CN103667408B - 一种利用小麦蛋白制备肠营养肽的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种利用小麦蛋白制备肠营养肽的方法，属于小麦蛋白深加工技术领域。该方法包括：(1)将小麦蛋白与多糖预混、加水分散，获得经多糖增溶的小麦蛋白悬浮液；(2)选用Protamex^TM复合蛋白酶对小麦蛋白进行分步限制性酶解，后一步酶解的底物为上步酶解产生的沉淀，酶解次数控制在3-4次，最终沉淀中蛋白含量低于5％(干基)即停止酶解；(3)将上述各步酶解离心后的上清液采用连续酶解-膜分离耦合系统处理，系统中添加一定量的Alcalase碱性蛋白酶酶解一定时间后，透过液经纳滤脱盐，即得到高谷氨酰胺低聚小麦肽。所制备的小麦活性肽能够明显减轻肠炎大鼠肠粘膜损伤程度，促进肠粘膜蛋白、DNA的合成，具有显著的肠营养功效。

Description

一种利用小麦蛋白制备肠营养肽的方法

技术领域

本发明属于小麦蛋白深加工技术领域，涉及一种利用小麦蛋白制备肠营养肽的方法。

背景技术

谷氨酰胺是肌体应激状态下的一种“条件必需氨基酸”，是肠道粘膜细胞代谢必需的营养物质，对于维持肠道粘膜上皮结构完整性十分重要。尤其是在疲劳、感染、外伤等严重应激状态下，肠道粘膜上皮细胞内谷氨酰胺很快耗竭。当肠道缺乏谷氨酰胺或食物、消化液等刺激时，肠道粘膜会发生萎缩，绒毛变稀、变短甚至脱落、肠道免疫功能严重受损。临床实践证明，肠外提供谷氨酰胺可有效防止肠道粘膜萎缩，增强肠道细胞活性，改善肠道免疫功能，维持正常肠道粘膜重量、结构及蛋白质含量，减少肠道细菌及内毒素易位(Owari M，Wasa M，OueT，Nose S，Fukuzawa M.Glutamine prevents intestinal mucosalinjury induced bycyclophosphamide in rats[J].Pediatric Surgery International，2012，28：299-303)。

然而研究发现，游离谷氨酰胺的水溶液极不稳定，受热后易形成有毒物质-焦谷氨酸(pyroglutamic，pGlu)(Kuhn KS，Stehle P，Furst P.QuantitativeAnalysis of Glutamine in Peptides and Proteins[J].Joumal of Agricultural and FoodChemistry.1996，44：1808-1811)。针对谷氨酰胺稳定性差的问题，国外通过化学法合法开发出谷氨酰胺代替品-谷氨酰胺肽，常见的有Gly-Gln、Ala-Gln等二肽，但产量低，成本高，限制了广泛使用。事实上，多数谷物蛋白质中均含有丰富的谷氨酰胺，尤其在小麦蛋白、豆粕、玉米黄粉中所占比例较高，采用酶法水解技术，将难溶性的谷物蛋白水解为富含谷氨酰胺的生物活性肽，为机体补充谷氨酰胺提供了新的途径。

我国是小麦生产和消费大国。目前，小麦加工副产物-小麦蛋白(俗称谷朊粉)的产量在15万吨左右，占世界产量的30％以上。作为一种性质独特的蛋白，小麦蛋白紧密的三维网状结构和氨基酸结合方式导致其溶解性极低，限制了功能特性的发挥。值得注意的是，小麦蛋白氨基酸组成中谷氨酸含量高达35％以上，且大部分以谷氨酰胺形式存在，使得以小麦蛋白为原料通过生物酶解技术制备谷氨酰胺肽成为可能，也为小麦蛋白高值化利用提供了新的思路。

目前酶法制备谷氨酰胺肽多采用间歇酶解工艺，存在反应转化率低、耗酶量大、产品质量不稳定等诸多问题。日本学者Tanabe等首次以小麦蛋白为原料，采用Molsin(XIII)和Actinase E两种蛋白酶对底物进行酶解，再经Sephadex G-15纯化后得到高谷氨酰胺小麦低聚肽(Tanabe S，Watanabe M，AraiS.Production of a High-Glutamine Oligopeptide Fraction from Gluten by EnzymaticTreatment and Evaluation of its Nutritional effect on the small Intestine of Rats[J].Journal of Food Biochemistry，1993，16：235-248)。但该酶解过程持续48小时，原料易发生腐败变质，反应进程不易控制。我国学者针对小麦蛋白源谷氨酰胺肽的开发也进行了部分工作。但整体来看，在酶解过程中，酰胺基团破坏严重，终产物有效谷氨酰胺含量普遍较低，大大降低了产物的活性(杨得胜.水解面筋蛋白高效制备谷氨酰胺结合肽的研究[J].食品科学，2006，27：181-185；刘文豪，孙智达，魏振承，池建伟，汤虎.二次酶解麦谷蛋白制备富含谷氨酰胺(Gln)活性肽营养液的研究.中国粮油学报[J].2009，24∶32-36)。此外，国内专利“一种工业化生产小麦谷氨酰胺肽的方法”(公开号CN103173511A)，报道了双酶分步酶解制备谷氨酰胺肽的方法，产物有效谷氨酰胺含量达到23.5％，低聚肽含量约为80％，但原料的利用率不足50％，且物料前处理工艺复杂、耗碱量大。

酶解-膜分离偶联技术集酶促反应、酶的回收利用和产物的分离纯化等工序于一体，可以提高酶的利用率，实现水解物在线膜分离，同时提高了生产效率和稳定产品质量。在酶解-膜分离耦合技术应用方面，有专利报道了一种利用酶膜反应器制备燕麦抗氧化肽的方法(CN102212600B)、一种高活性玉米降血压肽的制备方法及专用装置(CN102453741A)；但利用该技术生产具有肠营养功效的小麦谷氨酰胺肽，目前未见报道。现代消化理论认为分子量低于1000Da的低聚肽易于被机体直接消化吸收，具有转运速度快，耗能低的特点，特别是能够消除与游离氨基酸的吸收竞争，大大提高蛋白质的吸收利用率。本发明以小麦蛋白为原料，采用酶解-膜分离耦合技术将蛋白水解与低聚肽分离有机结合，避免过度酶解对肽链上酰胺基团的破坏，从而实现了高谷氨酰胺低聚小麦肽的有效制备，经动物试验证实，该小麦肽具有突出的肠道营养功效。本发明对于拓宽小麦蛋白应用范围，提高小麦蛋白附加值具有重要现实意义。

发明内容

本发明提供了一种利用小麦蛋白制备肠营养肽的方法，具体提供一种具有肠道营养功效的小麦谷氨酰胺肽的制备方法。

本发明是通过下列技术方案实现的：

一种利用小麦蛋白制备肠营养肽的方法，其包括原料的分步酶解及水解液的连续化酶解-膜分离耦合过程处理，所述的制备方法包括以下步骤：

(1)配置小麦蛋白料液：将小麦蛋白原料与多糖共混，多糖质量占小麦蛋白质量的0.1-0.5％，加水至蛋白质量浓度为10％-20％，充分搅拌，形成均匀悬浮液；

(2)分步酶解：调节料液的pH值为7.0±0.5，维持温度50±2℃，添加质量分数为小麦蛋白0.1-0.5％的Protamex^TM复合蛋白酶进行酶解，当水解度(DH)达到3-5％时，将酶解液离心，得到上清液1和沉淀1；沉淀1加入相当于步骤1的2／3质量的水复溶后，补添与第一步酶解等质量蛋白酶，继续酶解至DH再次达到3-5％，离心，得上清液2和沉淀2；重复第二步酶解过程1-2次，直至沉淀中蛋白含量<5％(干基)；

(3)连续化酶解-膜分离耦合过程处理：上述各级分步酶解后的上清液在制备后1h内，泵入连续酶解-膜分离耦合系统反应罐，料液pH维持在8.0±0.5，温度50±2℃，反应罐中加入Alcalase碱性蛋白酶，加酶量为步骤(1)中原始小麦蛋白质量的0.1-0.5％，酶解液连续循环的通过截留分子量为3000Da的超滤膜，得到分子量为3000Da以下的酶解产物，截留液返回至反应罐中继续酶解，此循环过程开始后，不断补添步骤(2)离心所得上清液，使反应罐中液位高度保持稳定，当透过液体积达到料液总体积的3／4时，停止超滤；

(4)灭酶、脱盐、干燥：将步骤(3)中的透过液升温至95-100℃，保持10min，灭酶；再冷却至25±5℃，调节pH至中性，采用纳滤膜脱盐，其中纳滤脱盐的工艺条件是等容循环渗透次数在3-5次，浓缩倍数为原始体积的1／2，浓缩液经冷冻干燥或喷雾干燥法去除水分，制成小麦谷氨酰胺肽粉。

所述小麦蛋白原料为谷朊粉或由小麦粉提取制备的小麦蛋白，其质量指标符合蛋白(干基)≥80％，灰分(干基)≤2.0，粗脂肪(干基)≤2.0，淀粉(干基))≤15％。

所述阴离子多糖为在水溶液中带有负电荷的大豆多糖(SPSS)、羧甲基纤维素钠(CMC)、果胶(Pectin)中的一种或几种多糖的混合物。

制备的小麦谷氨酰胺肽经理化成分分析确定蛋白含量>85％(干基)；利用高效凝胶过滤色谱测定分子量分布，根据峰面积计算出低聚肽含量达到90％以上；样品采用BTI保护、PITC柱前衍生后经高效液相色谱测得有效谷氨酰胺含量大于>30％。

采用甲氨蝶呤诱导大鼠肠炎，研究小麦谷氨酰胺肽谷对肠粘膜受损大鼠小肠粘膜组织形态、病理评分、粘膜细胞DNA及蛋白合成能力影响，结果发现所制备的谷氨酰胺肽能够明显减轻肠炎大鼠肠粘膜损伤程度，促进肠粘膜蛋白、DNA的合成，具有突出的肠营养功效。

本发明的有益效果在于：

(1)将小麦蛋白与少量带有负电荷的多糖共混，通多糖与蛋白之间的静电相互作用和水合作用，获得分散性良好的小麦蛋白悬浮液，避免了小麦蛋白遇水结团、酶解效率低下的问题。

(2)基于小麦蛋白亚基组成的多样性及酶解特性的差异性，在酶解-膜分离耦合处理料液之前，采用分步酶解法对小麦蛋白进行限制性酶解，当水解度达到一定要求时，分离出酶解上清液作为酶解-膜分离耦合处理的物料。该过程可可显著提高小麦蛋白的溶解性，获得满足进入酶解-超滤系统的物料，同时减轻一次性长时间酶解对易酶解亚基中酰胺基团的破坏作用。

(3)采用酶解-膜分离耦合技术将蛋白水解与低聚肽分离有机结合，避免过度酶解对肽链上酰胺基团的破坏，从而实现了高谷氨酰胺低聚小麦肽的有效制备。

(4)制得的高谷氨酰胺低聚小麦肽具有突出的肠营养功效，可作为临床用药或食品、保健品的配料，拓宽了小麦蛋白应用范围，对于提高小麦蛋白附加值具有重要现实意义。

附图说明

下面对附图进行简要说明。

图1为小麦谷氨酰胺肽的制备工艺图。

图2小麦谷氨酰胺肽的凝胶色谱图。

图3为样品经BTI保护前后液相色谱图。

图4为小肠粘膜蛋白及DNA含量测定结果。

具体实施方案

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的原料、试剂等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

本发明使用的小麦蛋白为商品化谷朊粉，其质量指标如下：蛋白(干基)83.2％，灰分(干基)1.8％，粗脂肪(干基)1.9％，淀粉(干基)12.3％。

本发明所用的复合蛋白酶Protamex^TM(1.5AU／g)由丹麦诺维信公司提供，碱性蛋白酶Alcalase(20.0万／g)由北京市鸿润宝顺科技有限公司提供。

实施例1：高谷氨酰胺低聚小麦肽的制备

(1)配置小麦蛋白料液：将100g小麦蛋白原料与0.1g羧甲基纤维素钠共混，加水至蛋白质量浓度为10％，搅拌30min形成均匀悬浮液；

(2)分步酶解：调节料液的pH值为7.0±0.5，维持温度50±2℃，添加0.5g Protamex^TM蛋白酶进行酶解，当水解度达到5％时，将酶解液离心(3000rpm，15min)，得到上清液1和沉淀1；沉淀1加入相当于步骤(1)2／3质量的水复溶后，补添0.5g Protamex^TM蛋白酶，继续酶解至水解度达到5％，离心(3000rpm，15min)，得上清液2和沉淀2；重复第二步酶解过程1次，得上清液3和沉淀3，经凯式定氮法测得沉淀3中蛋白含量为4.7％(干基)；

(3)连续化酶解-膜分离耦合过程处理：上述各级分步酶解后的上清液在制备后1h内，泵入连续酶解-膜分离耦合系统反应罐，料液pH维持在8.0±0.5，温度50±2℃，反应罐中加入0.5g Alcalase蛋白酶，酶解液连续循环的通过截留分子量为3000Da的超滤膜，得到分子量为3000Da以下的酶解产物，截留液返回至反应罐中继续酶解，此循环过程开始后，不断补添分步酶解所制备的各级上清液，使反应罐中液位高度保持稳定，当透过液体积达到各级原始料液总体积的3／4时，停止超滤；

(4)灭酶、脱盐、干燥：将步骤(3)中的透过液升温至95℃，保持10min，灭酶；再冷却至25±5℃，调节pH至中性，采用纳滤膜进行脱盐，等容循环渗透次数3次，浓缩倍数为原始体积的1／2，浓缩液经冷冻干燥法去除水分，最终得到75.6g小麦谷氨酰胺肽粉；

实施例2：小麦谷氨酰胺肽基本组分和分子量分布分析

小麦谷氨酰胺肽基本组分分析结果见表1。

表1小麦谷氨酰胺肽的基本组分分析

成分	蛋白(N×5.79)	脂肪	淀粉	灰分
					含量％(干基)	85.3	0.1	9.8	2.6

采用高效凝胶过滤色谱法对小麦谷氨酰胺肽的分子量分布进行分析，色谱条件如下：

色谱柱：TSKgel2000SWXL(300mm×7.8mm)

流动相：乙腈／水／TFA=45／55／0.1(V／V)

检测波长：UV220nm

流速：0.5ml／min

柱温：30℃

以细胞色素C(MW12500Da)、抑肽酶(MW6500Da)、杆菌肽(MW1450Da)、乙氨酰氨-乙氨酰氨-精氨酸(MW451Da)和乙氨酰氨-乙氨酰氨-乙氨酸(MW189Da)为标准品作相对分子质量校正曲线，得到相对分子质量与保留时间之间的回归方程y=-0.256x+7.229(R²=0.991)，进而预测相对分子质量分布。经测得小麦谷氨酰胺肽的凝胶色谱图如图2所示。采用液相数据处理软件将样品的凝胶色谱数据带入校正曲线方程，采用峰面积归一法计算各分子量段所占比例，结果见表2。数据表明样品分子量1000以下低聚肽含量达到91.3％(分子量低于181的组分视为游离氨基酸)。

表2小麦谷氨酰胺肽分子量分布结果

分子量范围(Da)	所占比例(％)
		<181	3.1
181-1000	91.3
		1000-3000	4.7
3000-5000	0.9
		>5000	0
合计	100

实施例3：小麦谷氨酰胺肽中有效谷氨酰胺含量的测定

采用BTI对谷氨酰胺肽中非氮端谷氨酰胺进行保护，再酸水解处理，经PITC柱前衍生后，在高效液相色谱上检测肽链中非氮端谷氨酰胺含量。所用标准品为Gly-Gln，标准曲线方程为：y=1582x-950.3(R²=0.998)。样品经BTI保护前后液相色谱图如3所示。经计算，有效谷氨酰胺含量为30.19％。

实施例4：小麦谷氨酰胺肽对大鼠肠粘膜损伤的修复作用研究

甲氨蝶呤(MTX)是癌症治疗主要化疗药物之一，在杀死生长、增殖快速的肿瘤细胞的同时，对正常组织细胞，尤其是肠粘膜细胞有严重的损害作用。本研究采用腹腔注射法构建MTX诱导的小肠粘膜损伤动物模型。30只雄性wistar大鼠(200±20g)，随机分为3组，每组10只。基础饲料喂食，随意摄水。大鼠适应4天后，连续3天腹膜注射氨甲蝶呤(1.5mg／kg／d)造成小肠炎，第四天杀死大鼠，进行指标分析。实验设A组正常对照组：腹腔注射0.9％的生理盐水1ml；B组MTX模型组；C组：小麦谷氨酰胺肽修复组(3.3g／kg／d，谷氨酰胺含量30.19％)，该组从造模当天开始，按剂量灌胃1次／d进行干预。

肠道组织病理学检查：将回肠末端组织固定于中性福尔马林溶液中，常规脱水，石蜡包埋，切片HE染色后光镜下观察小肠绒毛高度和隐窝深度。采用Park等报道的积分法评估小肠损伤程度。0分为正常黏膜；1分为绒毛顶部上皮下产生间隙；2分为上皮下间隙扩大；3分为上皮部分绒毛脱落；4分为绒毛脱落明显；5分为绒毛消失；6分为隐窝组织形成梗死；7分为转化粘液质形成梗死；8分为透壁梗死。肠粘膜形态测量学检查结果见表4。

表4肠粘膜形态学测量结果

项目	A组	B组	C组
				绒毛高度(μm)	532.6±4.3a	312.2±5.8c	512.4±2.9b
隐窝深度(μm)	183.4±2.6a	110.5±3.7b	174.3±3.5a
				小肠粘膜病理评分	0.4±0.2b	1.7±0.4a	0.6±0.2b

注：表中小写字母代表同行不同处理组0.05水平的差异显著性。

由表4数据可知，B组(MTX模型组)出现小肠绒毛缩短、隐窝深度变浅的现象，与A组正常对照组存在显著性差异(p<0.05)。C组谷氨酰胺肽修复组病理损伤较MTX模型组明显减轻，绒毛缩短和隐窝消失现象显著降低(p<0.05)。

小肠粘膜蛋白及DNA含量的测定。采用commassie亮蓝法；在生理盐水中用匀浆器将刮下的肠粘膜匀浆(6000rpm，30s)，定容至5ml，稀释30倍，取0.1ml加染液显色后比色，算出蛋白含量；小肠粘膜DNA含量采用天根试剂盒测定，结果见图4。可见，B组MTX模型组粘膜DNA和蛋白含量与A组正常对照组相比具有显著性差异(p<0.05)。与B组MTX模型组相比，C组谷氨酰胺肽修复组的粘膜DNA和蛋白含量较高(p<0.05)。

本研究表明，依据该专利方法所制备的小麦谷氨氨酰胺肽对大鼠肠粘膜损伤具有显著的修复效果，具有理想的肠道营养功效。

Claims (2)

1.一种利用小麦蛋白制备肠营养肽的方法，其特征在于：所述的制备方法包括以下步骤：

(1)配制小麦蛋白料液：将小麦蛋白原料与多糖共混，多糖质量占小麦蛋白质量的0.1-0.5％，加水至蛋白质量浓度为10％-20％，充分搅拌，形成均匀悬浮液；

(2)分步酶解：调节料液的pH值为7.0±0.5，维持温度50±2℃，添加小麦蛋白质量0.1-0.5％的Protamex^TM复合蛋白酶进行酶解，当水解度DH达到3-5％时，将酶解液离心，得到上清液1和沉淀1；沉淀1加入相当于步骤(1)2/3质量的水复溶后，补添与第一步酶解等质量蛋白酶，继续酶解至DH再次达到3-5％，离心，得上清液2和沉淀2；重复第二步酶解过程1-2次，直至沉淀中蛋白含量低于5％(干基)；

(3)连续化酶解-膜分离耦合过程处理：上述各级分步酶解后的上清液在制备后1h内，泵入连续酶解-膜分离耦合系统反应罐，料液pH维持在8.0±0.5，温度50±2℃，反应罐中加入Alcalase碱性蛋白酶，加酶量为步骤(1)中原始小麦蛋白质量的0.1-0.5％，酶解液连续循环的通过截留分子量为3000Da的超滤膜，得到分子量为3000Da以下的酶解产物，截留液返回至反应罐中继续酶解，此循环过称开始后，不断补添步骤(2)离心所得上清液，使反应罐中液位高度保持稳定，当透过液体积达到料液总体积的3/4时，停止超滤；

(4)灭酶、脱盐、干燥：将步骤(3)中的透过液升温至95～100℃，保持10min，灭酶；再冷却至25±5℃，调节pH至中性，采用纳滤膜脱盐，其中纳滤脱盐的工艺条件是等容循环渗透次数3-5次，浓缩倍数为原始体积的1/2，浓缩液经冷冻干燥或喷雾干燥法去除水分，制成小麦谷氨酰胺肽。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于多糖为在水溶液中呈负电性的大豆多糖SPSS、羧甲基纤维素钠CMC、果胶Pectin中的一种或几种的混合物。