聚糖胶囊配方

表四巴戟天提取物和菊糖型聚糖片配方

表五巴戟天提取物和菊糖型聚糖缓释片配方

实施例7巴戟天提取物和菊糖型10～21聚糖小鼠悬尾实验结果和方法

a.动物昆明种小鼠，一级，京动字(2009)第021号，18-22克，雄性，各组动物10只；

b.试验方法小鼠随机分组。药物(口服)30分钟后，将小鼠尾部距末端约4cm处用胶布固定，倒悬于25×25×40cm的箱内，头距箱底约10cm。每箱1只。悬挂时间为5分钟，累计后4分钟内的不动时间(秒)；

c.实验药物地昔帕明(阳性药物，美国Sigma产品，纯度＞99.8％)、巴戟天提取物、10～21聚糖和它们的制剂，实验前30分钟给药，地昔帕明腹腔注射，其他药物制成水溶液口服。

d.数据统计处数据用均数±标准差表示。多组均数显著性检验用方差分析，两组间均数显著性比较用t检验；

F.试验结果小鼠口服实验药物后，显著缩短悬尾的不动时间，结果显示实验药物均具有抗抑郁作用(表六、表七)。

表六巴戟天提取物和菊糖型10～21聚糖对小鼠悬尾不动时间的影响

X±SD，与同批试验溶剂对照比较：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

表七巴戟天提取物和菊糖型10～21聚糖胶囊对小鼠悬尾不动时间的影响

实施例8小鼠强迫性游泳实验结果和方法

b.试验方法将小鼠放入圆柱型玻璃缸中Φ10×20cm，每缸一只，缸中水深10cm，水温25℃，小鼠游泳2分钟后，立即开始观察4分钟，累计4分钟内小鼠在水中停止挣扎状态，仅有细小的肢体运动以保持头部浮在水面的持续时间(不动时间，秒)。药物或蒸馏水于测试前30分钟灌胃或腹腔注射。

F.试验结果小鼠口服实验药物后，显著缩短强迫性游泳期间的不动时间，显示具有抗抑郁作用(表八)。

表八巴戟天提取物和菊糖型10～21聚糖对小鼠强迫游泳不动时间的影响

X±SD，与同批试验溶剂对照比较：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

实施例9巴戟天提取物和菊糖型10～21聚糖小鼠高架十字迷宫实验结果和方法

a.动物雄性昆明小鼠，一级，，京动字(2009)第021号，18-22克，各组动物10只；

b.试验方法动物随机分组，每组10只。迷宫测试前将每只小鼠放入一个35cm×10cm×5cm塑料盒中，任其自由探究5min后迅速置于EPM的中央平台处，使其头部正对其中一个开放臂，释放后即开始记录下述指标。每只小鼠测试5min。观测人员在距离测试箱1.5m处分别观察记录动物的活动。中间用湿布擦拭迷宫，清除粪便，继用干布擦净后再进行下一只小鼠的测试。将实验室内光线昏暗(以1.5m距离处能区分小鼠细微活动的最低亮度为准)并保持恒亮，室温25℃左右，保持安静。

c.实验药物阳性药物，地西泮(北京益民制药厂，批号：0612130，2.5mg/片)，临用前取出药片，将其碾碎，用去离子水配制成溶液；巴戟天提取物和菊糖型10～21聚糖；

F.试验结果小鼠口服实验药物后，开臂时间和开臂次数均与溶剂相比具有非常明显的差异，显示它们具有良好的抗焦虑作用(表九)。

表九巴戟天提取物和菊糖型10～21聚糖对小鼠十字迷宫实验的的影响

X±SD，与同批试验溶剂对照比较：*P＜0.05，**P＜0.01。

附图说明：

图一式A(菊糖型10～21聚糖)

图二巴戟天提取物HPLC色谱图

图三菊芋提取物HPLC色谱图

图四菊薯提取物HPLC色谱图

图五菊糖型10聚糖结构式

图六菊糖型11聚糖结构式

图七菊糖型12～21聚糖结构式

Claims

1.一种具有式A结构的化合物在制备抗抑郁、抗焦虑药物中的应用，其特征在于，所述具有式A结构的化合物为：α-D-吡喃葡萄糖-(1→2)-[β-D-呋喃果糖-(1→2)]_8-19-β-D-呋喃果糖，

式A。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗抑郁、抗焦虑药物是利用所述的式A结构中任一化合物与药学可接受的载体或赋形剂制成的口服剂或注射剂。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗抑郁、抗焦虑药物是利用所述的式A结构中的任一化合物与药学可接受的载体或赋形剂制成的缓释剂或长效剂。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抗抑郁、抗焦虑药物为胶囊剂或片剂。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抗抑郁、抗焦虑药物是利用所述的式A结构中任一化合物与药学可接受的载体或赋形剂制成的胶囊剂或片剂。