CN101698684A - 一种从人参中提取多糖的方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从人参中提取多糖的方法及应用。它包括下列步骤：a、将干燥的人参粉碎；b、置入提取罐中，加入石油醚回流脱脂，滤出石油醚，得到脱脂后的残渣；c、向残渣中加入蒸馏水常压下提取，水煮提取重复三次，合并三次提取液；d、减压浓缩提取液，使溶液体积为所用a步骤人参粉末，得到浓缩液；e、向d步骤浓缩液中加入浓缩液，静置过夜，沉淀；f、离心得到沉淀，干燥，用Sevag法脱蛋白后，用无水乙醇、丙酮、乙醚各洗；g、水中用截留分子量1000～10000的半透膜透析，冷冻干燥得到人参多糖。一种人参多糖在制备治疗或预防骨关节炎药物中的应用。本发明的有效成分明确、疗效确定、无毒副作用，提取方法易于实施。

Description

一种从人参中提取多糖的方法及应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，更具体涉及一种从人参中提取人参多糖的方法，同时还涉及从人参中提取的人参多糖在防治骨关节炎中的用途。

背景技术

关节软骨组织主要是由软骨细胞和细胞外基质(extracellular matrix，ECM)组成，ECM的主要成分是II型胶原、蛋白多糖聚集体和水。正常关节软骨基质的降解和修复处于一种持续性的动态平衡状态，这一状态是由软骨细胞分泌软骨基质成分而得以维持的。骨关节炎是一种以局灶性关节软骨退行性变、骨丢失、关节边缘骨赘形成及关节畸形和软骨下骨质致密(硬化)为特征的慢性关节疾病，又称骨关节病、退行性骨关节病。随着老龄化社会的来临、人类平均寿命的延长，骨关节炎的患病率也逐渐升高。统计表明，我国50岁以上人群中50％患有骨关节炎，且随着年龄的增加，其患病率呈直线上升趋势。随着现代人活动频率、强度的增加以及生活方式、饮食结构和习惯的改变，骨关节炎发病正逐年增加并趋于年轻化。虽然原发性骨关节炎中关节软骨进行性破坏和丧失机制尚不清楚，但己认识到软骨基质中蛋白多糖缺失是骨关节炎最主要的病理特征。按其病理过程可以划分为三个相互交叉的阶段：①软骨基质改变：如胶原分子框架破坏、蛋白多糖降解等；②软骨细胞对组织损害作出反应：如细胞增殖、基质合成等代偿性修复；③软骨细胞合成代谢衰退及软骨组织的进行性丢失。

长期以来，目前临床上常用的药物有透明质酸制剂、氨基葡萄糖制剂以及糖皮质激素，一般通过口服或关节内注射治疗，但它们不能阻止骨关节炎最主要的病理进展，即受累关节软骨的进行性破坏。一旦病情发生，出现障碍和疼痛加重，只能靠关节镜局部冲洗甚至进行关节置换术，但前者治疗有限，而人工关节置换存在的关键是假体的寿命、松动及感染等问题。故只有研制开发能够促进基质合成、改善和重建骨关节结构的新型药物，才能从根本上解决骨关节炎的治疗问题。

人参为五加科植物Panax ginseng C.A.Mey.的干燥根及根茎，在我国有着悠久的药用历史，主要含有人参皂苷、人参多糖、人参多肽及挥发油、多种氨基酸、脂肪酸及维生素、微量元素等有效成分。

人参多糖(Ginseng Polysaccharide，GPS)为人参的主要成分之一。近年研究表明，GPS可明显增强免疫系统的功能，并有免疫抗肿瘤和辅助抗肿瘤活性。另外，GPS还有降血糖以及调控血细胞生成的作用。目前没有单独应用人参治疗骨关节炎的相关报道，更没有应用人参中提取的多糖预防或治疗骨关节炎的相关报道。

发明内容

本发明目的是在于提供了一种从人参中提取多糖的方法，方法简单，操作简便，从人参中经过水提、醇沉、透析、冷冻干燥等步骤即可得到人参多糖。该方法提取了人参的有效成分，且易于实施。

本发明的另一个目的是在于提供了一种人参多糖作为在制备治疗或预防骨关节炎药物中的应用。本发明中的人参多糖即是：用一定的方法从人参中提取的、具有预防或治疗骨关节炎作用的多糖成分。它对骨关节炎具有很好的预防和治疗作用。本发明人多年来一直致力于骨关节炎的临床治疗和植物活性成分的研究工作。长期的研究和大量的实验结果证实，与现有的主流疗法相比，人参多糖对骨关节炎的预防和治疗具有效果好、副作用小、价格便宜等优势。本发明中，人参多糖治疗骨关节炎的机制在于：①促进软骨基质主要成分蛋白多糖的合成；②抑制基质金属蛋白酶对软骨基质降解；③增强机体细胞抗氧化活性和细胞保护作用。

应用人参多糖抗骨关节炎既开发了人参的新用途，亦能在临床治疗方面给广大骨关节炎患者带来福音，这两点是本发明的新颖性和创造性之所在。在此基础之上发明者完成了本发明。

为了实现上述任务，本发明采用了以下技术措施：

一种从人参中提取多糖的方法，其步骤是：

A、将干燥的人参用粉碎机粉成80～100目的粉末；

B、置入提取罐中，加入3～7倍(w/v，g/mL)石油醚(沸程为60℃～90℃)回流30～60min脱脂，重复此步骤两次，滤出石油醚，得到脱脂后的残渣；

C、向残渣中加入7～15倍(w/v，g/mL)蒸馏水100℃提取1～2小时，重复此步骤三次，合并三次提取液；

D、50℃～80℃减压(1×10⁴～9×10⁴pa)浓缩提取液，使溶液体积(mL)为所用A步骤人参粉末重量g的5～7倍，得到浓缩液；

E、向D步骤浓缩液中加入浓缩液3倍体积的95％(v/v)乙醇，静置过夜后得到人参多糖沉淀；

F、离心得到沉淀，干燥，用Sevag法脱蛋白后，用7～15倍(w/v，g/mL)无水乙醇、丙酮、乙醚各洗三次，得到粗多糖；

G、步骤F所得物质溶于水中，用截留分子量1000～10000的半透膜透析24～48小时，冷冻干燥得到人参多糖。以葡萄糖为标准品，苯酚硫酸法检测人参多糖的含量≥60％。所述的人参为五加科植物Panax ginseng C.A.Mey.的干燥根及根茎。

一种提取人参多糖作为在制备治疗或预防骨关节炎药物中的应用基本过程是：将提取得到的无菌人参多糖粉末，临用前加入注射用水溶解至所需浓度的溶液，再经关节腔(如膝关节腔)给药。

申请人对人参多糖作为制备预防或治疗骨关节炎药物中的应用进行了系列实验验证：

1.人参多糖纯度的确定

用考马斯亮蓝法测定上述提取的人参多糖中残留的游离蛋白质含量，检测不到蛋白质残留，证明蛋白除得较为彻底。

2.多糖活性的确定

关于活性确定方法的说明：通过大量的药理实验，申请人证实人参多糖抗骨关节炎的机制：①蛋白多糖是软骨基质的主要成分，也是骨关节发生时丢失最严重的成分，体外实验发现人参多糖能明显促进蛋白多糖的合成，抑制细胞外基质成分的降解；②软骨细胞是关节软骨中唯一的细胞，其数目的多少决定着骨关节的基质合成水平，实验中人参多糖具有显著抗氧化活性和细胞保护作用，维持了细胞的正常结构和功能；③人参多糖可抑制金属蛋白酶对软骨基质的降价，对细胞外基质产生保护作用；④人参多糖作为一种天然的植物多糖，具有降解缓慢、作用持续时间长的特点，而其在粘度等生物物理性质方面与软骨基质有相似之处，注射到关节腔后，可长时间保持在关节腔内发挥作用。

发明人还根据国家《中药新药研究指导原则》，对人参多糖的安全性进行了探讨，实验结果证明人参多糖作为药用时，十分安全。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

(1)人参经过水提、醇沉、透析、冷冻干燥等步骤，即可得到人参多糖，其制备简单，提取方法易于实施；

(2)人参在我国分布极为广泛，近年来人工种植面积也逐步扩大，人参多糖含量在2％(w/w，g/g)以上，产量高，来源广泛，成本低；

(3)用人参多糖制备防治骨关节炎的药物，开发了人参的新用途；

(4)人参多糖注射液局部给药作用强、持续时间长，毒副作用小，适合骨关节炎治疗。

附图说明

图1.透射电镜下观察GPS对大鼠骨关节炎软骨细胞影响(×10000).

A：空白对照组：细胞核正常，胞浆内细胞器形态，数量正常；

B：模型对照组：细胞核正常，胞浆内线粒体水肿，内质网扩大成池，部分内质网池内容物缺失，可见少量溶酶体；

C：GPS 0.1mg/L组：细胞核正常，线粒体形态正常，内质网增生，且扩大成池，内容物丰富，内质网总面积较空白对照组大，可见少量溶酶体。

图2.各组软骨组织HE染色(×200).

A：正常对照组：软骨表面光滑，软骨细胞大小、形状、数量正常，排列规则，层次清楚，细胞核大小均匀，胞核着色较深，潮线清晰；

B：模型对照组：软骨表面粗糙不平，裂隙多，裂隙深达软骨移行层和辐射层，细胞排列极为紊乱，局部增生明显，出现成簇现象，总体数量减少，潮线紊乱不清；

C₁：GPS小剂量：软骨表面粗糙不平，裂隙较多，多见于表层，细胞排列紊乱，可见坏死凋亡细胞，增生明显，潮线紊乱多中断，可见多重潮线；

C₂：GPS中剂量：软骨表面稍不平整，裂隙较少，细胞排列较规则，局部增生明显，潮线模糊；

C₃：GPS大剂量：软骨表面平整规则，几乎无裂隙，细胞排列规则，细胞轻度增生，潮线稍模糊。

图3.各组软骨组织甲苯胺蓝染色(×200)

A：正常对照组：软骨着色深，软骨细胞大小、形状、排列规则，潮线清晰；

B：模型对照组：软骨着色重度减低，软骨细胞数目增多、密集，排列紊乱，潮线不清；

C₁：GPS小剂量：软骨着色重度减低，软骨细胞数目增多、密集，排列紊乱，潮线不清；

C₂：GPS中剂量：软骨着色中重度减低，软骨细胞、形状、排列规则，潮线清晰；

C₃：GPS大剂量：软骨着色轻度减低，软骨细胞大小、形状、排列规则，潮线清晰。

具体实施方式

下面通过具体的实验实例，进一步阐述本发明中人参提取人参多糖的方法，以及人参多糖在制备预防或骨关节炎药物中的应用。

实施例1：

从人参中提取人参多糖的方法，其步骤是：

A、将干燥的人参用粉碎机粉成80或85或90或95或100目的粉末；

B、将粉末置入提取罐中，加入3倍(w/v，g/mL)石油醚(沸程为60℃～90℃)回流60分钟，脱脂，重复此步骤两次，滤出石油醚，得到脱脂后的残渣；

C、向残渣中加入7倍(w/v，g/mL)蒸馏水100℃提取2小时，重复此步骤三次，合并三次提取液；

D、50℃减压(1×10⁴pa)浓缩提取液，使溶液体积为所用A步骤人参粉末重量(g)的5倍，得到浓缩液；

E、向D步骤浓缩液中加入浓缩液3倍体积的95％(v/v)乙醇，静置过夜后得到人参多糖沉淀；

F、离心得到沉淀，干燥，用Sevag法脱蛋白后，用7倍(w/v，g/mL)无水乙醇、丙酮、乙醚各洗三次，得到粗多糖；

G、将F步骤所得物质溶于水中，用截留分子量1000的半透膜透析48小时，冷冻干燥得到人参多糖；

H、本实施例采用苯酚硫酸法测定多糖，多糖含量大于60％。

实施例2：

从人参中提取人参多糖的方法，其步骤是：

A、将干燥人参粉碎后过80或85或90或95或100目筛；

B、置入提取罐中，以液料比(w/v，，g/mL)5∶1加入石油醚(沸程为60℃～90℃)回流脱脂两次，每次45分钟，过滤，得到脱脂残渣；

C、残渣中加入11倍(w/v，g/mL)蒸馏水100℃提取三次，每次1.5小时，合并提取液；

D、65℃减压(5×10⁴pa)浓缩提取液，使溶液体积(mL)为所用A步骤原料药粉末重量(g)的6倍，得到浓缩液；

E、向D步骤浓缩液中加入浓缩液3倍体积的95％(v/v)乙醇，静置过夜后得到人参多糖沉淀；

F、离心得到沉淀，干燥，用Sevag法脱蛋白后，分别以11倍(w/v，g/mL)无水乙醇、丙酮、乙醚各洗三次，得到粗多糖；

G、将F步骤所得物质溶于水中，用截留分子量5000的半透膜透析36小时，冷冻干燥得到人参多糖；

H、本实施例采用苯酚硫酸法测定多糖，多糖含量大于60％。

实施例3：

从人参中提取人参多糖的方法，其步骤是：

A、将干燥人参粉碎成80或85或90或95或100目粉末；

B、加入原料药材7倍(w/v，g/mL)量的石油醚(沸程为60℃～90℃)回流30分钟脱脂两次后过滤，得到脱脂后的残渣；

C、向B步骤所得残渣中以液料比(w/v，g/mL)15∶1加入蒸馏水，100℃提取1小时，重复此步骤三次，合并提取液；

D、将C步骤所得提取液80℃减压(9×10⁴pa)浓缩，使溶液体积(mL)为A步骤所得人参粉末重量(g)的7倍，得到浓缩液；

E、向D步骤浓缩液中加入3倍体积的95％(v/v)乙醇，静置过夜后得到人参多糖沉淀；

F、离心后弃上清，干燥，用Sevag法脱蛋白后，分别以15倍(w/v，g/mL)无水乙醇、丙酮、乙醚各洗三次，得到粗多糖；

G、将F步骤所得物质溶于水中，用截留分子量10000的半透膜透析48小时，冷冻干燥得到人参多糖；

H、本实施例采用苯酚硫酸法测定多糖，多糖含量大于60％。

实施例4：

苯酚硫酸法测多糖含量，其步骤是：

A、苯酚试液的配制：取苯酚100g加铝片0.1g和碳酸氢钠0.05g蒸馏，收集182℃馏分。称取5g加蒸馏水溶解，定容于100mL容量瓶中，得50g/L苯酚试剂，转入棕色试剂瓶中备用；

B、标准溶液的制备：精确称取105℃干燥至恒重的葡萄糖0.5057g加水溶解，定容于50mL容量瓶中，摇匀，得标准贮藏液。分别精确移取标准贮藏液0.01mL、0.03mL、0.05mL、0.10mL、0.20mL、0.25mL、0.30mL、0.35mL和0.45mL，稀释定容于50mL容量瓶中，摇匀，得系列标准液；

C、标准曲线的绘制：精确移取己配制好的系列标准液各1mL置15mL具塞试管中，加50g/L苯酚试剂1mL，混匀，快速沿管壁加入浓硫酸5mL，混匀，室温(20-25℃以下相同)下放置15min，置40℃水浴中放置10min，室温下静置10min，以蒸馏水同法操作为空白，在490nm处测定吸光度，计算得回归方程；

D、样品溶液多糖含量测定：精确移取样品溶液1mL于15mL具塞试管中，按“标准曲线绘制”项方法测吸光度，计算多糖含量。

一种提取人参多糖作为在制备治疗或预防骨关节炎药物中的应用基本过程是：将提取得到的无菌人参多糖粉末，临用前加入注射用水溶解至所需浓度的溶液，再经关节腔(如膝关节腔)给药，间隔一定时间后重复给药。申请人对人参多糖作为制备预防或治疗骨关节药物中的应用进行了系列实验验证，证实人参多糖能显著促进大鼠退变软骨细胞糖胺多糖的合成，抑制基质金属蛋白酶的合成，并对大鼠软骨细胞没有毒性。

实施例5：人参多糖对体外大鼠退变软骨细胞糖胺多糖合成的影响

1.细胞培养

Wistar大鼠(SPF级，由武汉大学动物实验中心提供)关节软骨细胞培养。待细胞基本长满后传代培养。传至第三代时，调整细胞浓度为1×10⁵/mL，接种于24孔培养板内用于实验。

2.DMMB溶液配置

3.实验分组及处理

细胞接种24小时后把培养孔分为空白对照组、IL-1β模型对照组和人参多糖不同浓度组。每组4孔，分别更换相应的培养液。

①空白对照组：换DMEM培养液；

②模型对照组：换DMEM培养液(含10ng/mL IL-1β)；

③人参多糖各实验组：换DMEM培养液(含10ng/mL IL-1β)，5min后添加0.0001、0.001、0.01、0.1mg/L人参多糖；

放入孵箱中继续培养。各项检测均在72小时后进行。

4.指标检测

细胞内糖胺多糖含量检测：采用DMB染色法，使用24孔培养板培养细胞。

(1)标准曲线测定：分别取100μL不同质量浓度(5～100μg/mL)硫酸软骨素标准溶液，加入1mL DMB显色剂，按照1、2步骤，测定吸光值，做出GAG含量标准曲线。

(2)测定管测定：取培养基100μl，按照1、2步骤，测定吸光值。将各试验组吸光值与标准曲线对比，求出蛋白多糖浓度。

5.实验结果

细胞培养基糖胺聚糖结果显示，模型对照组与空白对照组比较，GAG含量下降(P＜0.05)，说明造模成功。0.01、0.1mg/L组GAG含量较模型对照组明显增高(P＜0.01)，说明人参多糖在一定范围浓度内有明显的增加蛋白多糖含量作用，并表现为良好的量效关系，见表1。

表1不同浓度人参多糖对IL-1β诱导的大鼠软骨细胞增殖及GAG含量的的影响

注：与空白对照组比较，^★P＜0.05；与模型对照组比较，^▲P＜0.01。

实施例6：人参多糖对大鼠退变软骨细胞内细胞器的影响

1.细胞培养

Wistar大鼠(SPF级，由武汉大学动物实验中心提供)关节软骨细胞培养。待细胞基本长满后传代培养。传至第三代时，调整细胞浓度为1×10⁵/mL，接种于6cm培养皿内用于实验。

2.实验分组及处理

细胞接种24小时后把培养孔分为空白对照组、IL-1β模型对照组和0.1mg/L人参多糖组。每组4皿，分别更换相应的培养液：

①空白对照组：换DMEM培养液；

②模型对照组：换DMEM培养液(含10ng/mL IL-1β)；

③0.1mg/L人参多糖处理组：换DMEM培养液(含10ng/mL IL-1β)，5min后添加0.1mg/L人参多糖；

放入孵箱中继续培养。各项检测均在72小时后进行。

3.透射电镜下观察各组软骨细胞内细胞器形态学变化

结果见图1。

4.实验结果

空白对照组可见细胞核正常，胞浆内细胞器形态，数量正常。模型对照组细胞核正常，胞浆内线粒体水肿，内质网扩大成池，部分内质网池内容物缺失，可见少量溶酶体。人参多糖0.1mg/L组细胞核正常，线粒体形态正常，内质网增生，且扩大成池，内容物丰富，内质网总面积较空白组大，可见少量溶酶体。结果见图1。

实施例7：人参多糖对大鼠关节炎软骨组织形态学影响

1.OA模型的建立及动物分组

50只Wistar大鼠，雌雄各半，分成A、B、C₁、C₂、C₃五组，每组10只。A组为正常对照组，B组为模型对照组，C₁、C₂、C₃分别为人参多糖小、中、大剂量治疗组。采用关节腔内注射4％木瓜蛋白酶溶液的方法建立OA模型。

2.软骨组织的取材及大体观察

右膝胫骨上端截取胫骨平台，去除半月板和周围组织，从胫骨平台髁间棘处纵行劈裂为两块，一块在肉眼及手术显微镜下观察大体观；另一块置10％的多聚甲醛固定液中固定，室温下脱钙两周，然后经脱水、透明、石蜡包埋。软骨石蜡切片分别HE染色和甲苯胺蓝染色，光镜下观察软组织形态结果、细胞数量和甲苯胺蓝染色的情况，然后根据Mankin′s评分标准评分。

3.实验结果

关节软骨肉眼及手术显微镜下大体观察：

正常对照组(A)软骨表面光滑平整，略呈淡蓝色，透明度好，未见骨赘；模型对照组(B)软骨表面粗糙不平，色泽灰暗，透明度差，局部软骨变薄，呈纤维束状变，可见明显的裂隙，有的甚至可见软骨下骨，软骨边缘有大量骨赘；小剂量治疗组(C₁)软骨表面较粗糙，透明度差，局部软骨变薄，呈小纤维束状变，可见明显的裂隙，软骨边缘有部分骨赘；中剂量治疗组(C₂)软骨表面稍不平整，有少量裂隙，局部软骨变薄，呈小纤维束状变，软骨边缘有少量骨赘；大剂量治疗组(C₃)软骨表面较平整，裂隙很少，透明度较好，软骨边缘有少量小骨赘。结果见表2。

表2关节腔注射人参多糖对骨关节炎大鼠关节软骨大体评分的影响

注：与正常对照组比较，^★P＜0.01；与模型对照组比较，^▲P＜0.05。

关节软骨HE染色和甲苯胺蓝染色光镜观察：

正常对照组(A)软骨表面平整，细胞排列规则、结构层次清楚，细胞数量正常，潮线清晰；甲苯胺蓝染色正常。模型对照组(B)软骨表面粗糙不平，裂隙多，部分切片软骨表层缺失，裂隙深达软骨移行层和辐射层，细胞排列紊乱，局部增生明显，出现成簇现象，细胞数量减少，多见坏死崩解的细胞，潮线紊乱、模糊不清几不可见；甲苯胺蓝染色严重减退，甚至不着色。人参多糖小剂量治疗组(C₁)，软骨表面粗糙不平，裂隙较多，多见于表层，细胞排列紊乱，可见坏死凋亡细胞，增生明显，潮线紊乱多中断，可见多重潮线；甲苯胺蓝染色程度减退。

中剂量治疗组(C₂)，软骨表面稍不平整，裂隙较少，细胞排列较规则，局部增生明显，潮线模糊，可见多重潮线；甲苯胺蓝染色中度减退。人参多糖大剂量治疗组(C₃)，软骨表面平整规则，几乎无裂隙，细胞排列规则，细胞轻度增生，潮线稍模糊；甲苯胺蓝染色轻度减退。结果见图2、3。

关节软骨光镜下Mankin′s评分结果

模型对照组(B)的Mankin′s评分较正常对照组(A)显著性增加(P＜0.05)，人参多糖中、大剂量治疗组(C₂、C₃)的评分较模型对照组(B)显著性降低(均P＜0.05)，且人参多糖大剂量治疗组(C₃)的评分较人参多糖小、中剂量治疗组(C₁、C₂)的评分进一步降低(均P＜0.05)，结果见表3。

表3关节腔注射人参多糖对骨关节炎大鼠软骨Mankin′s评分的影响

注：与正常对照组比较，^★P＜0.05；与模型对照组比较，^▲P＜0.05；与人参多糖大剂量治疗组比较，^#P＜0.05。

Claims (2)

1.一种从人参中提取多糖的方法，其步骤是：

A、将干燥的人参用粉碎机粉碎成80～100目的粉末；

B、置入提取罐中，加入3～7倍w/v石油醚60℃～90℃回流30～60min脱脂，重复此步骤两次，滤出石油醚，得到脱脂后的残渣；

C、向残渣中加入7～15倍w/v蒸馏水100℃提取1～2小时，重复此步骤三次，合并三次提取液；

D、50℃～80℃减压1×10⁴～9×10⁴pa浓缩提取液，使溶液体积为所用(A)步骤人参粉末重量g的5～7倍，得到浓缩液；

E、向(D)步骤浓缩液中加入浓缩液3倍体积的95％v/v乙醇，静置过夜，沉淀；

F、离心得到沉淀，干燥，用Sevag法脱蛋白后，用7～15倍w/v，无水乙醇、丙酮、乙醚各洗三次；

G、步骤(F)所得物质溶于水中，用截留分子量1000～10000的半透膜透析24～48小时，冷冻干燥得到人参多糖。

2.权利要求1所述的一种人参多糖在制备治疗或预防骨关节炎药物中的应用。

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