CN101525391B

CN101525391B - 一种从甘草中提取多糖的方法及应用

Info

Publication number: CN101525391B
Application number: CN200910061357XA
Authority: CN
Inventors: 汪晖; 陈廖斌; 李小军; 汪巍; 何文博; 张逸杰; 范雯
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Guangzhou Nanfeng Biological Technology Co., Ltd.
Priority date: 2009-03-31
Filing date: 2009-03-31
Publication date: 2011-05-11
Anticipated expiration: 2029-03-31
Also published as: CN101525391A

Abstract

本发明公开了一种从甘草中提取多糖的方法及应用。它包括下列步骤：a、将干燥的甘草用粉碎；b、置入提取罐中，加入石油醚回流脱脂，滤出石油醚，得到脱脂后的残渣；c、向残渣中加入蒸馏水常压下提取，水煮提取重复三次，合并三次提取液；d、减压浓缩提取液，使溶液体积为所用a步骤甘草粉末，得到浓缩液；e、向d步骤浓缩液中加入浓缩液，静置过夜，沉淀；f、离心得到沉淀，干燥，用Sevag法脱蛋白后，用无水乙醇、丙酮、乙醚各洗；g、水中用截留分子量1000～10000的半透膜透析，冷冻干燥得到甘草多糖。一种甘草多糖在制备治疗或预防骨关节炎药物中的应用。本发明的有效成分明确、疗效确定、无毒副作用，提取方法易于实施。

Description

一种从甘草中提取多糖的方法及应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，更具体涉及一种从甘草中提取甘草多糖的方法，同时还涉及从甘草中提取的甘草多糖在防治骨关节炎药物中的用途。

背景技术

关节软骨组织主要是由软骨细胞和细胞外基质(extracellular matrix，ECM)组成，ECM的主要成分是II型胶原、蛋白多糖聚集体和水。正常关节软骨基质的降解和修复处于一种持续性的动态平衡状态，这一状态是由软骨细胞分泌软骨基质成分而得以维持的。骨关节炎是一种以局灶性关节软骨退行性变、骨丢失、关节边缘骨赘形成及关节畸形和软骨下骨质致密(硬化)为特征的慢性关节疾病，又称骨关节病、退行性骨关节病。随着老龄化社会的来临、人类平均寿命的延长，骨关节炎的患病率也逐渐升高。统计表明，我国50岁以上人群中50％患有骨关节炎，且随着年龄的增加，其患病率呈直线上升趋势。随着现代人活动频率、强度的增加以及生活方式、饮食结构和习惯的改变，骨关节炎发病正逐年增加并趋于年轻化。虽然原发性骨关节炎中关节软骨进行性破坏和丧失机制尚不清楚，但已认识到软骨基质中蛋白多糖缺失是骨关节炎最主要的病理特征。按其病理过程可以划分为三个相互交叉的阶段：①软骨基质改变：如胶原分子框架破坏、蛋白多糖降解等；②软骨细胞对组织损害作出反应：如细胞增殖、基质合成等代偿性修复；③软骨细胞合成代谢衰退及软骨组织的进行性丢失。

长期以来，目前临床上常用的药物有透明质酸制剂、氨基葡萄糖制剂以及糖皮质激素，一般通过口服或关节内注射治疗，但它们不能阻止骨关节炎最主要的病理进展，即受累关节软骨的进行性破坏。一旦病情发生，出现障碍和疼痛加重，只能靠关节镜局部冲洗甚至进行关节置换术，但前者治疗有限，而人工关节置换存在的关键是假体的寿命、松动及感染等问题。故只有研制开发能够促进基质合成、改善和重建骨关节结构的新型药物，才能从根本上解决骨关节炎的治疗问题。

甘草为豆科甘草属植物干燥的根和根茎，具有镇痛、抗炎、抗溃疡、抗变态反应、抗氧化等功能。同时甘草也是骨关节炎中医治疗方剂中的常用药。

甘草中的甘草多糖由鼠李糖、葡萄糖、阿拉伯糖和半乳糖等组成，具有治疗慢性和复发性呼吸道感染(ZL03130529.6)、调节人体免疫功能(CN1343729A)等药理作用。目前没有单独应用甘草治疗骨关节炎的相关报道，更没有应用甘草中提取的多糖预防或治疗骨关节炎的相关报道。

发明内容

本发明目的是在于提供了一种从甘草中提取多糖的方法，从甘草中经过水提、醇沉、透析、冷冻干燥等步骤即可得到甘草多糖。该方法提取了甘草的有效成分，且易于实施。

本发明的另一个目的是在于提供一种甘草多糖作为在制备治疗或预防骨关节炎药物中的应用。本发明中的甘草多糖即是：用一定的方法从甘草中提取的、具有预防或治疗骨关节炎作用的多糖成分。它对骨关节炎具有很好的预防和治疗作用。本发明人多年来一直致力于骨关节炎的临床治疗和植物活性成分的研究工作。长期的研究和大量的实验结果证实，与现有的主流疗法相比，甘草多糖对骨关节炎的预防和治疗具有效果好、副作用小、价格便宜等优势。本发明中，甘草多糖治疗骨关节炎的机制在于：①促进软骨基质主要成分蛋白多糖的合成；②促进软骨细胞增殖，抑制软骨细胞凋亡；③降解缓慢，可在骨关节腔内维持较长时间。

应用甘草多糖抗骨关节炎既开发了甘草的新用途，亦能在临床治疗方面给广大骨关节炎患者带来福音，这两点是本发明的新颖性和创造性之所在。在此基础之上发明者完成了本发明。

为了实现上述任务，本发明采用了以下技术措施：

一种从甘草中提取多糖的方法，其步骤是：

A、将干燥的甘草用粉碎机粉成80～100目的粉末；

B、置入提取罐中，加入3～7倍(w/v，g/mL)石油醚(沸程为60℃～90℃)回流30～60min脱脂，重复此步骤两次，滤出石油醚，得到脱脂后的残渣；

C、向残渣中加入7～15(w/v，g/mL)倍蒸馏水100℃提取1～2小时，重复此步骤三次，合并三次提取液；

D、50℃～80℃减压(1×10⁴～9×10⁴pa)浓缩提取液，使溶液体积(mL)为所用A步骤甘草粉末重量g的5～7倍，得到浓缩液；

E、向D步骤浓缩液中加入浓缩液3倍体积的95％(v/v)乙醇，静置过夜，以便充分沉淀；

F、离心得到沉淀，干燥，用Sevag法脱蛋白后，用7～15倍(w/v，g/mL)无水乙醇、丙酮、乙醚各洗三次；

G、水中用截留分子量1000～10000的半透膜透析24～48小时，冷冻干燥得到甘草多糖。

一种提取甘草多糖作为在制备治疗或预防骨关节炎药物中的应用基本过程是：将提取得到的无菌甘草多糖粉末，临用前加入注射用水溶解至所需浓度的溶液，再经关节腔(如膝关节腔)给药，间隔一定时间后重复给药。

申请人对甘草多糖作为制备预防或治疗骨关节药物中的应用进行了系列实验验证：

1.甘草多糖纯度的确定

用考马斯亮蓝法测定上述提取的甘草多糖中残留的游离蛋白质含量，检测不到蛋白质残留，证明蛋白除得较为彻底。

2.多糖结构及活性的确定

作为分子量范围较宽的天然高分子物质，甘草多糖的分子结构十分复杂。研究表明，甘草多糖至少具有三个核心结构：①由β-1，3-D半乳糖残基构成的主链，主链携带侧链中3/5的半乳糖单元是由6位连接的β-1，3和β-1，6-D半乳糖残基组成；②由α-1，5-L树胶醛醣-β-1，6或1，3-D半乳糖残基组成主链携带侧链的糖单位；③由α(1→4)D葡聚糖组成的糖单元。

甘草多糖经过DEAE-sephadex A-50分离主要得到三个峰，分别对应三个组分GP-1、GP-2和GP-3(见图1A)；透析除盐，冷冻干燥得到白色粉末。GP-2经过sephadex A-25分离，得到的峰较为单一(见图1B)，证明其分子量分布较为集中。

关于活性确定方法的说明：通过大量的药理实验，申请人证实甘草多糖抗骨关节炎的机制：①蛋白多糖是软骨基质的主要成分，也是骨关节发生时丢失最严重的成分，体外实验发现甘草多糖能明显促进蛋白多糖的合成；②软骨细胞是关节软骨中唯一的细胞，其数目的多少决定着骨关节的基质合成水平，实验中甘草多糖显著抑制了软骨细胞的凋亡；③甘草多糖作为一种天然的植物多糖，具有降解缓慢、作用持续时间长的特点，而其在粘度等生物物理性质方面与软骨基质有相似之处，注射到关节腔后，可长时间保持在关节腔内发挥作用。

发明人还根据国家《中药新药研究指导原则》，对甘草多糖的安全性进行了探讨，实验结果证明甘草多糖作为药用时，十分安全。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

(1)甘草经过水提、醇沉、透析、冷冻干燥等步骤，即可得到甘草多糖，其制备简单，提取方法易于实施；

(2)甘草在我国分布极为广泛，约为110万公顷，近年来人工种植面积也逐步扩大，甘草多糖含量在2％(w/w，g/g)以上，产量高，来源广泛，成本低；

(3)用甘草多糖制备防治骨关节炎的药物，开发了甘草的新用途；

(4)甘草多糖注射液局部给药作用强、持续时间长，毒副作用小，适合骨关节炎治疗。

附图说明

图1为一种甘草多糖分离的示意图.

A图：经DEAE-sephadex A-50分离；B图：经sephadex A-25分离.

甘草多糖经过DEAE-sephadex A-50分离主要得到三个峰，分别对应三个组分GP-1、GP-2和GP-3，透析除盐和冷冻干燥得到白色粉末。GP-2经过sephadex A-25分离，得到的峰较为单一，证明其分子量分布较为集中。

图2为一种甘草多糖对大鼠软骨细胞糖胺多糖释放影响的示意图

x±s，n＝4.与空白对照组相比，^☆P＜0.05，^☆☆P＜0.01；与模型对照组比，^★P＜0.05，^★★P＜0.01。IL-1β模型对照组较空白对照组蛋白多糖含量明显降低(P＜0.01)，说明造模成功。与模型对照组相比，甘草多糖各浓度组均有明显的增加蛋白多糖含量作用，500μg/mL组使其水平基本恢复至正常水平，并表现为良好的量效关系。

图3为一种甘草多糖对大鼠软骨细胞凋亡影响的DNA组方图

A；control；B：model IL1-β20μg/mL；C：IL1-β20μg/mL+GP 100μg/mL。与空白对照组相比，IL-1β导致大鼠软骨细胞凋亡率明显提高，而100μg/mL甘草多糖能对抗IL-1β的影响，100μg/mL甘草多糖凋亡率甚至比空白对照组还低。

图4为MTT法测定一种甘草多糖对大鼠软骨细胞毒性和增殖影响的示意图

x±s，n＝6。与空白对照组相比，^☆P＜0.05。与空白对照组相比，100μg/mL GP、GP-1、GP-2和GP-3均不会导致细胞活力的降低，证明甘草多糖及其组分在该浓度下对大鼠软骨细胞没有毒性，同时GP-2能够显著促进大鼠软骨细胞的增殖。

具体实施方式

下面通过具体的实验实例来进一步阐述本发明中甘草中提取甘草多糖的方法以及甘草多糖在制备预防或骨关节炎药物中的应用。

实施例1：从甘草中提取甘草多糖的方法

A、将干燥的甘草用粉碎机粉成80或85或90或95或100目的粉末；

B、将粉末置入提取罐中，加入3倍(w/v，g/mL)石油醚(沸程为60℃～90℃)回流30或35或42或51或56或60分钟，脱脂，重复此步骤两次，滤出石油醚，得到脱脂后的残渣；

C、向残渣中加入7倍(w/v，g/mL)蒸馏水100℃提取1小时，重复此步骤三次，合并三次提取液；

D、50℃减压(1×10⁴pa)浓缩提取液，使溶液体积为所用A步骤甘草粉末重量(g)的5倍，得到浓缩液；

F、离心得到沉淀，干燥，用Sevag法脱蛋白后，用7倍(w/v，g/mL)无水乙醇、丙酮、乙醚各洗三次；

G、将F步骤所得物质溶于水中，用截留分子量1000的半透膜透析24小时，冷冻干燥得到甘草多糖。

实施例2：从甘草中提取甘草多糖的方法

A、将干燥的甘草用粉碎机粉成80或85或90或95或100目的粉末；

B、置入提取罐中，加入4倍(w/v，g/mL)石油醚(沸程为60℃～90℃)回流35min脱脂，重复此步骤两次，滤出石油醚，得到脱脂后的残渣；

C、向残渣中加入8倍(w/v，g/mL)蒸馏水100℃提取1.5小时，重复此步骤三次，合并三次提取液；

D、55℃减压(2×10⁴pa)浓缩提取液，使溶液体积为所用A步骤甘草粉末重量(g)的6倍，得到浓缩液；

F、离心得到沉淀，干燥，用Sevag法脱蛋白后，用8(w/v，g/mL)倍无水乙醇、丙酮、乙醚各洗三次；

G、将F步骤所得物质溶于水中，用截留分子量2000的半透膜透析32小时，冷冻干燥得到甘草多糖。

实施例3：从甘草中提取甘草多糖的方法

A、将干燥的甘草用粉碎机粉成80或85或90或95或100目的粉末；

B、置入提取罐中，加入5倍(w/v，g/mL)石油醚(沸程为60℃～90℃)回流40min脱脂，重复此步骤两次，滤出石油醚，得到脱脂后的残渣；

C、向残渣中加入8倍(w/v，g/mL)蒸馏水100℃提取2小时，重复此步骤三次，合并三次提取液；

D、60℃减压(3×10⁴pa)浓缩提取液，使溶液体积(mL)为所用A步骤甘草粉末重量(g)的7倍，得到浓缩液；

F、离心得到沉淀，干燥，用Sevag法脱蛋白后，用9倍(w/v，g/mL)无水乙醇、丙酮、乙醚各洗三次；

G、将F步骤所得物质溶于水中，用截留分子量3000的半透膜透析36小时，冷冻干燥得到甘草多糖。

实施例4：从甘草中提取甘草多糖的方法

A、将干燥的甘草用粉碎机粉成80或85或90或95或100目的粉末；

B、置入提取罐中，加入6倍(w/v，g/mL)石油醚(沸程为60℃～90℃)回流45min脱脂，重复此步骤两次，滤出石油醚，得到脱脂后的残渣；

C、向残渣中加入10倍(w/v，g/mL)蒸馏水100℃提取1小时，重复此步骤三次，合并三次提取液；

D、65℃减压(4×10⁴pa)浓缩提取液，使溶液体积(mL)为所用A步骤甘草粉末重量(g)的5倍，得到浓缩液；

F、离心得到沉淀，干燥，用Sevag法脱蛋白后，用10倍(w/v，g/mL)无水乙醇、丙酮、乙醚各洗三次；

G、将F步骤所得物质溶于水中，用截留分子量4000的半透膜透析30小时，冷冻干燥得到甘草多糖。

实施例5：从甘草中提取甘草多糖的方法

A、将干燥的甘草用粉碎机粉成80或85或90或95或100目的粉末；

B、置入提取罐中，加入7倍(w/v，g/mL)石油醚(沸程为60℃～90℃)回流50min脱脂，重复此步骤两次，滤出石油醚，得到脱脂后的残渣；

C、向残渣中加入11倍(w/v，g/mL)蒸馏水100℃提取1.5小时，重复此步骤三次，合并三次提取液；

D、70℃减压(5×10⁴pa)浓缩提取液，使溶液体积(mL)为所用A步骤甘草粉末重量(g)的6倍，得到浓缩液；

F、离心得到沉淀，干燥，用Sevag法脱蛋白后，用11倍(w/v，g/mL)无水乙醇、丙酮、乙醚各洗三次；

G、将F步骤所得物质溶于水中，用截留分子量5000的半透膜透析40小时，冷冻干燥得到甘草多糖。

实施例6：从甘草中提取甘草多糖的方法

A、将干燥的甘草用粉碎机粉成80或85或90或95或100目的粉末；

B、置入提取罐中，加入3倍(w/v，g/mL)石油醚(沸程为60℃～90℃)回流55min脱脂，重复此步骤两次，滤出石油醚，得到脱脂后的残渣；

C、向残渣中加入12倍(w/v，g/mL)蒸馏水100℃提取2小时，重复此步骤三次，合并三次提取液；

D、75℃减压(6×10⁴pa)浓缩提取液，使溶液体积(mL)为所用A步骤甘草粉末重量(g)的7倍，得到浓缩液；

F、离心得到沉淀，干燥，用Sevag法脱蛋白后，用12倍(w/v，g/mL)无水乙醇、丙酮、乙醚各洗三次；

G、将F步骤所得物质溶于水中，用截留分子量6000的半透膜透析36小时，冷冻干燥得到甘草多糖。

实施例7：从甘草中提取甘草多糖的方法

A、将干燥的甘草用粉碎机粉成80或85或90或95或100目的粉末；

B、置入提取罐中，加入4倍(w/v，g/mL)石油醚(沸程为60℃～90℃)回流60min脱脂，重复此步骤两次，滤出石油醚，得到脱脂后的残渣；

C、向残渣中加入13倍(w/v，g/mL)蒸馏水100℃提取1小时，重复此步骤三次，合并三次提取液；

D、80℃减压(7×10⁴pa)浓缩提取液，使溶液体积(mL)为所用A步骤甘草粉末重量(g)的5倍，得到浓缩液；

F、离心得到沉淀，干燥，用Sevag法脱蛋白后，用13倍(w/v，g/mL)无水乙醇、丙酮、乙醚各洗三次；

G、将F步骤所得物质溶于水中，用截留分子量7000的半透膜透析48小时，冷冻干燥得到甘草多糖。

实施例8：从甘草中提取甘草多糖的方法

A、将干燥的甘草用粉碎机粉成80或85或90或95或100目的粉末；

B、置入提取罐中，加入5倍(w/v，g/mL)石油醚(沸程为60℃～90℃)回流30min脱脂，重复此步骤两次，滤出石油醚，得到脱脂后的残渣；

C、向残渣中加入14倍(w/v，g/mL)蒸馏水100℃提取1.5小时，重复此步骤三次，合并三次提取液；

D、72℃减压(8×10⁴)浓缩提取液，使溶液体积(mL)为所用A步骤甘草粉末重量(g)的6倍，得到浓缩液；

F、离心得到沉淀，干燥，用Sevag法脱蛋白后，用14倍(w/v，g/mL)无水乙醇、丙酮、乙醚各洗三次；

G、将F步骤所得物质溶于水中，用截留分子量8000的半透膜透析24小时，冷冻干燥得到甘草多糖。

实施例9：从甘草中提取甘草多糖的方法

A、将干燥的甘草用粉碎机粉成80或85或90或95或100目的粉末；

B、置入提取罐中，加入6倍(w/v，g/mL)石油醚(沸程为60℃～90℃)回流30min脱脂，重复此步骤两次，滤出石油醚，得到脱脂后的残渣；

C、向残渣中加入15倍(w/v，g/mL)蒸馏水100℃提取1小时，重复此步骤三次，合并三次提取液；

D、78℃减压(9×10⁴pa)浓缩提取液，使溶液体积(mL)为所用A步骤甘草粉末重量(g)的7倍，得到浓缩液；

F、离心得到沉淀，干燥，用Sevag法脱蛋白后，用15倍(w/v，g/mL)无水乙醇、丙酮、乙醚各洗三次；

G、将F步骤所得物质溶于水中，用截留分子量9000的半透膜透析48小时，冷冻干燥得到甘草多糖。

一种提取甘草多糖作为在制备治疗或预防骨关节炎药物中的应用基本过程是：将提取得到的无菌甘草多糖粉末，临用前加入注射用水溶解至所需浓度的溶液，再经关节腔(如膝关节腔)给药，间隔一定时间后重复给药。申请人对甘草多糖作为制备预防或治疗骨关节药物中的应用进行了系列实验验证，甘草多糖能显著促进大鼠退变软骨细胞糖胺多糖的合成，抑制大鼠软骨细胞凋亡并促进其增殖，并对大鼠软骨细胞没有毒性。

实施例10：甘草多糖对大鼠退变软骨细胞糖胺多糖合成的影响

1.细胞培养

用刀片削取Wistar大鼠(SPF级，由武汉大学动物实验中心提供)骨关节标本得到关节软骨片，剪成1mm³小块。用0.25％(w/v，g/mL)胰酶溶液消化0.5小时，然后用0.2％(w/v，g/mL)的II型胶原酶37℃水浴消化4～5小时直至成絮状。用200目不锈钢筛网过滤离心，加入全培养液重悬，获得单个软骨细胞悬液。将细胞接种于50mL培养瓶内单层培养。隔天换液。待细胞基本长满后传代培养。传至第三代时，调整细胞浓度为1×10⁵/mL，接种于24孔培养板内用于实验。

2.DMMB溶液配置及染色

①DMMB聚合工作液配置：16mg DMMB溶于25mL乙醇，并通过滤纸过滤；100mL的1M盐酸胍，1g甲酸钠，1mL的98％(v/v，g/mL)甲酸加入到上述DMMB乙醇溶液中，加水使总体积达到500mL。这个溶液不稳定，需要迅速用500mL(含100mL1M盐酸胍，1g甲酸钠，1mL 98％(v/v，g/mL)甲酸)。此溶液在室温(20℃-25℃以下相同)下至少能稳定4个月。

②DMMB解聚溶液：含10％(v/v，g/mL)丙醇的50mM醋酸钠缓冲液(pH 6.8)中加入盐酸胍粉末，使其终浓度为4M。此溶液在室温下至少能稳定4个月。

③GAG-DMMB的聚合和解聚：将1mL的DMMB工作液中加入100μl样品，剧烈振摇30min。12,000×g离心10min，倾倒，去除上清液。加入1mLDMMB解聚溶液，振摇30min，溶解沉淀。在656nm处测定OD值。

3.实验分组及处理

细胞接种24小时后把培养孔分为空白对照组、IL-1β模型对照组和甘草多糖不同浓度组。每组4孔，分别更换相应的培养液。

①空白对照组：换DMEM培养液；

②模型对照组：换DMEM培养液(含10ng/mL的IL-1β)；

③甘草多糖各实验组：换DMEM培养液(含10ng/mL的IL-1β)，5min后添加50、100、200μg/mL甘草多糖；

放入孵箱中继续培养。各项检测均在72小时后进行。

4.指标检测

细胞内糖胺多糖含量检测：采用DMB染色法，使用24孔培养板培养细胞。

(1)标准曲线测定：分别取100μL不同质量浓度(5～100μg/mL)硫酸软骨素标准溶液，加入1mL DMB显色剂，按照1、2步骤，测定吸光值，做出GAG含量标准曲线。

(2)测定管测定：取培养基100μl，按照1、2步骤，测定吸光值。将各试验组吸光值与标准曲线对比，求出蛋白多糖浓度。

5.实验结果

细胞培养基糖胺聚糖结果(图2)显示，IL-1模型对照组较空白对照组蛋白多糖含量明显降低(P＜0.01)，说明造模成功。与模型对照组相比，甘草多糖各浓度组均有明显的增加蛋白多糖含量作用，500μg/mL组使其水平基本恢复至正常水平，并表现为良好的量效关系。

实施例11：甘草多糖对大鼠退变软骨细胞凋亡的影响

1.细胞培养

用刀片削取Wistar大鼠(SPF级，由武汉大学动物实验中心提供)骨关节标本得到关节软骨片，剪成1mm³小块。用0.25％(w/v，g/mL)胰酶溶液消化0.5小时，然后用0.2％(w/v，g/mL)的II型胶原酶37℃水浴消化4～5小时直至成絮状。用200目不锈钢筛网过滤离心，加入全培养液重悬，获得单个软骨细胞悬液。将细胞接种于50mL培养瓶内单层培养。隔天换液。待细胞基本长满后传代培养。传至第三代时，调整细胞浓度为1×10⁵/mL，接种于6cm培养皿内用于实验。

2.实验分组及处理

细胞接种24小时后把培养孔分为空白对照组、IL-1β模型对照组和甘草多糖组。每组4皿，分别更换相应的培养液：

①空白对照组：换DMEM培养液；

②模型对照组：换DMEM培养液(含10ng/mL的IL-1β)；

③甘草多糖处理组：换DMEM培养液(含10ng/mL的IL-1β)，5min后添加100μg/mL甘草多糖；

放入孵箱中继续培养。各项检测均在72小时后进行。

3.细胞处理和流式细胞仪PI单染色法检测

0.25％(w/v，g/mL)胰酶溶液消化5min，1000r/min离心5min，弃去培养液，加入3mL PBS洗涤1次，离心去PBS，加入冰预冷的70％(v/v，g/mL)的乙醇4℃固定1.5小时。离心弃去固定液，加入3mLPBS重悬5min。400目的筛网过滤1次，1000r/min离心5min，弃去PBS。加入1mLPI染液染色，4℃避光30min。流式细胞仪(EpicsAltraII，美国Beckman Couler公司)，使用波长488nm，功率15MW，氢离子激光光源，每个样本检测前仪器均进行自动校准、细胞发出信号以直方图及数字的方式在多道脉冲0～400道显示，每次检测细胞数大于1×10⁴个。CellQest获得数据，软ModFitLT软件进行DNA含量分析。

4.实验结果

与空白对照组相比，IL-1β导致大鼠软骨细胞凋亡率明显提高，而100μg/mL甘草多糖能对抗IL-1β的影响，100μg/mL甘草多糖凋亡率甚至比空白对照组还低，结果见图3。

实施例12：甘草多糖对大鼠软骨细胞毒性和增殖的影响

1.细胞培养

用刀片削取Wistar大鼠(SPF级，由武汉大学动物实验中心提供)骨关节标本得到关节软骨片，剪成1mm³小块。用0.2％的II型胶原酶37℃水浴消化4～5小时直至成絮状。用200目不锈钢筛网过滤离心，加入全培养液重悬，获得单个软骨细胞悬液。将细胞接种于50mL培养瓶内单层培养。隔天换液。待细胞基本长满后传代培养。传至第三代时，调整细胞浓度为1×10⁵/mL，接种于96孔培养板内用于实验。

2.实验分组处理

细胞接种24小时后把培养孔分为空白对照组、GP处理组(100μg/mL)、GP-1处理组(100μg/mL)、GP-2处理组(100μg/mL)和GP-3(100μg/mL)处理组。每组10个复孔。放入孵箱中继续培养72小时。

3.MTT法测定甘草多糖对大鼠软骨细胞毒性和细胞增殖试验

每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL)，继续培养4小时。终止培养，吸去孔内培养液。每孔加入150μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。

4.实验结果

与空白对照组相比，100μg/mLGP、GP-1、GP-2和GP-3均不会导致细胞活力的降低，证明甘草多糖及其组分在该浓度下对大鼠软骨细胞没有毒性，同时GP-2能够显著促进大鼠软骨细胞的增殖，结果见图4。

Claims

1.一种从甘草中提取多糖的方法，它包括下列步骤：

A、将干燥的甘草用粉碎机粉碎成80～100目的粉末；

B、置入提取罐中，加入3～7倍g/mL石油醚60℃～90℃回流30～60min脱脂，重复此步骤两次，滤出石油醚，得到脱脂后的残渣；

C、向残渣中加入7～15倍g/mL蒸馏水100℃提取1～2小时，重复此步骤三次，合并三次提取液；

D、50℃～80℃减压1×10⁴～9×10⁴Pa浓缩提取液，使溶液体积mL为所用A步骤甘草粉末重量g的5～7倍，得到浓缩液；

E、向D步骤浓缩液中加入浓缩液3倍体积的95％v/v乙醇，静置过夜，沉淀；

F、离心得到沉淀，干燥，用Sevag法脱蛋白后，用7～15倍g/mL，无水乙醇、丙酮、乙醚各洗三次；

G、F步骤所得物质溶于水中，用截留分子量1000～10000的半透膜透析24～48小时，冷冻干燥得到甘草多糖。

2.权利要求1中所述的甘草多糖作为唯一活性组分在制备治疗或预防骨关节炎药物中的应用。