KR20150038588A - 방법 - Google Patents

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정홍 장
로잘린 라우
제용 유
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Abstract

본 발명은 SEQ ID No.1, SEQ ID No.2 또는 SEQ ID No.8 에서 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 자일라나아제, 및 SEQ ID No.3, SEQ ID No.4 또는 SEQ ID No.5 에서 나타낸 바와 같은 상기 자일라나아제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 본 발명은 또한 옥수수 또는 옥수수 부산물 또는 이의 조합을 포함하는 식물 조성물을 상기 자일라나아제와 접촉시키는 것을 포함하는, 옥수수 기재 생성물의 제조 방법을 제공한다.

Description

방법 {METHOD}
본 발명은 사용시 대상의 성능을 향상시키거나 소화율 (예를 들어 영양분 소화율) 을 향상시키거나 대상에서의 사료 효율성을 향상시킬 수 있는 사료 생성물 및/또는 사료 첨가제 조성물의 제조에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 옥수수 및 옥수수 부산물에서의 펜토산 가용화에 있어서 예기치 않게 양호한 활성을 갖는 자일라나아제의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 예를 들어 동물 사료 및 양조 및 맥아 제조에서의 자일라나아제의 용도에 관한 것이다.
수년 간, 엔도-β-1,4-자일라나아제 (EC 3.2.1.8) (본원에서 자일라나아제로서 언급됨) 는 식물 세포벽 물질로부터 유래된 복합 탄수화물의 개질을 위해 사용되었다. (상이한 미생물 또는 식물로부터 유래된) 상이한 자일라나아제의 기능성이 매우 상이하다는 것이 당업계에 잘 알려져 있다. 자일라나아제는 선형 다당류 베타-1,4-자일란을 자일로올리고당 또는 자일로오스로 분해하여, 따라서 식물 세포벽의 주 성분 중 하나인 헤미셀룰로오스를 붕괴시키는 효소 계열에 제시된 명칭이다.
자일라나아제의 기능성을 특징화하는 포괄적인 연구가 잘 특징분석되고 순수한 기질에 수행되었다 (Kormelink et al., 1992 Characterisation and mode of action of xylanases and some accessory enzymes. Ph.D. Thesis, Agricultural University Wageningen, Holland (175 pp., English and Dutch summaries)). 상기 연구는 상이한 자일라나아제가 아라비노자일란 (AX) 의 자일로오스 백본의 치환에 대해 상이한 특정 요건을 갖는다는 것을 보여준다. 일부 자일라나아제는 자일로오스 백본을 가수분해하기 위해 3 개의 미-치환된 자일로오스 잔기를 필요로 하고; 다른 것은 오직 1 또는 2 개만을 필요로 한다. 특이성의 상기 차이에 대한 이유는 촉매성 도메인 내의 3 차원 구조로 인한 것으로 여겨지고, 이것은 차례로 자일라나아제의 일차 구조, 즉, 아미노산 서열에 의존한다. 그러나, 아미노산 서열 내 상기 차이의 자일라나아제의 기능성의 차이로의 번역은, 지금까지 자일라나아제가 복합 환경에서, 예컨대 식물 물질에서, 예를 들어, 사료에서 작용하는 경우에 대한 문서화되지 않았다.
식물 물질에서, 예를 들어 밀에서의 자일라나아제 기질은 전통적으로 2 개 분획물로 나뉜다: 수 비-추출성 AX (WU-AX) 및 수-추출성 AX (WE-AX). AX 의 2 개의 상이한 분획물이 존재하는 이유에 대해서는 수많은 설명이 있다.
오래된 문헌 (D'Appolonia and MacArthur - (1976, Cereal Chem. 53. 711-718) 및 문헌 Montgomery 와 Smith (1955, J. Am. Chem. Soc. 77. 3325-332) 에서는 WE-AX 와 WU-AX 사이의 치환도의 꽤 큰 차이를 기술한다. 가장 큰 치환도는 WE-AX 에서 발견되었다. 이것이 AX 중 일부가 추출성이었는지의 이유를 설명하는데 사용되었다. 높은 치환도는, 낮은 치환도와 비교하여 중합체를 가용성으로 만들고, 이것은 중합체 사이에 수소 결합 및 따라서 침전을 야기할 것이다.
상이한 자일라나아제의 기능성 사이의 차이는 자일라나아제 특이성 및 따라서, WU-AX 또는 WE-AX 기질에 대한 이들의 선호도의 차이로 인한 것으로 생각된다.
자일라나아제 효소가 식물, 진균 및 박테리아를 포함하는 거의 100 개의 상이한 유기체로부터 보고되었다. 자일라나아제 효소는 글리코실 히드롤라아제 효소의 40 개 초과의 계열 중 여러 개로 분류된다. 자일라나아제, 만난나아제, 아밀라아제, β-글루카나아제, 셀룰라아제, 및 기타 카르보히드라아제를 포함하는 글리코실 히드롤라아제 효소는 아미노산의 서열, 그들의 3 차원 구조 및 그들의 촉매 부위의 기하학적 구조와 같은 그러한 특성에 근거하여 분류된다 (Gilkes, et al., 1991, Microbiol. Reviews 55: 303-315).
도면의 간단한 설명
도 1 은 본 발명의 자일라나아제 (FoxXyn6) 의 폴리펩티드 서열 (SEQ ID No. 1) 을 제시한다. 이는 프리 (pre)-단백질이다. 서열의 밑줄쳐진 (소문자) 부분은 효소가 성숙되기 전에 N-말단 신호 펩티드가 분할될 수 있다는 것을 반영한다. 서열의 굵은 글씨체 부분은 효소가 성숙되기 전에 절단될 수 있는 N 말단 신호 펩티드를 반영한다.
도 2 는 본 발명의 자일라나아제 (FoxXyn6) 의 폴리펩티드 서열 (SEQ ID No. 2) 을 제시한다. 이는 효소의 활성 형태이다. 이는 본원에서 효소의 성숙 형태로서 지칭될 수 있다.
도 3 은 본 발명의 자일라나아제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID No. 3) 을 제시한다. 굵은 글씨체인 소문자 뉴클레오티드는 인트론 서열을 보여준다. 신호 서열은 굵은 글씨체 (대문자) 로 제시된다.
도 4 는 본 발명의 자일라나아제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID No. 4) 을 제시한다. 신호 서열은 굵은 글씨체 (대문자) 로 제시된다.
도 5 는 본 발명의 자일라나아제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID No. 5) 을 제시한다.
도 6 은 FoxXyn6 자일라나아제의 폴리펩티드 서열 (SEQ ID No. 8) 을 제시한다. 이는 또한 Kexll N-말단 처리로부터 발생할 수 있는 효소의 활성 형태이다.
도 7 은 자동화된 플로로글루시놀 방법에 의한 펜토산의 측정을 위한 자동-분석기의 도식을 제시한다: (a) HCl 과 혼합된 아세트산; (b) 공기 버블링; (c) 에탄올 중의 플로로글루시놀; (d) 샘플; (e) 샘플 가속장치; (f) 흐름 세포 출구; (g) 연동 펌프; (h) 유리 코일; (i) 온도조절장치 (96℃); (j) 복합 파장 분광광도계 (410, 510, 550, 및 620 nm); (k) 폐기물; (l) 컴퓨터 (Rouau & Surget, 1994 Carbohydrate Polymers, 24, 123-32).
도 8 은 자일라나아제 투여량의 함수로서 밀기울로부터의 펜토산 (C-5 당) 배출 (펜토산의 가용화) 을 제시한다. 사용된 자일라나아제는 기준 (benchmark) 자일라나아제 Econase® XT 와 비교된 본 발명의 자일라나아제 (FoxXyn6) 였다.
도 9 는 자일라나아제 투여량의 함수로서 cDDGS 로부터 펜토산의 가용화를 제시한다. 사용된 자일라나아제는 기준 자일라나아제 Econase® XT 와 비교된 본 발명의 자일라나아제 (FoxXyn6) 였다.
도 10 은 의 pZZH139 의 의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 11 은 본 발명의 자일라나아제 (FoxXyn6) 의 pH 프로파일을 제시한다. 효소는 약 pH 6 에서 pH 최적점을 갖는 것으로 발견되었으며, pH 4.5 내지 6.9 에서 최대 활성의 70% 초과를 유지하는 것으로 발견되었다.
도 12 는 본 발명의 자일라나아제 (FoxXyn6) 의 온도 프로파일을 제시한다. 효소는 60℃ 의 온도 최적점을 갖는 것으로 발견되었으며, 48℃ 내지 65℃ 에서 최대 활성의 70% 초과를 유지하는 것으로 발견되었다.
발명의 개요
본 발명의 중대한 발견은 푸사리움 옥시스포룸 (Fusarium oxysporum) 으로부터 단리된 특정한 자일라나아제이며, 이는 식물 생성물, 예컨대 옥수수 및 옥수수 부산물에서의 아라비노자일란 (예를 들어 펜토산) 의 가용화에 있어서 놀랍게도 양호하다. 특히 상기 효소는 옥수수 기재 기질 및 밀 기재 기질을 포함하는 다양한 범위의 기질에서 아라비노자일란과 같은 특정 자일란-함유 물질에서의 펜토산 가용화에 있어서 특히 양호하다.
특히 자일라나아제 효소는 불용성 아라비노자일란 (AXinsol) 을 붕괴 (가용화) 시키는데 있어서 예기치 않게 양호하다. 놀랍게도 효소는 옥수수, 밀, DDGS 등, 특히 옥수수 및 옥수수 기재 기질, 특히 밀 (밀-기재 포함) 생성물 및 옥수수 (옥수수-기재 포함) 생성물 모두를 포함하는 광범위한 기질로부터 AXinsol 를 효율적으로 붕괴 (가용화) 시키는 것으로 발견되었다. 이는 옥수수 또는 옥수수-기재 기질에서 AXinsol 를 가용화시키는 것이 종종 열등하거나 밀- 및 옥수수-기재 기질 모두에서 효율적이지 않은 종래에 공지된 효소와는 대조되는 것이다.
또한, 본 발명의 효소는 특히 AXinsol 를 붕괴 (가용화) 시킬 뿐 아니라, 또한 가용화된 중합체를 효율적으로 붕괴 (또는 분해) 하는데 있어서 특히 양호하다.
이론에 구애됨 없이, 일부 통상의 자일라나아제가 AXinsol 을 붕괴시키더라도, 이들은 고분자량의 가용성 분해 산물의 증가를 초래하며, 이는 유리하지 않을 수 있다.
게다가 또는 대안적으로 그리고 다시금 이론에 구애됨 없이, 통상의 자일라나아제 효소는 AXinsol 을 붕괴시킬 수 있으나, 이는 이들이 혼합물 내의 점도가 이상적이지 않을 정도로 충분히 빨리 고분자량의 가용화된 생성물을 분해하지 않기 때문이다. 대조적으로, 본 발명의 방법 및 용도로는, 자일라나아제가 또한 고분자량의 가용화된 생성물을 신속히 분해시키면서, 그에 따라 통상의 효소에 비해 대상에서의 소화율, 성능 및 사료 효율에 있어서 향상을 제공하면서 AXinsol 를 붕괴시킨다.
또한, 상이한 근원으로부터의 헤미셀룰로오스의 이종성/변화는 막대하다. 대부분의 자일란의 근원적 구조가 유사하나 (즉, D-자일로오스 잔기의 α3-1,4 연결된 백본), 실제로 그 다양성은 모두 자일란의 근원에 따라 좌우되는 백본으로부터의 치환 유형 및 정도 및 백본 크기에 있어서의 차이로 인해 막대하다. 특히 치환 패턴은 근원에서 근원 사이에 상당히 다양할 수 있고, 가장 흔한 치환기는 α-4-0-메틸글루쿠론산, 아라비노오스, 아세트산 및 치환기 당을 통해 연결된 각종 페놀류이다. 자일란 모두에서의 치환 패턴은 그의 물리적 특성, 예를 들어 용해도, 수 결합 능력, 점도 뿐 아니라 효소에 의한 공격에 대한 그의 민감성을 변형시킨다. 예를 들어, 옥수수로부터의 자일란 가수분해 생성물은 크기, 치환 정도 및 양에 있어서 밀로부터 제조된 것들과 상이하다. 식물 세포벽 구조에 있어서의 이러한 이종성의 결과로서, 각각 그의 고유 특징을 갖는 과다한 자일란분해 시스템이 발달된다. 본 발명자는 놀랍게도, 광범위한 스펙트럼의 식물 물질 및 특히 옥수수 및/또는 옥수수 부산물에서의 당류 (예를 들어 펜토산) 의 가용화에 있어서 양호한 자일라나아제를 개발하였다.
본 발명의 및 본원에 기재된 효소는 옥수수, 밀, DDGS 등, 특히 옥수수 및 옥수수 기재 기질, 특히 밀 (밀-기재 포함) 생성물 및 옥수수 (옥수수-기재 포함) 생성물 모두를 포함하는 다양한 범위의 기질로부터 불용성 아라비노자일란 (AXinsol) 을 효과적으로 붕괴 (가용화) 시킬 뿐 아니라, 중합체를 효율적으로 붕괴시키고 따라서 가용화시키는 것으로 발견되었다.
점도가 상승되지 않고/거나 점도를 감소시키는 것을 효과적으로 확실히 한다는 것으로 발견되었다.
따라서 본 발명은 펜토산, 특히 자일란-함유 물질, 예컨대 아라비노자일란, 특히 불용성 아라비노자일란을 가용화시킬 수 있는 효소에 관한 것이다. 특히 상기 효소는 옥수수 기재 기질을 포함하는 광범위한 스펙트럼의 기질에서의 펜토산 특히 자일란-함유 물질, 예컨대 아라비노자일란, 특히 불용성 아라비노자일란의 가용화에 있어서 특히 유용하다.
상기 발견에 근거하여, 본 발명에 따른 자일라나아제는 자일란-함유 물질, 특히 아라비노자일란, 특히 AXinsol 을 분해하는데 사용될 수 있다. 부가적으로 또는 대안적으로는, 본 발명에 따른 자일라나아제는 AXinsol 의 분해로부터 생성된 또는 곡물-기재 물질에 (자연적으로) 존재하는 가용성 중합체 (예를 들어 올리고머) 를 분해하는데 사용될 수 있다. 놀랍게도 본 발명에 따른 자일라나아제가 자일란-함유 물질, 특히 아라비노자일란, 특히 AXinsol 을 분해하는데, 및 AXinsol 의 분해로부터 제조된 가용성 중합체 (예를 들어 올리고머) 를 분해하는데 모두 사용될 수 있다는 것이 발견되었다.
이러한 놀라운 발견에 근거하여, 본 발명은 식물 생성물, 특히 옥수수 또는 옥수수 부산물에서의 아라비노자일란 (예컨대 펜토산) 의 가용화 증가를 초래할 수 있는 사료 및/또는 사료 첨가제 조성물의 제조 방법을 제공한다.
예를 들어, 이러한 사료 및/또는 사료 첨가제 조성물은 향상된 비용 효율; 향상된 대상의 성능; 대상에서의 향상된 소화율 (예를 들어 영양분 소화율) 또는 향상된 사료 효율; 및/또는 향상된 수율을 초래할 수 있다.
발명의 설명
제 1 양태에 따라서 본 발명은 SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 또는 SEQ ID No. 8 과 80% 이상의 동일성 (적합하게는 85% 이상, 적합하게는 90% 이상, 적합하게는 95% 이상의 동일성) 을 갖는 SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 또는 SEQ ID No. 8 로서 본원에 나타낸 폴리펩티드 서열, 또는 이의 변이체, 단편, 상동체 또는 유도체를 포함하는 (또는 이로 이루어지는) 자일라나아제; 또는 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 로서 본원에 나타낸 뉴클레오티드 서열, 또는 높은 엄격도 조건 하에 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 에 하이브리드화될 수 있는 뉴클레오티드 서열, 또는 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 와 80% 이상 (적합하게는 85% 이상, 적합하게는 90% 이상, 적합하게는 93% 이상) 의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 자일라나아제, 또는 푸사리움 옥시스포룸 (Fusarium oxysporum) 으로부터 수득가능한 (또는 수득되는) 자일라나아제와 물질을 혼합하는 것을 포함하는, 불용성 아라비노자일란-함유 물질의 분해 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 자일란-함유 물질 (바람직하게는 아라비노자일란-함유 물질, 바람직하게는 불용성 아라비노자일란-함유 물질) 을 분해하기 위한, SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 또는 SEQ ID No. 8 과 80% 이상의 동일성 (적합하게는 85% 이상, 적합하게는 90% 이상, 적합하게는 95% 이상의 동일성) 을 갖는 SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 또는 SEQ ID No. 8 로서 본원에 나타낸 폴리펩티드 서열, 또는 이의 변이체, 단편, 상동체 또는 유도체를 포함하는 (또는 이로 이루어지는) 자일라나아제; 또는 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 로서 본원에 나타낸 뉴클레오티드 서열, 또는 높은 엄격도 조건 하에 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 에 하이브리드화될 수 있는 뉴클레오티드 서열, 또는 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 와 80% 이상 (적합하게는 85% 이상, 적합하게는 90% 이상, 적합하게는 93% 이상) 의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 자일라나아제, 또는 푸사리움 옥시스포룸으로부터 수득가능한 (또는 수득되는) 자일라나아제의 용도를 제공한다.
본 발명은 추가의 양태에서, SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 또는 SEQ ID No. 8 과 80% 이상의 동일성 (적합하게는 85% 이상, 적합하게는 90% 이상, 적합하게는 95% 이상의 동일성) 을 갖는 SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 또는 SEQ ID No. 8 로서 본원에 나타낸 폴리펩티드 서열, 또는 이의 변이체, 단편, 상동체 또는 유도체를 포함하는 (또는 이로 이루어지는) 자일라나아제; 또는 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 로서 본원에 나타낸 뉴클레오티드 서열, 또는 높은 엄격도 조건 하에 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 에 하이브리드화될 수 있는 뉴클레오티드 서열, 또는 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 와 80% 이상 (적합하게는 85% 이상, 적합하게는 90% 이상, 적합하게는 93% 이상) 의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 자일라나아제, 또는 푸사리움 옥시스포룸으로부터 수득가능한 (또는 수득되는) 자일라나아제를 옥수수 및/또는 옥수수 부산물을 포함하는 (또는 이로 본질적으로 이루어지는 또는 이로 이루어지는) 식물 조성물을 접촉시키는 것을 포함하는, 옥수수-기재 생성물의 제조 방법을 제공한다.
한 양태에서, 옥수수-기재 생성물은 사료, 또는 옥수수 시재 사료일 수 있다.
한 양태에서, 상기 방법은 하나 이상의 추가적인 식물 물질, 예컨대 고섬유 식물 물질의 첨가를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 하나 이상의 추가적인 사료 물질, 예컨대 고섬유 사료 물질의 첨가를 추가로 포함할 수 있다.
한 양태에서 사료 물질 조성물은, 상기 사료 물질 조성물을 자일라나아제와 혼합하고, 자일라나아제를 사료 물질 조성물에 분무하거나, 식품 물질 조성물을 자일라나아제를 포함하는 제제에 침지하여, 자일라나아제와 접촉될 수 있다.
한 양태에서, 옥수수 부산물은 옥수수 글루텐 박 또는 옥수수 글루텐 사료 또는 옥수수 주정박 또는 옥수수 주정혼합박 (DDGS) 이다.
한 양태에서, 사료 생성물 또는 사료 물질 조성물은 배합 사료, 배합 사료 성분, 배합 사료의 프리믹스, 여물, 여물 성분 또는 여물의 프리믹스이다.
한 양태에서, 본 발명에 따른 사료 생성물 제조 방법은 사료 물질 조성물을 식사, 펠렛, 견과, 케이크 또는 크럼블로 형성시키는 단계를 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서 본 발명은 SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 또는 SEQ ID No. 8 과 80% 이상의 동일성 (적합하게는 85% 이상, 적합하게는 90% 이상, 적합하게는 95% 이상의 동일성) 을 갖는 SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 또는 SEQ ID No. 8 로서 본원에 나타낸 폴리펩티드 서열, 또는 이의 변이체, 단편, 상동체 또는 유도체를 포함하는 (또는 이로 이루어지는) 자일라나아제; 또는 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 로서 본원에 나타낸 뉴클레오티드 서열, 또는 높은 엄격도 조건 하에 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 에 하이브리드화될 수 있는 뉴클레오티드 서열, 또는 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 와 80% 이상 (적합하게는 85% 이상, 적합하게는 90% 이상, 적합하게는 93% 이상) 의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 자일라나아제, 또는 푸사리움 옥시스포룸으로부터 수득가능한 (또는 수득되는) 자일라나아제 및 옥수수 및/또는 옥수수 부산물을 포함하는 옥수수 기재 생성물을 제공한다.
적합하게는 옥수수 기재 생성물은 사료이다.
본 발명은 SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 또는 SEQ ID No. 8 과 80% 이상의 동일성 (적합하게는 85% 이상, 적합하게는 90% 이상, 적합하게는 95% 이상의 동일성) 을 갖는 SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 또는 SEQ ID No. 8 로서 본원에 나타낸 폴리펩티드 서열, 또는 이의 변이체, 단편, 상동체 또는 유도체를 포함하는 (또는 이로 이루어지는) 자일라나아제; 또는 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 로서 본원에 나타낸 뉴클레오티드 서열, 또는 높은 엄격도 조건 하에 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 에 하이브리드화될 수 있는 뉴클레오티드 서열, 또는 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 와 80% 이상 (적합하게는 85% 이상, 적합하게는 90% 이상, 적합하게는 93% 이상) 의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 자일라나아제, 또는 푸사리움 옥시스포룸으로부터 수득가능한 (또는 수득되는) 자일라나아제를 사료 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 혼합하고, (임의로는) 패키징하는 것을 포함하는, 사료 첨가제 조성물의 제조 방법을 추가로 제공한다.
또 다른 양태에서, SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 또는 SEQ ID No. 8 과 80% 이상의 동일성 (적합하게는 85% 이상, 적합하게는 90% 이상, 적합하게는 95% 이상의 동일성) 을 갖는 SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 또는 SEQ ID No. 8 로서 본원에 나타낸 폴리펩티드 서열, 또는 이의 변이체, 단편, 상동체 또는 유도체를 포함하는 (또는 이로 이루어지는) 자일라나아제; 또는 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 로서 본원에 나타낸 뉴클레오티드 서열, 또는 높은 엄격도 조건 하에 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 에 하이브리드화될 수 있는 뉴클레오티드 서열, 또는 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 와 80% 이상 (적합하게는 85% 이상, 적합하게는 90% 이상, 적합하게는 93% 이상) 의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 자일라나아제, 또는 푸사리움 옥시스포룸으로부터 수득가능한 (또는 수득되는) 자일라나아제 및 사료 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 (또는 이로 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어지는) 사료 첨가제 조성물 (또는 패키징된 사료 첨가제 조성물) 이 제공된다.
추가 양태에서 본 발명은 본 발명에 따른 사료 첨가제 조성물 또는 SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 또는 SEQ ID No. 8 과 80% 이상의 동일성 (적합하게는 85% 이상, 적합하게는 90% 이상, 적합하게는 95% 이상의 동일성) 을 갖는 SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 또는 SEQ ID No. 8 로서 본원에 나타낸 폴리펩티드 서열, 또는 이의 변이체, 단편, 상동체 또는 유도체를 포함하는 (또는 이로 이루어지는) 자일라나아제; 또는 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 로서 본원에 나타낸 뉴클레오티드 서열, 또는 높은 엄격도 조건 하에 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 에 하이브리드화될 수 있는 뉴클레오티드 서열, 또는 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 와 80% 이상 (적합하게는 85% 이상, 적합하게는 90% 이상, 적합하게는 93% 이상) 의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 자일라나아제, 또는 푸사리움 옥시스포룸으로부터 수득가능한 (또는 수득되는) 자일라나아제를 하나 이상의 미네랄 및/또는 하나 이상의 비타민과 조합으로 포함하는 프리믹스를 제공한다.
적합하게는, 본 발명에 따른 사료 첨가제 조성물 또는 본 발명에 따른 프리믹스는 건조 분말 또는 과립 (바람직하게는 TPT 과립) 으로서 제형화될 수 있다.
한 양태에서, 본 발명은 하기를 투여하는 것을 포함하는, 대상의 성능을 향상시키거나 대상에서의 소화율 (예를 들어 영양분 소화율) 을 향상시키거나 사료 효율을 향상시키는 방법을 제공하며:
a. 본 발명에 따라 제조된 옥수수 기재 생성물; 또는
b. 본 발명에 따른 사료 첨가제 조성물 또는 프리믹스; 또는
c. SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 또는 SEQ ID No. 8 과 80% 이상의 동일성 (적합하게는 85% 이상, 적합하게는 90% 이상, 적합하게는 95% 이상의 동일성) 을 갖는 SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 또는 SEQ ID No. 8 로서 본원에 나타낸 폴리펩티드 서열, 또는 이의 변이체, 단편, 상동체 또는 유도체를 포함하는 (또는 이로 이루어지는) 자일라나아제; 또는 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 로서 본원에 나타낸 뉴클레오티드 서열, 또는 높은 엄격도 조건 하에 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 에 하이브리드화될 수 있는 뉴클레오티드 서열, 또는 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 와 80% 이상 (적합하게는 85% 이상, 적합하게는 90% 이상, 적합하게는 93% 이상) 의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 자일라나아제, 또는 푸사리움 옥시스포룸으로부터 수득가능한 (또는 수득되는) 자일라나아제;
이때, b. 및 c. 에서 대상에게는 임의로는 식물 조성물, 예를 들어 옥수수 또는 옥수수 부산물을 포함하는 식물 조성물이 추가로 투여된다.
한 양태에서, 본 발명은 대상의 성능을 향상시키거나 대상에서의 소화율 (예를 들어 영양분 소화율) 을 향상시키거나 대상에서의 사료 효율을 향상시키기 위한 (특히 옥수수 기재 사료 생성물에 관해), 본 발명에 따른 옥수수-기재 생성물 또는 이의 일부, 또는 본 발명에 따른 사료 첨가제 조성물 또는 본 발명에 따른 프리믹스, 또는 SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 또는 SEQ ID No. 8 과 80% 이상의 동일성 (적합하게는 85% 이상, 적합하게는 90% 이상, 적합하게는 95% 이상의 동일성) 을 갖는 SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 또는 SEQ ID No. 8 로서 본원에 나타낸 폴리펩티드 서열, 또는 이의 변이체, 단편, 상동체 또는 유도체를 포함하는 (또는 이로 이루어지는) 자일라나아제; 또는 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 로서 본원에 나타낸 뉴클레오티드 서열, 또는 높은 엄격도 조건 하에 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 에 하이브리드화될 수 있는 뉴클레오티드 서열, 또는 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 와 80% 이상 (적합하게는 85% 이상, 적합하게는 90% 이상, 적합하게는 93% 이상) 의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 자일라나아제, 또는 푸사리움 옥시스포룸으로부터 수득가능한 (또는 수득되는) 자일라나아제의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 사료 첨가제 조성물 또는 본 발명에 따른 프리믹스 및 옥수수-기재 사료 생성물의 투여를 위한 지시사항을 포함하는 키트를 추가로 제공한다.
추가 양태에서, 맥주와 같은 발효 음료의 제조에 있어서의, SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 또는 SEQ ID No. 8 과 80% 이상의 동일성 (적합하게는 85% 이상, 적합하게는 90% 이상, 적합하게는 95% 이상의 동일성) 을 갖는 SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 또는 SEQ ID No. 8 로서 본원에 나타낸 폴리펩티드 서열, 또는 이의 변이체, 단편, 상동체 또는 유도체를 포함하는 (또는 이로 이루어지는) 자일라나아제; 또는 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 로서 본원에 나타낸 뉴클레오티드 서열, 또는 높은 엄격도 조건 하에 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 에 하이브리드화될 수 있는 뉴클레오티드 서열, 또는 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 와 80% 이상 (적합하게는 85% 이상, 적합하게는 90% 이상, 적합하게는 93% 이상) 의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 자일라나아제, 또는 푸사리움 옥시스포룸으로부터 수득가능한 (또는 수득되는) 자일라나아제의 용도가 제공된다.
추가 양태에서, 본 발명은 SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 또는 SEQ ID No. 8 과 80% 이상의 동일성 (적합하게는 85% 이상, 적합하게는 90% 이상, 적합하게는 95% 이상의 동일성) 을 갖는 SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 또는 SEQ ID No. 8 로서 본원에 나타낸 폴리펩티드 서열, 또는 이의 변이체, 단편, 상동체 또는 유도체를 포함하는 (또는 이로 이루어지는) 자일라나아제; 또는 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 로서 본원에 나타낸 뉴클레오티드 서열, 또는 높은 엄격도 조건 하에 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 에 하이브리드화될 수 있는 뉴클레오티드 서열, 또는 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 와 80% 이상 (적합하게는 85% 이상, 적합하게는 90% 이상, 적합하게는 93% 이상) 의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 자일라나아제, 또는 푸사리움 옥시스포룸으로부터 수득가능한 (또는 수득되는) 자일라나아제와 매쉬 및/또는 맥아즙을 접촉시키는 단계를 포함하는, 발효 음료 (예를 들어 맥주) 의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 추가 양태에서는 하기 단계를 포함하는 발효 음료 (예를 들어 맥주) 의 제조 방법이 제공되며: (a) 매쉬를 제조하는 단계, (b) 매쉬를 여과하여 맥아즙을 수득하는 단계, 및 (c) 맥아즙을 발효하여 맥주와 같은 발효 음료를 수득하는 단계, 이때 SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 또는 SEQ ID No. 8 과 80% 이상의 동일성 (적합하게는 85% 이상, 적합하게는 90% 이상, 적합하게는 95% 이상의 동일성) 을 갖는 SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 또는 SEQ ID No. 8 로서 본원에 나타낸 폴리펩티드 서열, 또는 이의 변이체, 단편, 상동체 또는 유도체를 포함하는 (또는 이로 이루어지는) 자일라나아제; 또는 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 로서 본원에 나타낸 뉴클레오티드 서열, 또는 높은 엄격도 조건 하에 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 에 하이브리드화될 수 있는 뉴클레오티드 서열, 또는 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 와 80% 이상 (적합하게는 85% 이상, 적합하게는 90% 이상, 적합하게는 93% 이상) 의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 자일라나아제, 또는 푸사리움 옥시스포룸으로부터 수득가능한 (또는 수득되는) 자일라나아제가 (i) 단계 (a) 의 매쉬 및/또는 (ii) 단계 (b) 의 맥아즙 및/또는 (iii) 단계 (c) 의 맥아즙에 첨가된다.
본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 제조된, 맥주와 같은 발효 음료를 추가로 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예의 상세한 설명
다르게 정의되지 않는다면, 본원에 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 설명이 속하는 당업계의 당업자에 의해 통상 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 문헌 Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 20 ED., John Wiley and Sons, New York (1994), 및 Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991) 에서는 본 명세서에서 사용되는 많은 용어의 일반적인 사전을 당업자에게 제공한다.
본 명세서는 본원에 기재된 예시적인 방법 및 재료에 제한되지 않으며, 본원에 기재된 것과 유사한 또는 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 구현예의 실시 또는 시험에 사용될 수 있다. 수치 범위는 범위를 정의하는 수를 포함한다. 다르게 명시되지 않는다면, 임의의 핵산 서열은 좌측에서 우측으로 5' 에서 3' 방향으로 기재되며; 아미노산 서열은 좌측에서 우측으로 아미노에서 카르복시 방향으로 각각 기재된다.
본원에 제공된 제목은 전체로서 명세서에 대한 참조에 의해 가질 수 있는 본 명세서의 다양한 앙태 또는 구현예의 제한이 아니다. 따라서, 바로 아래에 정의된 용어들은 전체로서 명세서에 대한 참조에 의해 더욱 상세히 정의된다.
아미노산은 아미노산의 명칭, 3 자리 문자 약어 또는 1 자리 문자 약어를 사용하여 본원에 언급된다.
본원에 사용되는 용어 "단백질" 에는 단백질, 폴리펩티드 및 펩티드가 포함된다.
본원에 사용되는 용어 "아미노산 서열" 은 용어 "폴리펩티드" 및/또는 용어 "단백질" 과 동의어이다. 일부 예에서, 용어 "아미노산 서열" 은 용어 "펩티드" 와 동의어이다. 일부 예에서, 용어 "아미노산 서열" 은 용어 "효소" 와 동의어이다.
용어 "단백질" 및 "폴리펩티드" 는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 본 명세서 및 특허청구범위에서, 아미노산 잔기에 대한 통상의 1-글자 및 3-글자 코드가 사용될 수 있다. 아미노산에 대한 3-글자 코드는 IUPACIUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN) 에 따라 정의된다. 또한 폴리펩티드는 유전자 코드의 퇴보로 인해 1 개 초과의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있는 것으로 이해된다.
용어의 다른 정의는 명세서를 통해 명백해질 것이다. 예시적인 구현예를 더욱 상세히 설명하기 전에, 본 명세서가 기재된 특정 구현예에 제한되지 않고, 물론 변화가 있을 수 있다고 이해된다. 또한 본원에서 사용된 용어는 특정 구현예를 기재하는 목적만을 위한 것이며, 본 명세서의 범주가 특허청구범위에 의해서만 제한될 것으므로, 제한하는 것으로 의도되지 않는다는 것이 이해된다.
값 범위가 제공되는 경우, 해당 범위의 상한과 하한 사이의, 문맥상 다르게 명백하게 언급되지 않는 한 하한의 단위의 1/10 까지, 각 개입 값이 또한 구체적으로 기재된다는 것으로 이해된다. 임의의 언급된 값 또는 언급된 범위 내의 개입 값과, 임의의 기타 언급된 또는 언급된 범위 내의 개입 값 사이의 각각의 더 작은 범위가 본 명세서 내에 포함된다. 상기 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 범위 내에 포함되거나 제외될 수 있고, 어느 하나, 아무것도 또는 양쪽 한계가 더 작은 범위 내에 포함되는 각각의 범위가 또한 본 발명에 포함되어, 언급된 범위 내의 임의의 구체적으로 제외된 한계에 적용된다. 언급된 범위에 한계 중 하나 또는 둘다 포함되는 경우, 상기 포함된 한계 중 하나 또는 둘다를 제외한 범위가 또한 본 명세서에 포함된다.
본원에서 그리고 특허청구범위에서 사용되는, 단수형 표현에는 문맥상 명백하게 다르게 언급되지 않는 한 복수형 참조대상이 포함되는 것이 명시되어야만 한다. 따라서 예를 들어, "효소" 에 대한 참조대상에는 복수의 이러한 후보 작용제가 포함되며 "사료" 에 대한 참조대상에는 하나 이상의 사료(들) 및 당업자에게 공지된 이의 등가물(들) 에 대한 참조대상이 포함되는 것과 같다.
본원에 논의된 공개문헌은 본 출원의 출원일 전에 그들의 설명에 대해 단독으로 제공된다. 본원의 어느 것도 이러한 공개문헌이 특허청구범위에 대한 종래 기술을 구성한다는 승인으로서 해석되지 않는다.
동물 사료 중의 에너지 공급원으로서 통상적으로 사용되는 원재료의 가격 증가는 예를 들어 상기 산업에 대한 출발 물질 중 저-비용 섬유질 재료의 포함, 특히 동물 사료 중 저-비용 섬유질 부산물의 사용이라는 결과를 초래한다.
섬유질 첨가는 여러 불리한 효과를 야기할 수 있다. 예를 들어 동물 사료 내의 섬유질 첨가는 반-영양적 효과를 일으킬 수 있다. 동물의 장에 존재하는 미분해된 중합체의 존재는 고도로 점성인 내용물 및 지연된 확산을 야기하고, 그 결과 감소된 영양소 흡수를 야기한다. 또한, 상기 중합체는 물의 효과적인 재흡수를 방해하는 높은 물 유지 능력을 가지고, 물 보유가 장 내용물의 부피를 증가시키고, 이것이 장내 통과 시간 감소를 초래한다 (Englyst & Kingman (1993) in Human Nutrition and Dietetics, 9th edition (Garrow J. S., James W. P. T., eds.) p. 53).
사료물 중, 헤미셀룰로오스 및 셀룰로오스는 또한 전분 및 단백질과 같은 영양분을 캡슐화하고, 이로써 동물에게 상기 영양분의 접근을 유지시키는 물리적인 장벽을 형성한다.
헤미셀룰로오스 및 셀룰로오스는 그 자체가 또한 이들이 C5- 및 C6-당류로 이루어지므로, 잠재적인 에너지 공급원이다. 모노 C6-당류는 동물에 의해 에너지 공급원으로서 사용될 수 있는 반면, 올리고 C5-당류는 동물 소화관에 존재하는 마이크로 플로라에 의해 단쇄 지방산으로 변환될 수 있다 (van den Broek et al., 2008 Molecular Nutrition & Food Research, 52, 146-63).
물리적 장벽 분해의 결과로서 사료물로부터 영양분 및 물의 배출은 불용성 섬유질 성분을 분해시키는 자일라나아제의 능력에 따라 좌우된다.
본 발명은 SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 또는 SEQ ID No. 8 과 80% 이상의 동일성 (적합하게는 81% 이상, 적합하게는 85% 이상, 적합하게는 90% 이상, 적합하게는 95% 이상의 동일성) 을 갖는 SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 또는 SEQ ID No. 8 로서 본원에 나타낸 폴리펩티드 서열 또는 이의 변이체, 단편, 상동체 또는 유도체를 포함하는 (또는 이로 이루어지는) 자일라나아제 효소의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 로서 본원에 나타낸 뉴클레오티드 서열, 또는 높은 엄격도 조건 하에 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 에 하이브리드화될 수 있는 뉴클레오티드 서열, 또는 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 와 80% 이상 (적합하게는 적어도 85, 90 또는 93%) 의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 자일라나아제의 용도에 관한 것이다.
본 발명에서 사용하기 위한 자일라나아제 효소는 진균, 즉 푸사리움 옥시스포룸으로부터 수득가능한 (또는 수득되는) 것일 수 있다.
한 양태에서 본 발명은 사료 또는 사료 첨가제 조성물에서의 사용을 위한 푸사리움 옥시스포룸으로부터 수득가능한 (또는 수득되는) 자일라나아제를 제공한다.
본 발명의 자일라나아제 효소는 본원에서 FoxXyn6 으로서 지칭될 수 있다.
본 발명은 또한 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 로서 본원에 나타낸 뉴클레오티드 서열, 또는 높은 엄격도 조건 하에 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 에 하이브리드화될 수 있는 뉴클레오티드 서열, 또는 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 와 93% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 (또는 이로 이루어지는) 핵산을 추가로 제공한다.
폴리펩티드 서열 및 핵산 서열 둘 모두는 본원에서 바람직하게는 단리되는 것으로 교시된다.
한 구현예에서 바람직하게는 자일라나아제는 엔도자일라나아제, 예를 들어 엔도-1,4-β-d-자일라나아제이다. 엔도-1,4-β-d-자일라나아제에 대한 분류는 E.C. 3.2.1.8 이다.
바람직하게는 본 발명의 자일라나아제는 약 pH 6 에서 최적점 pH 를 갖는다.
바람직하게는 본 발명의 자일라나아제는 pH 4.5 내지 6.9 에서 최대 활성의 70% 초과를 유지한다.
바람직하게는 본 발명의 자일라나아제는 약 60℃ 의 최적점 온도를 갖는다.
바람직하게는 본 발명의 자일라나아제는 48℃ 내지 65℃ 에서 최대 활성의 70% 초과를 유지한다.
본원에서 사용하는 바와 같은 용어 "헤미셀룰로오스" 는 셀룰로오스 외에 식물 세포벽의 다당류 성분을 의미한다. 본원에서 사용하는 바와 같은 용어 "헤미셀룰로오스" 는 알칼리성 용액을 희석하여 추출가능한 식물 세포벽에서의 다당류를 의미할 수 있다. 헤미셀룰로오스는 수목 조직에서의 탄수화물의 거의 1/3 을 포함한다. 헤미셀룰로오스의 화학적 구조는 장쇄의 다양한 펜토오스, 헥소오스, 및 그의 상응하는 우론산으로 이루어진다. 헤미셀룰로오스는 과일, 식물 줄기 및 곡물 외피에서 발견될 수 있다. 완전 가수분해시 펜토오스를 산출하는 다당류는 펜토산으로 지칭된다. 자일란은 1β → 4 연결을 갖는 D-자일로오스 단위로 이루어지는 펜토산의 예이다.
본원에서 사용하는 바와 같은 용어 "펜토산" 은 완전 가수분해시 펜토오스를 산출하는 탄수화물의 임의의 군이다.
본원에서 사용하는 바와 같은 용어 "아라비노자일란" (AX) 은 사슬을 통해 자일로오스 단위에 대해 1α → 2 및/또는 1α →3 연결에 의해 무작위하게 부착된 L-아라비노푸라노오스 (그의 5-원자 고리 형태로의 L-아라비노오스) 를 갖는 자일란 백본 (1,4-연결된 자일로오스 단위) 으로 이루어지는 밀, 메이즈 (옥수수), 호밀 및 보리와 같은 곡물의 겨에서 발견되는 다당류를 의미한다. 아라비노자일란은 식물의 1 차 및 2 차 세포벽 모두에서 발견되는 헤미셀룰로오스이다.
자일로오스 및 아라비노오스 (아라비노자일란의 구성 성분) 가 모두 펜토오스이므로, 아라비노자일란은 통상 펜토산으로서 분류된다.
본원에서 사용되는 용어 "~으로 본질적으로 이루어지는" 은 청구된 조성물의 특징이 실질적으로 영향을 받지 않는 경우에는 비-명시된 성분이 존재할 수 있는 것을 의미한다.
용어 "~으로 이루어지는" 은 특정 성분의 비율이 총 100% 여야만 하는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "~을 포함하는" 은 일부 구현예에서 '~으로 본질적으로 이루어지는' 또는 '~으로 이루어지는' (둘다 "~을 포함하는" 을 의미하는 좀더 제한된 의미를 가짐) 을 언급하는 것으로 보정될 수 있다.
식물 조성물
본원에서 사용되는 용어 "식물 조성물" 은 아라비노자일란을 포함하는 임의의 식물 조성물을 의미한다. 한 구현예에서 식물 조성물은 밀, 옥수수, 보리, 호밀, 라이밀, 귀리 또는 이의 조합, 또는 이들 식물 조성물 중 하나의 부산물로 이루어지는 군에서 선택될 수 있다.
한 구현예에서 식물 조성물은 옥수수 및/또는 옥수수 부산물을 포함한다 (이로 이루어지거나 이로 본질적으로 이루어진다).
한 구현예에서 식물 조성물, 옥수수 및/또는 옥수수 부산물은 사료물 또는 사료 성분이다.
옥수수 기재 생성물
본원에서 사용되는 용어 "옥수수 기재 생성물" 은 옥수수 (메이즈), 예를 들어 옥수수 종자 또는 곡물 또는 옥수수 곡물의 부산물을 포함하는 (또는 이로 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어지는) 식물 조성물을 의미한다.
바람직하게는 옥수수 기재 생성물 또는 식물 조성물은 주요 구성성분으로서 옥수수 또는 옥수수의 부산물을 포함한다. 예를 들어 옥수수 기재 생성물 또는 식물 조성물은 35% 이상의 옥수수 또는 옥수수 부산물, 예컨대 50% 이상의 옥수수 또는 옥수수 부산물, 예컨대 70% 이상의 옥수수 또는 옥수수 부산물, 예컨대 90% 이상의 옥수수 또는 옥수수 부산물, 예를 들어 100% 의 옥수수 또는 옥수수 부산물을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 옥수수 기재 생성물 또는 식물 조성물은 미량 구성성분으로서 옥수수 또는 옥수수의 부산물을 포함할 수 있는데; 이 경우 사료물은 옥수수 또는 옥수수의 부산물로 보충될 수 있다. 예를 들어, 오직 옥수수 기재 생성물 또는 식물 조성물은 예를 들어 옥수수 또는 옥수수의 부산물로 보충된 밀을 포함할 수 있다.
옥수수 또는 옥수수의 부산물이 옥수수 기재 생성물 또는 식물 조성물의 미량 구성성분인 경우, 옥수수 또는 옥수수의 부산물은 사료물의 25% 이상, 바람직하게는 10% 이상, 바람직하게는 20% 이상, 바람직하게는 30% 이상이다.
의심의 여지 없이, 본원에서 사용되는 용어 "옥수수 (corn)" 는 메이즈 (maize), 예를 들어, 제아 메이즈 (Zea mays) 와 동의어이다.
한 구현예에서, 옥수수의 부산물은 옥수수 글루텐 박 또는 옥수수 주정혼합박 (cDDGS) 일 수 있다.
사료 또는 사료물
한 양태에서, 옥수수 기재 생성물은 옥수수 기재 사료 생성물 또는 이의 일부일 수 있다. 옥수수 기재 생성물이 옥수수 기재 사료 생성물의 일부로서 사용되는 경우, 옥수수 기재 생성물은 사료 첨가제 조성물로서 고려될 수 있다. 그러므로 일부 구현예에서 본원에서 사용되는 용어 옥수수 기재 생성물은 사료 생성물 또는 사료 첨가제 조성물을 의미할 수 있다.
본 발명의 사료 첨가제 조성물은 사료로서 - 또는 사료의 제조에서 - 사용될 수 있다.
용어 "사료" 는 본원에서 "사료물" 와 동의어로 사용된다. 본원에서 사용되는 용어 "사료물" 은 소 (예를 들어 젖소), 돼지, 양 (예를 들어 새끼양), 염소, 가금류, 예컨대 닭 또는 산란 닭, 칠면조, 타조, 꿩, 사슴, 엘크, 순록, 버팔로, 들소, 영양, 카멜, 캥거루; 말, 어류; 고양이, 개, 기니아피그, 설치류 예를 들어 랫트, 마우스, 게르빌루스쥐 및 친칠라같은 동물 소비에 적합한 먹이를 의미한다.
사료는, 용도 및/또는 적용 방식 및/또는 투여 방식에 따라, 용액의 형태로 또는 고체로서 또는 반-고체로서 존재할 수 있다.
사료 - 예컨대 기능적 사료로서 - 또는 이의 제조에서 사용되는 경우 - 본 발명의 효소 또는 조성물은: 영양적으로 허용가능한 담체, 영양적으로 허용가능한 희석제, 영양적으로 허용가능한 부형제, 영양적으로 허용가능한 면역보강제, 영양적으로 활성인 성분 중 하나 이상과 함께 사용될 수 있다.
한 양태에서, 사료 물질 조성물은 옥수수 (메이즈) 또는 옥수수 부산물을 포함한다 (또는 이로 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어짐). 한 양태에서, 사료 물질 조성물은 사료 또는 사료 첨가제 조성물이다.
한 양태에서, 본 발명의 사료 첨가제 조성물은 사료 성분과 함께 혼합되어 사료물을 형성한다.
본원에서 사용되는 용어 "사료 성분" 은 사료물의 전부 또는 일부를 의미한다. 사료물의 일부는 사료물의 구성성분 중 하나 또는 사료물의 구성성분 중 하나 초과, 예를 들어, 2 또는 3 또는 4 개를 의미할 수 있다. 한 구현예에서, 용어 "사료 성분" 은 프리믹스 또는 프리믹스 구성성분을 포함한다.
바람직하게는 사료는 여물 (fodder), 또는 이의 프리믹스, 배합 사료, 또는 이의 프리믹스일 수 있다. 한 구현예에서, 본 발명에 따른 사료 첨가제 조성물은 배합 사료, 배합 사료 성분 또는 배합 사료의 프리믹스 또는 여물, 여물 성분, 또는 여물의 프리믹스와 혼합될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "여물" 은 동물 (스스로 찾아다니는 동물 이외의 동물) 에게 제공되는 임의의 먹이를 의미한다. 여물은 절단된 식물을 포함한다.
용어 '여물' 에는 사일리지 (silage), 압착된 및 펠렛화된 사료, 오일 및 혼합된 배급물, 및 또한 발아 곡물 및 콩류가 포함된다.
여물은: 옥수수 (메이즈), 알팔파 (Lucerne), 보리, 벌노랑이, 배추속식물, 차우 모엘리에르 (Chau moellier), 케일, 유채 (카놀라), 루타바가 (스웨덴 무), 순무, 클로버, 앨사이크 클로버, 빨간 클로버, 서브터래이니언 클로버, 흰 클로버, 김의털, 참새귀리, 좁쌀, 귀리, 수수, 대두, 나무 (나무-건초를 위해 잘려진 나무 순), 밀, 및 콩류로부터 선택되는 하나 이상의 식물로부터 수득될 수 있다.
용어 "배합 사료" 는 박 (meal), 펠렛, 견과, 케이크 또는 크럼블 형태의 시판 사료를 의미한다. 배합 사료는 다양한 원재료 및 첨가제로부터 배합될 수 있다. 상기 배합물은 표적 동물의 특이적 필요요건에 따라 제형화된다.
배합 사료는 하루에 요구되는 영양분을 모두 제공하는 완전한 사료, 일부 배급물 (단백질, 에너지) 을 제공하는 농축물 또는 무기질 및 비타민과 같은 부가적인 미량영양분만을 제공하는 보충제일 수 있다.
배합 사료에 사용되는 주성분은 옥수수, 밀, 카놀라 박, 유채 박, 루핀, 대두, 수수, 귀리, 호밀 및 보리를 포함하는 사료 곡물이다.
적합하게는 본원에 언급된 프리믹스는 미량성분 예컨대 비타민, 무기질, 화학적 보존제, 항생제, 발효 생성물, 및 기타 필수 성분으로 구성된 조성물일 수 있다. 프리믹스는 통상 시판 배급물 내로 배합하기에 적합한 조성물이다.
본 발명의 임의의 사료물은 옥수수 또는 옥수수 부산물을 포함하는 것에 추가로 하기를 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 사료 물질을 추가로 포함할 수 있다: a) 곡식, 예컨대 소형 곡물 (예를 들어, 밀, 보리, 호밀, 귀리 및 이의 조합) 및/또는 대형 곡물, 예컨대 수수; b) 곡식, 예컨대 글루텐 박, 주정혼합박 (DDGS), 밀기울, 밀 미들링 (wheat middling), 밀 쇼오츠 (wheat shorts), 쌀겨, 왕겨, 귀리 껍질, 야자핵, 및 감귤류 펄프로부터의 부산물; c) 콩, 해바라기, 땅콩, 루핀, 완두, 파바 콩 (fava bean), 면화, 카놀라, 어분, 건조된 혈장 단백질, 육골분, 감자 단백질, 유청, 코프라, 참깨와 같은 공급원으로부터 수득된 단백질; d) 식물 및 동물 공급원으로부터 수득된 오일 및 지방; e) 무기질 및 비타민.
한 구현예에서, 사료 성분은 옥수수, DDGS (예를 들어 cDDGS), 옥수수 글루텐 박 또는 이의 조합일 수 있다.
한 구현예에서, 사료물은 성분은 옥수수, DDGS (예를 들어, cDDGS), 밀, 밀기울 또는 이의 조합일 수 있다.
한 구현예에서, 사료물은 옥수수, DDGS (예컨대 cDDGS), 옥수수 글루텐 박 또는 이의 조합을 포함하거나 이로 이루어진다.
한 구현예에서, 사료 성분은 옥수수, DDGS (예컨대 cDDGS) 또는 이의 조합일 수 있다.
본 발명의 사료물은 30 중량% 이상, 40 중량% 이상, 50 중량% 이상 또는 60 중량% 이상의 옥수수 및/또는 옥수수 부산물을 함유할 수 있다.
부가적으로 또는 대안적으로, 본 발명의 사료물은 하나 이상의 고 섬유질 사료 물질 및/또는 하나 이상의 고 섬유질 사료 물질의 하나 이상의 부산물을 포함하여, 고 섬유질 사료물을 제공할 수 있다. 고 섬유질 사료 물질의 예에는: 밀, 보리, 호밀, 귀리, 곡식 부산물, 예컨대 옥수수 글루텐 박, 주정혼합박 (DDGS), 밀기울, 밀 미들링, 밀 쇼오츠, 쌀겨, 왕겨, 귀리 껍질, 야자핵, 및 감귤류 펄프가 포함된다. 일부 단백질 공급원은 또한 고 섬유질로서 간주될 수 있다: 카놀라, 해바라기, 루핀, 파바 콩 및 면화와 같은 공급원으로부터 수득된 단백질.
한 구현예에서, 본 발명의 사료물은 예를 들어 주정혼합박 (DDGS) - 특히 cDDGS, 밀기울, 및 밀로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 하나 이상의 고 섬유질 물질 및/또는 하나 이상의 고 섬유질 사료 물질의 하나 이상의 부산물을 포함한다.
본 발명에서, 사료는 하기 중 하나 이상일 수 있다: 펠렛, 견과 또는 (cattle) 케이크를 포함하는 배합 사료 및 프리믹스; 작물 또는 작물 잔여물: 옥수수, 대두, 수수, 귀리, 보리, 코프라, 짚, 겉껍질, 사탕무 찌꺼기; 어분; 육골분; 당밀; 오일 케이크 및 프레스 케이크; 올리고당류; 보존된 사료물용 식물: 건초 및 사일리지; 해초; 씨 및 곡물 (통채로 또는 파쇄, 제분 등에 의해 제조된 채로); 발아 곡물 및 콩류; 효모 추출물.
본 발명에서 용어 "사료" 는 일부 구현예에서 또한 애완동물 사료를 포함한다. 애완동물 사료는 개 사료 또는 고양이 사료와 같은 애완동물에 의한 소비에 의도된 식물 또는 동물 물질이다. 애완동물 사료, 예컨대 개 및 고양이 사료는 건조 형태, 예컨대 개 껌 또는 통조림 형태일 수 있다. 고양이 사료는 아미노산 타우린을 함유할 수 있다.
본 발명에서 용어 "사료" 는 일부 구현예에서 또한 물고기 사료를 포함한다. 물고기 사료는 통상 양식 물고기를 양호한 건강상태로 유지하는데 필수적인 대량영양소, 미량 원소 및 비타민을 함유한다. 물고기 사료는 플레이크, 펠렛 또는 정제의 형태일 수 있다. 펠렛화된 형태 (이 중 일부는 빠르게 가라앉음) 는 종종 대형 어류 또는 바닥에서 사료를 찾는 종을 위해 사용된다. 일부 물고기 사료는 또한 관상용 어류의 색상을 인공적으로 향상시키기 위해, 베타 카로텐 또는 성 호르몬과 같은 첨가제를 함유한다.
본 발명에서 용어 "사료" 는 일부 구현예에서 새 먹이를 포함한다. 새 먹이는 새사료 (birdfeeders) 및 애완용 새를 사료는데 모두 사용되는 먹이를 포함한다. 전형적으로 새 먹이는 다양한 종자로 구성되나, 또한 슈에트 (소고기 또는 양고기 지방) 을 포함할 수 있다.
한 양태에서, 사료는 돼지, 양, 소 및 가금류와 같은 가축을 위한 것이다.
한 양태에서, 사료는 가금류 사료이다.
본원에서 사용되는 용어 "접촉된" 은 본 발명의 효소 (또는 상기 효소를 포함하는 조성물) 의 생성물 (예를 들어, 사료) 에 대한 간접적인 또는 직접적인 적용을 의미한다. 사용될 수 있는 적용 방법의 예에는, 사료 첨가제 조성물을 포함하는 물질로의 생성물 처리, 사료 첨가제 조성물을 생성물과 혼합함에 의한 직접 적용, 사료 첨가제 조성물의 생성물 표면 상에 대한 분사 또는 생성물의 사료 첨가제 조성물 제제 내로의 침지를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
한 구현예에서, 본 발명의 사료 첨가제 조성물은 바람직하게는 생성물 (예를 들어 사료물) 과 혼합된다. 대안적으로는, 사료 첨가제 조성물은 사료물의 에멀젼 또는 원 성분에 포함될 수 있다.
일부 적용을 위해, 조성물을 영향을 받는/처리되는 생성물의 표면 상에 또는 표면에 이용가능하게 만드는 것이 중요하다. 이것은 조성물이 하나 이상의 하기 바람직한 특성: 성능 이점을 부여하도록 하는 것을 가능하게 한다.
본 발명의 효소 (또는 상기 효소를 포함하는 조성물) 는 생성물 (예를 들어, 사료물 또는 사료물의 원 성분) 을 제어량의 상기 효소와 섞기, 코팅하기 및/또는 함침시키기 위해 적용될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 효소 (또는 상기 효소를 포함하는 조성물) 는 약 70℃ 이하; 약 85℃ 이하; 또는 약 95℃ 이하의 열 처리에 열적으로 안정할 것이다. 열 처리는 약 1 분 이하; 약 5 분 이하; 약 10 분 이하; 약 30 분 이하; 약 60 분 이하 동안 수행될 수 있다. 용어 '열적으로 안정한' 은 특정 온도로 가열하기 전 첨가제 내에 존재하던/활성이었던 효소의 약 75% 이상이 이것을 실온으로 냉각한 후에도 여전히 존재하는/활성인 것을 의미한다. 바람직하게는, 특정 온도로 가열하기 전 첨가제 내에서 존재하고 활성인 효소의 약 80% 이상이 이것을 실온으로 냉각한 후에도 여전히 존재하고 활성이다.
특히 바람직한 구현예에서, 본 발명의 효소 (또는 상기 효소를 포함하는 조성물) 는 균질화되어 분말이 생성된다.
대안적인 바람직한 구현예에서, 본 발명의 효소 (또는 상기 효소를 포함하는 조성물) 는 본원에 참조로서 포함되는 WO2007/044968 (TPT 과립으로서 지칭) 에 기재된 바와 같이 과립으로 제형화된다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 사료 첨가제 조성물이 과립으로 제형화되는 경우, 과립은 단백질 코어 상에 코팅된 수화된 장벽 염을 포함한다. 이러한 염 코팅의 장점은 향상된 열-내성, 향상된 저장 안정성 및 다르게는 효소 상에 악영향을 주는 기타 사료 첨가제에 대항하는 보호이다.
바람직하게는, 염 코팅에 사용되는 염은 20℃ 에서 0.25 초과의 수분 활성 또는 60% 초과의 일정한 습도를 갖는다.
바람직하게는, 염 코팅은 Na2SO4 를 포함한다.
본 발명의 효소 (또는 상기 효소를 포함하는 조성물) 의 제조 방법은 또한 분말을 펠렛화하는 추가 단계를 또한 포함할 수 있다. 분말은 당업계에 공지된 기타 성분과 혼합될 수 있다. 분말, 또는 분말을 포함하는 혼합물은 다이를 통과하도록 강요될 수 있고, 수득된 가닥은 다양한 길이의 적합한 펠렛으로 절단된다.
임의로, 펠렛화 단계는 펠렛의 형성 전에, 스팀 처리 또는 컨디셔닝 단계를 포함할 수 있다. 분말을 포함하는 혼합물은 컨디셔너 (conditioner) 내에, 예를 들어 스팀 주입이 있는 혼합기 내에 위치할 수 있다. 혼합물은 컨디셔너에서 특정 온도, 예컨대 60-100℃ 까지 가열되며, 전형적인 온도는 70℃, 80℃, 85℃, 90℃ 또는 95℃ 일 것이다. 잔존 시간은 초 내지 분 및 심지어 시간까지 다양할 수 있다 (예컨대 5 초, 10 초, 15 초, 30 초, 1 분, 2 분, 5 분, 10 분, 15 분, 30 분 및 1 시간).
본 발명의 효소 (또는 상기 효소를 포함하는 조성물) 가 임의의 적합한 사료 물질 (예를 들어 옥수수 또는 옥수수 부산물 포함) 에 대한 첨가에 적합한 것으로 이해될 것이다.
당업자는 상이한 동물이 상이한 사료물을 필요로 하며, 심지어 동일한 동물도 동물을 기르는 목적에 따라 상이한 사료물을 필요로 할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
임의로, 사료물은 또한 부가적인 무기질, 예컨대 칼슘 및/또는 부가적인 비타민을 또한 함유할 수 있다.
바람직하게는, 사료물은 옥수수 대두 박 믹스이다.
한 구현예에서, 바람직하게는 사료는 애완동물 사료가 아니다.
또 다른 앙태에서, 사료물의 제조 방법이 제공된다. 사료물은 전형적으로 원재료가 먼저 적합한 입자 크기로 분쇄된 다음 적합한 첨가제와 혼합되는 사료 밀 (mill) 에서 제조된다. 이후 사료물은 맥아즙 또는 펠렛으로서 제조될 수 있고; 이것은 전형적으로 온도를 표적 수준으로 상승시킨 다음, 사료를 특정 크기의 펠렛을 생성하는 다이를 통과시키는 방법을 포함한다. 펠렛은 냉각시킬 수 있다. 이후 지방 및 효소와 같은 액체 첨가제가 첨가될 수 있다. 사료물의 제조는 또한 - 특히 적어도 스팀의 사용을 포함할 수 있는 적합한 기법에 의해, 펠렛화 전에 압출 또는 팽창을 포함하는 추가적인 단계를 포함할 수 있다.
사료물은 단위 동물, 예컨대 가금류 (예를 들어, 육용계, 산란계, 육용계 종계, 칠면조, 오리, 거위, 물새), 돼지 (모든 연령 카테고리), 애완동물 (예를 들어 개, 고양이) 또는 물고기에 대한 사료물일 수 있고, 바람직하게는 사료물은 가금류를 위한 것이다.
사료 첨가제 조성물
본 발명의 사료 첨가제 조성물 및/또는 이를 포함하는 사료물은 임의의 적합한 형태로 사용될 수 있다.
본 발명의 사료 첨가제 조성물은 고체 또는 액체 제제 또는 이의 대안물의 형태로 사용될 수 있다. 고체 제제의 예는 습윤성, 분무-건조 또는 동결-건조될 수 있는 분말, 페이스트, 환약 (boluses), 캡슐, 펠렛, 정제, 분제 (dusts), 및 과립을 포함한다. 액체 제제의 예는 수성, 유기 또는 수성-유기 용액, 현탁액 및 에멀젼을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 적용에서, 본 발명의 사료 첨가제 조성물은 사료와 혼합될 수 있거나, 식수에 투여될 수 있다.
하나의 앙태에서, 본 발명은 본원에 교시된 자일라나아제를 사료 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 혼합하고, (임의로는) 패키징하는 것을 포함하는, 사료 첨가제 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.
프리믹스
사료물 및/또는 사료 첨가제 조성물은 하나 이상의 무기질 및/또는 하나 이상의 비타민과 조합될 수 있다. 그렇게 유래된 조성물은 본원에서 프리믹스로서 언급될 수 있다.
옥수수 기재 사료물
바람직한 구현예에서, 사료물은 옥수수 기재 사료물일 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "옥수수 기재 사료물" 는 옥수수 (메이즈) 또는 옥수수의 부산물을 포함하거나 이로 이루어지는 사료물을 의미한다.
바람직하게는 옥수수 기재 사료물은 주요 구성성분으로서 옥수수 또는 옥수수의 부산물을 포함한다. 예를 들어 옥수수 기재 사료물은 35% 이상의 옥수수 또는 옥수수 부산물, 예컨대 40% 이상의 옥수수 또는 옥수수 부산물, 예컨대 50% 이상의 옥수수 또는 옥수수 부산물, 예컨대 60% 이상의 옥수수 또는 옥수수 부산물, 예컨대 70% 이상의 옥수수 또는 옥수수 부산물, 예컨대 80% 이상의 옥수수 또는 옥수수 부산물, 예컨대 90% 이상의 옥수수 또는 옥수수 부산물, 예를 들어 100% 의 옥수수 또는 옥수수 부산물을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 옥수수 기재 사료물은 미량 구성성분으로서 옥수수 또는 옥수수의 부산물을 포함할 수 있는데; 이 경우 사료물은 옥수수 또는 옥수수의 부산물로 보충될 수 있다. 예를 들어, 오직 사료물이 예를 들어 옥수수 또는 옥수수의 부산물로 보충된 밀을 포함할 수 있다.
옥수수 또는 옥수수의 부산물이 사료물의 미량 구성성분인 경우, 옥수수 또는 옥수수의 부산물은 사료물의 5% 이상, 바람직하게는 10% 이상, 바람직하게는 20% 이상, 바람직하게는 30% 이상이다.
의심의 여지 없이, 본원에서 사용되는 용어 "옥수수 (corn)" 는 옥수수 (maize), 예를 들어, 제아 메이즈 (Zea mays) 와 동의어이다.
한 구현예에서, 옥수수의 부산물은 옥수수 주정혼합박 (cDDGS) 또는 옥수수 웨트-케이크 또는 옥수수 주정박 (DDG) 또는 옥수수 글루텐 박 또는 옥수수 글루텐 사료 또는 이의 조합일 수 있다.
한 구현예에서, 바람직하게는 본 발명의 사료물 또는 옥수수 부산물은 옥수수의 부산물, 예컨대 옥수수 주정혼합박 (cDDGS) 또는 옥수수 웨트-케이크 또는 옥수수 주정박 (DDG) 또는 옥수수 글루텐 박 또는 옥수수 글루텐 사료 또는 이의 조합을 포함한다.
옥수수 부산물
옥수수 부산물은 옥수수 또는 옥수수 처리에서 유래한 임의의 생성물일 수 있다.
옥수수 부산물의 예는 옥수수의 부산물인 임의의 아라비노자일란-함유 물질, 예컨대 옥수수 주정혼합박 (cDDGS) 또는 옥수수 웨트-케이크 또는 옥수수 주정박 (DDG) 또는 옥수수 글루텐 박 또는 옥수수 글루텐 사료 또는 이의 조합이다.
웨트-케이크, 주정박 (DDG) 및 주정혼합박 (DDGS)
웨트-케이크, 주정박 및 주정혼합박은 곡물 증류 산업에서 사용되는 방법에 의해 곡물 또는 곡물 혼합물의 효모 발효로부터 증류에 의해 에틸 알코올을 제거한 후 수득되는 생성물이다.
증류로부터 유래하는 주정찌꺼기 (예를 들어 물, 곡물의 나머지, 효모 세포 등 포함) 는 "고체" 부분과 액체 부분으로 분리된다.
고체 부분은 "웨트-케이크" 라고 지칭되고 그대로 동물 사료로서 사용될 수 있다.
액체 부분은 (부분적으로) 시럽 (가용물) 으로 증발된다.
웨트-케이크가 건조되는 경우, 이것은 주정박 (DDG) 이다.
웨트-케이크가 시럽 (가용물) 과 함께 건조되는 경우, 이것은 주정혼합박 (DDGS) 이다.
웨트-케이크는 낙농 작업 및 육우 사육장에서 사용될 수 있다.
건조된 DDGS 는 가축 (예를 들어 낙농, 소고기용 및 돼지) 사료 및 가금류 사료에 사용될 수 있다.
옥수수 DDGS 는 젖소를 위한 매우 양호한 단백질 공급원이다.
옥수수 글루텐 박 (CGM)
한 양태에서, 옥수수의 부산물은 옥수수 글루텐 박 (CGM) 일 수 있다.
CGM 은 옥수수 제분 산업의 분말성 부산물이다. CGM 은, 예를 들어, 동물 사료에서 유용성을 갖는다. 이는 사료, 예컨대 애완동물 사료, 가축 사료 및 가금류 사료를 위한 값싼 단백질 공급원으로서 사용될 수 있다. 이는 아미노산 시스테인의 특히 유용한 공급원이나, 라이신에 대해 기타 단백질로 균형을 맞춰야만 한다.
밀 기재 사료물
바람직한 구현예에서, 사료물은 밀 기재 사료물일 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "밀 기재 사료물" 은 밀 또는 밀의 부산물을 포함하거나 이로 이루어지는 사료물을 의미한다.
바람직하게는 밀 기재 사료물은 주요 구성성분으로서 밀 또는 밀의 부산물을 포함한다. 예를 들어 밀 기재 사료물은 40% 이상의 밀 또는 밀 부산물, 예컨대 60% 이상의 밀 또는 밀 부산물, 예컨대 80% 이상의 밀 또는 밀 부산물, 예컨대 90% 이상의 밀 또는 밀 부산물, 예를 들어 100% 의 밀 또는 밀 부산물을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 밀 기재 사료물은 미량 구성성분으로서 밀 또는 밀의 부산물을 포함할 수 있는데; 이 경우 사료물은 밀 또는 밀의 부산물로 보충될 수 있다. 예를 들어, 오직 사료물이 예를 들어 밀 또는 밀의 부산물로 보충된 밀을 포함할 수 있다.
밀 또는 밀의 부산물이 사료물의 미량 구성성분인 경우, 밀 또는 밀의 부산물은 사료물의 5% 이상, 바람직하게는 10% 이상, 바람직하게는 20% 이상, 바람직하게는 30% 이상이다.
한 구현예에서, 밀의 부산물은 예를 들어 밀기울, 밀 미들링, 밀 섬유질일 수 있다.
겨는 곡물의 딱딱한 외부 층이고, 조합된 호분 및 과피로 이루어진다. 싹과 함께, 이것은 통 곡물의 필수적인 부분이고, 종종 정제된 곡물의 제조시 제분의 부산물로서 제조된다. 겨를 곡물로부터 제거하는 경우, 곡물은 그의 영양가의 일부를 상실한다. 겨는 벼, 옥수수, 밀, 귀리, 보리 및 기장을 포함하는 임의의 곡식 곡물 내에 존재하고 그로부터 제분될 수 있다. 겨에는 특히 식이 섬유 및 필수 지방산이 풍부하고, 상당량의 전분, 단백질, 비타민 및 식이 무기질을 함유한다.
밀 미들링은 밀기울의 거친 입자 및 미립자 및 밀 쇼오츠, 밀 싹, 밀가루 및 "제분 꼬리 (tail of the mill)" 로부터의 찌꺼기의 미립자이다.
밀 미들링은 인간 음식물 및 동물 사료의 값싼 부산물 중간체이다. 한 구현예에서, 바람직하게는 본 발명의 아라비노자일란-함유 물질은 밀기울 및/또는 밀 미들링을 포함한다.
맥아제조 (MALTING) 및 양조 (BREWING)
한 구현예에서 옥수수 기재 생성물은 옥수수 기재 곡물-물질, 매쉬, 맥아즙, 부원료 (adjunct), 맥아 또는 그의 일부 (예를 들어 양조 또는 맥아제조에서 사용됨) 일 수 있다.
본 발명의 효소 (또는 본 발명의 효소를 포함하는 조성물) 는 맥아제조 및 양조에서 사용될 수 있다.
아라비노자일란 (AXsol) 및 베타-글루칸의 효율적 가수분해는 중요하며, 그 이유는 그러한 화합물이 생산 문제 예컨대 맥아즙 점도 (Ducroo, P. & Frelon, P.G., Proceedings of the European Brewery Convention Congress, Zurich, 1989, 445; Vietor, R.J. & Voragen, A.G.J., Journal of the Institute of Brewing, 1993, 99, 243) 및 여과성 및 헤이즈 형성 (Coote, N. & Kirsop, B.H. 1976., Journal of the Institute of Brewing, 1976, 82, 34; Izawa, M., Kano, Y. & Kanimura, M. 1991. Proceedings Aviemore Conference on Malting, brewing and Distillling, 1990, 427) 에 관여될 수 있기 때문이다.
본 발명은 맥아제조 및 양조 동안 아라비노자일란 (예를 들어 AXinsol 및 AXsol) 의 가수분해 방법을 제공하며, 이때 옥수수 기재 곡물-물질, 매쉬, 맥아즙, 부원료, 맥아, 그의 일부, 또는 이의 조합이 본 발명의 효소와 혼합된다.
한 양태에서 본 발명은 SEQ ID No. 6 또는 SEQ ID No. 7 또는 SEQ ID No. 8 과 85% 이상의 동일성을 갖는 SEQ ID No. 6 또는 SEQ ID No. 7 또는 SEQ ID No. 8 에서 나타낸 바와 같은 폴리펩티드; 또는 이의 변이체, 단편, 상동체 또는 유도체를 포함하는 자일라자아제; 또는 SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 또는 SEQ ID No. 3 으로서 본원에 나타낸 뉴클레오티드 서열, 또는 높은 엄격도 조건 하에 SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 또는 SEQ ID No. 3 의 상보체에 하이브리드화될 수 있는 뉴클레오티드 서열, 또는 SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 또는 SEQ ID No. 3 과 80% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 자일라나아제를 포함하는, 발효 음료 예컨대 맥주 및 와인을 포함하나 그에 제한되지 않는, 음료인 식품 조성물에 관한 것일 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "발효 음료" 는 발효 과정, 예컨대 미생물 발효, 예컨대 박테리아 및/또는 효모 발효를 포함하는 방법에 의해 생산된 임의의 음료를 포함하는 것을 의미한다.
본 발명의 양태에서 발효 음료는 맥주이다. 용어 "맥주" 는 전분-함유 식물 물질의 발효/양조에 의해 생산된 임의의 발효된 맥아즙을 포함하는 것을 의미한다. 종종, 맥주는 전분-함유 식물 물질로서 맥아 또는 부원료, 또는 맥아와 부원료의 임의의 조합으로부터 생산된다. 본원에서 사용되는 용어 "맥아 (malt)" 는 임의의 맥아제조된 곡류 곡물, 예컨대 맥아제조된 보리 또는 밀로서 이해된다.
본원에서 사용되는 용어 "부원료" 는 맥아, 예컨대 보리 또는 밀 맥아가 아닌 임의의 전분 및/또는 당 함유 식물 물질을 의미한다. 부원료의 예로서, 통상적 옥수수 그리트 (grit), 정제된 옥수수 그리트, 양조업자의 제분된 (brewer's milled) 효모, 쌀, 수수, 정제된 옥수수 전분, 보리, 보리 전분, 도정된 보리, 밀, 밀 전분, 말린 (torrified) 곡류, 곡류 플레이크, 호밀, 귀리, 옥수수 (메이즈), 감자, 타피오카, 카사바 및 시럽, 예컨대 옥수수 시럽, 사탕수수 시럽, 전화당 시럽, 보리 및/또는 밀 시럽 등의 재료가 전분의 공급원으로서 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는, 용어 "매쉬 (mash)" 는 나중에 맥아즙 및 사용된 (spent) 곡물로 분리되는 물과 혼합된, 예를 들어 파쇄된 보리 맥아, 파쇄된 보리, 및/또는 기타 부원료 또는 이의 조합을 포함하는, 임의의 전분 및/또는 당 함유 식물 물질 예컨대 찧은 곡식 (grist) 의 수성 슬러리를 의미한다.
본원에서 사용되는, 용어 "맥아즙 (wort)" 은 담금 (mashing) 동안 찧은 곡식을 추출한 후의 발효되지 않은 리큐어 런오프 (liquor run-off) 이다.
또 다른 양태에서 본 발명은 본 발명의 자일라나아제를 맥아 또는 부원료와 혼합하는 단계를 포함하는 발효 음료 예컨대 맥주의 제조 방법에 관한 것이다.
맥주의 예는 하기를 포함한다: 풀 몰티드 비어 (full malted beer), 독일맥주순수령 하에 양조된 맥주 (beer brewed under the "Reinheitsgebot"), 에일 (ale), IPA, 라거 (lager), 비터 (bitter), 발포주 (Happoshu) (세컨드 비어 (second beer)), 써드 비어 (third beer), 드라이 비어 (dry beer), 니어 비어 (near beer), 라이트 비어 (light beer), 저알코올 맥주, 저칼로리 맥주, 흑맥주 (porter), 보크 비어 (bock beer), 스타웃 (stout), 몰트 리큐어 (malt liquor), 비-알코올성 맥주, 비-알코올성 몰트 리큐어 등, 뿐만 아니라 대안적 곡류 및 맥아 음료 예컨대 과실 가향 맥아 음료, 예를 들어 시트러스 가향, 예컨대 레몬-, 오렌지-, 라임-, 또는 베리-가향 맥아 음료, 리큐어 가향 맥아 음료, 예를 들어, 보드카-, 럼-, 또는 데킬라-가향 몰트 리큐어, 또는 커피 가향 맥아 음료, 예컨대 카페인-가향 몰트 리큐어 등.
자일란-함유 물질
본 발명의 방법 및 용도에서 사용되는 자일라나아제 (또는 본 발명의 방법 및 용도에서 사용되는 자일라나아제를 포함하는 조성물) 는 임의의 자일란-함유 물질을 분해하는데 사용될 수 있다.
따라서 식물 조성물, 옥수수 및/또는 옥수수 부산물은 자일란-함유 물질을 포함한다.
한 구현예에서 식물 조성물, 옥수수 및/또는 옥수수 부산물은 불용성 아라비노자일란 (AXinsol) 을 포함한다.
붕괴 또는 분해
본 발명의 또는 본원에 개시된 효소 (또는 본 발명의 효소를 포함하는 조성물) 는 식물 조성물, 옥수수 기재 생성물, 옥수수, 옥수수 부산물 또는 사료물 중 AXinsol 또는 AXsol 또는 AXinsol 의 분해 산물을 붕괴 (분해) 시키는데 사용될 수 있다. 용어 "붕괴" 또는 "분해" 는 가수분해와 동의어로 사용된다.
가용화 / 분해
본 발명은 자일란-함유 물질로부터의 아라비노자일란 분해 방법, 및 옥수수 기재 생성물, 예컨대 옥수수를 포함하는 사료 또는 사료 첨가제 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.
적합하게는, 본 발명은 식물 조성물, 옥수수 기재 생성물, 옥수수, 옥수수 부산물 또는 사료물 중 자일란-함유 물질 (바람직하게는 아라비노자일란-함유 물질, 바람직하게는 불용성 아라비노자일란 (AXinsol)-함유 물질) 을 분해하여 가용성 펜토산 (이는 중합체, 올리고머 또는 단량체일 수 있음) 을 생산하는 것에 관한 것일 수 있다.
이러한 방법은 본원에서 펜토산 가용화 또는 아라비노자일란 가용화 또는 AXinsol 가용화 또는 AXinsol 의 분해로서 기재될 수 있다.
한 구현예에서, 본 발명은 불용성 아라비노자일란 (AXinsol) 의 분해 (또는 붕괴) 방법에 관한 것이다. 이는 또한 불용성 아라비노자일란의 가용화 및/또는 펜토산의 가용화로 언급될 수 있다.
본 발명의 추가 구현예에서 본 방법은 불용성 아라비노자일란의 분해에서 유래하는 중합체의 분해 (예를 들어 붕괴) 방법에 관한 것이다.
적합하게는, 이러한 방법은 옥수수 기재 생성물 또는 옥수수를 포함하는 식물 조성물을 분해하여 당류 예컨대 C5 및 C6 당 (바람직하게는, 펜토산 예컨대 자일로오스) 을 생성하는 것을 수반할 수 있다.
적합하게는, 이러한 방법은 옥수수에 존재하는 자일란-함유 물질 (바람직하게는 아라비노자일란-함유 물질) 을 분해하여 당류 예컨대 C5 및 C6 당 (바람직하게는, 펜토산 예컨대 자일로오스) 을 생성하는 것을 수반할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "가용화" 는 옥수수에 존재하는 자일란-함유 물질 (바람직하게는 아라비노자일란-함유 물질) 을 분해하여 당류 예컨대 C5 및 C6 당 (바람직하게는, 펜토산 예컨대 자일로오스) 을 생성하는 것을 의미한다.
아라비노자일란 (AX)
본원에서 사용되는 용어 "아라비노자일란" (AX) 은 사슬 전체에서 자일로오스 단위에 1α→2 및/또는 1α→3 연결에 의해 무작위로 부착된 L-아라비노푸라노오스 (5-원 고리 형태의 L-아라비노오스) 를 갖는 자일란 백본 (1,4-연결된 자일로오스 단위) 으로 이루어지는 다당류를 의미한다. 아라비노자일란은 식물의 일차 및 이차 세포벽 모두에서 발견되는 헤미셀룰로스이다. 아라비노자일란은 풀 및 곡물 예컨대 밀, 메이즈 (옥수수), 호밀, 및 보리의 겨에서 발견될 수 있다.
아라비노자일란 (AX) 은 식물 세포벽과 밀접하게 연관되어 발견되며, 식물 세포벽에서 그것은 식물 세포벽 및 조직의 다양한 빌딩 블록을 연결하는 접착제로서 작용하여, 구조적 강성 및 강직성을 제공한다.
본원에서 사용되는 용어 "펜토산" 은 주로 펜토오스로 구성되는 다당류를 의미한다.
자일로오스 및 아라비노오스 (아라비노자일란의 구성성분) 는 둘다 펜토오스이므로, 아라비노자일란은 통상적으로 펜토산으로 분류된다.
AX 은 밀 및 옥수수를 포함하는 가장 중요한 사료 원재료 중 여럿에서 주요 비 전분 다당류 (NSP)-분획물이다.
그의 존재비, 식물 재료 내에서의 위치 및 분자 구조는 AX 가 사료 소화율에 심각한 부정적 영향을 미치게 하며, 이것이 존재하는 원재료의 영양가를 효과적으로 감소시킨다. 이는 AX 를 중요한 항-영양 인자로 만들며, 동물 생산 효율을 감소시킨다.
본원에서 사용되는 용어 "헤미셀룰로오스" - 는 셀룰로오스 이외의 식물 세포벽의 다당류 구성성분을 의미한다. 본원에서 사용되는 용어 "헤미셀룰로오스" 는 알칼리 용액을 희석함으로써 추출가능한 식물 세포벽 내의 다당류를 의미할 수 있다. 헤미셀룰로오스는 목본 식물 조직 내 탄수화물의 거의 3 분의 1 을 구성한다. 헤미셀룰로오스의 화학적 구조는 여러 가지 펜토오스, 헥소오스, 및 그들의 상응하는 우론산의 긴 사슬로 이루어진다. 헤미셀룰로오스는 과실, 식물 줄기, 및 곡물 껍질에서 발견될 수 있다. 자일란 (Xylan) 은 1β→4 연결을 갖는 D-자일로오스 단위로 이루어지는 펜토산의 예이다.
수-불용성 아라비노자일란 (AXinsol)
또한 수-비추출성 아라비노자일란 (WU-AX) 으로도 공지된 수-불용성 아라비노자일란 (AXinsol) 은 식물 재료의 건조물의 상당한 비율을 구성한다.
옥수수에서, AXinsol 은 건조물의 3.5-6% (예를 들어, 5.1%) 를 차지할 수 있다. 옥수수에서, DDGS AXinsol 은 건조물의 10-20% (예를 들어, 12.6%) 를 차지할 수 있다.
AXinsol 은 사료 내 영양소 포획을 야기한다. 많은 양의 소화가 잘되는 영양소 예컨대 전분 및 단백질은 세포벽 물질의 클러스터에 둘러싸이거나 AX 의 측쇄에 결합된 상태로 유지된다. 이들 포획된 영양소는 소화 및 후속적인 소장에서의 흡수에 이용가능하지 않을 것이다.
수용성 아라비노자일란 (AXsol)
사료에서 수용성 아라비노자일란 (AXsol) 은 AXsol 의 특별한 물-결합 능력에 의해 야기되는, 장 내용물의 점도의 상당한 증가를 야기하므로 특히 단위동물에서 항-영양 효과를 가질 수 있다. 점도 증가는 사료와 소화 효소 및 담즙산염의 적절한 혼합을 방해하고/하거나 영양소 이용률 및 흡수를 둔화시키고/시키거나 후장에서 발효를 자극할 수 있으므로 사료 소화 및 영양소 이용에 영향을 미칠 수 있다.
옥수수에서, AXsol 은 건조물의 0.1-0.4% (예를 들어, 0.1%) 를 차지할 수 있다. 옥수수에서, DDGS AXinsol 은 건조물의 0.3-2.5% (예를 들어, 0.4%) 를 차지할 수 있다.
그러나, 식물 재료에 존재하는 AXsol 의 양에 더하여, 자일라나아제가 식물 물질 중 AXinsol 을 가용화할 때, 이는 식물 물질의 AXsol 함량에 기여하는 펜토산 및/또는 올리고머를 배출할 수 있다.
본원에 개시된 자일라나아제의 하나의 장점은 그것이 AXinsol 을 가용화시킬 뿐만 아니라 가용화된 올리고머 및/또는 펜토산을 신속하고 효율적으로 붕괴시키는 능력을 갖고, 따라서 효소가 AXinsol 을 점도 증가 및/또는 점도 감소 없이 가용화시킬 수 있다는 것이다.
AXsol 의 붕괴로 영양소가 배출될 수 있다.
사료 성분
본 발명의 사료 첨가제 조성물은 사료 성분으로서 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "사료 성분" 은 기능성 사료 또는 사료물에 영양 보충제 및/또는 섬유소 보충제로서 첨가되는 또는 첨가될 수 있는 제형을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 사료 성분은 또한 점도 증가 없이, 겔화, 텍스처화 (texturising), 안정화, 현탁화, 필름-형성 및 구조화, 다즙성의 유지 및 향상된 식감을 요구하는 여러 가지 생성물에서 낮은 수준으로 사용될 수 있는 제형을 의미한다.
사료 성분은 용도 및/또는 적용 방식 및/또는 투여 방식에 따라 용액 또는 고체 형태일 수 있다.
자일라나아제
한 양태에서 본 발명의 방법, 용도, 조성물 및/또는 옥수수 기재 생성물 (예를 들어 사료) 에서 사용되는 자일라나아제는 SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 또는 SEQ ID No. 8 과 80% 이상의 동일성 (적합하게는 85% 이상, 적합하게는 90% 이상, 적합하게는 95% 이상의 동일성) 을 갖는 SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 또는 SEQ ID No. 8 로서 본원에 나타낸 폴리펩티드 서열, 또는 이의 변이체, 단편, 상동체 또는 유도체를 포함하는 (또는 이로 이루어지는) 자일라나아제; 또는 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 로서 본원에 나타낸 뉴클레오티드 서열, 또는 높은 엄격도 조건 하에 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 에 하이브리드화될 수 있는 뉴클레오티드 서열, 또는 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 와 80% 이상 (적합하게는 85% 이상, 적합하게는 90% 이상, 적합하게는 93% 이상) 의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 자일라나아제, 또는 푸사리움 옥시스포룸으로부터 수득가능한 (또는 수득되는) 자일라나아제이다.
적합하게는, 자일라나아제는 SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 또는 SEQ I D No. 8 과 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.
적합하게는, 자일라나아제는 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ I D No. 5 와 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩티드를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.
투여량
바람직하게는, 자일라나아제는 자일란-함유 물질 (예를 들어 사료물) 에 약 500XU/kg 내지 약 16,000XU/kg 자일란-함유 물질 (예를 들어 사료), 보다 바람직하게는 약 750XU/kg 사료 내지 약 8000XU/kg 자일란-함유 물질 (예를 들어 사료), 보다 더 바람직하게는 약 1000XU/kg 자일란-함유 물질 (예를 들어 사료) 내지 약 4000XU/kg 자일란-함유 물질 (예를 들어 사료) 범위로 존재한다.
한 구현예에서 자일라나아제는 자일란-함유 물질 (예를 들어 사료물) 에 약 500XU/kg 자일란-함유 물질 (예를 들어 사료) 초과, 적합하게는 약 600XU/kg 자일란-함유 물질 (예를 들어 사료) 초과, 적합하게는 약 700XU/kg 자일란-함유 물질 (예를 들어 사료) 초과, 적합하게는 약 800XU/kg 자일란-함유 물질 (예를 들어 사료) 초과, 적합하게는 약 900XU/kg 자일란-함유 물질 (예를 들어 사료) 초과, 적합하게는 약 1000XU/kg 자일란-함유 물질 (예를 들어 사료) 초과로 존재한다.
한 구현예에서 자일라나아제는 자일란-함유 물질 (예를 들어 사료물) 에 약 16,000XU/kg 자일란-함유 물질 (예를 들어 사료) 미만, 적합하게는 약 8000XU/kg 자일란-함유 물질 (예를 들어 사료) 미만, 적합하게는 약 7000XU/kg 자일란-함유 물질 (예를 들어 사료) 미만, 적합하게는 약 6000XU/kg 자일란-함유 물질 (예를 들어 사료) 미만, 적합하게는 약 5000XU/kg 자일란-함유 물질 (예를 들어 사료) 미만, 적합하게는 약 4000XU/kg 자일란-함유 물질 (예를 들어 사료) 미만으로 존재한다.
바람직하게는, 자일라나아제는 사료 첨가제 조성물에 약 100XU/g 내지 약 320,000XU/g 조성물, 보다 바람직하게는 약 300XU/g 조성물 내지 약 160,000XU/g 조성물, 보다 더 바람직하게는 약 500XU/g 조성물 내지 약 50,000 XU/g 조성물, 보다 더욱 바람직하게는 약 500XU/g 조성물 내지 약 40,000 XU/g 조성물의 범위로 존재할 수 있다.
한 구현예에서 자일라나아제는 사료 첨가제 조성물에 약 100XU/g 조성물 초과, 적합하게는 약 200XU/g 조성물 초과, 적합하게는 약 300XU/g 조성물 초과, 적합하게는 약 400XU/g 조성물 초과, 적합하게는 약 500XU/g 조성물 초과로 존재한다.
한 구현예에서 자일라나아제는 사료 첨가제 조성물에 약 320,000XU/g 조성물 미만, 적합하게는 약 160,000XU/g 조성물 미만, 적합하게는 약 50,000XU/g 조성물 미만, 적합하게는 약 40,000XU/g 조성물 미만, 적합하게는 약 30000XU/g 조성물 미만으로 존재한다.
1 자일라나아제 단위 (XU) 가 pH 5.3 및 50℃ 에서 분 당 귀리-스펠트 (spelt)-자일란 기질로부터 0.5 μmol 의 환원당 당량을 배출하는 효소의 양 (디니트로살리실산 (DNS) 검정에 의한 자일로오스로서 - 환원당 방법) 이라는 것이 이해될 것이다 (Bailey, M.J. Biely, P. and Poutanen, K., Journal of Biotechnology, Volume 23, (3), May 1992, 257-270).
한 구현예에서 적합하게는 효소는 상기 E.C. 분류를 사용하여 분류되고, E.C. 분류는 1 XU 를 결정하기 위한 본원에 개시된 검정에서 시험될 때의 활성을 갖는 효소를 지정한다.
본 발명에 따른 효소 및/또는 효소를 포함하는 조성물은 1-회 투여를 위해 디자인될 수 있거나 매일 사용 (예를 들어 사료공급 (feeding)) 을 위해 디자인될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 효소 및/또는 효소를 포함하는 조성물의 최적량은 처리되는 생성물 및/또는 생성물을 조성물과 접촉시키는 방법 및/또는 그의 의도되는 용도에 따라 달라질 것이다.
조성물에서 사용되는 효소의 양은 효과적이기에 충분한 양이어야 한다.
조성물에서 사용되는 효소의 양은 예를 들어 상기 조성물을 함유하는 사료 생성물을 공급받는 동물의 성능을 향상시키거나, 반죽 및 구운 생성물의 반죽 및 굽기 특성을 향상시킴에 있어서 효과적이고 충분히 효과적으로 유지되에 충분한 양이어야 한다. 이러한 효과성의 시간 길이는 적어도 생성물 (예를 들어 사료 첨가제 조성물 또는 이를 함유하는 사료) 의 이용 시간까지 연장되어야 한다.
제형
한 구현예에서 효소는 액체, 건조 분말 또는 과립으로서 제형화될 수 있다.
건조 분말 또는 과립은 당업자에게 공지된 방법에 의해, 예컨대 탑-스프레이 유동층 코팅기 (top-spray fluid bed coater), 바텀 스프레이 부르스터 (buttom spray Wurster) 에서 또는 드럼 과립화 (drum granulation) (예를 들어 하이 시어 과립화 (high sheer granulation)), 압출, 팬 (pan) 코팅에 의해 또는 미량성분 혼합기에서 제조될 수 있다.
일부 구현예에서 효소는 코팅, 예를 들어 캡슐화될 수 있다.
한 구현예에서 코팅은 효소를 열로부터 보호하고, 열예방보호제로서 여겨질 수 있다.
한 구현예에서 WO2007/044968 (TPT 과립으로 지칭) 또는 WO1997/016076 또는 WO1992/012645 (이들은 각각 본원에 참조로 포함됨) 에 기재된 바와 같이 사료 첨가제 조성물은 건조 분말 또는 과립으로 제형화된다.
한 구현예에서 사료 첨가제 조성물은 코어; 활성제; 및 하나 이상의 코팅을 포함하는 사료 조성물용 과립으로 제형화될 수 있고, 상기 과립의 활성제는 a) 사료 펠렛화 과정, b) 증기-가열되는 사료 전처리 과정, c) 저장, d) 미펠렛화 혼합물 중 성분으로서 저장, 및 e) 미량 미네랄, 유기 산, 환원당, 비타민, 콜린 클로라이드로부터 선택되는 하나 이상의 화합물, 및 산성 또는 염기성 사료 베이스 믹스 또는 사료 프리믹스를 초래하는 화합물을 포함하는 사료 베이스 믹스 또는 사료 프리믹스 중 성분으로서 저장, 중 하나 이상으로부터 선택되는 조건 후에 50% 이상의 활성, 60% 이상의 활성, 70% 이상의 활성, 80% 이상의 활성을 보유한다.
과립에 관하여 하나 이상의 코팅은 과립의 55% w/w 이상을 구성하는 수분 수화 물질을 포함할 수 있고/있거나; 하나 이상의 코팅은 2 개의 코팅을 포함할 수 있다. 2 개의 코팅은 수분 수화 코팅 및 수분 장벽 코팅일 수 있다. 일부 구현예에서, 수분 수화 코팅은 과립의 25% 내지 60% w/w 일 수 있고, 수분 장벽 코팅은 과립의 2% 내지 15% w/w 일 수 있다. 수분 수화 코팅은 무기 염, 수크로오스, 전분, 및 말토덱스트린으로부터 선택될 수 있고, 수분 장벽 코팅은 중합체, 검, 유장 및 전분으로부터 선택될 수 있다.
과립은 사료 펠렛화 과정을 사용하여 생산될 수 있고, 사료 전처리 과정은 70℃ 내지 95℃ 에서 수 분 동안, 예컨대 85℃ 내지 95℃ 에서 수행될 수 있다.
한 구현예에서 사료 첨가제 조성물은 코어; 활성제 (과립의 활성제는 저장 후에 및 과립이 성분인 증기-가열되는 펠렛화 과정 후에 80% 이상의 활성을 보유함); 수분 장벽 코팅; 및 수분 수화 코팅 (과립의 25% w/w 이상임) 을 포함하는 동물 사료용 과립으로 제형화될 수 있고, 상기 과립은 증기-가열되는 펠렛화 과정 전에 0.5 미만의 물 활성을 갖는다.
과립은 중합체 및 검으로부터 선택되는 수분 장벽 코팅을 가질 수 있고, 수분 수화 물질은 무기 염일 수 있다. 수분 수화 코팅은 과립의 25% 내지 45% w/w 일 수 있고, 수분 장벽 코팅은 과립의 2% 내지 10% w/w 일 수 있다.
과립은 85℃ 내지 95℃ 에서 수 분 동안 수행될 수 있는 증기-가열되는 펠렛화 과정을 사용하여 생산될 수 있다.
일부 구현예에서 효소는 희석제, 예컨대 전분 분말, 석회석 등을 사용하여 희석될 수 있다.
한 구현예에서, 효소 또는 효소를 포함하는 조성물은 소비에 적합한 액체 제형 중에 있고, 바람직하게는 이러한 액체 소비물은 완충제, 염, 소르비톨 및/또는 글리세롤 중 하나 이상을 함유한다.
또 다른 구현예에서 효소 또는 효소를 포함하는 조성물은 효소(들) 를 담체 기질, 예컨대 분쇄된 밀 상에 적용, 예를 들어 분무하여 제형화될 수 있다.
한 구현예에서 효소 또는 본 발명에 따른 효소를 포함하는 조성물은 프리믹스로서 제형화될 수 있다. 단지 예로서 프리믹스는 하나 이상의 사료 성분, 예컨대 하나 이상의 미네랄 및/또는 하나 이상의 비타민을 포함할 수 있다.
한 구현예에서 본 발명에서 사용되는 효소는 말토덱스트린, 석회석 (탄산칼슘), 시클로덱스트린, 밀 또는 밀 성분, 수크로오스, 전분, Na2SO4, 탈크, PVA, 소르비톨, 벤조에이트, 소르비에이트, 글리세롤, 수크로오스, 프로필렌 글리콜, 1,3-프로판 디올, 글루코오스, 파라벤, 염화나트륨, 시트레이트, 아세테이트, 포스페이트, 칼슘, 메타바이술파이트, 포르메이트 및 이의 혼합물 중 하나 이상으로부터 선택되는 하나 이상의 생리학적으로 허용가능한 담체와 함께 제형화된다.
패키징
한 구현예에서 효소 및/또는 이를 포함하는 조성물 (예를 들어 사료 첨가제 조성물) 및/또는 프리믹스 및/또는 본 발명에 따른 사료 또는 사료물은 패키징된다.
한 바람직한 구현예에서 사료 첨가제 조성물 및/또는 프리믹스 및/또는 사료 또는 사료물은 백 (bag), 예컨대 종이 백 (paper bag) 내에 패키징된다.
대안적 구현예에서 사료 첨가제 조성물 및/또는 프리믹스 및/또는 사료 또는 사료물은 용기 내에 밀봉될 수 있다. 임의의 적합한 용기가 사용될 수 있다.
형태
본 발명의 효소 또는 본 발명의 효소를 포함하는 조성물 (예를 들어 사료 첨가제 조성물) 및 기타 성분 및/또는 이를 포함하는 사료물은 임의의 적합한 형태로 사용될 수 있다.
본 발명의 효소 또는 본 발명의 효소를 포함하는 조성물 (예를 들어 사료 첨가제 조성물) 은 고체 또는 액체 제제 또는 그의 대안적 형태로 사용될 수 있다. 고체 제제의 예는 분말, 페이스트, 볼루스 (bolus), 캡슐, 펠렛, 정제, 알약, 캡슐, 오불 (ovule), 용액 또는 현탁액, 분진, 및 수화, 분무-건조 또는 동결-건조될 수 있는 과립을 포함한다. 액체 제제의 예는 수성, 유기 또는 수성-유기 용액, 현탁액 및 에멀젼을 포함하나 그에 제한되지 않는다.
본 발명의 효소를 포함하는 조성물은 즉시 (immediate)-, 지연 (delayed)-, 변형 (modified)-, 지속 (sustained)-, 맥동 (pulsed)- 또는 제어 (controlled)-방출형 적용물을 위한 향미 또는 착색제를 함유할 수 있다.
예로서, 본 발명의 조성물이 고체, 예를 들어 펠렛화된 형태로 사용되는 경우, 이는 또한 하기 중 하나 이상을 함유할 수 있다: 부형제 예컨대 미세결정질 셀룰로오스, 락토오스, 나트륨 시트레이트, 탄산칼슘, 2염기 칼슘 포스페이트 및 글리신; 붕괴제 예컨대 전분 (바람직하게는 옥수수, 감자 또는 타피오카 전분), 나트륨 전분 글리콜레이트, 크로스카르멜로오스 나트륨 및 특정 복합 실리케이트; 과립화 결합제 예컨대 폴리비닐피롤리돈, 히드록시프로필메틸셀룰로오스 (HPMC), 히드록시프로필셀룰로오스 (HPC), 수크로오스, 겔라틴 및 아카시아; 윤활제 예컨대 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산, 글리세릴 베헤네이트 및 탈크.
상기 형태를 제조하는데 사용되는 영양적으로 허용가능한 담체의 예는, 예를 들어 물, 염 용액, 알코올, 실리콘, 왁스, 페트롤륨 젤리, 식물성 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 리포좀, 당, 겔라틴, 락토오스, 아밀로오스, 마그네슘 스테아레이트, 탈크, 계면활성제, 규산, 점성 파라핀, 퍼퓸 오일, 지방산 모노글리세리드 및 디글리세리드, 페트로에트랄 지방산 에스테르, 히드록시메틸-셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈 등을 포함한다.
상기 형태에 바람직한 부형제는 락토오스, 전분, 셀룰로오스, 유당 또는 고분자량 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다.
수성 현탁액 및/또는 엘릭시르 (elixir) 의 경우, 본 발명의 조성물은 다양한 감미 또는 향미제, 색소 또는 염료, 유화 및/또는 현탁제 및 희석제 예컨대 물, 프로필렌 글리콜 및 글리세린, 및 이의 조합과 조합될 수 있다.
대상
본원에서 사용되는 용어 "대상" 은 본 발명에 따른 사료 첨가제 조성물 또는 상기 본 발명에 따른 사료 첨가제 조성물을 포함하는 사료물이 투여될 또는 투여된 동물을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "대상" 은 동물을 의미한다.
한 구현예에서, 대상은 포유류, 조류, 어류 또는 갑각류 예를 들어 가축 또는 길들여진 동물 (예를 들어 애완동물) 이다.
한 구현예에서 "대상" 은 가축이다.
본원에서 사용되는 용어 "가축" 은 임의의 사육된 (farmed) 동물을 의미한다. 바람직하게는, 가축은 반추류 예컨대 젖소 또는 황소 (예를 들어 송아지), 단위 동물 예컨대 가금류 (예를 들어 육계 (broiler), 닭 및 칠면조), 돼지 (예를 들어 새끼돼지), 조류, 수중 동물 (예컨대 어류, 무위 어류, 유위 어류, 민물고기 예컨대 연어, 대구, 송어 및 잉어, 예를 들어 코이 카프 (koi carp), 바다 어류 예컨대 농어, 및 갑각류 예컨대 새우, 홍합 및 가리비), 말 (예를 들어 경주마), 양 (예를 들어 새끼양) 중 하나 이상이다.
또 다른 구현예에서 "대상" 은 길들여진 동물 또는 애완동물 또는 동물원 환경에서 유지되는 동물이다.
본원에서 사용되는 용어 "길들여진 동물 또는 애완동물 또는 동물원 환경에서 유지되는 동물" 은 임의의 관련 동물 예를 들어 개과 (예를 들어 개), 고양이과 (예를 들어 고양이), 설치류 (예를 들어 기니아피그, 랫트, 마우스), 조류, 어류 (예를 들어 민물 어류 및 바다 어류), 및 말을 의미한다.
성능
본원에서 사용되는, "동물 성능" 은 동물의 사료 효율 및/또는 체중 증가 및/또는 사료 전환율 및/또는 사료 내 영양분의 소화율 (예를 들어 아미노산 소화율) 및/또는 사료 내 소화가능 (digestible) 에너지 또는 대사가능 에너지 및/또는 질소 축적률 및/또는 회저성 장염의 부정적 효과를 회피하는 동물 능력 및/또는 대상의 면역 반응에 의해 측정될 수 있다.
바람직하게는 "동물 성능" 은 동물의 사료 효율 및/또는 체중 증가 및/또는 사료 전환율에 의해 측정된다.
"향상된 동물 성능" 은 사료 첨가제 조성물을 포함하지 않는 사료와 비교하여 사료 내에 본 발명의 사료 첨가제 조성물을 사용하여 초래되는 증가된 사료 효율, 및/또는 증가된 체중 증가 및/또는 감소된 사료 전환율 및/또는 향상된 사료 내 영양분 또는 에너지 소화율 및/또는 향상된 대상 내 질소 축적률 및/또는 회저성 장염의 부정적 효과를 회피하는 능력 및/또는 대상에서의 향상된 면역 반응이 존재함을 의미한다.
바람직하게는, "향상된 동물 성능" 은 증가된 사료 효율 및/또는 증가된 체중 증가 및/또는 감소된 사료 전환율이 존재함을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "사료 효율" 은 동물이 일정한 시간 동안 먹이를 특정량으로 또는 무제한으로 공급받을 때 발생하는 동물에서의 체중 증가량을 의미한다.
"증가된 사료 효율" 은 사료 내에 본 발명에 따른 사료 첨가제 조성물을 사용할 때 사료 첨가제 조성물을 포함하지 않은 사료를 공급받은 동물과 비교하여 사료 섭취 단위 당 증가된 체중 증가가 초래됨을 의미한다.
사료 전환율 (FCR)
본원에서 사용되는 용어 "사료 전환율" 은 동물의 체중을 특정량 만큼 증가시키기 위해 동물에게 공급되는 사료의 양을 의미한다.
향상된 사료 전환율은 더 낮은 사료 전환율을 의미한다.
"더 낮은 사료 전환율" 또는 "향상된 사료 전환율" 은 사료 내에 사료 첨가제 조성물을 사용할 때 동물의 체중을 특정량 만큼 증가시키기 위해 동물에게 공급되어야 하는 사료의 양이 사료가 상기 사료 첨가제 조성물을 포함하지 않을 때 동물의 체중을 동일한 양 만큼 증가시키기 위해 요구되는 사료의 양과 비교하여 더 낮아짐을 의미한다.
영양분 소화율
본원에서 사용되는 영양분 소화율은 위장관 또는 위장관의 특정 분절, 예를 들어 소장으로부터 소멸되는 영양분의 분율을 의미한다. 영양분 소화율은 대상에게 투여되는 것과 대상의 대변으로 나오는 것 사이, 또는 대상에게 투여되는 것과 위장관의 특정 분절, 예를 들어 회장에서 소화물에 남는 것 사이의 차이로서 측정될 수 있다.
본원에서 사용되는 영양분 소화율은 일정한 시간 동안 배설물의 총 수집물을 이용하여 영양분의 섭취와 배설된 영양분 사이의 차이에 의해; 또는 동물에 의해 흡수되지 않고 연구자가 전체 위장관 또는 위장관의 분절에서 소멸된 영양분의 양을 계산하는 것을 허용하는 불활성 마커를 사용하여 측정될 수 있다. 그러한 불활성 마커는 이산화티탄, 산화크롬 또는 산 불용성 회분일 수 있다. 소화율은 사료 내 영양분의 백분율로서, 또는 사료 내 영양분의 질량 단위 당 소화가능 영양분의 질량 단위로서 표현될 수 있다.
본원에서 사용되는 영양분 소화율은 전분 소화율, 지방 소화율, 단백질 소화율, 및 아미노산 소화율을 포괄한다.
본원에서 사용되는 에너지 소화율은 소비된 사료의 총 에너지에서 대변의 총 에너지를 뺀 값 또는 소비된 사료의 총 에너지에서 동물의 위장관의 특정 분절, 예를 들어 회장에 남아 있는 소화물의 총 에너지를 뺀 값을 의미한다. 본원에서 사용되는 대사가능 에너지는 겉보기 (apparent) 대사가능 에너지를 언급하고, 소비된 사료의 총 에너지에서 대변, 소변, 및 가스성 소화 산물에 함유된 총 에너지를 뺀 값을 의미한다. 에너지 소화율 및 대사가능 에너지는 영양분 소화율 측정과 동일한 방법을 사용하여 총 에너지의 섭취와 대변으로 배설되는 총 에너지 또는 위장관의 특정 분절에 존재하는 소화물의 차이로서 측정될 수 있고, 질소 배출에 대해 적절히 보정하여 사료의 대사가능 에너지를 계산한다.
동물 생산으로부터 감소된 폐기물 배출량
본 발명의 자일라나아제는 동물 생산으로부터 폐기물 배출량을 감소시키는데 사용될 수 있다. 이는 상당한 이점을 갖는다.
기타 성분과의 조합
본 발명의 효소는 기타 성분과의 조합으로 사용될 수 있다.
한 구현예에서 본 발명의 효소는 프로바이오틱 (probiotic) 또는 생균제 (direct fed microorganism) (DFM), 예를 들어 다이렉트 페드 박테리아 (direct fed bacteria) 와의 조합으로 사용될 수 있다.
본 발명의 조합은 본 발명의 효소 (또는 본 발명의 효소를 포함하는 조성물, 예를 들어 사료 첨가제 조성물) 및 인간 또는 동물 소비에 적합하고 소비자에게 의학적 또는 생리학적 혜택을 제공할 수 있는 또 다른 성분을 포함한다.
한 구현예에서 "또 다른 성분" 은 하나 이상의 추가의 효소 (예를 들어 추가의 사료 효소) 일 수 있다.
본 발명에서 사용하기에 적합한 추가적 효소는 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 효소일 수 있다: 엔도글루카나아제 (E.C. 3.2.1.4); 셀리오바이오히드롤라아제 (E.C. 3.2.1.91), β-글루코시다아제 (E.C. 3.2.1.21), 셀룰라아제 (E.C. 3.2.1.74), 리체나아제 (E.C. 3.1.1.73), 리파아제 (E.C. 3.1.1.3), 지질 아실트랜스퍼라아제 (일반적으로 E.C. 2.3.1.x 로서 분류됨), 포스포리파아제 (E.C. 3.1.1.4, E.C. 3.1.1.32 또는 E.C. 3.1.1.5), 피타아제 (예를 들어 6-피타아제 (E.C. 3.1.3.26) 또는 3-피타아제 (E.C. 3.1.3.8), 알파-아밀라아제 (E.C. 3.2.1.1), 기타 자일라나아제 (E.C. 3.2.1.8, E.C. 3.2.1.32, E.C. 3.2.1.37, E.C. 3.1.1.72, E.C. 3.1.1.73), 글루코아밀라아제 (E.C. 3.2.1.3), 프로테아제 (예를 들어 서브틸리신 (E.C. 3.4.21.62) 또는 바실로리신 (E.C. 3.4.24.28) 또는 알칼리성 세린 프로테아제 (E.C. 3.4.21.x) 또는 케라티나아제 (E.C. 3.4.x.x)) 및/또는 만난아제 (예를 들어 β-만난아제 (E.C. 3.2.1.78)).
한 구현예에서 (특히 사료 적용물에서) 기타 성분은 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 효소일 수 있다: 아밀라아제 (예를 들어 α-아밀라아제 (E.C. 3.2.1.1), G4-형성 아밀라아제 (E.C. 3.2.1.60), β-아밀라아제 (E.C. 3.2.1.2) 및 γ-아밀라아제 (E.C. 3.2.1.3)); 및/또는 프로테아제 (예를 들어 서브틸리신 (E.C. 3.4.21.62) 또는 바실로리신 (E.C. 3.4.24.28) 또는 알칼리성 세린 프로테아제 (E.C. 3.4.21.x) 또는 케라티나아제 (E.C. 3.4.x.x)).
한 구현예에서 (특히 사료 적용물에서) 기타 성분은 아밀라아제 (예를 들어 α-아밀라아제 (E.C. 3.2.1.1)) 와 프로테아제 (예를 들어 서브틸리신 (E.C. 3.4.21.62)) 의 조합일 수 있다.
한 구현예에서 (특히 사료 적용물에서) 기타 성분은 β-글루카나아제, 예를 들어 엔도-1,3(4)-β-글루카나아제 (E.C. 3.2.1.6) 일 수 있다.
한 구현예에서 (특히 사료 적용물에서) 기타 성분은 만난아제 (예를 들어 β-만난아제 (E.C. 3.2.1.78)) 일 수 있다.
한 구현예에서 (특히 사료 적용물에서) 기타 성분은 리파아제 (E.C. 3.1.1.3), 지질 아실트랜스퍼라아제 (일반적으로 E.C. 2.3.1.x 로 분류됨), 또는 포스포리파아제 (E.C. 3.1.1.4, E.C. 3.1.1.32 또는 E.C. 3.1.1.5), 적합하게는 리파아제 (E.C. 3.1.1.3) 일 수 있다.
한 구현예에서 (특히 사료 적용물에서) 기타 성분은 프로테아제 (예를 들어 서브틸리신 (E.C. 3.4.21.62) 또는 바실로리신 (E.C. 3.4.24.28) 또는 알칼리성 세린 프로테아제 (E.C. 3.4.21.x) 또는 케라티나아제 (E.C. 3.4.x.x)) 일 수 있다.
한 구현예에서 추가적 성분은 안정화제 또는 유화제 또는 결합제 또는 담체 또는 부형제 또는 희석제 또는 붕괴제일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "안정화제" 는 생성물 (예를 들어 사료 생성물) 이 시간의 흐름에 따라 변화하는 것을 방지하는 성분 또는 성분들의 조합으로서 정의된다.
본원에서 사용되는 용어 "유화제" 는 에멀젼의 분리를 방지하는 성분 (예를 들어 사료 성분) 을 의미한다. 에멀젼은 하나가 다른 하나에 함유된 액적 형태로 존재하는 2 개의 비혼성 물질이다. 에멀젼은 액적 또는 분산상이 오일이고 연속상이 물인 수중유; 또는 물이 분산상이 되고 연속상이 오일인 유중수로 이루어질 수 있다. 액체 중 기체 (gas-in-liquid) 인 거품, 및 액체 중 고체 (solid-in-liquid) 인 현탁액이 또한 유화제의 사용을 통해 안정화될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "결합제" 는 물리 또는 화학 반응을 통해 생성물을 함께 결합시키는 성분 (예를 들어 사료 성분) 을 의미한다. 예를 들어 "겔화" 동안, 물이 흡수되어, 결합 효과를 제공한다. 그러나, 결합제는 다른 액체, 예컨대 오일을 흡수하여, 그들을 생성물 중에 유지시킬 수 있다. 본 발명의 맥락에서 결합제는 전형적으로 고체 또는 저-수분 생성물 예를 들어 제과품: 패스트리, 도넛, 빵 등에 사용될 것이다. 과립화 결합제의 예는 하기 중 하나 이상을 포함한다: 폴리비닐피롤리돈, 히드록시프로필메틸셀룰로오스 (HPMC), 히드록시프로필셀룰로오스 (HPC), 수크로오스, 말토오스, 겔라틴 및 아카시아.
"담체" 는 효소의 투여에 적합한 물질을 의미하고, 당업계에 공지된 임의의 이러한 물질, 예를 들어 비-독성이고 조성물의 임의의 성분과 유해한 방식으로 상호작용하지 않는 임의의 액체, 겔, 용매, 액체 희석제, 가용화제 등을 포함한다.
본 발명은 본 발명의 효소를 말토덱스트린, 석회석 (탄산칼슘), 시클로덱스트린, 밀 또는 밀 성분, 수크로오스, 전분, Na2SO4, 탈크, PVA, 소르비톨, 벤조에이트, 소르비에이트, 글리세롤, 수크로오스, 프로필렌 글리콜, 1,3-프로판 디올, 글루코오스, 파라벤, 나트륨 클로라이드, 시트레이트, 아세테이트, 포스페이트, 칼슘, 메타바이술파이트, 포르메이트 및 이의 혼합물 중 하나 이상으로부터 선택되는 하나 이상의 생리학적으로 허용가능한 담체와 혼합하는 단계를 포함하는 조성물 (예를 들어 사료 첨가제 조성물) 의 제조 방법을 제공한다.
"부형제" 의 예는 하기 중 하나 이상을 포함한다: 미세결정질 셀룰로오스 및 기타 셀룰로오스, 락토오스, 나트륨 시트레이트, 탄산칼슘, 2염기 칼슘 포스페이트, 글리신, 전분, 유당 및 고분자량 폴리에틸렌 글리콜.
"붕괴제" 의 예는 하기 중 하나 이상을 포함한다: 전분 (바람직하게는 옥수수, 감자 또는 타피오카 전분), 나트륨 전분 글리콜레이트, 크로스카르멜로스 나트륨 및 특정 복합 실리케이트.
"희석제" 의 예는 하기 중 하나 이상을 포함한다: 물, 에탄올, 프로필렌 글리콜 및 글리세린, 및 이의 조합.
기타 성분은 본 발명의 자일라나아제와 동시에 (예를 들어 그들이 함께 혼합물로 존재할 때 또는 심지어는 그들이 상이한 경로에 의해 전달될 때) 또는 순차적으로 (예를 들어 그들은 상이한 경로에 의해 전달될 수 있음) 사용될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 사료 첨가제 조성물이 또 다른 성분(들) 과 혼합될 때, DFM 은 생육가능한 상태로 유지된다.
한 구현예에서 바람직하게는 본 발명에 따른 사료 첨가제 조성물은 크롬 또는 유기 크롬을 포함하지 않는다.
한 구현예에서 바람직하게는 본 발명에 따른 사료 첨가제는 글루카나아제를 함유하지 않는다.
한 구현예에서 바람직하게는 본 발명에 따른 사료 첨가제는 소르브산을 함유하지 않는다.
단리
한 양태에서, 바람직하게는 본 발명에 따른 아미노산 서열 또는 핵산 또는 효소는 단리된 형태이다. 용어 "단리된" 은 서열 또는 효소 또는 핵산이, 상기 서열, 효소 또는 핵산이 자연계에서 자연적으로 연관되며 자연계에서 발견되는 바와 같은 하나 이상의 다른 성분을 적어도 실질적으로 포함하지 않는다는 것을 의미한다. 본 발명의 서열, 효소 또는 핵산은 물질이 달리 연관될 수 있는 하나 이상의 오염물을 실질적으로 포함하지 않는 형태로 제공될 수 있다. 따라서 예를 들어, 이는 하나 이상의 잠재적 오염 폴리펩티드 및/또는 핵산 분자를 실질적으로 포함하지 않을 수 있다.
정제
한 양태에서, 바람직하게는 본 발명에 따른 서열, 효소 또는 핵산은 정제된 형태이다. 용어 "정제된" 은 주어진 성분이 높은 수준으로 존재하는 것을 의미한다. 성분은 바람직하게는 조성물 중에 존재하는 주요 성분이다. 바람직하게는, 이는 약 90% 이상 또는 약 95% 이상 또는 약 98% 이상의 수준으로 존재하는데, 상기 수준은 고려되는 총 조성물에 대해 건조 중량/건조 중량 기준으로 측정된다.
뉴클레오티드 서열
본 발명의 범주는 본원에 정의한 바와 같은 특정한 특성을 갖는 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본원에서 사용하는 바와 같은 용어 "뉴클레오티드 서열" 은 올리고뉴클레오티드 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열, 및 이의 변이체, 동족체, 단편 및 유도체 (예컨대 이의 일부) 를 의미한다. 뉴클레오티드 서열은 게놈 또는 합성 또는 재조합 기원의 것일 수 있으며, 이는 센스 또는 안티-센스 가닥을 나타내는지 여부에 따라 이중가닥 또는 단일가닥일 수 있다.
본 발명에 관련된 용어 "뉴클레오티드 서열" 은 게놈 DNA, cDNA, 합성 DNA 및 RNA 를 포함한다. 바람직하게는 이는 본 발명을 위해 코딩하는 DNA, 보다 바람직하게는 cDNA 서열을 의미한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 범주에 자체적으로 포함되며 이에 관련되는 경우 뉴클레오티드 서열은, 이의 자연 환경에 있으며 이의 자연 환경에 또한 존재하는 이의 자연적으로 연관된 서열(들) 에 연결되는 경우 본 발명에 따른 선천적 뉴클레오티드 서열을 포함하지 않는다. 참조 용이성을 위해, 이러한 바람직한 구현예를 "비-선천적 뉴클레오티드 서열" 로 지칭한다. 이와 관련하여, 용어 "선천적 뉴클레오티드 서열" 은 그의 선천적 환경에서 존재하며, 자연적으로 연관되는, 프로모터가 또한 그의 선천적 환경에서 존재하는, 전체 프로모터에 작동가능하게 연결되는 경우의 전체 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 그러나, 본 발명의 범주에 의해 포함되는 아미노산 서열은 이의 선천적 유기체에서의 뉴클레오티드 서열의 발현 후 단리되고/되거나 정제될 수 있다. 그러나 바람직하게는, 본 발명의 범주에 의해 포함되는 아미노산 서열은 이의 선천적 유기체에서의 뉴클레오티드 서열에 의해 발현될 수 있으나 이때 상기 뉴클레오티드 서열은 이러한 유기체 내에서 자연적으로 연관되는 프로모터의 제어 하에 있지 않다.
통상, 본 발명의 범주에 의해 포함되는 뉴클레오티드 서열은 재조합 DNA 기술 (즉, 재조합 DNA) 을 사용하여 제조된다. 그러나 본 발명의 대안적인 구현예에서, 뉴클레오티드 서열은 당업계에 널리 공지된 화학적 방법을 사용하여 전체 또는 일부 합성될 수 있다 (Caruthers MH et al., (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23 and Horn T et al., (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 225-232 참조).
뉴클레오티드 서열의 제조
본원에 정의한 바와 같은 특정한 특성을 갖는 단백질 또는 변형에 적합한 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 상기 단백질을 생성하는 임의의 세포 또는 유기체로부터 확인되고/되거나 단리되고/되거나 정제될 수 있다. 뉴클레오티드 서열의 확인 및/또는 단리 및/또는 정제를 위한 다양한 방법이 당업계 내에 널리 공지되어있다.
예를 들어, 적합한 서열이 확인되고/되거나 단리되고/되거나 정제되고나면, 더 많은 서열을 제조하기 위한 PCR 증폭 기술이 사용될 수 있다.
추가적으로 예를 들어, 게놈 DNA 및/또는 cDNA 라이브러리는 효소를 생성하는 유기체로부터의 염색체 DNA 또는 메신저 DNA 를 사용하여 구축될 수 있다. 효소의 아미노산 서열이 공지되어 있는 경우, 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브를 합성하고 사용하여 유기체로부터 제조된 게놈 라이브러리로부터의 효소-인코딩 효소를 확인할 수 있다. 대안적으로, 또 다른 공지된 효소와 상동인 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브 함유 서열을 사용하여 효소-인코딩 클론을 확인할 수 있다. 이 경우, 더 낮은 엄격도의 하이브리드화 및 세척 조건을 사용한다.
대안적으로, 게놈 DNA 의 단편을 발현 벡터, 예컨대 플라스미드 내에 삽입하고, 생성된 게놈 DNA 라이브러리로 효소-음성 박테리아를 형질전환한 후, 형질전환된 박테리아를 효소에 대한 기질 (즉, 말토오스) 을 함유하는 한천 플레이트 상에 플레이팅하고, 이로써 효소를 발현하는 클론이 확인될 수 있게 함으로써, 효소-인코딩 클론을 확인할 수 있다.
추가 대안에서, 효소를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 확립된 표준 방법, 예를 들어 [Beucage S.L. et al., (1981 ) Tetrahedron Letters 22, p 1859-1869] 에 의해 기재된 포스포로아미디트 방법 또는 [Matthes et al., (1984) EMBO J. 3, p 801-805] 에 의해 기재된 방법에 의해 합성적으로 제조될 수 있다. 포스포로아미디트 방법에서, 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 자동식 DNA 합성기에서 합성되고, 정제되고, 어닐링되고, 라이게이션되고 적절한 벡터 내에서 클로닝된다.
뉴클레오티드 서열은 표준 기술에 따라 합성, 게놈 또는 cDNA 기원 (적절한 바에 따라) 의 단편을 라이게이션하여 제조된, 혼합된 게놈 및 합성 기원, 혼합된 합성 및 cDNA 기원, 또는 혼합된 게놈 및 cDNA 기원의 것일 수 있다. 각각의 라이게이션된 단편은 전체 뉴클레오티드 서열의 다양한 부분에 상응한다. DNA 서열은 또한 예를 들어 US 4,683,202 또는 [Saiki R K et al., (Science (1988) 239, pp 487-491)] 에서 기재된 바와 같이, 특이적 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 에 의해 제조될 수 있다.
아미노산 서열
본 발명의 범주는 또한 본원에 정의한 바와 같은 특정한 특성을 갖는 효소의 아미노산 서열을 포함한다.
본원에서 사용하는 바와 같이, 용어 "아미노산 서열" 은 용어 "폴리펩티드" 및/또는 용어 "단백질" 과 동의어이다. 일부 예에서, 용어 "아미노산 서열" 은 용어 "펩티드" 와 동의어이다. 일부 예에서, 용어 "아미노산 서열" 은 용어 "효소" 와 동의어이다.
아미노산 서열은 적합한 근원으로부터 제조/단리될 수 있거나, 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조될 수 있거나 합성적으로 만들어질 수 있다.
바람직하게는 본 발명의 범주에 자체적으로 포함되며 이에 관련되는 경우 아미노산 서열은 선천적 효소가 아니다. 이와 관련하여, 용어 "선천적 효소" 는 이의 선천적 환경에서 존재하며 이의 선천적 뉴클레오티드 서열에 의해 발현되는 경우의 전체 효소를 의미한다.
서열 동일성 또는 서열 상동성
본 발명은 또한, 본원에 정의된 특정한 특성을 갖는 폴리펩티드 또는 이러한 폴리펩티드를 인코딩하는 임의의 뉴클레오티드 서열의 아미노산 서열(들) 과의 서열 동일성 또는 서열 상동성 정도를 갖는 서열 (이하, "상동 서열(들) 로 지칭함) 의 사용을 포함한다. 여기서, 용어 "상동체" 는 대상 아미노산 서열 및 대상 뉴클레오티드 서열과 특정 상동성을 갖는 개체를 의미한다. 여기서, 용어 "상동성" 은 "동일성" 과 동일시될 수 있다.
상동 아미노산 서열 및/또는 뉴클레오티드 서열은 효소의 기능적 활성을 유지하고/하거나 상기 활성을 증진시키는 폴리펩티드를 제공하고/하거나 인코딩해야 한다.
본 맥락에서, 상동 서열은 대상 서열에 대해 80% 이상의 동일성 (적합하게는 85% 이상, 적합하게는 90% 이상, 적합하게는 93% 이상의 동일성, 적합하게는 95% 이상의 동일성, 적합하게는 97% 이상의 동일성, 적합하게는 98% 이상의 동일성 또는 99% 이상의 동일성) 을 가질 수 있는 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것으로 의도된다. 통상, 상동체는 예를 들어 대상 아미노산 서열과 동일한 활성 부위 등을 포함할 것이다. 상동성이 또한 유사성 측면 (즉, 유사한 화학적 특성/기능을 갖는 아미노산 잔기) 에 있어서 고려될 수 있으나, 본 발명의 맥락에서, 서열 동일성 측면에 있어서 상동성을 표현하는 것이 바람직하다.
한 구현예에서, 상동 서열은 대상 서열과 비교하여 하나 또는 여러 부가, 결실 및/또는 치환을 갖는 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것으로 의도된다.
한 구현예에서 본 발명은 모체 단백질의 활성을 가지며 모체 단백질의 아미노산 서열에 있어서 하나 또는 여러 아미노산, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 개 아미노산, 또는 그 이상의 아미노산, 예컨대 10 개 또는 10 개 초과의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의해 이러한 (모체) 단백질로부터 유래된 단백질 또는 그의 아미노산 서열을 본원에서 나타내는 단백질에 관한 것이다.
한 구현예에서 본 발명은 모체 단백질의 활성을 가지며 모체 단백질의 아미노산 서열에 있어서 하나 또는 여러 아미노산, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 개 아미노산, 또는 그 이상의 아미노산, 예컨대 10 개 또는 10 개 초과의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의해 이러한 (모체) 단백질로부터 유래된 단백질을 인코딩하거나 그의 아미노산 서열을 본원에서 나타내는 단백질을 인코딩하는 핵산 서열 (또는 유전자) 에 관한 것이다.
본 맥락에서, 상동 서열은 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 (대상 서열) 에 대해 93% 이상 동일하고, 바람직하게는 적어도 95 또는 97 또는 98 또는 99% 동일할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것으로 의도된다. 통상, 상동체는 대상 서열과 동일한 활성 부위 등 코딩 서열을 포함할 것이다. 상동성이 또한 유사성 측면 (즉, 유사한 화학적 특성/기능을 갖는 아미노산 잔기) 에 있어서 고려될 수 있으나, 본 발명의 맥락에서, 서열 동일성 측면에 있어서 상동성을 표현하는 것이 바람직하다.
본 맥락에서, 상동 서열은 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 (대상 서열) 에 대해 80% 이상의 동일성 (적합하게는 85% 이상, 적합하게는 90% 이상, 적합하게는 93% 이상의 동일성, 적합하게는 95% 이상의 동일성, 적합하게는 97% 이상의 동일성, 적합하게는 98% 이상의 동일성 또는 99% 이상의 동일성) 을 가질 수 있는 아미노산 서열을 포함하는 것으로 의도된다. 통상, 상동체는 대상 서열과 동일한 활성 부위 등 코딩 서열을 포함할 것이다. 상동성이 또한 유사성 측면 (즉, 유사한 화학적 특성/기능을 갖는 아미노산 잔기) 에 있어서 고려될 수 있으나, 본 발명의 맥락에서, 서열 동일성 측면에 있어서 상동성을 표현하는 것이 바람직하다.
상동성 비교는 육안으로, 또는 보다 통상적으로는 용이하게 이용가능한 서열 비교 프로그램을 보조로 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 시판 컴퓨터 프로그램은 둘 이상의 서열 사이의 상동성 % 를 계산할 수 있다.
상동성 % 는 인접 서열에 대해 계산될 수 있는데, 즉, 하나의 서열이 다른 서열과 함께 정렬되며 한 서열에서의 각 아미노산이 다른 서열에서의 상응하는 아미노산과 한 번에 1 개 잔기씩 직접 비교된다. 이는 "갭이 없는 (ungapped)" 정렬로 지칭된다. 통상, 이러한 갭이 없는 정렬은 상대적으로 짧은 수의 잔기에 대해서만 수행된다.
이것이 매우 간단하고 일관적인 방법이지만, 이는 예를 들어, 다르게는 동일쌍의 서열에서 1 개 삽입 또는 결실이 그 다음의 아미노산 잔기가 정렬에서 빠지게 하여, 따라서 전역적 정렬을 수행할 때 상동성 % 에 있어서 큰 감소가 잠재적으로 초래된다는 것을 고려하는데 실패한다. 결과적으로, 대부분의 서열 비교 방법은 전체 상동성 스코어를 지나치게 희생시킴이 없이 가능한 삽입 및 결실을 고려하는 최적의 정렬을 생성시키도록 설계된다. 이는 국부 상동성을 최대화시키고자 서열 정렬에서의 "갭 (gap)" 을 삽입하여 이루어진다.
그러나, 이러한 더 복잡한 방법은 정렬에서 발생하는 각각의 갭에 대해 "갭 패널티" 를 부과하여, 동일 수의 동일한 아미노산에 대해, 가능한 한 적은 갭을 갖는 서열 정렬 (2 개의 비교 서열 사이의 높은 관련성을 반영) 이 많은 갭을 갖는 서열 정렬보다 더 높은 스코어를 얻게 된다. "아핀 갭 코스트 (Affine gap cost)" 가 통상 사용되며 이는 갭의 존재에 대해 상대적으로 높은 코스트 및 갭에서의 각각의 후속 잔기에 대해 더 적은 패널티를 부과한다. 이는 가장 흔히 사용되는 갭 스코어링 시스템이다. 높은 갭 패널티는 물론 더 적은 갭을 갖는 최적화된 정렬을 생성시킬 것이다. 대부분의 정렬 프로그램은 갭 패널티가 변형될 수 있게 한다. 그러나, 서열 비교를 위해 이러한 소프트웨어르르 사용하는 경우 디폴트 값을 사용하는 것이 바람직하다.
그러므로 최대 상동성 % 의 계산은 우선, 갭 패널티를 고려하여 최적 정렬의 생성을 필요로 한다. 이러한 정렬을 실행하기 위한 적합한 컴퓨터 프로그램은 Vector NTI (Invitrogen Corp.) 이다. 서열 비교를 수행할 수 있는 소프트웨어의 예는 비제한적으로, BLAST 패키지 (Ausubel et al 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed - Chapter 18 참조), BLAST 2 (FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8 및 tatiana@ncbi.nlm.nih.qov 참조), FASTA (Altschul et al 1990 J. Mol. Biol. 403-410) 및 AlignX 를 예로써 포함한다. 적어도 BLAST, BLAST 2 및 FASTA 가 오프라인 및 온라인 검색으로 이용가능하다 (Ausubel et al 1999, p. 7-58 ~ 7-60 참조).
최종 상동성 % 가 동일성 측면에 있어서 측정될 수 있으나, 정렬 프로세스 자체는 통상 양자택일 쌍 비교를 기반으로 하지 않는다. 대신, 화학적 유사성 또는 진화적 거리를 기반으로 각각의 쌍별 비교에 대해 스코어를 부과하는 환산된 유사성 스코어 매트릭스가 일반적으로 사용된다. 흔히 사용되는 이러한 매트릭스의 예는 BLOSUM62 매트릭스 (프로그램의 BLAST 스위트에 대한 디폴트 매트릭스) 이다. 벡터 NTI 프로그램은 일반적으로, 공급되는 경우 커스텀 기호 비교 표 (추가 세부사항에 대해서는 사용자 매뉴얼 참조) 또는 공개적 디폴트 값을 사용한다. 일부 적용에 대해, Vector NTI 패키지에 대한 디폴트 값을 사용하는 것이 바람직하다.
대안적으로, 상동성 % 는 CLUSTAL (Higgins DG & Sharp PM (1988), Gene 73(1), 237-244) 과 유사한 알고리즘을 기반으로 Vector NTI (Invitrogen Corp.) 에서 다수의 정렬 특징을 사용하여 계산될 수 있다.
소프트웨어가 최적 정렬을 생성시키고 나면, 상동성 %, 바람직하게는 서열 동일성 % 를 계산할 수 있다. 소프트웨어는 통상 서열 비교의 일부로서 이를 수행하며 수치적 결과를 생성시킨다.
서열 동일성 측정시 갭 패널티를 사용하고, 바람직하게는 하기 매개변수를 쌍별 정렬에 사용한다:
Figure pct00001
Figure pct00002
한 구현예에서, CLUSTAL 은 상기 정의한 바와 같은 갭 패널티 및 갭 연장 세트로 사용될 수 있다.
적합하게는, 뉴클레오티드 서열에 대한 동일성 정도는 20 개 이상의 인접한 뉴클레오티드, 바람직하게는 30 개 이상의 인접한 뉴클레오티드, 바람직하게는 40 개 이상의 인접한 뉴클레오티드, 바람직하게는 50 개 이상의 인접한 뉴클레오티드, 바람직하게는 60 개 이상의 인접한 뉴클레오티드, 바람직하게는 100 개 이상의 인접한 뉴클레오티드에 대해 측정된다.
적합하게는, 뉴클레오티드 서열에 대한 동일성 정도는 전체 서열에 대해 측정될 수 있다.
서열은 또한 기능적으로 동등한 물질을 초래하며 침묵 변화 (silent change) 를 생성하는 아미노산 잔기의 결실, 삽입 또는 치환을 가질 수 있다. 의도적 아미노산 치환은 물질의 2 차적 결합 활성이 유지되는 한, 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매적 성질을 기반으로 생성될 수 있다. 예를 들어, 음하전된 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함하고; 양하전된 아미노산은 리신 및 아르기닌을 포함하고; 유사한 친수성 값을 갖는 미하전 극성 헤드 기는 류신, 이소류신, 발린, 글리신, 알라닌, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 페닐알라닌 및 티로신을 포함한다.
보존적 치환이 예를 들어 하기 표에 따라 생성될 수 있다. 두 번째 컬럼에서 동일 블록 내, 바람직하게는 세 번째 컬럼에서 동일 라인에 있는 아미노산은 서로 치환될 수 있다:
Figure pct00003
본 발명은 또한, 즉 동일 응수 (like-to like) 치환 예컨대 염기성 대 염기성, 산성 대 산성, 극성 대 극성 등으로 발생할 수 있는 상동 치환 (치환 및 대체는 모두 본원에서 현존 아미노산 잔기의 대안 잔기와의 교환을 의미하는 것으로 사용됨) 을 포함한다. 비-상동 치환이 또한 즉 한 클래스의 잔기로부터 서로에 대해 발생할 수 있거나, 대안적으로는 오르니틴 (이하, Z 로 지칭함), 디아미노부티르산 오르니틴 (이하, B 로 지칭함), 노르류신 오르니틴 (이하, O 로 지칭함), 피리일알라닌, 티에닐알라닌, 나프틸알라닌 및 페닐글리신과 같은 비자연적 아미노산의 포함을 수반하여 발생할 수 있다.
대체는 또한 하기를 포함하는 비자연적 아미노산에 의해 생성될 수 있다; 알파* 및 알파-이중치환* 아미노산, N-알킬 아미노산*, 락트산*, 자연적 아미노산의 할라이드 유도체 예컨대 트리플루오로티로신*, p-Cl-페닐알라닌*, p-Br-페닐알라닌*, p-l-페닐알라닌*, L-알릴-글리신*, β-알라닌*, L-α-아미노 부티르산*, L-γ-아미노 부티르산*, L-α-아미노 이소부티르산*, L-ε-아미노 카프로산#, 7-아미노 헵탄산*, L-메티오닌 술폰#*, L-노르뉴신*, L-노르발린*, p-니트로-L-페닐알라닌*, L-히드록시프롤린#, L-티오프롤린*, 페닐알라닌 (Phe) 의 메틸 유도체 예컨대 4-메틸-Phe*, 펜타메틸-Phe*, L-Phe (4-아미노)#, L-Tyr (메틸)*, L-Phe (4-이소프로필)*, L-Tic (1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-3-카르복실산)*, L-디아미노프로피온산# 및 L-Phe (4-벤질)*. 표기법 * 는 유도체의 소수성이 표시되도록 상기 토의의 목적 (상동 또는 비-상동 치환에 관한) 을 위해 이용된 반면, # 는 유도체의 친수성이 표시되도록 이용되었고, #* 는 양친매성 특징을 나타낸다.
변이체 아미노산 서열은 글리실 또는 β-알라닌 잔기와 같은 아미노산 스페이서에 추가로, 메틸, 에틸 또는 프로필기와 같은 알킬기를 포함하는 서열의 임의의 2 개 아미노산 잔기 사이에 삽입될 수 있는 적합한 스페이서 기를 포함할 수 있다. 펩토이드 형태로의 하나 이상의 아미노산 잔기의 존재를 포함하는 추가 형태의 변이가 당업자에 의해 잘 이해될 것이다. 의심을 없애기 위해, "펩토이드 형태" 는 α-탄소 치환기가 α-탄소보다는 잔기의 질소 원자 상에 존재하는 변이체 아미노산 잔기를 지칭하는데 사용된다. 펩토이드 형태로 펩티드를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어 [Simon RJ et al., PNAS (1992) 89(20), 9367-9371] 및 [Horwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13(4), 132-134]).
본 발명에서 사용하기 위한 뉴클레오티드 서열은 이들 내에 합성 또는 변형된 서열을 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드에 대한 다수의 상이한 변형이 당업계에 공지되어있다. 이들은 메틸포스포네이트 및 포스포로티오에이트 백본 및/또는 분자의 3' 및/또는 5' 말단에서의 아크리딘 또는 폴리리신 사슬의 부가를 포함한다. 본 발명의 목적을 위해서, 본원에 기재된 뉴클레오티드 서열이 당업계에서 이용가능한 임의의 방법에 의해 변형될 수 있다는 것이 이해된다. 이러한 변형은 본 발명의 뉴클레오티드 서열의 수명 또는 생체내 활성을 증진시키기 위해 실행될 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 제시된 서열, 또는 임의의 유도체에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열, 이의 단편 또는 유도체의 사용을 포함한다. 그러나 서열이 이의 단편에 대해 상보적인 경우, 상기 서열은 다른 유기체 등에서 유사한 코딩 서열을 확인하기 위한 프로브로서 사용될 수 있다.
본 발명의 서열에 대해 100% 상동이 아니지만 본 발명의 범주 내에 포함되는 폴리뉴클레오티드는 많은 방식으로 수득될 수 있다. 본원에 기재된 서열의 다른 변이체는 예를 들어 다양한 개인, 예를 들어 상이한 집단의 개인으로부터 생성된 DNA 라이브러리를 탐색함으로써 수득될 수 있다. 또한, 다른 상동체가 수득될 수 있으며 이러한 이의 상동체 및 단편은 일반적으로 본원에 열거하고 있는 서열에서 나타낸 서열에 선택적으로 하이브리드화될 수 있다. 이러한 서열은 다른 동물 종류로부터의 게놈 DNA 라이브러리 또는 그로부터 생성된 cDNA 라이브러리를 탐색하고, 이러한 라이브러리를 중간에서 높은 엄격도의 조건 하에 첨부된 서열 목록에서의 임의 하나의 서열 중 일부 또는 전부를 포함하는 프로브로 탐색함으로써 수득될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드 또는 뉴클레오티드 서열의 상동체 및 대립형질 변이체를 수득하기 위해 유사한 고려사항이 적용된다.
변이체 및 균주/종류 상동체는 또한, 본 발명의 서열 내의 보존된 아미노산 서열을 인코딩하는 변이체 및 상동체 내의 서열을 표적화하도록 설계된 프라이멀를 사용할 퇴보 (degenerate) PCR 을 사용하여 수득될 수 있다. 보존된 서열은 예를 들어 여러 변이체/상동체로부터의 아미노산 서열을 정렬함으로써 예측될 수 있다. 서열 정렬은 당업계에 공지된 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어 GCG Wisconsin PileUp 프로그램이 널리 사용된다.
퇴보 PCR 에서 사용되는 프라이머는 하나 이상의 퇴보 위치를 함유하며 공지된 서열에 대한 단일 서열 프라이머와 함께 클로닝 서열에 대해 사용한 바 보다 더 낮은 엄격도 조건에서 사용된다.
대안적으로, 이러한 폴리뉴클레오티드는 특징화된 서열의 부위 지정 돌연변이유발에 의해 수득될 수 있다. 이는 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 서열이 발현되는 특정 숙주 세포에 대해 코돈 선호도를 최적화하는데 침묵 코돈 서열 변화가 필요한 경우 유용할 수 있다. 제한 효소 인지 부위를 도입하거나, 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 폴리펩티드의 특성 또는 기능을 변형시키기 위해 다른 서열 변화가 필요할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 (뉴클레오티드 서열) 를 사용하여 프라이머, 예를 들어 PCR 프라이머, 대안적 증폭 반응용 프라이머, 예를 들어 방사성 또는 비-방사성 표지를 사용하여 종래의 수단에 의해 발현 (revealing) 표지로 표지된 프로브를 생성시킬 수 있거나, 상기 폴리뉴클레오티드는 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 이러한 프라이머, 프로브 및 기타 단편은 15 개 이상, 바람직하게는 20 개 이상, 예를 들어 적어도 25, 30 또는 40 개 뉴클레오티드의 길이이며, 본원에서 사용하는 바와 같은 본 발명의 용어 폴리뉴클레오티드에 의해 포함된다.
폴리뉴클레오티드 예컨대 본 발명에 따른 DNA 폴리뉴클레오티드 및 프로브는 재조합적으로, 합성적으로, 또는 당업자에게 이용가능한 임의의 수단에 의해 생성될 수 있다. 이들은 또한 표준 기술에 의해 클로닝될 수 있다.
일반적으로, 프라이머는 한번에 1 개 뉴클레오티드씩 원하는 핵산 서열의 단계적 생산을 포함하는 합성적 수단에 의해 생성될 것이다. 이러한 자동화된 기술을 사용하여 이를 이루기 위한 기술은 당업계에서 용이하게 이용가능하다.
재조합 수단, 예를 들어 PCR (중합효소 연쇄 반응) 클로닝 기술을 사용하여 더 긴 폴리뉴클레오티드가 일반적으로 생성된다. 프라이머는 적합한 제한 효소 인지 부위를 함유하도록 설계되어, 증폭된 DNA 가 적합한 클로닝 벡터 내로 클로닝될 수 있다.
하이브리드화
본 발명은 또한 본 발명의 서열 또는 이와 상보적인 서열에 하이브리드화될 수 있는 서열 또는 본 발명의 핵산 서열에 상보적인 서열을 포함한다.
본원에서 사용하는 바와 같은 용어 "하이브리드화" 는 "핵산 가닥이 염기쌍형성을 통해 상보적 가닥과 연결되는 과정" 뿐 아니라 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 기술로 실행되는 바와 같은 증폭 과정을 포함할 것이다.
본 발명은 또한 본원에 나타낸 서열과 상보적인 서열, 또는 임의의 유도체에 하이브리드화될 수 있는 뉴클레오티드 서열, 이의 단편 또는 유도체의 사용을 포함한다.
용어 "변이체" 는 또한 본원에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 하이브리드화될 수 있는 서열에 상보적인 서열을 포함한다.
바람직하게는, 용어 "변이체" 는 엄격한 조건 하에 (예를 들어 50℃ 및 0.2xSSC {1xSSC = 0.15 M NaCl, 0.015 M Na3 시트레이트 pH 7.0}) 본원에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 하이브리드화될 수 있는 서열에 상보적인 서열을 포함한다.
보다 바람직하게는, 용어 "변이체" 는 높은 엄격한 조건 하에 (예를 들어 65℃ 및 O.1xSSC {1xSSC = 0.15 M NaCl, 0.015 M Na3 시트레이트 pH 7.0}) 본원에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 하이브리드화될 수 있는 서열에 상보적인 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 뉴클레오티드 서열에 하이브리드화될 수 있는 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다 (본원에 나타낸 것들의 상보적 서열 포함).
본 발명은 또한 본 발명의 뉴클레오티드 서열에 하이브리드화될 수 잇는 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다 (본원에 나타낸 것들의 상보적 서열 포함).
효소의 발현
본 발명에서 사용하기 위한 뉴클레오티드 서열은 재조합 복제가능 벡터 내로 혼입될 수 있다. 벡터는 효소 형태로, 양립가능한 숙주 세포에서 및/또는 그로부터 뉴클레오티드 서열을 복제하고 발현시키는데 사용될 수 있다.
발현은 예를 들어 조절 서열과 같은 제어 서열을 사용하여 제어될 수 있다.
뉴클레오티드 서열의 발현에 의해 숙주 재조합 세포에 의해 생성된 단백질이 분비될 수 있거나 사용한 서열 및/또는 벡터에 따라 세포내적으로 함유될 수 있다. 코딩 서열은 특정 원핵 또는 진핵세포 멤브레인을 통해 물질 코딩 서열의 분비를 유도하는 신호 서열을 갖도록 설계될 수 있다.
발현 벡터
용어 "발현 벡터" 는 생체내 또는 시험관내에서 발현될 수 있는 구축물을 의미한다.
바람직하게는, 발현 벡터는 적합한 숙주 유기체의 게놈 내로 혼입된다. 용어 "혼입" 은 바람직하게는 게놈 내로의 안정한 혼입을 포함한다.
본 발명의 뉴클레오티드 서열은, 뉴클레오티드 서열이 적합한 숙주 유기체에 의한 뉴클레오티드 서열의 발현을 제공할 수 있는 조절 서열에 작동가능하게 연결되는 벡터 내에 존재할 수 있다.
본 발명에서 사용하기 위한 벡터는 하기 기재한 바와 같이 적합한 숙주 세포 내로 형질전환되어 본 발명의 폴리펩티드의 발현을 제공할 수 있다.
벡터 예를 들어 플라스미드, 코스미드 또는 파지 벡터의 선택은 이것이 도입되는 숙주 세포에 따라 종종 좌우된다.
본 발명에서 사용하기 위한 벡터는 하나 이상의 선택가능 마커 유전자 - 예컨대 암피실린, 카나마이신, 클로람페니콜 또는 테트라사이클린 저항성과 같은 항생제 저항성을 부여하는 유전자를 함유할 수 있다. 대안적으로, 선택은 동시-형질전환에 의해 이루어질 수 있다 (W091/17243 에서 기재된 바와 같음).
벡터는 시험관내, 예를 들어 RNA 의 생성을 위해 사용될 수 있거나 숙주 세포를 트랜스펙션, 형질전환, 형질도입 또는 감염시키는데 사용될 수 있다.
따라서 추가 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 뉴클레오티드 서열을 복제가능 벡터 내로 도입하고, 상기 벡터를 양립가능한 숙주 세포 내로 도입하고, 상기 숙주 세포를 벡터가 복제되게 하는 조건 하에 성장시킴으로써 본 발명의 뉴클레오티드 서열을 생성시키는 방법을 제공한다.
벡터는 의문의 숙주 세포 내에서 벡터가 복제될 수 있게 하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 서열의 예는 플라스미드 pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 및 plJ702 의 복제 기원이다.
조절 서열
일부 적용에서, 본 발명에서 사용하기 위한 뉴클레오티드 서열은 예컨대 선택된 숙주 세포에 의한 뉴클레오티드 서열의 발현을 제공할 수 있는 조절 서열에 작동가능하게 연결된다. 예를 들어, 본 발명은 이러한 조절 서열에 작동가능하게 연결되는 본 발명의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 포함하며, 즉 상기 벡터는 발현 벡터이다.
용어 "작동가능하게 연결된" 은 기재된 성분이 그의 의도된 방식으로 이들이 기능하도록 하는 관계에 있는 병치 (juxtaposition) 를 의미한다. 코딩 서열에 "작동가능하게 연결된" 조절 서열은 이러한 방식으로 라이게이션되어, 상기 코딩 서열의 발현이 제어 서열과 양립가능한 조건 하에 이루어진다.
용어 "조절 서열" 은 프로모터 및 인핸서 및 기타 발현 조절 신호를 포함한다.
용어 "프로모터" 는 당업계의 정상적 의미, 예를 들어 RNA 중합효소 결합 부위로 사용된다.
본 발명의 효소를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 증진된 발현은 또한 이종 조절 부위, 예를 들어 프로모터, 선택 리더 및 터미네이터 부위의 선택에 의해 이루어질 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
다른 프로모터가 본 발명의 폴리펩티드의 직접 발현에 사용될 수 있다.
박테리아, 진균 또는 효모에서의 뉴클레오티드 서열의 전사를 유도하기에 적합한 프로모터의 예는 당업계에 널리 공지되어있다.
프로모터는 추가적으로, 적합한 숙주에서의 발현을 확실히 하거나 증가시키기 위한 특징을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 특징은 Pribnow 박스 또는 TATA 박스와 같은 보존된 부위일 수 있다.
구축물
"접합체", "카세트" 및 "하이브리드" 와 같은 용어와 동의어인 용어 "구축물" 은 프로모터에 직접적으로 또는 간접적으로 부착된 본 발명에 따라 사용하기 위한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
간접적 부착의 예는 적합한 스페이서기 예컨대 인트론 서열, 예컨대 Sh1-인트론 또는 ADH 인트론의 제공이며, 본 발명의 프로모터 및 뉴클레오티드 서열을 중개한다. 이는 직접 또는 간접 부착을 포함하는 본 발명에 관련된 용어 "융합된" 에 대해서도 마찬가지이다. 일부 경우, 상기 용어는 이들 모두가 그의 자연적 환경에서 존재하는 경우이며 야생형 유전자 프로모터와 통례적으로 연관된 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 자연적 조합을 포함하지 않는다.
구축물은 유전적 구축물의 선택을 가능하게 하는 마커를 함유하거나 발현할 수 있다.
일부 경우에 대해, 바람직하게는 본 발명의 구축물은 프로모터에 작동가능하게 연결된 적어도 본 발명의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
숙주 세포
본 발명에 관련된 용어 "숙주 세포" 는 상기 기재한 바와 같은 뉴클레오티드 서열 또는 발현 벡터를 포함하며 본원에 정의한 바와 같은 특정한 특성을 갖는 단잭질의 재조합체 생성에 사용되는 임의의 세포를 포함한다.
한 구현예에서 유기체는 발현 숙주이다.
따라서 본 발명의 추가 구현예는 본 발명의 단백질을 발현하는 뉴클레오티드 서열로 형질전환되거나 트랜스펙션된 숙주 세포를 제공한다. 상기 세포는 상기 벡터와 양립가능한 것으로 선택될 것이며 예를 들어 원핵세포 (예를 들어 박테리아), 진균 또는 효모 세포일 수 있다.
적합한 박테리아 숙주 유기체의 예는 그람 양성 또는 그람 음성 박테리아 종류이다.
한 구현예에서 본원에 교시된 자일라나아제는 발현 숙주 트리코데르마 레세이 (Trichoderma reesei) 에서 발현된다.
일부 구현예에서 본원에 교시된 자일라나아제에 대한 발현 숙주는 하기의 진균 발현 숙주: 푸사리움 종(Fusarium spp.) (예컨대 푸사리움 옥시스포룸); 아스페르길루스 종 (Aspergillus spp.) (예컨대 아스페르길루스 니게르 (Aspergillus niger), A. 오리자에 (A. oryzae), A. 니둘란스 (A. nidulans) 또는 A. 아와모리 (A. awamori)) 또는 트리코데르마 종 (Trichoderma spp.) (예컨대 T. 레세이) 중 하나 이상의 것일 수 있다.
일부 구현예에서 발현 숙주는 하기의 박테리아 발현 숙주: 스트렙토마이세스 종 (Streptomyces spp.) 또는 바실러스 종 (Bacillus spp.) (예를 들어 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 또는 B. 리체니포르미스 (B. licheniformis) 중 하나 이상의 것일 수 있다.
효모 및 진균 숙주 세포와 같은 적합한 숙주 세포의 사용은 전사후 변형 (예를 들어 미리스토일화, 글리코실화, 절두, 지질화 및 티로신, 세린 또는 트레오닌 인산화) 을 제공할 수 있는데, 이는 본 발명의 재조합 발현 생성물에서 최적의 생물학적 활성을 부여하는데 필요할 수 있기 때문이다.
유기체
본 발명에 관련된 용어 "유기체" 는 본 발명에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및/또는 그로부터 수득한 생성물을 포함하는 임의의 유기체를 포함하고/하거나 이때 프로모터는 유기체에 존재하는 경우 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열이 발현되게 할 수 있다.
한 구현예에서 유기체는 발현 숙주이다.
적합한 유기체는 원핵생물, 진균, 효모 또는 식물을 포함할 수 있다.
본 발명에 관련된 용어 "트랜스제닉 유기체" 는 본 발명에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및/또는 그로부터 수득한 생성물을 포함하는 임의의 유기체를 포함하고/하거나 이때 프로모터는 유기체 내에서 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열이 발현되게 할 수 있다. 바람직하게는 뉴클레오티드 서열은 유기체의 게놈 내에 혼입된다.
용어 "트랜스제닉 유기체" 는 이의 자연적 환경에서 또한 존재하는 그의 선천적 프로모터의 제어 하에 있는 경우 그의 자연적 환경에서의 선천적 뉴클레오티드 코딩 서열을 포함하지 않는다.
따라서 본 발명의 트랜스제닉 유기체는 본 발명에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 본 발명에 따른 구축물, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 플라스미드, 본 발명에 따른 세포, 본 발명에 따른 조직, 또는 이의 생성물 중 임의의 하나 또는 이의 조합을 포함하는 유기체를 포함한다.
예를 들어 트랜스제닉 유기체는 또한 이종 프로모터의 제어 하에 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
숙주 세포/유기체의 형질전환
이전에 나타낸 바와 같이, 숙주 유기체는 원핵생물 또는 진핵생물 유기체일 수 있다. 적합한 원핵생물 숙주의 예는 대장균 (E. coli), 스트렙토마이세스 종 (Streptomyces spp.) 및 바실러스 종 (Bacillus spp.), 예를 들어 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 를 포함한다.
원핵생물 숙주의 형질전환에 대한 교시는 당업계에서 잘 문서화되어 있으며, 예를 들어 [Sambrook et al (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press)] 를 참조한다. 원핵생물 숙주가 사용되는 경우 뉴클레오티드 서열은 형질전환 전에, 예컨대 인트론의 제거에 의해 적합하게 변형되는 것이 필요할 수 있다.
사상균 세포는 당업계에 공지된 다양한 방법 (예컨대 원형질체 형성 및 원형질체의 형질전환 후 공지된 방식으로의 세포벽 재생을 포함하는 과정) 을 사용하여 형질전환될 수 있다. 숙주 미생물로서 아스페르길루스의 사용이 EP 0 238 023 에 기재되어있다.
원핵생물, 진균 및 효모의 형질전환은 일반적으로 당업자에게 널리 공지되어 있다.
숙주 유기체는 곰팡이와 같은 진균일 수 있다. 적합한 이러한 숙주의 예는 트리코데르마 (Trichoderma) (예를 들어 T. 레세이), 테르모마이세스 (Thermomyces), 아크레모늄 (Acremonium), 푸사리움 (Fusarium), 아스페르길루스 (Aspergillus), 페니실리움 (Penicillium), 털곰팡이 (Mucor), 뉴로스포라 (Neurospora) 속 등에 속하는 임의의 일원을 포함한다.
한 구현예에서, 숙주 유기체는 진균일 수 있다. 한 바람직한 구현예에서 숙주 유기체는 트리코데르마 (예를 들어 T. 레세이) 속에 속한다.
배양 및 생성
본 발명에서 사용하기 위한 뉴클레오티드 서열로 형질전환된 숙주 세포는 인코딩된 폴리펩티드의 생성에 도움이 되며 세포 및/또는 배양 배지로부터의 폴리펩티드 회수를 촉진하는 조건 하에 배양될 수 있다.
세포 배양에 사용한 배지는 의문의 숙주 세포 성장 및 폴리펩티드 발현 수득에 적합한 임의의 종래 배지일 수 있다.
재조합 세포에 의해 생성된 단백질은 세포의 표면 상에 디스플레이될 수 있다.
단백질은 숙주 세포로부터 분비될 수 있으며 편리하게는 널리 공지된 절차를 사용하여 배양 배지로부터 회수될 수 있다.
분비
발현 숙주로부터, 단백질이 보다 용이하게 회수될 수 있는 배양 배지 내로 단백질이 분비되는 것이 종종 바람직하다. 본 발명에 따라서, 분비 리더 서열은 원하는 발현 숙주를 기반으로 선택될 수 있다. 하이브리드 신호 서열은 또한 본 발명의 맥락으로 사용될 수 있다.
대규모 적용
본 발명의 한 바람직한 구현예에서, 아미노산 서열은 대규모 적용에 사용된다.
바람직하게는 아미노산 서열은 숙주 유기체의 배양 후 총 세포 배양물 부피 1 리터 당 1 g 내지 1 리터 당 약 2 g 의 양으로 생성된다.
바람직하게는 아미노산 서열은 숙주 유기체의 배양 후 총 세포 배양물 부피 1 리터 당 100 mg 내지 1 리터 당 약 900 mg 의 양으로 생성된다.
바람직하게는 아미노산 서열은 숙주 유기체의 배양 후 총 세포 배양물 부피 1 리터 당 250 mg 내지 1 리터 당 약 500 mg 의 양으로 생성된다.
일반적인 재조합 DNA 방법론적 기술
본 발명은 다르게 나타내지 않는 한, 당업자의 능력 내에 있는 종래의 화학, 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학 기술을 이용한다. 이러한 기술은 문헌에서 설명되어 있다. 예를 들어, J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al. (1995 및 주기적 부록; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N.Y.); B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; M. J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Irl Press; and, D. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press 를 참조한다. 이들 일반적 문헌 각각은 본원에 참조로 포함된다.
이점
본원에 교시된 자일라나아제의 사용은 공지된 자일라나아제에 비해 많은 이점을 갖는다.
본원에 교시된 바와 같은 자일라나아제는 특히 옥수수 기재 생성물에서의 펜토산 용해에 있어서 예기치 않게 양호하다.
본원에 교시된 바와 같은 자일라나아제는 특히 옥수수 기재 생성물에서의 AXinsol 용해에 있어서 예기치 않게 양호하다.
특히 본 발명의 자일라나아제는 옥수수 기재 기질에서의 아라비노자일란 (예를 들어 AXinsol) 과 같은 자일란-함유 물질을 분해하는데 있어서 특히, 펜토산을 분해하는데 예기치 않게 양호하다. 상업적으로 생성되며 시판되는 자일라나아제인 기준 자일라나아제와 비교하여, 본원에 교시된 자일라나아제는 시판 자일라나아제와 비교하여 훨씬 더 효율적인 분해 및 옥수수-기재 기질로부터의 펜토산 배출을 가능하게 한다. 이는 완전히 예기치 못했던 것이었다. 이로 인해, 광범위한 적용에서의 본 발명의 자일라나아제 이용가능성이 제공된다.
놀랍게도, 본 발명의 자일라나아제가 광범위한 스펙트럼의 기질, 옥수수, 밀, DDGS 등, 특히 옥수수 및 옥수수 기재 기질, 특히 밀 (밀-기재 포함) 생성물 및 옥수수 (옥수수-기재 포함) 생성물에서의, 자일란-함유 물질, 예컨대 아라비노자일란, 예를 들어 AXinsol 을 분해하는데 특히 양호하다는 것이 발견되었다. 상업적으로 생성되는 기준 자일라나아제 및 시판 자일라나아제와 비교하여, 본원에 교시된 신규한 자일라나아제는 시판 자일라나아제와 비교하여 훨씬 더 효율적인 분해 및 더 많은 식물 기재 물질 (특히 옥수수-기재 기질) 로부터의 펜토산 배출이 가능하게 하였다. 이는 완전히 예기치 못했던 것이었다. 이는 옥수수 또는 옥수수-기재 기질에서 AXinsol 을 용해하는데 종종 열등하거나 밀- 및 옥수수-기재 기질 모두에서 효율적이지 않은 선행 공지된 효소와 대조적이다.
또한, 본 발명의 효소는 AXinsol 붕괴 (용해) 시키는데에서 뿐 아니라 용해된 중합체를 효율적으로 붕괴 (또는 분해) 시키는데 있어서 특히 양호하다.
본 발명의 효소는 대상의 성능을 증진시키거나 옥수수 기재 사료물에서의 원재료의 소화가능성을 향상시키고/시키거나 대상에서의 공급 효율성을 향상시키는데 있어서 특히 효율적이다.
본 발명을 이제 하기의 도면과 실시예를 참조로 하여 단지 예로서 설명할 것이다.
실시예
실시예 1
푸사리움 옥시스포룸 자일라나아제 (FoxXyn6) 의 클로닝
푸사리움 옥시스포룸 균주로부터 단리한 게놈 DNA 를 자일라나아제 유전자 증폭에 사용하였다. FoxXyn6 유전자로 지칭되는 클로닝된 유전자의 서열을 SEQ ID NO.3 로서 나타낸다 (예측된 인트론을 소문자로 나타냄). FoxXyn6 유전자에 의해 인코딩된 단백질을 SEQ ID NO. 1 및 SEQ ID No. 2 로서 나타낸다.
FoxXyn6 유전자의 단백질 생성물은 PFAM 데이터베이스 (http://pfam.sanger.ac.uk/) 의 검색을 기반으로 한 글리코실 히드롤라아제 패밀리 11 도메인을 인코딩한다. N-말단에서, FoxXyn6 단백질은 SignalP4.0 소프트웨어에 의해 예측된 바와 같이 19 개의 아미노산 신호 펩티드를 갖는다 (Thomas Nordahl Petersen et al., Nature Methods, 8:785-786, 2011).
실시예 2
FoxXyn6 단백질의 발현
FoxXyn6 유전자를 다음의 프라이머를 사용하여 푸사리움 옥시스포룸의 게놈 DNA 로부터 증폭하였다: 프라이머 1 (Not I) 5'- ccgcggccgcaccATGGTTTCCTTCACCTCTCTCCTC-3' (SEQ ID No. 6), 및 프라이머 2 (Asc I) 5'-ccggcgcgcccttaTTACTGGGAGACAGTCATGCTGGC-3' (SEQ ID No. 7). Not I 및 Asc I 로 소화시킨 후, PCR 생성물을 동일한 제한 효소로 소화시킨 pTrex3gM 발현 벡터 (US 2011/0136197 A1 에서 기재됨) 내로 클로닝하였으며, 생성된 플라스미드는 표지된 pZZH139 였다. pZZH139 의 플라스미드 맵을 도 10 에 제공한다. FoxXyn6 유전자의 서열을 DNA 서열분석에 의해 확인하였다.
플라스미드 pZZH139 를 쿼드 결실된 트리코데르마 레세이 균주 (WO 05/001036 에서 기재됨) 내로 세포융합법 (biolistic method) 을 사용하여 형질전환하였다 (Te'o VS et al., J Microbiol Methods, 51:393-9, 2002). 질소의 단독 공급원으로서 아세트아미드를 함유하는 배지 (아세트아미드 0.6 g/L; 염화세슘 1.68 g/L; 글루코오스 20 g/L; 인산이수소칼륨 15 g/L; 황산마그네슘 7수화물 0.6 g/L; 염화칼슘 2수화물 0.6 g/L; 철 (II) 술페이트 5 mg/L; 황산아연 1.4 mg/L; 코발트 (II) 클로라이드 1 mg/L; 망간 (II) 술페이트 1.6 mg/L; 한천 20 g/L; pH 4.25) 상에서 형질전환체를 선택하였다. 5 일 후, 10% 글리세롤을 사용하여 포자를 수집하고, 1 x 108 개 포자를 250 ml 진탕 플라스크 내에서 단백질 발현을 위해 30 ml 글루코오스/소포로오스 제한 배지와 함께 접종하였다. 단백질 발현을 SDS-PAGE 에 의해 확인하였다. 포자 현탁액을 이후 60% 글루코오스-소포로오스 사료 함유 제한 배지 중에서 7 L 발효기에서 성장시켰다.
글루코오스/소포로오스 제한 배지는 (1 리터 당) (NH4)2S04 5 g, PIPPS 완충액 33 g, 카사미노 (Casamino) 산 9 g, KH2P04 4.5 g, CaCl2 (무수) 1 g, MgS04.7H20 1 g (50% NaOH 로 pH 를 5.5 로 조정), 966.5 mL 가 되도록 하는 Milli-Q H20 로 이루어진다. 멸균 후, 하기를 첨가하였다: 26 mL 60% 글루코오스/소포로오스 및 400X T. 레세이 트레이스 금속 2.5 mL.
FoxXyn6 을 하나의 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 7L 발효기 배양물의 농축 발효 브로쓰로부터 정제하였다. 농축된 발효 브로쓰를 겔 여과 컬럼 (HiLoad Superdex 75 pg 26/60) 에 로딩하였고, 사용한 이동상은 0.15 M NaCl 을 함유하는 20 mM 인산나트륨 (pH 7.0) 이었다. 정제된 단백질을 3K Amicon Ultra-15 장치를 사용하여 농축하고 농축한 단백질 분획물을 추가 연구에서 사용하였다.
발현 플라스미드 pZZH139 로부터의 FoxXyn6 유전자의 뉴클레오티드 서열을 SEQ ID No. 3 으로서 나타낸다. 신호 서열을 굵은 글씨체 (대분자) 로 나타내고, 예측된 인트론을 굵은 글씨체 (소문자) 로 나타낸다.
플라스미드 pZZH139 로부터 발현된 FoxXyn6 단백질의 아미노산 서열을 SEQ ID No. 1 로서 나타낸다. 신호 서열을 굵은 글씨체 (대문자) 로 나타낸다.
FoxXyn6 단백질의 예측된 성숙 형태의 아미노산 서열을 SEQ ID No. 2 로서 나타낸다.
실시예 3
FoxXyn6 의 자일라나아제 활성
FoxXyn6 은 PFAM 상동성 검색을 기반으로 한 글리코실 히드롤라아제 11 패밀리 (GH11, CAZy 번호) 에 속한다. FoxXyn6 의 베타 1-4 자일라나아제 활성을 자작나무로부터의 자일란 (Sigma 95588) 및 밀가루로부터의 아라비노자일란 (Megazyme P-WAXYM) 을 기질로서 사용하여 측정하였다. 검정을 1% 기질, 50 mM 구연산나트륨 (pH 5.3), 0.005% Tween-80 완충액의 존재 하에, 50℃ 에서 10 분 동안 인큐베이션하여 수행하였다. 분광광도계에서 540 nm 에서 광학 밀도를 측정하여, 배출된 환원당을 DNS (디니트로살리실산) 검정으로 정량하였다 (G. L. Miller, Anal. Chem. 31 : 426-428, 1959). 자일로오스를 사용하여 표준 곡선을 제작하고 효소 활성 단위를 계산하는데 사용하였다. 이러한 검정에서, 1 자일라나아제 단위는 검정 조건 하에 분당 1 마이크로몰의 자일로오스 환원당 등가물을 생성시키는데 필요한 효소의 양으로서 정의된다.
실시예 4
FoxXyn6 의 pH 프로파일
FoxXyn6 의 pH 프로파일을 자작나무로부터의 자일란 (Sigma 95588) 을 기질로서 사용하여 측정하였다. pH 값을 2 내지 9 로 조정한 구연산나트륨/인산나트륨 완충액 중에서 검정을 수행하였다. 물에 용해한 자작나무 자일란 (2% 용액) 을 96-웰 플레이트에서 동일 부피의 50 mM 시트레이트/포스페이트 완충액과 혼합하고, 효소 첨가 전에 기질을 50℃ 에서 평형화하였다. 인큐베이션 10 분 후, 60 ㎕ 의 반응 혼합물을, 100 ㎕ 의 DNS 용액을 함유하는 96-웰 PCR 플레이트에 옮겨 효소 반응을 중단시켰다. PCR 플레이트를 Bio-Rad DNA 엔진에서 95℃ 에서 5 분 동안 가열하였다. 이후 플레이트를 실온으로 냉각시키고 100 ㎕ 를 각 웰로부터 새로운 96-웰 플레이트에 옮겼다. 분광광도계에서 540 nm 에서 광학 밀도를 측정하여 기질로부터의 환원당의 배출을 정량하였다. 각 pH 에서의 효소 활성을 상대적 활성으로서 나타내었고, 이때 pH 최적점에서의 활성을 100% 로 설정하였다. FoxXyn6 의 pH 프로파일을 도 11 에서 나타낸다. FoxXyn6 은 약 pH 6 의 최적점을 갖는 것으로 발견되었으며, pH 4.5 내지 6.9 에서 최대 활성의 70% 초과를 유지하는 것으로 발견되었다.
실시예 5
FoxXyn6 의 온도 프로파일
pH 5.3 에서 50 mM 구연산나트륨 완충액 중에서 30℃ 내지 75℃ 범위의 온도에서 10 분 동안 자일라나아제 활성을 검정하여, 정제된 FoxXyn6 의 온도 최적점을 측정하였다. 활성을 실시예 3 에서 기재한 바와 같이 측정하고 상대적 활성으로서 나타내었으며, 이때 온도 최적점에서의 활성을 100% 로 설정하였다. FoxXyn6 의 온도 프로파일을 도 12 에서 나타낸다. FoxXyn6 은 60℃ 의 온도 최적점을 갖는 것으로 발견되었으며, 48℃ 내지 65℃ 에서 최대 활성의 70% 초과를 유지하는 것으로 발견되었다.
실시예 6
펜토산 가용화
자일라나아제 (FoxXyn 6) 를 클로닝하고, 발현시키고, 정제하고 분석하고 기준 자일라나아제 제품 Econase® XT 에 대하여 시험하였다.
재료 및 방법
효소 샘플
이 연구에서 사용한 자일라나아제는:
트리코데르마 레세이에서 발현된 푸사리움 옥시스포룸으로부터의 GH11 자일라나아제 (FoxXyn6 으로 지정) (상기 효소를 멸균 여과된 발효물로서 사용함) 및
하기의 기준, 시판 자일라나아제이다:
Econase® XT - 상기 기준 효소를 시판 건조 제형화된 샘플로부터 추출하였다. Econase® XT 시판 건조 제형화된 샘플로부터의 자일라나아제 성분을 Mcllvain 완충액 (pH 5.0) 을 사용하여 33% (w/w) 슬러리 중에서 추출하였다. 추출물을 원심분리 (10 분 동안 3000 RCF) 를 사용하여 세정하고, PALL Acrodisc PF 시린지 필터 (0.8/0.2 ㎛ Supor 멤브레인) 을 사용하여 여과한 후, 20 분 동안 70℃ 에서 가열하였다. 원심분리 (38 724 RCF, 15 분) 에 의해 침전물을 제거한 후, 완충액을 20 mM Na 시트레이트, 20 mM NaCl, pH 3.4 으로 평형화한 Sephadex G25 컬럼 (PD10, Pharmacia 사제) 을 통과시켜 대체하였다. Source 15S 수지를 사용한 후 선형 증가 염 구배로 용리 (20 mM Na 시트레이트 완충액 pH 3.4 중 NaCl) 하여 자일라나아제 성분을 정제하였다.
Econase® XT 는 ABVista 로부터 이용가능한 트리코데르마 레세이로부터의 엔도-1,4-β-자일라나아제이다.
OD280 에서의 흡광도를 측정하여 단백질 농도를 측정하였다. 흡광 계수는 아미노산 서열로부터의 추정치였다.
사료 원재료
이러한 실험에서 사용한 사료는 원재료이다. 사료는 옥수수, 옥수수 DDGS, 밀 또는 밀기울이다.
펜토산 가용화 (AXinsol 가용화)
펜토산 가용화에 사용한 방법은 하기와 같다: 100 mg 의 사료 원재료를 2 ml Eppendorf 원심분리 튜브에 옮기고 정확한 중량을 기록하였다. 750 ㎕ 인큐베이션 완충액 (200 mM HEPES, 100 mM NaCl, 2 mM CaCl, pH 6.0) 및 900 ㎕ 클로람페니콜 용액 (인큐베이션 완충액 중 40 ㎍/ml) 을 첨가하였다. 선택 효소를 첨가하여 총 부피를 1.8 ml 로 만들었다.
각 샘플을 이반복물로 및 블랭크 (외부적으로 첨가한 효소가 없는 인큐베이션) 와 동시에 검정하였다. 샘플을 Eppendorf 열혼합기 (thermomixer) 에서 진탕하면서 40℃ 에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 2 또는 18 시간 후 상청액을 96 웰 필터플레이트 (Pall Corporation, AcroPrep 96 필터 플레이트, 1.0 ㎛ 유리, NTRL, 1 mL 웰) 를 사용하여 여과하였다. 여과 후 샘플을 C5 당, 아라비노오스 및 자일로오스의 총량에 대한 분석 때까지 4℃ 에서 보관하였다.
C5 당 (펜토산) 의 정량
용액에 도입된 펜토산 총량을 연속 흐름 주입 장치 (도 7) 로 Rouau 와 Surget 의 방법 (1994, A rapid semi-automated method of the determination of total and water-extractable pentosan in wheat flours. Carbohydrate Polymers, 24, 123-32) 을 사용하여 측정하였다. 상청액을 산으로 처리하여 다당류를 단당류로 가수분해하였다. 플로로글루시놀 (1,3,5-트리히드록시벤젠) 을, 착색된 복합체를 형성하는 모노펜토오스 및 모노헥소오스와의 반응에 대해 첨가하였다. 510 nm 와 비교한 550 nm 에서의 흡광도 차이를 측정하여, 용액 중 펜토오스의 양을 표준 곡선을 사용하여 계산하였다. 펜토오스-플로로글루시놀 복합체와 달리, 헥소오스-플로로글루시놀 복합체의 흡광도는 이들 파장에서 일정하다. 글루코오스를 플로로글루시놀 용액에 첨가하여 일정한 글루코오스 신호를 생성시키고 헥소오스 당으로부터의 간섭이 없음을 추가로 확인하였다.
결과 및 토의
FoxXyn6 은 밀 및 옥수수에서의 펜토산 가용화 모두에 있어서 놀라울 정도로 강력하게 역할을 수행하였다 (놀랍게도 옥수수에서 펜토산 가용화에 있어서 시판 기준을 훨씬 능가함 (예를 들어 아라비노자일란에서 펜토산 (예를 들어 자일로오스) 으로의 분해)).
펜토산 가용화
밀의 섬유성 부산물 (즉 밀기울) 및 옥수수의 섬유성 부산물 (즉 cDDGS) 을 사용하여 용량 반응 설정에서 펜토산 가용화를 모니터링하였다.
펜토산 가용화에 대한 기준 Econase® XT 및 신규 자일라나아제 (FoxXyn 6) 로부터의 결과를 도 8 (밀기울에서) 및 도 9 (옥수수 DDGS 에서) 에 나타낸다.
도 8 은 자일라나아제 투여량의 함수로서 밀기울로부터의 펜토산 (C-5 당) 배출 (펜토산의 가용화) 을 나타낸다. 사용한 자일라나아제는 기준 자일라나아제 Econase® XT 와 비교한 본 발명의 자일라나아제 (FoxXyn6) 였다.
도 9 는 자일라나아제 투여량의 함수로서 cDDGS 로부터의 펜토산의 가용화를 나타낸다. 사용한 자일라나아제는 기준 자일라나아제 Econase® XT 와 비교한 본 발명의 자일라나아제 (FoxXyn6) 였다.
Econase® XT 는 밀에서 매우 양호하게 역할을 수행하였으나 도 8 에서 나타낸 바와 같이 옥수수에서의 펜토산 가용화에 대해서는 효과가 없거나 제한된 효과를 나타낸다. FoxXyn6 은 놀랍게도, 옥수수에서 펜토산 가용화시 기준 효소 Econase® XT 를 능가한다 (도 8 참조).
시험한 시판 자일라나아제 (Econase® XT) 가 옥수수의 유의한 가용화를 나타내지 않는다는 것에 주목할 가치가 있다.
이는 Econase® XT 와 비교하여 FoxXyn6 에 대한 기질 특이성에 있어서 명백한 차이를 나타낸다. 기준 효소와 비교하여 펜토산 가용화에 대해, 신규 자일라나아제 (FoxXyn6) 는 더 넓은 기질 특이성을 갖는다.
상기 명세서에서 언급한 모든 출판물은 본원에 참고문헌으로 포함된다. 본 발명의 범주 및 취지를 멋어나지 않는 본 발명의 기재된 방법 및 시스템의 다양한 변형 및 변이가 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명이 특정한 바람직한 구현예와 관련되어 기재되었으나, 청구항 발명이 이러한 특정한 구현예에 지나치게 제한되어서는 안된다는 것이 이해될 것이다. 실제로, 생화학 및 생물공학 또는 관련 분야에서의 당업자에게 명백한 본 발명을 실행하기 위한 기재된 방식의 다양한 변형이 하기의 특허청구범위의 범주 내에 있는 것으로 의도된다.
<110> DuPont Nutrition Biosciences ApS <120> Method <130> P045466PCT <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 232 <212> PRT <213> Fusarium oxysporum <400> 1 Met Val Ser Phe Thr Ser Leu Leu Ala Ala Val Ser Ala Val Thr Gly 1 5 10 15 Val Met Ala Leu Pro Ser Ala Gln Pro Val Asp Gly Met Ser Val Val 20 25 30 Glu Arg Asp Pro Pro Thr Asn Val Leu Asp Lys Arg Thr Gln Pro Thr 35 40 45 Thr Gly Thr Ser Gly Gly Tyr Tyr Phe Ser Phe Trp Thr Asp Thr Pro 50 55 60 Asn Ser Val Thr Tyr Thr Asn Gly Asn Gly Gly Gln Phe Ser Met Gln 65 70 75 80 Trp Ser Gly Asn Gly Asn His Val Gly Gly Lys Gly Trp Met Pro Gly 85 90 95 Thr Ser Arg Thr Ile Lys Tyr Ser Gly Ser Tyr Asn Pro Asn Gly Asn 100 105 110 Ser Tyr Leu Ala Val Tyr Gly Trp Thr Arg Asn Pro Leu Ile Glu Tyr 115 120 125 Tyr Ile Val Glu Asn Phe Gly Thr Tyr Asn Pro Ser Ser Gly Gly Gln 130 135 140 Lys Lys Gly Glu Val Asn Val Asp Gly Ser Val Tyr Asp Ile Tyr Val 145 150 155 160 Ser Thr Arg Val Asn Ala Pro Ser Ile Asp Gly Asn Lys Thr Phe Gln 165 170 175 Gln Tyr Trp Ser Val Arg Arg Asn Lys Arg Ser Ser Gly Ser Val Asn 180 185 190 Thr Gly Ala His Phe Gln Ala Trp Lys Asn Val Gly Leu Asn Leu Gly 195 200 205 Thr His Asp Tyr Gln Ile Leu Ala Val Glu Gly Tyr Tyr Ser Ser Gly 210 215 220 Ser Ala Ser Met Thr Val Ser Gln 225 230 <210> 2 <211> 213 <212> PRT <213> Fusarium oxysporum <400> 2 Leu Pro Ser Ala Gln Pro Val Asp Gly Met Ser Val Val Glu Arg Asp 1 5 10 15 Pro Pro Thr Asn Val Leu Asp Lys Arg Thr Gln Pro Thr Thr Gly Thr 20 25 30 Ser Gly Gly Tyr Tyr Phe Ser Phe Trp Thr Asp Thr Pro Asn Ser Val 35 40 45 Thr Tyr Thr Asn Gly Asn Gly Gly Gln Phe Ser Met Gln Trp Ser Gly 50 55 60 Asn Gly Asn His Val Gly Gly Lys Gly Trp Met Pro Gly Thr Ser Arg 65 70 75 80 Thr Ile Lys Tyr Ser Gly Ser Tyr Asn Pro Asn Gly Asn Ser Tyr Leu 85 90 95 Ala Val Tyr Gly Trp Thr Arg Asn Pro Leu Ile Glu Tyr Tyr Ile Val 100 105 110 Glu Asn Phe Gly Thr Tyr Asn Pro Ser Ser Gly Gly Gln Lys Lys Gly 115 120 125 Glu Val Asn Val Asp Gly Ser Val Tyr Asp Ile Tyr Val Ser Thr Arg 130 135 140 Val Asn Ala Pro Ser Ile Asp Gly Asn Lys Thr Phe Gln Gln Tyr Trp 145 150 155 160 Ser Val Arg Arg Asn Lys Arg Ser Ser Gly Ser Val Asn Thr Gly Ala 165 170 175 His Phe Gln Ala Trp Lys Asn Val Gly Leu Asn Leu Gly Thr His Asp 180 185 190 Tyr Gln Ile Leu Ala Val Glu Gly Tyr Tyr Ser Ser Gly Ser Ala Ser 195 200 205 Met Thr Val Ser Gln 210 <210> 3 <211> 751 <212> DNA <213> Fusarium oxysporum <400> 3 atggtttcct tcacctctct cctcgccgcc gtctcggctg tcactggtgt catggccctt 60 ccctccgctc agcccgttga cggcatgagc gttgtcgagc gtgaccctcc cacaaacgtc 120 ctcgacaagc gcactcagcc cactactggc acaagcggtg gttactactt ctctttctgg 180 actgatacac ccaactctgt cacctacacc aacggcaacg gtggccagtt cagcatgcag 240 tggagcggca acggcaacca cgtcggtgga aagggttgga tgcctggtac ttctcggtaa 300 gttccccctg tgctgcctct ctaagcctca tactaacttc atgtgcagca ccatcaagta 360 ctctggttct tacaacccca acggcaacag ctacctcgcc gtttacggtt ggacccgcaa 420 ccctctcatt gagtactaca tcgttgagaa cttcggcact tacaacccct cttccggtgg 480 ccagaagaag ggtgaggtca atgttgacgg atctgtctac gatatctacg tcagcacccg 540 tgtcaacgcc ccctccattg acggtaacaa gacctttcag cagtactggt ctgtccgacg 600 caacaagcgt tccagcggat ccgtcaatac cggtgctcat ttccaggcct ggaagaacgt 660 cggcctcaac cttggtaccc acgactatca gatccttgct gttgagggtt actacagctc 720 tggctctgcc agcatgactg tctcccagta a 751 <210> 4 <211> 699 <212> DNA <213> Fusarium oxysporum <400> 4 atggtttcct tcacctctct cctcgccgcc gtctcggctg tcactggtgt catggccctt 60 ccctccgctc agcccgttga cggcatgagc gttgtcgagc gtgaccctcc cacaaacgtc 120 ctcgacaagc gcactcagcc cactactggc acaagcggtg gttactactt ctctttctgg 180 actgatacac ccaactctgt cacctacacc aacggcaacg gtggccagtt cagcatgcag 240 tggagcggca acggcaacca cgtcggtgga aagggttgga tgcctggtac ttctcgcacc 300 atcaagtact ctggttctta caaccccaac ggcaacagct acctcgccgt ttacggttgg 360 acccgcaacc ctctcattga gtactacatc gttgagaact tcggcactta caacccctct 420 tccggtggcc agaagaaggg tgaggtcaat gttgacggat ctgtctacga tatctacgtc 480 agcacccgtg tcaacgcccc ctccattgac ggtaacaaga cctttcagca gtactggtct 540 gtccgacgca acaagcgttc cagcggatcc gtcaataccg 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Sequence <220> <223> Primer 1 <400> 6 ccgcggccgc accatggttt ccttcacctc tctcctc 37 <210> 7 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 2 <400> 7 ccggcgcgcc cttattactg ggagacagtc atgctggc 38 <210> 8 <211> 188 <212> PRT <213> Fusarium oxysporum <400> 8 Thr Gln Pro Thr Thr Gly Thr Ser Gly Gly Tyr Tyr Phe Ser Phe Trp 1 5 10 15 Thr Asp Thr Pro Asn Ser Val Thr Tyr Thr Asn Gly Asn Gly Gly Gln 20 25 30 Phe Ser Met Gln Trp Ser Gly Asn Gly Asn His Val Gly Gly Lys Gly 35 40 45 Trp Met Pro Gly Thr Ser Arg Thr Ile Lys Tyr Ser Gly Ser Tyr Asn 50 55 60 Pro Asn Gly Asn Ser Tyr Leu Ala Val Tyr Gly Trp Thr Arg Asn Pro 65 70 75 80 Leu Ile Glu Tyr Tyr Ile Val Glu Asn Phe Gly Thr Tyr Asn Pro Ser 85 90 95 Ser Gly Gly Gln Lys Lys Gly Glu Val Asn Val Asp Gly Ser Val Tyr 100 105 110 Asp Ile Tyr Val Ser Thr Arg Val Asn Ala Pro Ser Ile Asp Gly Asn 115 120 125 Lys Thr Phe Gln Gln Tyr Trp Ser Val Arg Arg Asn Lys Arg Ser Ser 130 135 140 Gly Ser Val Asn Thr Gly Ala His Phe Gln Ala Trp Lys Asn Val Gly 145 150 155 160 Leu Asn Leu Gly Thr His Asp Tyr Gln Ile Leu Ala Val Glu Gly Tyr 165 170 175 Tyr Ser Ser Gly Ser Ala Ser Met Thr Val Ser Gln 180 185

Claims (36)

  1. 불용성 아라비노자일란-함유 물질의 분해 방법으로서, SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 또는 SEQ ID No. 8 과 80% 이상의 동일성 (적합하게는 85% 이상, 적합하게는 90% 이상, 적합하게는 95% 이상의 동일성) 을 갖는 SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 또는 SEQ ID No. 8 로서 본원에 나타낸 폴리펩티드 서열, 또는 이의 변이체, 단편, 상동체 또는 유도체를 포함하는 (또는 이로 이루어지는) 자일라나아제; 또는 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 로서 본원에 나타낸 뉴클레오티드 서열, 또는 높은 엄격도 조건 하에 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 에 하이브리드화될 수 있는 뉴클레오티드 서열, 또는 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 와 80% 이상 (적합하게는 85% 이상, 적합하게는 90% 이상, 적합하게는 93% 이상) 의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 자일라나아제, 또는 푸사리움 옥시스포룸 (Fusarium oxysporum) 으로부터 수득가능한 (또는 수득되는) 자일라나아제와 물질을 혼합하는 것을 포함하는 방법.
  2. 자일란-함유 물질 (바람직하게는 아라비노자일란-함유 물질, 바람직하게는 불용성 아라비노자일란-함유 물질) 을 분해하기 위한, SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 또는 SEQ ID No. 8 과 80% 이상의 동일성 (적합하게는 85% 이상, 적합하게는 90% 이상, 적합하게는 95% 이상의 동일성) 을 갖는 SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 또는 SEQ ID No. 8 로서 본원에 나타낸 폴리펩티드 서열, 또는 이의 변이체, 단편, 상동체 또는 유도체를 포함하는 (또는 이로 이루어지는) 자일라나아제; 또는 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 로서 본원에 나타낸 뉴클레오티드 서열, 또는 높은 엄격도 조건 하에 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 에 하이브리드화될 수 있는 뉴클레오티드 서열, 또는 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 와 80% 이상 (적합하게는 85% 이상, 적합하게는 90% 이상, 적합하게는 93% 이상) 의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 자일라나아제, 또는 푸사리움 옥시스포룸으로부터 수득가능한 (또는 수득되는) 자일라나아제의 용도.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 아라비노자일란-함유 물질이 식물 조성물인 방법 또는 용도.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 식물 조성물이 곡류 기재 생성물, 예를 들어 옥수수 기재 생성물, 밀 기재 생성물, 보리 기재 생성물, 호밀 기재 생성물, 라이밀 기재 생성물, 귀리 기재 생성물인 방법 또는 용도.
  5. 제 4 항에 있어서, 옥수수 기재 생성물이 옥수수 기재 사료 생성물 또는 이의 일부인 방법.
  6. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서, 식물 조성물이 곡물-물질, 매쉬 (mash), 맥아즙, 부원료, 맥아 또는 이의 일부인 방법.
  7. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 하나 이상의 추가적인 식물 물질의 첨가를 추가로 포함하는 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 식물 조성물 및 자일라나아제를 혼합하고, 자일라나아제를 식물 조성물에 분무하거나 식물 조성물을 자일라나아제를 포함하는 제제에 침지하여, 식물 조성물이 자일라나아제와 접촉되는 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 식물 조성물이 고섬유 식물 물질 (예를 들어 고섬유 사료 물질) 을 포함하는 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 아라비노자일란-함유 물질이 글루텐박 또는 글루텐 사료 또는 주정박 또는 주정혼합박 (DDGS), 밀 분쇄물, 밀 섬유, 밀기울, 밀 쇼오츠, 쌀겨, 왕겨 또는 귀리 껍질과 같은 식물 부산물을 포함하는 (또는 이로 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어지는) 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 아라비노자일란-함유 물질이 배합 사료, 배합 사료 성분, 배합 사료의 프리믹스, 여물, 여물 성분 또는 여물의 프리믹스인 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 식물 조성물을 식사, 펠렛, 견과, 케이크 또는 크럼블로 형성시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 자일라나아제가 아밀라아제 (α-아밀라아제 (E.C. 3.2.1.1), G4-형성 아밀라아제 (E.C. 3.2.1.60), β-아밀라아제 (E.C. 3.2.1.2) 및 γ-아밀라아제 (E.C. 3.2.1.3) 포함); 및/또는 프로테아제 (예를 들어 서브틸리신 (E.C. 3.4.21.62) 또는 바실로리신 (E.C. 3.4.24.28) 또는 알칼리성 세린 프로테아제 (E.C. 3.4.21.x) 또는 케라티나아제 (E.C. 3.4.x.x)) 로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 효소와 조합으로 사용되는 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 자일라나아제가 아밀라아제 (예를 들어 α-아밀라아제 (E.C. 3.2.1.1)) 및 프로테아제 (예를 들어 서브틸리신 (E.C. 3.4.21.62)) 와 조합으로 사용되는 방법.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 자일라나아제가 엔도-1,3(4)-β-글루카나아제 (E.C. 3.2.1.6) 와 같은 β-글루카나아제와 조합으로 사용되는 방법.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조되는 식물 기재 생성물 (예를 들어 옥수수 기재 생성물).
  17. 식물 조성물 (예를 들어 옥수수 또는 밀) 및/또는 부산물 (예를 들어 옥수수 또는 밀 부산물) 및 SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 또는 SEQ ID No. 8 과 80% 이상의 동일성을 갖는 SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 또는 SEQ ID No. 8 로서 본원에 나타낸 폴리펩티드 서열, 또는 이의 변이체, 단편, 상동체 또는 유도체를 포함하는 자일라나아제; 또는 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 로서 본원에 나타낸 뉴클레오티드 서열, 또는 높은 엄격도 조건 하에 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 에 하이브리드화될 수 있는 뉴클레오티드 서열, 또는 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 와 80% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 자일라나아제, 또는 푸사리움 옥시스포룸으로부터 수득가능한 자일라나아제를 포함하는 식물 조성물 (예를 들어 옥수수 또는 밀 기재 생성물).
  18. 제 17 항에 있어서, 옥수수 기재 생성물, 적합하게는 옥수수 기재 사료 생성물인 식물 조성물.
  19. 제 17 항 또는 제 18 항에 있어서, 아밀라아제 (α-아밀라아제 (E.C. 3.2.1.1), G4-형성 아밀라아제 (E.C. 3.2.1.60), β-아밀라아제 (E.C. 3.2.1.2) 및 γ-아밀라아제 (E.C. 3.2.1.3) 포함); 및/또는 프로테아제 (예를 들어 서브틸리신 (E.C. 3.4.21.62) 또는 바실로리신 (E.C. 3.4.24.28) 또는 알칼리성 세린 프로테아제 (E.C. 3.4.21.x) 또는 케라티나아제 (E.C. 3.4.x.x)) 로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 효소를 추가로 포함하는 식물 조성물.
  20. 제 17 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 아밀라아제 (예를 들어 α-아밀라아제 (E.C. 3.2.1.1)) 및 프로테아제 (예를 들어 서브틸리신 (E.C. 3.4.21.62)) 를 추가로 포함하는 식물 조성물.
  21. 제 17 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 엔도-1,3(4)-β-글루카나아제 (E.C. 3.2.1.6) 와 같은 β-글루카나아제를 추가로 포함하는 식물 조성물.
  22. SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 또는 SEQ ID No. 8 과 80% 이상의 동일성을 갖는 SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 또는 SEQ ID No. 8 로서 본원에 나타낸 폴리펩티드 서열, 또는 이의 변이체, 단편, 상동체 또는 유도체를 포함하는 자일라나아제; 또는 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 로서 본원에 나타낸 뉴클레오티드 서열, 또는 높은 엄격도 조건 하에 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 에 하이브리드화될 수 있는 뉴클레오티드 서열, 또는 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 와 80% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 자일라나아제, 또는 푸사리움 옥시스포룸으로부터 수득가능한 자일라나아제를 사료 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 혼합하고, (임의로는) 패키징하는 것을 포함하는, 사료 첨가제 조성물의 제조 방법.
  23. 제 22 항에 있어서, 자일라나아제가 아밀라아제 (α-아밀라아제 (E.C. 3.2.1.1), G4-형성 아밀라아제 (E.C. 3.2.1.60), β-아밀라아제 (E.C. 3.2.1.2) 및 γ-아밀라아제 (E.C. 3.2.1.3) 포함); 및/또는 프로테아제 (예를 들어 서브틸리신 (E.C. 3.4.21.62) 또는 바실로리신 (E.C. 3.4.24.28) 또는 알칼리성 세린 프로테아제 (E.C. 3.4.21.x) 또는 케라티나아제 (E.C. 3.4.x.x)) 로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 효소와 혼합되는 방법.
  24. 제 22 항 또는 제 23 항에 있어서, 자일라나아제가 아밀라아제 (예를 들어 α-아밀라아제 (E.C. 3.2.1.1)) 및 프로테아제 (예를 들어 서브틸리신 (E.C. 3.4.21.62)) 와 혼합되는 방법.
  25. 제 22 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 자일라나아제가 엔도-1,3(4)-β-글루카나아제 (E.C. 3.2.1.6) 와 같은 β-글루카나아제와 혼합되는 방법.
  26. SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 또는 SEQ ID No. 8 과 80% 이상의 동일성을 갖는 SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 또는 SEQ ID No. 8 로서 본원에 나타낸 폴리펩티드 서열, 또는 이의 변이체, 단편, 상동체 또는 유도체를 포함하는 자일라나아제; 또는 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 로서 본원에 나타낸 뉴클레오티드 서열, 또는 높은 엄격도 조건 하에 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 에 하이브리드화될 수 있는 뉴클레오티드 서열, 또는 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 와 80% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 자일라나아제, 또는 푸사리움 옥시스포룸으로부터 수득가능한 자일라나아제 및 사료 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하고, 임의로는 패키징된 사료 첨가제 조성물.
  27. 제 26 항에 따른 사료 첨가제 조성물 또는 SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 또는 SEQ ID No. 8 과 80% 이상의 동일성을 갖는 SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 또는 SEQ ID No. 8 로서 본원에 나타낸 폴리펩티드 서열, 또는 이의 변이체, 단편, 상동체 또는 유도체를 포함하는 자일라나아제; 또는 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 로서 본원에 나타낸 뉴클레오티드 서열, 또는 높은 엄격도 조건 하에 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 에 하이브리드화될 수 있는 뉴클레오티드 서열, 또는 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 와 80% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 자일라나아제, 또는 푸사리움 옥시스포룸으로부터 수득가능한 자일라나아제를 하나 이상의 미네랄 및/또는 하나 이상의 비타민과 조합으로 포함하는 프리믹스.
  28. 사료 첨가제 조성물 또는 프리믹스가 건조 분말 또는 과립 (바람직하게는 TPT 과립) 으로서 제형화되는, 제 26 항에 따른 사료 첨가제 조성물 또는 제 27 항에 따른 프리믹스.
  29. 아밀라아제 (α-아밀라아제 (E.C. 3.2.1.1), G4-형성 아밀라아제 (E.C. 3.2.1.60), β-아밀라아제 (E.C. 3.2.1.2) 및 γ-아밀라아제 (E.C. 3.2.1.3) 포함); 및/또는 프로테아제 (예를 들어 서브틸리신 (E.C. 3.4.21.62) 또는 바실로리신 (E.C. 3.4.24.28) 또는 알칼리성 세린 프로테아제 (E.C. 3.4.21.x) 또는 케라티나아제 (E.C. 3.4.x.x)) 로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 효소를 추가로 포함하는, 제 26 항 또는 제 28 항에 따른 사료 첨가제 조성물 또는 제 27 항 또는 제 28 항에 따른 프리믹스.
  30. 아밀라아제 (예를 들어 α-아밀라아제 (E.C. 3.2.1.1)) 및 프로테아제 (예를 들어 서브틸리신 (E.C. 3.4.21.62)) 을 추가로 포함하는, 제 26 항 또는 제 27 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 따른 사료 첨가제 조성물 또는 제 27 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 따른 프리믹스.
  31. 엔도-1,3(4)-β-글루카나아제 (E.C. 3.2.1.6) 와 같은 β-글루카나아제를 추가로 포함하는, 제 26 항 또는 제 27 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 따른 사료 첨가제 조성물 또는 제 27 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 따른 프리믹스.
  32. 맥주와 같은 발효 음료의 제조에 있어서의, SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 또는 SEQ ID No. 8 과 80% 이상의 동일성을 갖는 SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 또는 SEQ ID No. 8 로서 본원에 나타낸 폴리펩티드 서열, 또는 이의 변이체, 단편, 상동체 또는 유도체를 포함하는 자일라나아제; 또는 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 로서 본원에 나타낸 뉴클레오티드 서열, 또는 높은 엄격도 조건 하에 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 에 하이브리드화될 수 있는 뉴클레오티드 서열, 또는 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 와 80% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 자일라나아제, 또는 푸사리움 옥시스포룸으로부터 수득가능한 자일라나아제의 용도.
  33. SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 또는 SEQ ID No. 8 과 80% 이상의 동일성을 갖는 SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 또는 SEQ ID No. 8 로서 본원에 나타낸 폴리펩티드 서열, 또는 이의 변이체, 단편, 상동체 또는 유도체를 포함하는 자일라나아제; 또는 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 로서 본원에 나타낸 뉴클레오티드 서열, 또는 높은 엄격도 조건 하에 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 에 하이브리드화될 수 있는 뉴클레오티드 서열, 또는 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 5 와 80% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 자일라나아제, 또는 푸사리움 옥시스포룸으로부터 수득가능한 자일라나아제와 매쉬 및/또는 맥아즙을 접촉시키는 단계를 포함하는, 발효 음료의 제조 방법.
  34. 제 33 항에 있어서, 하기 단계를 포함하는 발효 음료의 제조 방법으로서:
    (a) 매쉬를 제조하는 단계,
    (b) 매쉬를 여과하여 맥아즙을 수득하는 단계, 및
    (c) 맥아즙을 발효하여 맥주와 같은 발효 음료를 수득하는 단계,
    여기서 상기 자일라나아제가: (i) 단계 (a) 의 매쉬 및/또는 (ii) 단계 (b) 의 맥아즙 및/또는 (iii) 단계 (c) 의 맥아즙에 첨가되는 방법.
  35. 제 33 항 또는 제 34 항에 따른 방법에 의해 제조되는 맥주와 같은 발효 음료.
  36. 도면 및 실시예를 참조로 본원에 실질적으로 개시된 바와 같은 방법, 용도, 키트, 사료 생성물 또는 사료 첨가제.
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