CN101065420A - 产生还原剂含量低的角蛋白的方法及其产品 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及产生还原剂含量低的角蛋白的方法，包括步骤：(a)使用还原剂在水性介质中切割含有角蛋白初始材料中的二硫键(CysS－SCys)，以获得角蛋白中间产物，其中至少90％切割的二硫键具有CysS－或CysSH结构；(b)在pH 9至14之间除去多余的还原剂，获得R比率为至少10％的角蛋白水溶液或分散体，其中R＝100×([CysS－]+[CysSH])/([CysS－]+[CysSH]+2[CysS－SCys])；和(c)任选地，除去水以获得含有角蛋白的分散体、粉末或颗粒。本发明还涉及例如水溶液、分散体、粉末、颗粒的产品，以及获得的角蛋白在制备泡沫、成形物和制剂中的用途。
Description
技术领域
本发明涉及产生还原剂含量低的角蛋白的方法，含有所述角蛋白的水溶液、分散体、粉末或颗粒，及其在制备泡沫、成形物和制剂中的用途。
背景技术
羽毛是养禽业的重要废弃产物，全世界每年产生约4百万吨。尽管其少量用于衣服、隔热和寝具，并且更多的用于制备用来生产动物饲料的羽毛颗粒物，目前尚不能充分、有经济价值地应用如此大量的羽毛。出于环境因素，燃烧或掩埋羽毛并非总是可行；并且没有经济利用的大量废弃羽毛形成工业，例如养禽业的严重的处置问题。
因此，发明的普遍目标是为废弃羽毛提供经济可行的利用范围，以及提供使废弃羽毛适用于这些利用的方法。这一目标在WO 03/006531中得以实现，其公开了获得改良的基于角蛋白的产品的方法，该方法涉及角蛋白分子的部分水解与获得的游离CysSH基团的部分修饰的组合。这一部分水解和部分修饰的产物可分散于水中并且可以用于一系列的应用。获得的游离CysSH基团必须进行部分修饰以防止在除去还原剂过程中角蛋白的交联。这样的在所用条件下不可逆的过早交联影响角蛋白的进一步利用。另一方面，如果角蛋白被完全修饰，其不能再交联，并因此丧失了进一步的商业利用。如果没有应用修饰步骤，角蛋白将在除去还原剂的过程中交联(例如在透析或过滤期间)，并将随后作为也不能利用的不溶产物块沉淀。因此需要部分修饰从而在防止过早交联和另一方面防止失活之间精细平衡。此外，角蛋白的修饰是不利的，因为修饰的额外加工步骤和除去多余修饰剂的步骤严重增加了成本。
因此，非常需要经济可行的方法来制备可溶或可分散的并且有活性的含有角蛋白的材料用于溶液、分散体、粉末、颗粒等。
发明内容
现已发现，当除去步骤(例如透析或过滤步骤)在特定pH范围进行时，未修饰的角蛋白能够容易和完全地从还原剂游离而不发生干扰性的过早交联。这是非常有意义的发现，因为迄今为止认为未修饰的角蛋白不能在保持其可溶或可分散的条件下从还原剂分离。修饰程度很低以至于修饰对于角蛋白的纯化没有作用的角蛋白(例如，少于10％的游离CysS-和/或CysSH基团被修饰的角蛋白)包括在本发明的范围内。
因此，一方面，本发明涉及产生还原剂含量低的角蛋白的方法，包括步骤：
(a)使用还原剂在水性介质中切割含有角蛋白的起始材料中的二硫键，以获得角蛋白中间产物，其中至少90％的切割的二硫键具有CysS-或CysSH结构。
(b)在pH 9至14之间除去多余的还原剂，获得R比率至少为10％的角蛋白水溶液或分散体，其中R＝100×([CysS-]+[CysSH])/([CysS-]+[CysSH]+2[CysS-SCys])；和
(c)任选地，除去水以获得含有角蛋白的分散体、粉末或颗粒。
在US4135942中，实施例1的羽毛提取物在pH 11用还原剂(硫基乙醇酸钠)处理并且在离心之后用蒸馏水透析上清液。这意指多余的还原剂是在pH 7(蒸馏水)而非pH 9-14(本发明的pH范围)除去。因此获得的角蛋白并非游离的角蛋白，而是凝结成二聚物和多聚物，形成凝胶状结构。因此这样的角蛋白不满足R至少为10％的需要。
出于同样原因，Schrooyen等人，
J.Agric.Food Chem.，48，4326-4334未公开游离的角蛋白，而是凝结成二聚物和多聚物，形成凝胶状结构的角蛋白，其不满足R至少为10％的需要。
本发明的关键特征是除去多余还原剂以获得还原剂含量低的角蛋白所必需的pH条件，所述还原剂含量低的角蛋白没有干扰性的过早交联并且因此保持其反应性。本发明使用的术语“还原剂含量低的角蛋白”意指每克角蛋白中所含还原剂少于10-2摩尔，优选少于10-3摩尔，最优选少于10-4摩尔的角蛋白。
可以使用任何适当来源的角蛋白作为含有角蛋白的起始材料。具体而言，可以使用天然来源的角蛋白纤维，例如头发、羽毛、羊毛、角质鞘、趾甲、角等。优选地，使用含有至少β-角蛋白的角蛋白来源。羽毛是尤其首选的起始材料，具体地，例如作为养禽业废弃产品获得的小鸡、火鸡、鸭子、鹅或任何其它家禽的羽毛。这些角蛋白来源可以含有少量的其它蛋白质和/或其它成分，如脂肪或血，例如通常量少于总重量的5％(基于干材料，例如羽毛)。一般而言，可以容忍其它成分的存在，否则，可以在步骤(a)之前除去一些或全部的这些非角蛋白成分。优选对含有角蛋白的起始材料进行一种或更多的预处理，如清洁、洗涤、拣选、去脂、切割、粉碎、磨碎、干燥或其任意组合。这类预处理可以有利于起始材料的操作，它可以提高进一步加工步骤(如角蛋白切割)的效率，和/或可以提高基于角蛋白的终产物的质量。备选地，可以使用已经预加工的含有角蛋白的起始材料，例如羽毛颗粒物；以及已经分离的角蛋白或角蛋白纤维。无任何更多预处理地直接在步骤(a)中使用天然来源的角蛋白或角蛋白纤维，例如羽毛，也包括在本发明的范围内。
可以从本技术领域已知的任何合适的还原剂，例如硫化物、硫醇、硼氢化物和膦或其组合中选择还原剂。首选的硫化物是碱金属硫化物(例如硫化钠)和硫化铵。由于还原剂通常是有毒且难闻的物质，例如2-巯基乙醇或二硫苏糖醇，需要除去多余的还原剂。
优选获得满意的角蛋白产率的还原条件，即含有角蛋白的起始材料、还原剂以及缓冲液的浓度，和pH、温度以及持续时间，其中优选至少10％，优选至少20％，最优选至少40％的CysS-SCys键被切割(即，通常通过还原切割角蛋白分子内和分子间的二硫基)。更多优选的切割条件被详细说明如下。
水性介质中还原剂的浓度，例如碱金属硫化物或硫化铵，优选在0.05M和1.0M之间。
切割角蛋白的pH为碱性，即高于pH 7，并且优选不高于14。
然而，优选在pH至少为8，优选至少为9，和最优选至少为10的碱性pH进行切割，因为在至少为10的pH，硫化物的离解平衡向S2-移动，其为强于HS-的还原剂。
还原角蛋白的温度优选为至少20℃。
然而，优选使用更高的温度切割，例如优选温度至少为30℃，更优选约50至80℃，但是优选不高于100℃。
角蛋白切割步骤的持续时间主要选择能够在给定的切割条件下获得期望程度的二硫化物的切割。通常切割发生在10分钟至24小时之间。
因此技术人员将经验地优化角蛋白切割的条件体系以获得至少期望程度的角蛋白二硫键切割。
在本发明的方法中，优选不修饰角蛋白。因此优选至少90％，更优选至少95％，最优选至少99％，和最好100％的角蛋白切割的二硫键具有CysSH或CysS-结构。
可以水解角蛋白酰胺键至某种程度，使由切割和部分水解角蛋白产生的基于角蛋白的产物具有需要的物理和化学特性。水解意指角蛋白分子中肽键的切割。因此，经切割和部分水解的角蛋白分子量的分布可以定义如下。经切割和任选地部分水解的角蛋白优选其主要分子量在1和11千道尔顿之间，特别是在3和10.4千道尔顿之间，此处“主要”被理解为意指存在于部分水解的角蛋白部分中的至少50％，优选至少90％，更优选至少95％，和最优选至少99％的角蛋白分子具有所示范围内的分子量(如在WO03/006531中确定的分子量)。
必须从尽可能多的还原剂中游离出由此获得的角蛋白中间产物，通常二价硫离子来自还原剂。为此使混合物经过除去步骤，例如沉淀和离心，或透析或过滤(如超滤或纳米过滤)从还原剂分离角蛋白，以获得优选地每克角蛋白含有少于10-2摩尔还原剂的角蛋白。优选地，每克角蛋白含有少于10-3摩尔还原剂，最优选少于10-4摩尔还原剂，和如果可能，完全不含有还原剂。
这一除去步骤，特别是透析或过滤步骤，必须在pH 9至14，优选在10和13之间，和最优选在10和12.5之间的狭窄pH范围内进行。
透析方法如在C.M.Mohr等人；
Membrane applications and research in food processing；Noyes Data Corporation，New Jersey，USA手册中所述。
过滤方法包括纳米过滤和超滤，如在C.M.Mohr等人；
Membrane applications and research in food processing；Noyes Data Corporation，New Jersey，USA手册中所述。
由此获得的角蛋白是可溶或可分散的并且有活性。因而能够在水溶液或分散体中获得角蛋白。同时，角蛋白仍然是有活性的，含有游离的CysSH和/或CysS-基团，使角蛋白在需要时能够交联。将这一反应性表示为比率R，其中R代表系数100×([CysS-]+[CysSH])/([CysS-]+[CysSH]+2[CysS-SCys])。R为至少10％，优选至少20％，和最优选至少40％。
在本发明任选的方面，可以使切割的角蛋白经过更多加工步骤，其可以包括修饰、交联、进一步纯化，例如从获得的角蛋白产物中除去不期望的成分和/或物质。这些可以例如包括剩余的角蛋白起始材料、较高分子量的角蛋白组分、较低分子量的角蛋白组分、反应剂和/或来自任何加工步骤的副产物，和/或其它杂质或不期望的组分。除去这些组分或物质的合适的技术包括，例如洗涤、沉淀、透析、过滤和离心。
同样地，由使用目的决定，可以将角蛋白产物与一种或更多其它物质、添加物、组分等组合或混合。其非限制性的一些实例包括色素、盐、抗微生物剂、去污剂和增塑剂。
应该清楚的是还可以由最终使用者进行任何这类进一步的加工和/或添加其它组分；并且这也被包括在本发明的范围内。
根据本发明的组合物通常是水溶液或角蛋白分散体的形式。这类溶液或分散体优选每升含有至少10g的角蛋白，和优选每升多于50g的角蛋白。通常这类溶液或分散体每升将含有约100g的角蛋白或更多。这些溶液和分散体在化学和物理意义上稳定。因此，从化学意义上，在贮存期间不发生干扰性(进一步的)交联。为了稳定本发明的溶液或分散体，可以使用本技术领域已知的添加剂。为了长期贮存或更加方便的运输，本发明的组合物可以是固体形式，优选为可分散的粉末或颗粒形式。可以使用常用的干燥和/或制粒技术，包括使用添加剂帮助形成固体形式。
本发明另一方面涉及使用本发明还原剂含量低的角蛋白作为角蛋白来源产生基于角蛋白的产品的方法。首选通过铸型本发明还原剂含量低的角蛋白溶液或分散体产生基于角蛋白的产品。
在优选的实施方案中，基于角蛋白的产物是由本发明还原剂含量低的角蛋白溶液或分散体铸型的薄膜或包衣。基于角蛋白的产品也可以用于制备泡沫或用于纺纱纤维的纺纱涂料。
本发明的角蛋白可以用于本技术领域已知的基于角蛋白产品的任何应用，包括在以上给出的现有技术中提到的那些应用。一般而言，在这些应用中，本发明的角蛋白衍生的产品提供有利的特性，包括但不限于提高的机械特性如机械稳定性；提高的物理和化学稳定性；和良好的薄膜形成特性。因此，本发明的角蛋白的一些非限制性使用包括用于薄膜、纤维、包衣等，或其制备中；用于(生物可降解)包装材料，或其产生中；用于例如控释系统(如用于活性物质，例如药物)、农用化学品(例如除草剂、杀虫剂或其它杀生物剂)、调味剂、香料等制剂中；用于形成乳剂、分散体或其它多相体系中；用于填充剂、胶凝剂、粘合剂、膨胀剂、制粒剂、释放剂(releaseagent)、基质材料、乳化剂、稳定剂或其它制剂；用作抗氧化剂；用作抗微生物剂等等。
同样地，本发明的角蛋白可以例如广泛地应用于食品或食品技术领域；药物和兽医产品；化妆品；农用化学品领域；粘合剂；涂料或其它包衣；包装材料；清洁剂如去污剂；农业中。设想的本发明角蛋白一些具体用途包括，但不限于用作颗粒、粉末等(例如洗衣粉或其它去污剂)的包衣或粘合剂；用于普通目的、工业以及家庭用途的粘合剂；用作木材、纸、卡纸或模制纤维的粘合剂；用作包衣中的粘合剂，包括但不限于同时用于工业和家庭使用的水性涂料体系和/或墨水性体系；用作抗氧化剂；用于形成胶囊和/或包衣技术；在例如动物饲料和化妆品中用作抗微生物剂。
附图说明
通过下列图和实施例进一步说明本发明。
图1：显示角蛋白的反应性。
图2：显示角蛋白样品的SDS琼脂糖特性。
图1给出渗滤过程中角蛋白反应性的确定结果。在渗滤过程的不同阶段(其与多种游离硫化物水平相关)采集样品并确定角蛋白中CysS-SCys电桥和游离CysSH基团的水平。还显示在渗滤不同阶段的R值(使用公式R＝100×([CysS-]+[CysSH])/([CysS-]+[CysSH]+2[CysS-SCys])。该图显示在渗滤过程中游离半胱氨酸水平和CysS-SCys二硫电桥水平变化不大，意指在这一过程中保持角蛋白反应性。
图2显示在溶解过程和随后的渗滤过程中不同阶段的角蛋白样品的SDS-琼脂糖凝胶。1：小鸡羽毛溶解后的角蛋白(100mM硫化物)；2：角蛋白(1)对pH 10的水透析之后；3：在50mM硫化物中渗滤后的角蛋白；4：在25mM硫化物中渗滤后的角蛋白；5：在1mM硫化物中渗滤后的角蛋白。
实施例：
实施例1：
将小鸡羽毛(40g/l)置于100mM Na2S中60℃，pH 11.5溶解1小时。溶解之后，使用截断值为5千道尔顿的膜超滤角蛋白混合物。在超滤过程中，使用pH 10-11的水渗滤角蛋白溶液。在超滤过程的不同点采集样品以确定角蛋白的反应性。其通过确定CysS-SCys电桥的量和游离CysSH基团的量完成(图1)。
如在P.Schrooyen，
Feather keratins；modification and film formation，thesis University of Twente(1999)，29页所述，使用NTSB测定法测量CysS-SCys电桥的含量并且使用DTNB(Ellman’s reagens)测定法确定CysSH基团的含量。本实施例表明在渗滤过程中角蛋白的反应性保持恒定因而未发生活性丧失。
实施例2：
在溶解和渗滤过程中应该防止角蛋白过早交联。因此，将小鸡羽毛(40g/l)置于100mM Na2S中，60℃，pH 11.5溶解1小时。溶解之后，使用截断值为5千道尔顿的膜超滤角蛋白混合物。在超滤过程中，使用pH 10-11的水，用截断值为5千道尔顿的超滤膜渗滤角蛋白溶液。在不同时间点采集角蛋白样品并如A.C.Alting等人，
J.Agric.Food Chem.，48，5001-5007(2000)所述，使用SDS琼脂糖凝胶电泳技术测量交联(大量共价聚合的发生)。图2中显示了本实验结果。
从这些结果可以断定，在渗滤过程中没有发生显著的交联。
实施例3：
将小鸡羽毛(420克)置于10.5升体积的100mM Na2S中于60℃，pH11.5溶解。溶解1小时后，对角蛋白混合物使用超滤膜(截断值为2千道尔顿)，用pH 11.5的水渗滤(700％)除去多余的硫化物。渗滤的角蛋白溶液浓缩为3升体积(7.6％角蛋白w/w)。随后将这一最终角蛋白浓缩液冻干并获得219克角蛋白干粉。
Claims (10)
1.产生还原剂含量低的角蛋白的方法，包括步骤：
(a)使用还原剂在水性介质中切割含有角蛋白的起始材料中的二硫键，以获得角蛋白中间产物，其中至少90％的切割的二硫键具有CysS-或CysSH结构；
(b)在pH9至14之间除去多余的还原剂以获得具有比率R为至少10％的角蛋白水溶液或分散体，其中R＝100×([CysS-]+[CysSH])/([CysS-]+[CysSH]+2[CysS-SCys])；和
(c)任选地，除去水以获得含有角蛋白的分散体、粉末或颗粒。
2.根据权利要求1的方法，其中在pH10至13之间，优选在pH10至12.5之间进行步骤(b)。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述还原剂包括无机碱和选自金属硫化物和硫化铵的硫化物。
4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中所述无机碱选自钠、钾或铵的氢氧化物、碳酸盐和碳酸氢盐。
5.根据权利要求4的方法，其中所述无机碱是氢氧化钠。
6.根据权利要求1-5中任一项的方法，其中所述硫化物是硫化铵或碱性硫化物，优选硫化钠。
7.根据权利要求1-6中任一项的方法，其中通过透析或过滤，优选通过超滤除去多余的还原剂。
8.包含至少10g/l角蛋白的水溶液或分散体，或包含角蛋白的固体粉末或颗粒，所述角蛋白具有至少为10％的比率R，其中R＝100×([CysS-]+[CysSH])/([CysS-]+[CysSH]+2[CysS-SCys])并且每克角蛋白含有少于10-2摩尔的还原剂。
9.权利要求8的水溶液或分散体、或粉末或颗粒在制备如下物质中的用途：泡沫或成形物，包括薄膜、包衣；生物可降解的包装材料；以及纤维；或活性物质控释系统制剂；形成乳化剂；形成分散体或多相水性体系；或用于填充剂、胶凝剂、粘合剂、膨胀剂、制粒剂、释放剂、基质材料、乳化剂、稳定剂、抗氧化剂或抗微生物剂。
10.权利要求1-7中任一项方法在制备纯的未修饰角蛋白中的用途。
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