CN113307860A - 基于生物酶解作用从制革回收牛毛中提取角蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于生物酶解作用从制革回收牛毛中提取角蛋白的方法，该方法以保毛脱毛废牛毛为原料，使用表面活性剂进行脱脂；用双氧水在pH 7~10条件下对牛毛进行预处理去除鳞片层以利于生物酶的传质过程，并加入过氧化氢酶去除体系中残留的双氧水；然后向体系中加入适量生物酶，在50~60℃温度下水浴搅拌水解6~10 h，过滤并收集相应的水解液；将两步水解液分别干燥后得到牛毛角蛋白。该方法提取牛毛角蛋白水解率＞94%，由于双氧水的脱色作用得到的角蛋白粉末颜色较浅，无中性盐二次污染，不需要提纯即可以得到纯度较高的角蛋白，便于产物后续资源化利用。
Description
技术领域
本发明属于制革废弃物资源利用技术领域，特别是涉及基于生物酶解作用从制革回收牛毛中提取角蛋白的方法。
背景技术
在制革业中，由于保毛脱毛法可以有效减少废水中的悬浮物和有机物，降低BOD和COD，因此成为当前制革业清洁生产主要的脱毛方法。制革业通过加工农民和肉类工业产生的副产品，为减少污染做出了贡献，估计价值为10.53亿美元。全世界范围内，每年牛皮和羊皮加工产生的废物中含有约20万吨牛毛和5.6万吨羊毛。我国是制革和皮革需求大国，废牛毛在制革固废中占有相当比重，保毛脱毛回收牛毛的毛干基本完整，如果不能有效回收利用，必然会给环境带来很大负担。
牛毛较羊毛相比短小而柔韧，难以应用于毛纺业，但蛋白质含量丰富，含有大量角蛋白，是一种天然的蛋白质资源，因此提取牛毛角蛋白是解决资源短缺和利用资源的重要手段。对角蛋白、角蛋白纤维和结构的研究大约始于80年以前。毛发、鬃毛和羊毛等角质材料，主要由α-角蛋白(50~60%)、位于中间纤维周围的细胞间质蛋白 (20~30%)和少量β-角蛋白组成。角蛋白分子内胱氨酸含量占氨基酸残基的7~20%，胱氨酸含有大量二硫键，使肤链内部和肽链之间发生交联，加上氢键、离子键等弱相互作用形成三维网状结构，这是天然角蛋白难以溶解的主要原因。角蛋白的胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸和丝氨酸含量高，但赖氨酸、组氨酸和蛋氨酸含量低，还有极少量色氨酸。角蛋白降解主要包括两个步骤： 二硫键断裂和蛋白质水解。
提取角蛋白常用的方法主要有机械法、酸法、碱法、氧化法、还原法、酶法、微波辐射法、金属盐法、铜氨溶液法等。机械法中的高温高压处理会使毛的结构更加松散，显著破坏胱氨酸、赖氨酸、精氨酸等氨基酸的结构，而水解率普遍不高，且能耗高。酸法常用盐酸、硫酸，主要破坏盐键(碱性基团)，较高浓度的酸才能水解角蛋白。碱法采用氢氧化钠等强碱溶液，既可破坏二硫键、盐键，也会破坏肽键。碱法对这些键的破坏可导致在处理过程中形成碱性硫化物的气味，酸碱法的生产过程中有大量的碱性废水和废酸气体产生，对人体和环境有害，还会在后续中和处理中产生大量盐分。还原法中效果较好的巯基乙醇存在价格昂贵、有毒有害的缺点，硫化钠是一种廉价的巯基乙醇替代品，形成的半胱氨酸（R–S–H）和半胱氨酸磺酸盐（R–S–S–O3H）是角蛋白的稳定位点。一般认为，巯基化合物作为还原剂比金属硫化物更有效，但两者都需要使用大量尿素作为蛋白质变性剂。且上述处理方法都存在牛毛水解液中色素无法去除的情况。氧化法所使用的氧化剂一般为过甲酸、过氧乙酸、过氧化氢等强氧化剂。羊毛和其它富含角蛋白的材料在不同的pH值下用氧化剂处理时，磺酸盐一般都是主要的氧化产物，水解率较高，产物水溶性较好。这些方法单一使用对毛发水解和角蛋白的提取不够彻底，考虑到每种方法的优缺点，并为了寻找一种有效的、生态友好的毛发水解方法，几种手段结合的方法一直被研究者广泛关注。
酶法是一种环境友好的方法，主要使肽键断裂，破坏蛋白主链结构。酶作为一种绿色环保的催化剂，与化学品相比具有较低的热能成本和相对温和的处理条件，不会产生有害的副产物，且能够较好的保护氨基酸。一般的蛋白酶（如胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶）都不能作用于双硫键破坏牛毛，只有当牛毛双硫键被打开后，牛毛结构更加松散，酶的作用才能更好发挥出来。角蛋白酶是一种具有角蛋白酶解活性的蛋白酶，一般由真菌和细菌产出，具有广泛的底物选择性，可分解角蛋白，将其转化为可溶性蛋白质、多肽和氨基酸，但有文献报道会在脱离产酶菌体存在的环境后降解作用减弱。
与化学提取法相比，生物酶解作用是一种比较温和的作用方式，且提取过程环境友好，不腐蚀设备，且不会产生大量的中性盐污染。为此，本申请提供基于生物酶解作用从制革回收牛毛中提取角蛋白的方法。据作者目前调研，有关基于生物酶解作用从牛毛中提取角蛋白的方法还未见文献报道。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了基于生物酶解作用从制革回收牛毛中提取角蛋白的方法。采用氧化法与酶法结合，双氧水进行第一步水解，将二硫键氧化为磺酸盐基团，破坏牛毛二硫键和漂白脱色，反应结束后的副产物为水，酶法进行第二步水解，在温和的条件下充分水解，水解液过滤、冻干、研磨得到牛毛角蛋白粉末，不需要提纯即可以得到纯度较高的角蛋白，以解决制革领域保毛脱毛废牛毛缺少优良环保利用技术的问题。
为实现上述技术问题，本发明提供的基于生物酶解作用从制革回收牛毛中提取角蛋白的方法，该方法中所涉及到的百分数均为质量分数，其特征在于，包括如下步骤：
(1)按重量份计，取1份废牛毛，于室温下加入5份质量浓度为0.5~1%的表面活性剂震荡浸泡2h，水洗4~6次，挤出水分，然后在40~60℃鼓风干燥箱中烘干；
(2)按重量份计，取步骤(1)处理过的牛毛1份置于反应器中，加入4~7%过氧化氢，调节pH 7~10，在70~85℃温度下水浴低速搅拌水解2~4 h，并加入适量过氧化氢酶去除体系中的双氧水，经400目滤布抽滤并收集水解液，回收预处理后的牛毛并在40~60℃鼓风干燥箱中烘干；
(3)按重量份计，取步骤(2)处理过的牛毛置于反应器中，加入20~30份缓冲液，0.01~0.2份蛋白酶，在50~60℃温度下水浴搅拌水解6~10 h，升温85℃持续15min使酶失活，经400目滤布抽滤并收集水解液，保留滤渣；
(4)将步骤(2)和 (3)中收集的水解液干燥后研磨得到牛毛角蛋白粉末。
步骤(1)所述的表面活性剂为月桂醇聚氧乙烯醚、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠、十二烷基硫酸钠、十二醇硫酸钠、十二烷基磺酸钠中的一种或几种的混合物。
步骤(3)所述的缓冲液为pH 8~10的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。
步骤(3)所述的蛋白酶为中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、角蛋白酶中的一种。
步骤(3)所述的蛋白酶为丝氨酸蛋白酶、木瓜蛋白酶、角蛋白酶中的一种。
本方法所制得的牛毛角蛋白指标：牛毛角蛋白水解率＞94%，外观为浅黄色，产物的分子量约3000-5000Da。
具体实施方式
下面通过具体实施例来详细说明本发明的实施方式，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容做出一些非本质的改进和调整。本发明中所使用的牛毛为兴业皮革科技股份有限公司制革脱毛所产生的废牛毛，所用试剂均为通过商业途径可以购买到的常用试剂。
实施例1
(1)取100g废牛毛，于室温下加入500g浓度为0.5%的十二醇硫酸钠震荡浸泡2h，水洗5次，挤出水分，然后在45℃烘箱中烘干；
(2)取步骤(1)处理过的牛毛2g置于反应器中，加入30%过氧化氢6g ，20g去离子水，调节pH 7.5，在85℃温度下水浴低速搅拌水解3h，加入适量过氧化氢酶去除残留的双氧水，经400目滤布抽滤并收集水解液，回收剩余牛毛并烘干；
(3)取步骤(2)处理过的牛毛置于反应器中，加入pH 10的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液20g，0.1g木瓜蛋白酶，在50℃温度下水浴搅拌水解6h，升温85℃持续15min使酶失活，经400目滤布抽滤并收集滤液，保留滤渣并烘干，得到两步水解率共94.6%；
(4)将步骤(2)和 (3)中收集的水解液干燥后研磨得到牛毛角蛋白粉末，外观呈淡黄色。
实施例2
(1)取100g废牛毛，于室温下加入500g浓度为0.5%的十二醇硫酸钠震荡浸泡2h，水洗5次，挤出水分，然后在45℃烘箱中烘干；
(2)取步骤(1)处理过的牛毛2g置于反应器中，加入30%过氧化氢4g，20g去离子水，调节pH 7.5，在85℃温度下水浴低速搅拌水解3h，加入适量过氧化氢酶去除残留的双氧水，经400目滤布抽滤并收集水解液，回收剩余牛毛并烘干；
(3)取步骤(2)处理过的牛毛置于反应器中，加入pH 10的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液30g，0.1g 木瓜蛋白酶，在50℃温度下水浴搅拌水解6h，升温85℃持续15min使酶失活，经400目滤布抽滤并收集水解液，保留滤渣并烘干，得到两步水解率共98.2%；
(4)将步骤(2)和 (3)中收集的水解液干燥后研磨得到牛毛角蛋白粉末，外观呈淡黄色。
实施例3
(1)取100g废牛毛，于室温下加入500g浓度为1%的十二烷基硫酸钠震荡浸泡2h。水洗5次，挤出水分，然后在45℃烘箱中烘干；
(2)取步骤(1)处理过的牛毛2g置于反应器中，加入30%过氧化氢6g，20g去离子水，调节pH 7.5，在80℃温度下水浴低速搅拌水解4h，加入适量过氧化氢酶去除残留的双氧水，经400目滤布抽滤并收集水解液，回收剩余牛毛并烘干；
(3) 取步骤(2)处理过的牛毛置于反应器中，加入pH 10的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液25g，0.1g角蛋白酶，在50℃温度下水浴搅拌水解8h，升温85℃持续15min使酶失活，经400目滤布抽滤并收集水解液，保留滤渣并烘干，得到两步水解率共95.0%；
(4)将步骤(2)和 (3)中收集的水解液干燥后研磨得到牛毛角蛋白粉末，外观呈淡黄色。
实施例4
(1)取100g废牛毛，于室温下加入500g浓度为1%的十二醇硫酸钠震荡浸泡2h。水洗5次，挤出水分，然后在45℃烘箱中烘干；
(2)取步骤(1)处理过的牛毛2g置于反应器中，加入30%过氧化氢4g，20g去离子水，调节pH 7.5，在85℃温度下水浴低速搅拌水解3h，加入适量过氧化氢酶去除残留的双氧水，经400目滤布抽滤并收集水解液，回收剩余牛毛并烘干；
(3)取步骤(2)处理过的牛毛置于反应器中，加入pH 10的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液30g，0.1g 角蛋白酶，在60℃温度下水浴搅拌水解10h，升温85℃持续15min使酶失活，经400目滤布抽滤并收集水解液，保留滤渣并烘干，得到两步水解率共97.0%；
(4)将步骤(2)和 (3)中收集的水解液干燥后研磨得到牛毛角蛋白粉末，外观呈淡黄色。
Claims (5)
1.基于生物酶解作用从制革回收牛毛中提取角蛋白的方法，该方法中所涉及到的百分数均为质量分数，其特征在于，包括如下步骤：
(1)按重量份计，取1份废牛毛，于室温下加入5份质量浓度为0.5~1%的表面活性剂震荡浸泡2h，水洗4~6次，挤出水分，然后在40~60℃鼓风干燥箱中烘干；
(2)按重量份计，取步骤(1)处理过的牛毛1份置于反应器中，加入4~7%过氧化氢，调节pH 7~10，在70~85℃温度下水浴低速搅拌水解2~4 h，并加入适量过氧化氢酶去除体系中的双氧水，经400目滤布抽滤并收集水解液，回收预处理后的牛毛并在40~60℃鼓风干燥箱中烘干；
(3)按重量份计，取步骤(2)处理过的牛毛置于反应器中，加入20~30份缓冲液，0.01~0.2份蛋白酶，在50~60℃温度下水浴搅拌水解6~10 h，升温85℃持续15min使酶失活，经400目滤布抽滤并收集水解液，保留滤渣；
(4)将步骤(2)和 (3)中收集的水解液干燥后研磨得到牛毛角蛋白粉末。
2.据权利要求1所述的基于生物酶解作用从制革回收牛毛中提取角蛋白的方法，其特征在于，步骤(1)所述的表面活性剂为月桂醇聚氧乙烯醚、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠、十二烷基硫酸钠、十二醇硫酸钠、十二烷基磺酸钠中的一种或几种的混合物。
3.根据权利要求1所述的基于生物酶解作用从制革回收牛毛中提取角蛋白的方法，其特征在于，步骤(3)所述的缓冲液为pH 8~10的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。
4.根据权利要求1所述的基于生物酶解作用从制革回收牛毛中提取角蛋白的方法，其特征在于，步骤(3)所述的蛋白酶为中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、角蛋白酶中的一种。
5.根据权利要求1所述的基于生物酶解作用从制革回收牛毛中提取角蛋白的方法，其特征在于，所制得的牛毛角蛋白指标：牛毛角蛋白水解率＞94%，外观为浅黄色，产物的分子量约3000-5000 Da。
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