CN102046182A - 在结缔组织保护和修复中的硫酸化的不饱和二糖硫酸软骨素 - Google Patents

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Abstract

本发明一般性地涉及结缔组织的保护和修复。具体来说，本发明涉及硫酸软骨素及其衍生物在结缔组织保护和修复中的用途。本发明的发明人已发现不饱和二糖硫酸软骨素能够用于制备用来形成、保护和/或修复结缔组织的组合物。这使得其能够例如用来有效地治疗或预防骨关节炎或类风湿性关节炎和/或其症状，以及用来有效地治疗或预防皮肤老化的体征诸如皱纹的出现。

Description

在结缔组织保护和修复中的硫酸化的不饱和二糖硫酸软骨素
本发明一般性地涉及结缔组织的保护和修复。具体来说，本发明涉及硫酸软骨素及其衍生物在结缔组织保护和修复中的用途。
骨关节炎(OA)为累及老年人的最普遍的致残性慢性疾病之一。其最突出的特征为关节软骨的进行性破坏，其引起关节活动受损、重度痛，最终致残。它的高患病率和它对日常生活中度至重度的影响导致了重要的公共健康问题。已对西欧的膝关节OA患病率进行估计，60-79岁年龄之间的荷兰男性为18-25％，女性为24-40％，西班牙为28-34％。估计在欧盟国家中有1亿人口患有OA。在法国，2001年估计的OA直接成本为16.4亿欧元。在美国，2001年患有OA的人口为0.699亿。
现今，OA的治愈仍难以实现，且OA的治疗大部分为集中于缓解症状的姑息治疗。对OA治疗的当前推荐包括非药理学干预(体重减轻、教育计划、锻炼等)和药理学治疗(对乙酰氨基酚、非甾体抗炎药物-NSAIDs-等)的组合。
硫酸软骨素(CS)是治疗OA的最常用的治疗之一。硫酸软骨素经口摄入，但取决于具体的国家，其作为药物或作为食品添加物进行销售。与葡糖胺一起，据估计CS的市场规模为每年8亿美元。CS减轻骨关节炎患者的膝痛和改善膝功能的能力已在多项临床试验中得到证明，并在荟萃分析(meta-analyses)中得到证实。根据欧洲风湿病防治联合会(European League against Rheumatism)的科学建议，CS显示了对膝关节OA疗效的最高水平的证据(即，随机临床试验-RCT的荟萃分析)。在7个持续时间为3-24个月的评价CS对膝关节OA的改善症状作用的双盲、安慰剂对照的RCT中，6个得出的结论为CS在减轻自发性疼痛和增加运动性方面比安慰剂更有效[L′Hirondel JL，Litera Rheumatologica 1992，14：77-84；Bucsi L，Poor G，骨关节炎和软骨(Osteoarthritis Cartilage)1998，6增刊A：31-36；Uebelhart D等人，骨关节炎和软骨1998，6增刊A：39-46；Pavelka K等人，Litera Rheumatologica 1999，24：21-30；Bourgeois P等人，骨关节炎和软骨1998，6增刊A：25-30；Uebelhart D等人，骨关节炎和软骨2004，12：269-276]。800mg和1200mg一天一次比安慰剂或200mg剂量对疼痛和运动性更有效。在1200mg CS一天一次和400mg一天三次之间对运动性而言没有发现统计学显著性差异，两种治疗皆优于安慰剂。在一年内使用800mg一天一次的两个为期3个月的治疗通过改善运动性表明与安慰剂相比具有持续疗效。效果不是立即产生的；在患者能够检测到疼痛和运动性方面的显著性差异之前至少需要2周。在一项试验中，CS(每天1000mg)在改善功能方面并不比安慰剂更好[Mazieres B等人，JRheumatol 2001，28：173-181]。在一项双盲RCT中，400mg CS一天三次比50mg双氯芬酸一天三次在改善Lesquesne指数(疼痛和功能的验证指数)方面见效更慢，但在减轻疼痛的视觉模拟评分方面则不慢[Morreale P等人，J Rheumatol 1996，23：1385-1391]。当治疗终止后，CS的作用比双氯芬酸的作用持续时间更长。CS对膝关节OA的改善症状作用进一步得到了3项荟萃分析的支持[Leeb BF等人，J Rheumatol 2000，27：205-211；McAlindon TE等人，Jama-美国医学协会杂志(Journal of the American Medical Association)2000，283：1469-1475；Richy F等人，Arch Intern Med2003，163：1514-1522]。这些荟萃分析得出结论：CS优于安慰剂，对骨关节炎症状具有显著的作用，对OA的疼痛和功能的多项验证工具(Lesquene指数、疼痛的视觉模拟评分、运动性和反应状态的视觉模拟评分)是有效的。
除了它的改善症状作用之外，在3项试验中报告CS能够减缓OA患者的软骨破坏。这些试验使用耗时数年采用连续X-射线测定的关节间隙损失/宽度(当前用于软骨破坏的金标准替代标记)作为主要终点。在第一项为期一年、双盲、安慰剂对照的RCT中，采用X-射线测定的关节间隙宽度和关节间隙表面积的平均值和最小值在安慰剂组中显著降低，但在800mgCS组中无显著降低[Uebelhart D等人，骨关节炎和软骨2004，12：269-276]。在该试验中，在骨钙素、硫酸角质素、吡啶啉(pyridinoline)和脱氧-吡啶啉生物标记方面的变化表明CS影响骨骼和软骨的代谢。在第二项对膝盖OA进行的为期2年的双盲RCT中，800mg一天一次可预防关节间隙狭窄，而在安慰剂组中平均关节间隙损失为0.14mm[Michel BA等人，关节炎(Arthritis Rheum)2005，52：779-786]。这些结果在第3项选取了622位患者的对膝盖OA进行的为期2年的双盲RCT中得到证实(STOPP试验，即将发表)。最后，在一项小型安慰剂对照的开放试验中，800mg CS一天一次给药10天显著增加膝关节滑液中的粘度和透明质酸盐浓度同时降低胶原酶、磷脂酶A2和N-乙酰氨基葡糖苷酶的活性，进一步支持存在改善症状和改善结构的作用[Ronca F等人，骨关节炎和软骨1998，6：14-21]。CS的改善结构作用还获得了动物研究的支持。在年轻的大鼠中，在向膝关节注射缓激肽(bradikinin)之前的两周开始100和300mg/kg体重/天的6-硫酸软骨素(临床剂量的5倍和15倍)给药，减少或阻止软骨中蛋白聚糖耗竭[Omata T等人，药物研究杂志(Arzneimittelforschung)1999，49：577-581]。在年轻的兔子中，在注射木瓜凝乳蛋白酶之前11天开始20mg/kg体重/天的CS给药，并持续到注射后21天，可降低软骨破坏和蛋白聚糖损失[Uebelhart D等人，骨关节炎和软骨1998，6：6-13]。
总之，上面概述的现有技术给出如下结论：现今，硫酸软骨素为少数能够改善症状和减缓关节软骨破坏的分子之一。然而，尽管有效，但它的作用是缓慢的(即达到全面症状缓解最多需要2个月)和部分的(即患者感觉有所好转但不会感觉良好)。
因此，本发明的目的为鉴别特殊的硫酸软骨素，其与本领域中普遍已知的和应用的硫酸软骨素相比具有更优良的作用和更高的效力。因此，本发明目的在于向骨关节炎患者和患有其它结缔组织疾病的患者提供更有效的疗法。
本发明的发明人已研究了CS的糖类，并且已证明它们中极特殊的一组，即不饱和的二糖硫酸软骨素、尤其是4-硫酸化的不饱和二糖硫酸软骨素，对本发明的目的而言是特别有效的。
值得注意的是，其它已测试过的CS糖类，如任何已测试过的饱和二糖类或商品化的CS在测试试验中都不能使软骨中葡糖氨基聚糖类(GAG)的破坏降低到与本发明所要求保护的化合物相似的程度。
对于本发明的目的而言，硫酸化的不饱和二糖硫酸软骨素的这一特别高的效力为新的和出乎意料的。因此，本发明人惊讶地发现通过权利要求1中的用途可以达到本发明的目的。
本发明的一个实施方案为用于形成(developing)、保护和/或修复结缔组织的不饱和二糖硫酸软骨素。
在一些不同的软骨素二糖和一些更高分子量形式的硫酸软骨素中，4-硫酸化不饱和硫酸软骨素二糖(Δdi4S)是到目前为止在体外减缓细胞因子-诱导的软骨破坏方面最有效的化合物。硫酸化(理想情况为在N-乙酰基-半乳糖胺残基的4位)和在葡萄糖醛酸环2上的4位和5位之间的不饱和看来有益于这一显著的效力，因为在结构上密切相关的化合物不能像本发明的4-硫酸化的不饱和二糖硫酸软骨素那样减少细胞因子-诱导的软骨破坏。常规商品化的硫酸软骨素不具有任何显著的作用。
根据平行比较，在大鼠肠弯模型中，如果测试分子的分子量降低则硫酸软骨素的生物利用度增加。因此，表明4-硫酸化的不饱和硫酸软骨素二糖也比常规高分子量的硫酸软骨素的生物利用度更高。
本发明因此提供例如比常规商品化的高分子量硫酸软骨素更有效的和具有更高生物利用度形式的硫酸软骨素。
鉴于此，本发明化合物将向OA患者提供比现有技术的硫酸软骨素更高的疼痛缓解和更好的对抗软骨破坏的保护作用。该发现因此是治疗领域的重大进步，在所述治疗领域中除了修复手术外没有干预能够充分减轻骨关节炎疼痛、能够让患者感觉良好，并且其中几乎没有干预能有效减缓软骨破坏。
因此，本发明的一个实施方案为至少一种硫酸化的不饱和二糖硫酸软骨素在制备用于保护和/或修复结缔组织的组合物中的用途。另一个实施方案为至少一种硫酸化的不饱和二糖硫酸软骨素在制备用于治疗和/或预防结缔组织疾病症状的组合物中的用途。
结缔组织为传统分类中的4种组织类型之一(其它为上皮组织、肌肉组织和神经组织)。在通常情况下结缔组织为涉及结构和支撑的组织，其特征在于存在重要的细胞外有机基质。
例如，软骨为典型的结缔组织。
硫酸软骨素为硫酸化的糖胺聚糖(GAG)，由交替的糖(N-乙酰半乳糖胺和葡糖醛酸)链组成。经常发现其连接在蛋白质上作为蛋白聚糖的部分。软骨素链可以具有100个以上的个体糖。每个单糖可能为未硫酸化的、一次硫酸化的或两次硫酸化的。最常见的是，N-乙酰基-半乳糖胺的4位和6位的羟基被硫酸化。
本发明的硫酸化的不饱和二糖硫酸软骨素优选选自4-硫酸化不饱和二糖硫酸软骨素(Δdi4S)、6-硫酸化不饱和二糖硫酸软骨素(Δdi6S)和非硫酸化的不饱和二糖硫酸软骨素(Δdi0S)。
可以通过应用本发明来制备的组合物是能够用于向人或宠物施用硫酸化的不饱和二糖硫酸软骨素的任何组合物。优选地，其为药物组合物、饮料、食物产品、食品补充剂和/或营养食品。
组合物可以优选选自基于奶粉的产品；速溶饮料(instant drinks)；方便饮料制品；营养粉；基于奶的产品，特别是酸乳酪或冰淇淋；谷类制品；饼干；压缩干粮；饮料；水；咖啡；热牛奶咖啡(cappuccino)；茶；果汁；麦芽饮料；巧克力调味的饮料；烹调用制品；汤；糖果制品；巧克力；局部用乳膏剂、栓剂、片剂、糖浆剂和经皮施用的制剂。
在本发明的一方面，通过应用本发明来制备的组合物用于治疗或预防结缔组织疾病。典型的结缔组织疾病既可以是遗传性的也可以是环境因素造成的，并包括马方(Marfan)综合征、坏血病(scurvy)、Ehlers-Danlos综合征、Loeys-Dietz综合征、弹性假黄色瘤、系统性红斑狼疮、成骨不全(脆骨病)、进行性骨化性纤维发育不良、自发性气胸和/或肉瘤。
根据本发明的用途最优选治疗或预防的两种结缔组织疾病为骨关节炎和类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)。
通过应用本发明制备的组合物还可用于治疗或预防骨关节炎或类风湿性关节炎的症状，诸如例如疼痛和运动性受损。
其还可用于美容方面，例如治疗或预防皮肤老化的体征诸如皱纹的出现。
本发明的发明人还发现硫酸化的不饱和二糖硫酸软骨素特别可以用于平衡软骨细胞的合成代谢和分解代谢活性和/或减缓或停止软骨破坏，尤其是关节软骨破坏。
由于它的高的效力和生物利用度，包含硫酸化的不饱和二糖硫酸软骨素的组合物还可以用于缓解疼痛，尤其是在OA患者中。
通过应用本发明制备的组合物还可用于改善活动性，尤其是改善关节功能。
硫酸化的不饱和二糖硫酸软骨素可以单独使用或与其它化合物联合使用。通过应用本发明制备的组合物还可含有本文公开的硫酸化的不饱和二糖硫酸软骨素的组合，和/或还可含有本领域中现已知的硫酸软骨素。
组合物还可以进一步包含至少一种软骨聚集蛋白聚糖、至少一种胶原、至少一种硫酸软骨素和/或至少一种葡糖胺或其部分(fractions)。
与II型胶原一起，软骨聚集蛋白聚糖构成软骨(尤其是关节软骨)的主要结构成分。软骨聚集蛋白聚糖包含N-末端的两个球形结构域和C-末端的一个球形结构域，二者被主要用葡糖氨基聚糖类修饰的一个大型结构域分隔开。N-末端球形结构域之间的连接域(称为球间结构域)对蛋白水解高度敏感。已将这种降解与关节炎的形成相关联。能够降解软骨聚集蛋白聚糖的蛋白酶称为软骨聚集蛋白聚糖酶，它们为ADAMTS(具有凝血酶敏感蛋白模体的解聚素和金属蛋白酶)蛋白家族的成员。因此，如果通过应用本发明制备的组合物进一步包含至少一种ADAMTS抑制剂，尤其是软骨聚集蛋白聚糖酶抑制剂和/或基质金属蛋白酶抑制剂，则能够增加组合物的疗效。
依赖于根据本发明制备的组合物的预期用途，组合物可以进一步包含至少一种其它化合物，例如至少一种选自下列的化合物：疼痛解除剂(pain relieving agent)、稳定剂、矫味剂、着色剂、润滑剂、抗炎剂、血管发生抑制剂、软骨保护剂、抗骨质吸收剂和/或增加骨形成的药物。
根据本发明制备的组合物以受控方式在很长时期内缓慢释放它的活性化合物可能是需要的。通过这种方式，能够避免频繁的施用并能够实现长期效果。对于该目的，可以将组合物制备成例如持续释放制剂。可以将活性化合物例如适当地包囊，以便将它们以相应于即时需要的量缓慢释放。
组合物还可以包含载体。载体确保例如良好的给药性(dosability)和长期贮藏的可能性。本领域中任何已知的载体适用于本发明，并且它的选取将取决于组合物和其预期用途。
组合物预期用于人类或动物尤其是宠物和/或伴侣动物。对于动物，优选预期具有较长寿命的动物。本发明的组合物能够例如用来确保长时间良好的运动性。特别优选猫和狗。
根据本发明制备的组合物可以应用于任何年龄组。组合物预期用于例如婴儿、儿童、青少年、成人和/或老人。然而，因为结缔组织保护和修复更正确来讲为成人或老年人群的问题，因此这些年龄组是优选的。
结缔组织的形成可能是所有年龄组共同的问题，例如受伤后。特别是对于婴儿，结缔组织的形成例如对确保生成强壮的骨-软骨系统是非常重要的。
本发明的组合物中的硫酸化的不饱和二糖硫酸软骨素的剂量将主要取决于例如组合物的性质；待治疗的疾病；患者的年龄、尺寸大小、健康状态和性别；和/或可能同时服用的其它药物，仅列举少数例子。因此对剂量没有具体限制，任何有效剂量均适用于本发明的目的。有效剂量可以由医护人员或营养学家很容易地进行确定。
然而，一般来说，优选4-硫酸化不饱和硫酸软骨素以大约100ng-1g/g干组合物质量的量存在于组合物中，优选大约1mg-1g/g干组合物质量，甚至更优选大约200mg-1g/g干组合物质量。
关于日摄入量，如果要施用4-硫酸化不饱和硫酸软骨素，则优选日剂量为大约1ng-100mg/kg待治疗的个体体重，优选大约1mg-80mg/kg待治疗的个体体重，甚至更优选大约5mg-50mg/kg待治疗的个体体重。
硫酸化的不饱和二糖硫酸软骨素的有效剂量对于成年患者可以例如介于每天大约800mg至1200mg之间，一次性或例如在一天内分为3个单剂量给予。
对于本领域技术人员很明显的是，他们可以在不脱离公开的发明范围的情况下自由组合本文所述的本发明的所有特征。具体来说，对本发明的用途所述的所有特征都可以用于本发明的不饱和二糖硫酸软骨素。
根据下列实施例和附图，本发明的其它优点和特征将是显而易见的。
图1：Δdi4S对IL1β-诱导的GAG释放的作用。负载放射性后，将软骨外植体仅用DMEM(黄色)或仅用50ng/ml IL1β(紫色)或用IL1β和ΔDi4S(蓝色)处理72小时。代谢产物I的剂量范围为：500-50-5μg/ml。数据以释放的放射性的百分比(6个培养孔的平均值±标准差)进行表示，释放的放射性的百分比＝上清液放射性/(上清液放射性+外植体放射性)。将释放的放射性的百分比用作GAG释放的替代标记；(**：p＜0.001)。
图2：4硫酸化N-乙酰半乳糖胺(GalNAc 4S)对IL1β-诱导的GAG释放的作用。负载放射性后，将软骨外植体仅用DMEM(黄色)或仅用50ng/mlIL1β(紫色)或用IL1β和GalNac 4S(蓝色)处理72小时。GalNac 4S的剂量范围为：500-50-5μg/ml。数据以释放的放射性的百分比(6个培养孔的平均值±标准差)进行表示，释放的放射性的百分比＝上清液放射性/(上清液放射性+外植体放射性)。将释放的放射性的百分比用作GAG释放的替代标记。GalNac 4S对GAG释放无作用。
图3：Δdi4S对IL1β-诱导的NO产生的作用。将软骨外植体仅用DMEM(黄色)或仅用50ng/ml IL1β(红色)或用IL1β和ΔDi4S(蓝色)处理72小时。Δdi4S的剂量范围为：500-50-5μg/ml。数据以上清液中NO的量(uM)除以外植体中DNA的量(ng/ml)表示，(6个培养孔的平均值±标准差；**：p＜0.001)
图4：所显示的为特别优选的本发明的硫酸软骨素，即4-硫酸化不饱和二糖硫酸软骨素(Δdi4S)(C4S)、6-硫酸化不饱和二糖硫酸软骨素(Δdi6S)(C6S)和非硫酸化的不饱和二糖硫酸软骨素(Δdi0S)(C0S)
实施例：
骨关节炎是一种特征在于关节软骨缓慢破坏的疾病。这种软骨破坏是由于软骨细胞的合成代谢和分解代谢活性之间的不平衡造成的。软骨细胞是存在于软骨中的独特的细胞类型，其负责维持软骨细胞外基质。在骨关节炎中，分解代谢增加，其引起软骨流失。软骨的细胞外基质由2种主要分子组成：II型胶原和软骨聚集蛋白聚糖。而胶原主要是由基质金属蛋白酶(MMP)进行消化的，软骨聚集蛋白聚糖则能够被MMP和另一类称为软骨聚集蛋白聚糖酶的酶降解。
在此研究正常商购的硫酸软骨素和不同低分子量形式的硫酸软骨素(包括二糖类)能否在关节软骨的培养外植体中抑制软骨聚集蛋白聚糖的降解。将源自健康牛关节软骨的外植体置于培养物中，并负载S35。S35被引入到软骨的软骨聚集蛋白聚糖分子中的糖胺聚糖链上，并将它在培养基中的释放看作糖胺聚糖释放和软骨聚集蛋白聚糖分解代谢的替代标记。然而，源自健康牛关节软骨的外植体本来显示极低的分解代谢活性，因此其对于测试潜在生物活性剂的抗分解代谢活性是不太理想的。为了提高试验的敏感性，在IL1β(促炎细胞因子，已知作为MMP和软骨聚集蛋白聚糖酶活性的强效诱导剂)的存在下培养外植体。将不同的分子量形式的硫酸软骨素和IL1β一起加入到培养基中，观察它们是否可以降低IL1β-诱导的软骨聚集蛋白聚糖分解代谢。此外，还研究了低分子量形式的硫酸软骨素对IL1β-诱导的NO产生的作用。一氧化氮为已知参加骨关节炎发展的活性氧。
实验步骤：
将关节软骨外植体从老牛(8-10岁)的掌指关节解剖出来。将足上的皮肤除去。横向打开关节。横切关节内的韧带。将软骨的全厚切片解剖出来，将其置入含有补充有20％FBS(胎牛血清白蛋白)和抗生素(青霉素、链霉素和庆大霉素)的DMEM的陪替(Petri)培养皿中。在通风柜中，将相似数量的软骨分配在每孔含有500μl培养基(DMEM+20％FBS、1％青霉素/链霉素、0.1％庆大霉素)的24孔板的各孔中。最后，将板置于培养箱中(37℃/5％CO2)。
在它们收获后5天，将外植体分至5个不同的处理条件：
1-阴性对照：孔中仅含有培养基。
2-阳性刺激对照：将白细胞介素1β(IL1β)以50ng/ml的浓度加入到培养基中。这种细胞因子用来刺激分解代谢和诱导炎症。
3/4/5-测试化合物：这些条件测试在IL1β存在下三种浓度的硫酸软骨素代谢产物的作用。
外植体在培养箱(37℃，5％CO2)中进行这些处理，处理72小时。
下列方案基于Campbell等人，Arch Biochem Biophys 234(1)：275-289和Hascall VC等人，Arch Biochem Biophys 224(1)：206-223。外植体收获后48小时，将硫35(35S)加入到培养基中，以将其结合到外植体的细胞外基质内新合成的多硫酸化葡糖氨基聚糖类中。72小时后，进行数次洗涤以消除未结合的放射性。然后将外植体处理72小时，此后，收集上清液，并用β-粒子计数器测量培养基中释放的放射性的量，作为GAG分解代谢的标记。也测量了在外植体中存在的放射性，并用其来标准化释放到培养基中的放射性的量。放射性以DPM(每分钟降解)来表示，通过下面公式评估GAG释放：
GAG释放＝上清液中的放射性/(上清液中的放射性+外植体中的放射性)
对于NO的测量，使用基于Gilliam等人，Anal Biochem 212(2)：359-365的方案。简短而言，将50μl培养物上清液(SN)与等体积的磺胺溶液(在磷酸中的)在96孔板中混合。随后，将50μl萘基-乙二胺(Naphtyl-ethylene-diamine)溶液加入到各孔中。10分钟后，在538nm下测定吸收度。为了定量上清液中的NO的量，使用亚硝酸钠(0-60μM)制作标准曲线。
结果：
50ng/ml白细胞介素1β(IL1β)的刺激，使培养基中的基础GAG释放增加到1.8-4(平均值＝2.5，中位值＝2.53)倍。与单用IL1β相比，浓度为500μg/ml的ΔUA-->GalNAc 4S(ΔDi4S)在4个独立试验中显著(p＜0.05)降低上清液中的释放的GAG的量(参见图1中一个代表性试验的结果)。在结构上与Δdi4S密切相关的其它糖类在相同的浓度下没有这些作用(参见图2和表1)。
50ng/ml IL1β的刺激使培养基中NO的生成增加到2.9-190(平均值＝39.64，中位值＝24.98)倍。与单用IL1β相比，浓度为500μg/ml的ΔUA-->GalNAc 4S在4个独立试验中显著(p＜0.05)降低上清液中NO的量(参见图3，4个试验中的1个代表性实验中获得的结果)。相反，在结构上与Δdi4S密切相关的其它糖类，在相同的浓度下，对该参数无作用(数据未显示)。
表1：就糖胺聚糖释放(DPM)来讲，低分子量形式的硫酸软骨素(剂量范围：500-50-5μg/ml)抑制IL1β的刺激作用的百分比。注意负数表示IL1β刺激作用的放大。
Figure BPA00001263646400121
说明：
P值(与IL1β比较)用如下所示的单元格颜色给出：
Figure BPA00001263646400122
黑色单元格＝未进行测量

Claims (15)

1.不饱和二糖硫酸软骨素在制备用于形成、保护和/或修复结缔组织的组合物中的用途。
2.根据权利要求1的用途，其中硫酸化的不饱和二糖硫酸软骨素选自4-硫酸化不饱和二糖硫酸软骨素(Δdi4S)、6-硫酸化不饱和二糖硫酸软骨素(Δdi6S)和非硫酸化的不饱和二糖硫酸软骨素(Δdi0S)。
3.根据前述权利要求之一的用途，其中组合物为药物组合物、食物产品、饮料、食品补充剂和/或营养食品，并尤其是选自基于奶粉的产品；速溶饮料；方便饮料制品；营养粉；基于奶的产品，特别是酸乳酪或冰淇淋；谷类制品；饼干；压缩干粮；饮料；水；咖啡；热牛奶咖啡；茶；果汁；麦芽饮料；巧克力调味的饮料；烹调用制品；汤；糖果制品；巧克力；局部用乳膏剂、栓剂、片剂、糖浆剂和经皮施用的制剂。
4.用于治疗或预防结缔组织疾病的根据前述权利要求之一的用途。
5.用于治疗或预防骨关节炎或类风湿性关节炎和/或其症状的根据前述权利要求之一的用途。
6.用于治疗或预防皮肤老化体征例如皱纹的出现的根据前述权利要求之一的用途。
7.用于平衡软骨细胞的合成代谢和分解代谢活性的根据前述权利要求之一的用途。
8.用于减缓或停止软骨破坏特别是关节软骨破坏的根据前述权利要求之一的用途。
9.用于缓解疼痛的根据前述权利要求之一的用途。
10.用于改善活动性特别是改善关节功能的根据前述权利要求之一的用途。
11.根据前述权利要求之一的用途，其中组合物进一步包含软骨聚集蛋白聚糖、胶原、硫酸软骨素和/或葡糖胺或其部分。
12.根据前述权利要求之一的用途，其中组合物进一步包含软骨聚集蛋白聚糖酶抑制剂或基质金属蛋白酶抑制剂。
13.根据前述权利要求之一的用途，其中组合物进一步包含疼痛解除剂、稳定剂、矫味剂、着色剂、润滑剂、抗炎剂、血管发生抑制剂、软骨保护剂、抗骨质吸收剂和/或增加骨形成的药物。
14.根据前述权利要求之一的用途，其中组合物预期用于人类特别是婴儿、儿童、青少年、成人和/或老人，或用于宠物。
15.根据前述权利要求之一的用途，其中4-硫酸化不饱和硫酸软骨素以大约100ng-1g/g干组合物质量的量存在于组合物中，和/或以每日大约1ng-100mg/kg待治疗的个体体重的量施用。
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