CN102212600A - 一种利用酶膜反应器制备燕麦抗氧化肽的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种制备燕麦抗氧化肽的方法。通过考察不同蛋白酶酶解燕麦麸蛋白所得产物的抗氧化活性和产物得率，确定Alcalase作为制备用酶；并通过考察Alcalase对燕麦麸蛋白的酶解速度，可知Alcalase酶解燕麦麸蛋白速度的降低主要是由于底物消耗和酶活损失共同造成的。同时，通过研究酶膜反应器系统对酶活的影响，可知酶膜反应器系统对Alcalase具有很好的保留效果，其中蠕动泵运转过程对酶造成的破坏和超滤膜对酶的吸附是导致Alcalase酶活损失的主要原因。通过利用DesignExpert 6.0.5设计四因素三水平的响应面分析试验，求得酶膜反应器制备燕麦抗氧化肽的最佳工艺条件为底物浓度3％、加酶量3.2％、料液流量45L/h、操作压力0.07MPa、温度55℃、pH值＝7.3，经过验证，在该条件下产物的DPPH清除率可达57.39％。

Description

一种利用酶膜反应器制备燕麦抗氧化肽的方法

技术领域

本发明涉及一种利用酶膜反应器制备燕麦抗氧化肽的方法。

背景技术

生物活性肽是蛋白质中20个天然氨基酸以不同组成和排列方式构成的从二肽到复杂的线形和环行结构的不同肽类的总称，是源于蛋白质最复杂的多功能化合物，具有人体代谢和生理调节功能，食用安全性高，是当前国际食品界最热门的研究课题^[1]。随着生物科学技术的发展以及人们保健意识的加强，生物活性肽已成为目前制药和保健品行业的主要发展趋势。近些年来抗氧化剂在国内外得到了蓬勃的发展，用途也越来越广泛，不仅用于含脂肪食品的抗氧化防御，而且作为功能因子用于保健食品及化妆品等的开发(夏向东，吕飞杰，台建祥.抗氧化剂的功效及抗氧化活性的体外分析评价[J].食品科学，2001，22(1)：89-93.)，但是研究发现人工合成的抗氧化剂具有许多副作用(刘志先.合理使用食品添加剂[J].饮食与健康，1992，(3)：44-45.)，因此食源抗氧化肽的研究成为了各国的研究热点。

目前，酶解法是制备生物活性肽的最主要方法，因为水解过程仅使蛋白肽键断裂产生特定序列的肽段，而氨基酸的结构和构型保持不变，不会产生有毒和有害物质，具有安全性高、水解条件温和、过程易控制及仪器设备简单等独特的优势^[4]，同时，随着基因工程技术的进步和发酵工业的发展，酶解蛋白制备生物活性肽将成为一种主流。

目前，工业化水解蛋白制备生物活性肽的方式几乎都是间歇式生产，其存在很多不足之处，如酶的一次性使用、各批次产物性能不稳定、生产周期长及劳动强度大等，而酶膜反应器的使用则能很好地克服这些不足之处。酶膜反应器(Enzymatic Membrane Reactor，简称EMR)是把酶促反应与膜的选择性物质传递有效地结合在一起，即采用适当孔径的膜将酶和底物与产物分开，并使产物不断透过膜的一种反应设备，创造出有利于过程的热力学和动力学，实现了反应与分离的同步进行。同传统的化学反应器或其他酶反应器(如间歇反应器)等相比，酶膜反应器在结构设计和操作流程上的优点是比较明显的，如可连续操作、反应-分离相耦合、酶的循环再生及有效富集产物等(Giorno L，Drioli.Biocatalytic membrane reactors：applications perspectives[J].Trends in Biotechnology，2000，18(8)：339-349.)。随着基因工程以及材料科学的发展，酶的催化性能及膜的性能均得到逐步的改善和提高，再加上高效固定化技术的开发以及过程设计的不断优化，已使得酶膜反应器在生物、医药、化工、环保、食品工业等领域得到了越来越广泛的应用。但是，由于目前对酶膜反应器特性的认识还不够全面，其存在很多问题还待进一步研究和解决。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用酶膜反应器制备燕麦抗氧化肽的方法。

本发明所提供的制备燕麦抗氧化肽的方法，是在酶膜反应器中进行制备的，包括下述步骤：1)将燕麦麸蛋白溶液加入到所述酶膜反应器的酶解罐中，调节所述燕麦麸蛋白溶液的pH值为7.0～7.5，并加热至55℃～60℃；然后再将碱性蛋白酶(Alcalase)加入到所述酶解罐中，使燕麦麸蛋白与碱性蛋白酶在搅拌状态下反应2～4min；其中，所述燕麦麸蛋白溶液的质量浓度为2.5％-3％，所加入的碱性蛋白酶与所述燕麦麸蛋白溶液中燕麦麸蛋白的配比为(17000-18000)U/g_{燕麦麸蛋白}；

2)关闭所述酶膜反应器中超滤循环装置的超滤膜透过液出口，同时打开蠕动泵，使酶解液以45～50L/h的料液流量常压循环2～4min；

3)开启所述超滤膜透过液出口，使酶解液仍以45～50L/h的料液流量循环，调节超滤膜的操作压力为0.06～0.07MPa，进行酶解-膜分离耦联反应，反应过程中每隔30min向所述酶解罐中补加燕麦蛋白溶液和碱性蛋白酶维持反应体系体积恒定以及蛋白浓度、酶量恒定，，同时保持反应体系的pH值为7.0～7.5、温度为55℃～60℃，反应结束将收集的超滤膜透过液干燥，即得到所述燕麦抗氧化肽。

为了降低蠕动泵运转过程对酶造成的破坏，步骤2)中所述蠕动泵的转速可选择240-300rpm。同时，为了减少超滤膜对酶的吸附，可在使用前，用燕麦麸蛋白溶液对超滤膜进行预吸附处理。预吸附处理，即加酶之前关闭所述酶膜反应器中超滤循环装置的超滤膜透过液出口，同时打开蠕动泵，使燕麦蛋白溶液以45～50L/h的料液流量常压循环2～4min达到预吸附处理的目的。

上述所用的超滤膜具体可为中空纤维膜，其截留分子量为6000～10000Da。

步骤3)中所述酶解-膜分离耦联反应的反应时间可为3-6小时。

在反应过程中，当超滤膜的膜通量下降至初始膜通量的30％或30％以下时停止反应，利用反冲系统恢复膜通量继续反应。

步骤3)中反应过程中向所述酶解罐中补加燕麦麸蛋白溶液的量是通过测定每小时收集的超滤液的量来确定的，补料浓度则是通过测定超滤液中的多肽含量确定的，即出多少产物补多少量。

本发明对碱性蛋白酶酶活定义：1g固体酶粉(或1ml液体酶)在酶最适条件下(60℃、pH值8.0的条件下)，每分钟降解酪蛋白释放1μg酪氨酸所需要的酶量为一个酶活单位U，以U/g(U/ml)表示。

本发明通过对Alcalase、Trypsin和Pepsin酶解燕麦麸蛋白所获得产物的抗氧化活性和产物得率的研究，确定Alcalase作为酶解燕麦麸蛋白制备抗氧化肽的初步用酶，并在Alcalase单酶作用的基础上研究Alcalase+Trypsin和Alcalase+Pepsin耦合酶解燕麦麸蛋白对产物活性的影响，最终确定在研究酶膜反应器制备燕麦抗氧化肽工艺的过程中不考虑分步酶解作用。

通过研究Alcalase在不同酶解体系大小、底物浓度及加酶量条件下对燕麦麸蛋白酶解速度的影响，可知Alcalase酶解燕麦麸蛋白的速度存在两个阶段：初期高速酶解和后期酶解速度迅速降低；经过进一步研究发现，Alcalase酶解燕麦麸蛋白速度的降低主要是由于底物消耗和酶活损失共同造成的。因此，为了使Alcalase酶解燕麦麸蛋白连续进行，需要在酶解过程中定期向酶解体系中加入燕麦麸蛋白和Alcalase。

通过研究酶膜反应系统对酶活的影响，可知酶膜反应系统对Alcalase具有很好的保留效果，其中蠕动泵运转过程对酶造成破坏和超滤膜对酶的吸附是导致Alcalase酶活损失的原因，故在优化酶膜反应器利用Alcalase酶解燕麦麸蛋白制备抗氧化肽的工艺条件时，可通过调节蠕动泵的转速及超滤膜预吸附底物等方式来降低Alcalase酶活的损失。

通过DPS软件设计均匀试验方案和SPSS软件处理试验数据，求得在利用酶膜反应器酶解燕麦麸蛋白制备抗氧化肽过程中，酶活保留率和多肽生产效率均取较大值时各因素的水平条件为底物质量浓度(即燕麦麸蛋白溶液浓度)3％、加酶量17000U/g、料液流量45L/h、操作压力0.06MPa、温度60℃、pH值＝7；经过验证，在该条件下酶膜反应器对Alcalase酶活的保留率达92.86％、多肽生产效率为1896.5mg/(m²·h)。

同时，以DPPH清除率为指标，利用Design Expert 6.0.5设计四因素三水平的响应面分析试验，求得酶膜反应器制备燕麦抗氧化肽的最佳工艺条件为底物浓度3％、加酶量18000U/g、料液流量45L/h、操作压力0.07MPa、温度55℃、pH值＝7.3，经过验证，在该条件下产物的DPPH清除率可达57.39％，多肽生产效率为1896.5mg/(m²·h)。

综上所述，本发明以燕麦麸蛋白为原料，在最佳工艺条件下利用酶膜反应器酶解燕麦蛋白制备燕麦抗氧化肽。所得产物的DPPH清除率可达57.39％，多肽生产效率可达1896.5mg/(m²·h)。该方法具有良好的应用前景。

附图说明

图1为本发明所用的分体式酶膜反应器的结构示意图；其中，1-反应罐；2-恒温水浴加热套；3-恒温原料罐；4-碱液罐；5-搅拌器；6-温度计；7-pH计；8-蠕动泵；9、12-压力表；10-超滤膜；11、13、14-控制阀；15-流量计；16-产物储液罐。

图2为不同蛋白酶的水解度与多肽得率之间的关系。

图3为不同蛋白酶的水解度与产物DPPH清除率之间的关系。

图4为3种蛋白酶酶解燕麦麸蛋白制备抗氧化肽的酶解时间与产物DPPH清除率之间的关系。

图5为3种蛋白酶酶解燕麦麸蛋白制备抗氧化肽的酶解时间与多肽得率之间的关系。

图6为Alcalase+Pepsin分步酶解燕麦麸蛋白制备抗氧化肽的酶解时间与产物DPPH清除率之间的关系。

图7为酶解体系大小对Alcalase酶解燕麦麸蛋白速度的影响。

图8为底物浓度对Alcalase酶解燕麦麸蛋白速度的影响。

图9为加酶量对Alcalase酶解燕麦麸蛋白速度的影响。

图10为考察底物消耗和酶活损失对Alcalase酶解燕麦麸蛋白速度影响的流程图。

图11为考察酶解产物对Alcalase酶解燕麦麸蛋白速度影响的流程图。

图12为底物消耗及酶活损失对Alcalase酶解燕麦麸蛋白速度的影响

图13为酶解产物对Alcalase酶解燕麦麸蛋白速度影响。

图14为酶活保留率和截留液于280nm处吸光度随超滤时间的变化。

图15为酶活泄漏率和透过液于280nm处吸光度随超滤时间的变化。

图16为酶活损失率随超滤时间的变化。

图17为蠕动泵、搅拌器、压力表及硅胶管对Alcalase酶活的影响。

图18为超滤膜对Alcalase酶活的影响。

具体实施方式

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

燕麦麸皮(蛋白质含量17.8％)：河北省康保县翔龙食品有限公司；UEOS503中空纤维膜：天津膜天膜工程技术有限公司，截留分子量6000Da；DPPH：Sigma公司；碱性蛋白酶(Alcalase)：Novozymes公司；胃蛋白酶(Pepsin)：Sigma公司；胰蛋白酶(Trypsin)：Amresco公司；Folin-酚试剂：SIGMA公司；酪蛋白：北京奥博星生物技术有限责任公司；其他试剂均为分析纯。

燕麦麸蛋白是按照下述方法制备得到的：

首先，称取一定量的燕麦麸皮置于反应罐中，以料液比1∶8(g/ml)加入去离子水，将pH值调至4.5，并加入1.5％(w/w)糖化酶，反应罐升温至55℃，恒温搅拌酶解60min；接着，将提取液的pH值调至6，加入1％(w/w)淀粉酶，反应罐升温至85℃，酶解，直至无淀粉为止；然后，再将提取液的温度降至55℃，pH值调至4.5，加入1％(w/w)糖化酶，酶解60min；最后，将提取液pH值调至10，在55℃恒温条件下搅拌浸提90min，离心(4000r/min)，将上清液pH值调至燕麦麸蛋白等电点处(pI＝4.0)，室温静置12h，离心(4000r/min)，将燕麦麸蛋白沉淀物置于真空干燥箱中烘干，粉碎，即得燕麦麸蛋白粉，备用。

下述实施例中利用Folin-酚法测酶活力的方法对蛋白酶活力进行测定，具体测定过程如下：

1)酪氨酸标准曲线的绘制

酪氨酸标准曲线的绘制过程，见表1所示。

表l酪氨酸标准曲线的绘制

2)蛋白酶活力的测定过程

首先，取4支10ml离心管(编号为0、1、2和3)分别加入待测酶样(Alcalase)1ml或1g(Pepsin或Trypsin)，并向0号管内加入2ml 0.4mol/L三氯乙酸，将4支管置于蛋白酶的最适作用温度下预热5min；然后，向各管中加入经同样温度预热的酪蛋白1ml，精确酶解10min后，立即向1、2、3号管中加入2ml 0.4mol/L三氯乙酸溶液，终止反应，继续水浴保温20min；最后，将酶解液进行离心或过滤，并利用Folin-酚法测定上清液中酪氨酸含量。酶活力的计算公式见1：

酶活力＝(C×4)/10×F    (1)

C：酶解液中酪氨酸的浓度(μg/mL)；4：酶解液的体积为4ml；

F：稀释倍数；10：反应时间(min)。

酪氨酸浓度与680nm处吸光度存在良好的线性关系，其标准方程为y＝0.0086x+0.0236(R²＝0.999)，方程中x为酪氨酸浓度，y为680nm处吸光度。由该标准方程分别求得Alcalase、Pepsin和Trypsin 3种蛋白酶酶活力分别为568640U/ml、306928U/g和86668U/g。

下述实施例中各指标的测定方法如下

1)水解度的测定

本发明在测定Alcalase和Trypsin对燕麦麸蛋白的水解度时采用pH-STAT法(参考文献：(1)张敏.部分品种燕麦的氨基酸测定及评价[J].仪器仪表与分析监测，1994，10(1)：55-57.(2)Adler N J.Control of proteolytic reaction and level of bitterness in protein hydrolysis processes[J].J Chem Technol Biotechnol，1984，34(3)：215-222.(3)Adler N J.Enzymatic Hydrolysis of Food Protein[M]，London：Elesevier Applied Science publishers，1986：12-14.(4)廖丹葵.鸡蛋蛋黄蛋白质制备降血压肽的研究[D].广西：广西大学，2006.(5)袁斌，吕桂善，刘小玲.蛋白质水解度的简易测定方法[J].广西农业生物科学，2002，21(2)：113-115.)。

而在测定Pepsin酶解燕麦麸蛋白的水解度时采用TCA法(农绍庄，徐龙权，朱蓓薇.海参蛋白酶解工艺条件的优化[J].大连轻工业学院学报，2001，20(2)：105-108.)。

2)多肽得率的计算公式(见2)

3)多肽生产效率的计算公式(见3)

多肽浓度的测定方法：采用Folin-酚法[文献：R.K.Owusu-Apenten.Food protein analysis：quantitative effects on processing[M].New York：Marcel Dekker，Inc.，2002，70-71]

4)DPPH自由基清除率的测定

测定酶解产物对DPPH自由基的清除率的过程，如表2所示。

表2酶解产物DPPH自由基清除率的测定过程

DPPH自由基清除率的计算公式见4：

$Y/\%=(1-\frac{\mathrm{As}-\mathrm{Ar}}{A_o})\×100---\left(4\right)$

实施例1、考察酶解燕麦麸蛋白所用蛋白酶及酶解方式

(1)酶解指标的确定

首先，称取一定量的燕麦麸蛋白置于恒温反应器中，根据表2中Alcalase、Pepsin和Trypsin 3种蛋白酶酶解条件对燕麦麸蛋白进行酶解，在酶解过程中利用1mol/LNaOH或HCl溶液保持pH值恒定，并记录NaOH或HCl溶液的消耗量，同时，分别在0min、60min、120min、180min、240min处取样，并将其迅速置于沸水浴中15min，灭酶，冷却至室温，调节溶液pH值至燕麦麸蛋白等电点处(pI＝4.0)，静置30min，离心(10000r/min，4℃，10min)，取上清液并将pH值调至7.0；然后，将上清液置于-20℃冷冻24h，常温融解，离心(10000r/min，4℃，10min)，即得燕麦多肽溶液；最后，分别测定不同酶在各时间段下的水解度、多肽得率和DPPH清除率，研究水解度与多肽得率和DPPH清除率之间的关系。

表3试验中选用的酶及水解条件

利用Alcalase、Pepsin和Trypsin 3种蛋白酶分别酶解燕麦麸蛋白，研究不同酶在各时间段下水解度与多肽得率和DPPH清除率之间的关系，试验结果见图2、图3。

由图2、3可知，Alcalase、Trypsin和Pepsin 3种蛋白酶酶解燕麦麸蛋白过程中，水解度与多肽得率和DPPH清除率之间不存在简单的线性关系，故并不能以燕麦麸蛋白的水解程度来说明酶解产物活性的高低，Theodore等(heodore A E，Kristinsson H G.Angiotensin converting enzyme inhibition of fish protein hydrolysates prepared from alkaline-aided channel catfish protein isolate[J].Journal of the Science of Food and Agriculture，2007，87(12)：2353-2357.)同样证明水解度与活性之间不存在简单的线性关系，同时，考察的主要目的是优化酶解燕麦麸蛋白制备抗氧化肽的工艺条件。因此，决定将产物活性作为衡量指标来优化制备工艺。

(2)单酶酶解方式

分别利用Alcalase、Pepsin和Trypsin 3种蛋白酶对燕麦麸蛋白进行酶解(酶解条件及过程见1.3.3)，酶解结束后，测定不同酶在各时间段下的多肽得率和DPPH清除率。

以DPPH清除率和多肽得率为指标，分别研究Alcalase、Trypsin和Pepsin 3种蛋白酶对产物活性及多肽得率的影响，试验结果见图4、图5。

由图4、5可知，Alcalase、Trypsin和Pepsin酶解燕麦麸蛋白所制备产物之间的活性存在显著差异，并且随着酶解的进行，各酶解产物的活性均随之发生不同程度的变化，但是，与Trypsin和Pepsin相比，Alcalase酶解燕麦麸蛋白所制备产物的活性随酶解时间的变化程度较小，而且Alcalase酶解燕麦麸蛋白的多肽得率要高于Trypsin和Pepsin。同时，由于酶膜反应器酶解燕麦麸蛋白制备抗氧化肽过程中，要求所用蛋白酶具有价格低、单位质量(体积)酶活高及对底物利用率高等特点，而且要求其酶解燕麦麸蛋白制备的产物具有活性稳定和含量高等特性。因此，决定采用Alcalase作为酶解燕麦麸蛋白制备抗氧化肽的初步用酶。

(3)分步酶解方式

首先，称取一定量的燕麦麸蛋白置于恒温反应器中，加入一定量的去离子水配成2％(w/v)蛋白溶液，将pH值调至8、温度升至60℃，加入Alcalase(加酶量11250U/g蛋白)，酶解240min(在酶解过程中利用1mol/L NaOH或HCl溶液保持pH值恒定)，置于沸水浴中15min，灭酶，冷却至室温；接着，将燕麦麸蛋白酶解液混匀，分成两等分，一份加入Pepsin(酶解条件：加酶量6140U/g蛋白，温度45℃，pH值＝8)，另一份加入Trypsin(酶解条件：加酶量6140U/g蛋白，温度37℃，pH值＝2)，分别酶解240min(在酶解过程中利用1mol/L NaOH或HCl溶液保持反应液pH值恒定)，同时，分别在0min、60min、120min、180min、240min处取样，并将其迅速置于沸水浴中15min，灭酶，冷却至室温，调节溶液pH值至燕麦麸蛋白等电点处(pI＝4.0)，静置30min，离心(10000r/min，4℃，10min)，取上清液并将pH值调至7.0；然后，将上清液置于-20℃冷冻24h，常温融解，离心(10000r/min，4℃，10min)，即得燕麦多肽溶液；最后，分别测定不同酶在各时间段下的DPPH清除率。

以DPPH清除率为指标，分别研究Alcalase+Trypsin和Alcalase+Pepsin分步酶解燕麦麸蛋白对产物活性的影响，试验结果见图6。

由图6可知，在Alcalase酶解燕麦麸蛋白的基础上，加入Trypsin或Pepsin继续酶解燕麦麸蛋白，所获得产物对DPPH自由基的清除效果出现了较大程度的变化，甚至产物的活性出现了降低；同时，根据DPPH自由基清除率的整体变化趋势而言，Trypsin或Pepsin的加入并没有明显提高产物的活性，而且分步水解会延长生产周期和提高生产成本。因此，决定在研究酶膜反应器制备燕麦抗氧化肽工艺的过程中不考虑分步酶解。

实施例2、考察Alcalase酶解燕麦麸蛋白的速度

研究Alcalase酶解燕麦麸蛋白的特性是进一步优化酶膜反应器利用Alcalase制备燕麦抗氧化肽工艺的前提条件，而酶解速度是研究Alcalase对燕麦麸蛋白酶解特性的关键，因为酶解速度的快慢直接决定酶膜反应器制备抗氧化肽的可行性，若Alcalase对燕麦麸蛋白的酶解速度太慢，会使燕麦麸蛋白在膜表面迅速形成凝胶层，膜被严重污染，造成酶膜反应器停止运行。因此，以NaOH消耗速度来表征酶解速度，考察酶解体系大小、底物浓度及加酶量对酶解速度的影响，并分析了造成酶解速度下降的主要原因。

1)酶解体系大小、底物浓度及加酶量对酶解速度的影响

通过间歇反应分别考察在不同酶解体系(酶解体系：200ml和2L两种酶解体系；酶解条件：底物浓度2％(w/v)，加酶量11250U/g protein，温度60℃，pH值＝8)、底物浓度(底物浓度：1％、3％、5％、7％、9％；酶解条件：酶解体系200ml，加酶量11250U/g protein，温度60℃，pH值＝8)、加酶量(加酶量：2813U/g protein、5625U/g protein、11250U/gprotein、16875U/g protein、22500U/g protein、25125U/gprotein；酶解条件：酶解体系200ml，底物浓度3％，温度60℃，pH值＝8)条件下Alcalase酶解燕麦麸蛋白过程中，在不同时间段下反应液消耗1mol/LNaOH溶液的速度，考察酶解体系大小、底物浓度及加酶量对Alcalase酶解燕麦麸蛋白速度的影响。试验结果见图7-9。

由图7-9可知，在不同酶解体系大小、底物浓度及加酶量条件下，Alcalase对燕麦麸蛋白酶解速度的变化趋势基本一致，即在酶解初期酶解速度非常快，而在酶解中后期酶解速度逐渐下降，尤其是酶解中期酶解速度下降最快，并且根据酶解过程中每克蛋白消耗1mol/L NaOH的体积及pH-STAT法中耗碱量和水解度的关系可知，酶解体系的扩大和加酶量的增加有利于提高酶解速度和燕麦麸蛋白水解度，而底物浓度的增加会降低酶解速度和燕麦麸蛋白水解度，说明底物对酶活存在一定的抑制作用。因此，需要综合考虑产物性质、生产效率及成本等因素，在特定的酶解体系下进一步研究确定底物浓度和加酶量。

2)影响酶解速度变化因素的研究

通过间歇反应分别研究底物消耗、酶活损失及产物生成对Alcalase酶解燕麦麸蛋白速度的影响，试验过程见图10和11。结果见图12、图13。

由图12可知，在酶解初期，当向酶解体系中分别加入燕麦麸蛋白和Alcalase时，加入燕麦麸蛋白的体系的酶解速度要明显高于加入Alcalase的，说明酶解初期Alcalase酶解燕麦麸蛋白速度的降低主要是由于底物消耗造成的，这可能是因为随着酶解的进行，底物中被Alcalase所能作用的位点逐渐减少，导致酶解速度降低；在酶解后期，当向反应体系中加入底物后，酶解平衡所需的时间变短，并且消耗NaOH的总量也减少，而当向酶解体系中再加入蛋白酶时，酶解速度迅速提高，说明酶解后期Alcalase酶解燕麦麸蛋白速度的降低主要是由于酶活损失造成的。因此，为了使Alcalase酶解燕麦麸蛋白连续进行，需要在酶解过程中定期向酶解体系中加入燕麦麸蛋白和Alcalase。

由图13可知，当利用Alcalase再次酶解燕麦麸蛋白残渣时，底物中含有产物对酶解速度并没有抑制作用，并且含产物的酶解体系消耗的碱量要高于不含产物的酶解体系，可能是由于产物被Alcalase再次作用造成的，说明在酶解后期酶解产物对Alcalase酶解燕麦麸蛋白的速度并没有影响，而酶解产物对Alcalase酶解新燕麦麸蛋白的速度具有一定抑制作用。

实施例3、考察酶膜反应器系统对酶活的影响

首先，向反应罐中加入2500ml缓冲液(0.02mol/L pH值＝8.0磷酸缓冲液)，并加入12.5ml Alcalase，搅拌15min，取5ml酶液测其酶活力及280nm处吸光度；接着，关闭超滤膜透过液出口，打开蠕动泵，料液流量为25L/h，常温、常压循环3min后，打开超滤膜透过液出口，并调节压力至0.01MPa，常温循环超滤，并不断向体系中加入磷酸缓冲液，记录加入量，每循环60min后，打开压力控制阀，关闭蠕动泵，关闭透过液出口，量取超滤膜透过液体积，并测其酶活力及280nm处吸光度；然后，通过循环过程中向反应系统中加入缓冲液的量和透过液的量，向体系中再补入一定量的缓冲液(维持体系恒定)后，打开蠕动泵，料液流量为25L/h，常温、常压循环5min，取5ml酶液测其酶活力及280nm处吸光度。

以酶活保留率、酶活泄漏率、酶活损失率及截留液和透过液中蛋白含量为指标，考察酶膜反应器对Alcalase酶活的保留性能，试验结果见图14-16。

由图14-16可知，在酶膜反应系统的运行过程中，虽然伴随着Alcalase的泄漏和酶活的损失，但是酶膜反应系统仍对Alcalase酶活力具有很高的保留率，运行5h后Alcalase酶活力保留率达83.52％，而酶活泄漏率仅6.67％，同时酶活力也仅损失了9.81％。因此，酶膜反应系统对Alcalase具有很好的截留效果。

实施例4、考察酶膜反应器系统中影响酶活的主要因素

1)蠕动泵、搅拌器、压力表及硅胶管对酶活的影响

首先，将酶膜反应器中超滤膜拆卸掉，利用反应罐、蠕动泵、搅拌器、压力表及硅胶管组成循环系统；接着，向反应罐中加入2000ml缓冲液(0.02mol/L pH值＝8.0磷酸缓冲液)，并加入10mlAlcalase，搅拌15min，取5ml酶液测其酶活力及280nm处吸光度；然后，打开蠕动泵，料液流量为25L/h，常温、常压循环，每循环60min，取5ml酶液液测其酶活力及280nm处吸光度；最后，关闭蠕动泵，将体系中酶液分成两等份，一份置于常温中静置5h，另一份置于搅拌器下搅拌5h(搅拌器应用条件前后一致)，分别测量两体系5h前后酶活的变化。

2)超滤膜对酶活的影响

首先，利用超纯水测量超滤膜的膜通量(超滤条件：操作压力0.02MPa，温度30℃，流量25L/h；)；接着，向反应罐中加入2000ml缓冲液(0.02mol/LpH值＝8.0磷酸缓冲液)，并加入10ml Alcalase，搅拌15min，取5ml酶液测其酶活力及280nm处吸光度；然后，关闭超滤膜超滤液出口，打开蠕动泵，料液流量为25L/h，常温、常压循环，每循环60min，取5ml酶液液测其酶活力及280nm处吸光度；最后，将体系中酶液排尽，利用超纯水测量超滤膜的膜通量(条件同上)。

以酶活保留率为指标，研究了超滤膜、蠕动泵、搅拌器、压力表及硅胶管对Alcalase酶活的影响，试验结果见图17-18。

由图17可知，由蠕动泵、搅拌器、压力表及硅胶管组成的循环系统在运行过程中会对Alcalase酶活造成一定的损失，运行5h后酶活保留率为96.32％，损失了3.68％；根据酶液在280nm下吸光度随时间的变化曲线可知，该系统中各组件对酶并没有吸附作用，可以排除系统中硅胶管和压力表对Alcalase酶活的影响；而酶液分别在常温中静置和在常温中搅拌5h后，酶液中的酶活基本没变化，说明酶活的降低并不是由于酶的自身降解和搅拌器形成的剪切力造成的。因此，在该系统中Alcalase酶活的降低主要是由于蠕动泵运转过程中造成的。

由图18可知，由蠕动泵、超滤膜、搅拌器、压力表及硅胶管组成的循环系统在运行过程中对Alcalase酶活造成的损失要明显高于由蠕动泵、搅拌器、压力表及硅胶管组成的循环系统，该系统运行5h后酶活保留率降低至92.24％，酶活损失率达7.76％，说明超滤膜是造成Alcalase酶活降低的另一主要因素；根据运行5h后超滤膜的膜通量由最初的4.7L/(m²·h)降低至4L/(m²·h)及酶液在280nm下吸光度随时间的变化曲线可知，超滤膜对酶具有一定吸附作用，其造成酶液中Alcalase酶活的降低。

因此，在酶膜反应系统中Alcalase酶活的降低主要是由于蠕动泵运转过程对酶造成的破坏和超滤膜对酶的吸附造成的，故在优化酶膜反应器利用Alcalase酶解燕麦麸蛋白制备抗氧化肽的工艺条件时，可通过调节蠕动泵的转速及超滤膜预吸附底物等方式来降低Alcalase酶活的损失。

实施例5、酶膜反应器制备抗氧化肽

1)试验方案的设计

首先，利用DPS(Data Processing System)软件设计均匀试验，研究底物浓度、加酶量、料液流量、操作压力、温度和pH值六因素对酶活保留率、多肽生产效率和DPPH清除率的影响；接着，利用SPSS 16.0 for window软件处理数据，分析六因素对各指标的影响程度及主次顺序；然后，利用DPS软件处理数据，求出酶活保留率和多肽生产效率取最大值时各因素的最优组合水平；最后，以酶活保留率和多肽生产效率取最大值时各因素的最优组合水平为基础，取影响DPPH清除率的四个主要因素为研究对象，利用Design Expert 6.05进行试验设计，优化抗氧化肽的制备工艺。

2)试验操作流程

首先，向反应罐中加入2500ml一定浓度的蛋白溶液，将其置于恒温水浴锅中升温，并利用1mol/L NaOH调pH值，直至温度和pH值达到要求；接着，向反应体系中加入一定量的Alcalase，搅拌3min后，打开蠕动泵，常压循环2min；然后，调节系统压力，运行15min(期间需要不断向反应体系中加入1mol/L NaOH和恒温去离子水，维持反应体系pH值和体积恒定)后，关闭蠕动泵；最后，分别测定酶膜反应系统的酶活保留率、多肽生产效率及产物的DPPH清除率。

3)结果分析

根据底物浓度和加酶量对酶解速度的影响、Alcalase作用条件及酶膜反应系统中各元件正常运行条件，确定了底物浓度、加酶量、料液流量、操作压力、温度和pH值六因素的水平范围(因素-水平表见表4)，并利用DPS软件设计了混合均匀试验(混合均匀试验方案及结果见表5)。

表4酶膜反应器制备燕麦抗氧化肽工艺优化混合均匀试验的因素-水平设计表

表5酶膜反应器制备燕麦抗氧化肽工艺优化的混合均匀试验方案及结果

注：1)测定产物的DPPH清除率时，多肽浓度为2mg/ml；2)“-”为缺失值；

各因素对酶活保留率的影响

以底物浓度、加酶量、料液流量、操作压力、温度和pH值为自变量、酶活保留率为因变量，利用SPSS软件进行全回归分析，分析结果见表6。

由表6可知，经过SPSS软件全回归分析，所得回归方程为：

y₁＝177.799-0.085x₁+0.442x₂+0.088x₃-38.542x₄-x₅-4.584x₆

结果显示，回归模型的判定系数R²为0.983，且调整后的判定系数R²达到了0.949，说明回归模型的因变量与自变量之间的线性相关性显著，同时，F＝28.998≥F_0.01(6，3)＝27.911，且P＝0.009＜0.01，说明该回归模型是非常显著的，因此可以用该回归模型对试验结果进行分析和预测；根据标准化回归系数可知，各因素对酶活保留率的影响顺序为温度＞pH值＞料液流量＞操作压力＞加酶量＞底物浓度，其中温度、pH值、操作压力、底物浓度与Alcalase酶活保留率呈负相关性，而料液流量与加酶量呈正相关性，且根据P值可知温度和pH值对Alcalase酶活保留率的影响是非常显著的。

以底物浓度、加酶量、料液流量、操作压力、温度和pH值为自变量、酶活保留率为因变量，利用DPS软件通过偏最小二乘法建模，求得Alcalase酶活保留率取最大值时各因素的最优组合为：底物浓度2.5％、加酶量0.5％、料液流量46L/h、操作压力0.01MPa、温度50℃、pH值＝7，预测Alcalase酶活保留率可达98.98％；经过验证，在该条件下酶活保留率可达97.13％。

表6(a)拟合模型概况

表6(c)模型各项回归系数

各因素对多肽生产效率的影响

以底物浓度、加酶量、料液流量、操作压力、温度和pH值为自变量、多肽生产效率为因变量，利用SPSS软件进行全回归分析，分析结果见表7。

由表7可知，经过SPSS软件全回归分析，所得回归方程为：

y₂＝-1979.323+165.311x₁+165.276x₂+12.897x₃+21180.734x₄+7.419x₅+8.694x₆

结果显示，回归模型的判定系数R²为0.968，且调整后的判定系数R²达到了0.903，说明回归模型的因变量与自变量之间的线性相关性显著，同时，F＝14.984≥F_0.05(6，3)＝8.941，且P＝0.024＜0.05，说明该回归模型是显著的，因此可以用该回归模型对试验结果进行分析和预测；根据标准化回归系数可知，各因素对多肽生产效率的影响顺序为操作压力＞底物浓度＝加酶量＞料液流量＞温度＞pH值，其中各因素均与多肽生产效率呈正相关性，且根据P值可知操作压力对多肽生产效率的影响是非常显著的、底物浓度和加酶量对多肽生产效率的影响是显著的。

以底物浓度、加酶量、料液流量、操作压力、温度和pH值为自变量、多肽生产效率为因变量，利用DPS软件通过偏最小二乘法建模，求得多肽生产效率取最大值时各因素的最优组合为：底物浓度3％、加酶量5％、料液流量50L/h、操作压力0.1MPa、温度65.5℃、pH值＝7，预测多肽生产效率可达2469.5mg/(m²·h)；经过验证，在该条件下多肽生产效率可达2256.7mg/(m²·h)。

表7(a)拟合模型概况

表7(b)模型方差分析表

表7(c)模型各项回归系数

各因素对产物DPPH清除率的影响

以底物浓度、加酶量、料液流量、操作压力、温度和pH值为自变量、DPPH清除率为因变量，利用SPSS软件进行全回归分析，分析结果见表8。

由表8可知，经过SPSS软件全回归分析，所得回归方程为：

y₄＝128.017-0.736x₁-1.784x₂+0.105x₃+304.919x₄-0.405x₅-6.046x₆

结果显示，回归模型的判定系数R²为0.991，且调整后的判定系数R²达到了0.965，说明回归模型的因变量与自变量之间的线性相关性显著，同时，F＝37.852≥F_0.05(6，2)＝19.330，且P＝0.026＜0.05，说明该回归模型是显著的，因此可以用该回归模型对试验结果进行分析和预测；根据标准化回归系数可知，各因素对DPPH清除率的影响顺序为操作压力＞pH值＞温度＞加酶量＞料液流量＞底物浓度，其中底物浓度、加酶量、温度、pH值与DPPH清除率呈负相关性，而料液流量与操作压力呈正相关性，且根据P值可知操作压力对DPPH清除率的影响是非常显著的、pH值对DPPH清除率的影响是显著的。

表8(a)拟合模型概况

表8(b)模型方差分析表

表8(c)模型各项回归系数

高的酶活保留率和多肽生产效率是利用酶膜反应器制备燕麦活性肽的基础条件，也是利用酶膜反应器制备燕麦抗氧化肽的前提条件，并且二者须同时满足。因此，根据上述分析结果，综合考虑底物浓度、加酶量、料液流量、操作压力、温度和pH值分别对酶活保留率和多肽生产效率的影响程度及酶活保留率和多肽生产效率取最大值时各因素的水平条件，同时，结合各因素对酶膜反应器实际应用过程中的影响，确定酶活保留率和多肽生产效率均取较大值时各因素的水平条件为底物浓度3％、加酶量3％、料液流量45L/h、操作压力0.06MPa、温度60℃、pH值＝7，因为：1)底物浓度对多肽生产效率的影响显著，而对酶活保留率的影响较小，故确定底物浓度为3％；2)虽然加酶量对多肽生产效率影响显著，但是根据加酶量对燕麦麸蛋白酶解速度的影响可知，当加酶量超过3％时燕麦麸蛋白酶解速度变化不大，并且加酶量大会提高生产成本，故确定加酶量为3％；3)料液流量对酶活保留率的影响较大，故确定料液流量为45L/h；4)虽然操作压力对多肽生产效率影响非常显著，但是操作压力越大膜污染的程度越大，并且会大大缩短膜的有效使用寿命，综合考虑确定操作压力为0.06MPa；5)温度对酶活保留率的影响非常显著，而对多肽生产效率的影响较小，理应确定温度为50℃，但是考虑到在该温度下多肽生产效率较低，最终确定温度为60℃；经过验证，在该条件下酶膜反应器对Alcalase酶活的保留率达92.86％、多肽生产效率为1896.5mg/(m²·h)。

同时，根据2.6分析结果可知，影响产物DPPH清除率的主要因素有加酶量、温度、pH值和操作压力，因此，本研究决定根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，利用Design Expert 6.0.5设计四因素三水平的响应面分析试验，以DPPH清除率为指标进一步优化酶膜反应器制备燕麦抗氧化肽的工艺。响应面分析试验设计中因素-水平设计表见表9，响应面分析试验设计方案及结果见表10。

表9酶膜反应器制备抗氧化肽的响应面分析试验设计中因素-水平设计表

表10酶膜反应器制备抗氧化肽的响应面分析试验设计方案及试验结果

汪：测定产物的DPPH清除率时，多肽浓度为1mg/ml。

以DPPH清除率为响应值，利用Design Expert 6.0.5软件进行响应面分析，得到加酶量(x₁)、温度(x₂)、pH值(x₃)和操作压力(x₄)四因素与DPPH清除率(y)的回归方程及其方差分析结果(见表11)，回归方程为：

y＝47.62-1.13x₁-0.26x₂-1.56x₃+6.94x₄-1.63x₁x₁-0.47x₂x₂-5.34x₃x₃+

0.89x₄x₄-2.49x₁x₂+0.027x₁x₃+0.29x₁x₄-0.057x₂x₃-0.47x₂x₄-2.44x₃x₄

由表11回归方程方差分析结果可知，回归模型的判定系数R²为0.9336，且调整后的判定系数R²达到了0.8621，说明回归模型的因变量与自变量之间的拟合程度较高，且F＝13.06≥F_0.05(14，3)＝8.715，P＜0.0001＜0.05，说明该回归模型显著，同时，失拟项不显著(P＝0.2323＞0.05)，因此可以用该回归模型对试验结果进行分析和预测；根据回归方程各项方差分析结果可知，回归方程中的x₃、x₄、x₃x₃、x₁x₂、x₃x₄对DPPH清除率均有显著影响，说明各因素对DPPH清除率的影响并不是简单的线性关系，其中x₃、x₃x₃、x₁x₂、x₃x₄与响应值呈负相关，而x₄呈正相关，因此，各因素对酶膜反应器制备燕麦抗氧化肽的影响比较复杂；同时，根据F值和P值可知，各因素对DPPH清除率的影响顺序为操作压力＞pH值＞加酶量＞温度，其中操作压力对DPPH清除率的影响极显著，pH值对DPPH清除率影响显著。

通过Design Expert 6.0.5软件对回归方程最大值进行预测，结果显示酶膜反应器制备燕麦抗氧化肽的最佳条件为加酶量3.2％、温度55℃、pH值＝7.3、操作压力0.07MPa，DPPH清除率最高达56.85％。

表11回归方程方差分析表

采用酶膜反应器制备燕麦抗氧化肽的最佳工艺条件进行验证，具体如下：

首先将底物浓度为3％的燕麦麸蛋白溶液加入到酶膜反应器的酶解罐中，调节燕麦蛋白溶液的pH值为7.3，并加热至55℃；其次再按照加酶量为18000U/g_燕麦蛋白将碱性蛋白酶(Alcalase)加入到酶解罐中，使燕麦蛋白与碱性蛋白酶在搅拌状态下反应3min；接着关闭酶膜反应器中超滤循环装置的超滤膜透过液出口，同时打开蠕动泵，使酶解液以45L/h的料液流量常压循环3min；然后开启所述超滤膜透过液出口，使酶解液仍以45L/h的料液流量循环，调节超滤膜的操作压力为0.07MPa，进行酶解-膜分离耦联反应，反应过程中每30min根据收集的超滤液的量及超滤液中多肽含量，向酶解罐中补加燕麦麸蛋白溶液维持反应体系体积和蛋白浓度恒定，测定反应液中的酶活力，根据Alcalase在酶膜反应器系统中酶活的损失量加入相应量的Alcalase。整个过程中保持反应体系的pH值为7.3、温度为55℃，反应4小时后结束反应，将收集的超滤液干燥，即得到所述燕麦抗氧化肽。经测得上述条件所制备的抗氧化肽的DPPH清除率为57.39％，多肽生产效率为1896.5mg/(m²·h)。

Claims (7)

1.一种制备燕麦抗氧化肽的方法，是在酶膜反应器中进行制备的，包括下述步骤：1)将燕麦麸蛋白溶液加入到所述酶膜反应器的酶解罐中，调节所述燕麦麸蛋白溶液的pH值为7.0～7.5，并加热至55℃～60℃；然后再将碱性蛋白酶加入到所述酶解罐中，使燕麦麸蛋白与碱性蛋白酶在搅拌状态下反应2～4min；其中，所述燕麦麸蛋白溶液的质量浓度为2.5％-3％，所加入的碱性蛋白酶与所述燕麦麸蛋白溶液中燕麦麸蛋白的配比为(17000-18000)U/g_{燕麦麸蛋白}；

2)关闭所述酶膜反应器中超滤循环装置的超滤膜透过液出口，同时打开蠕动泵，使酶解液以45～50L/h的料液流量常压循环2～4min；

3)开启所述超滤膜透过液出口，酶解液仍以45～50L/h的料液流量循环，调节超滤膜的操作压力为0.06～0.07MPa，进行酶解-膜分离耦联反应，反应过程中每隔一定时间向所述酶解罐中补加燕麦蛋白溶液和碱性蛋白酶维持反应体系体积恒定以及蛋白浓度、酶量恒定，同时保持反应体系的pH值为7.0～7.5、温度为55℃～60℃，反应结束将收集的超滤膜透过液干燥，即得到所述燕麦抗氧化肽。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)中所述蠕动泵的转速为240-300rpm。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤2)中超滤循环装置的超滤膜在使用前用燕麦麸蛋白溶液进行预吸附处理。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：步骤2)中超滤循环装置的超滤膜为中空纤维膜，其截留分子量为6000～10000Da。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：步骤3)中所述酶解-膜分离耦联反应的反应时间为3-6小时。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于：步骤3)中每隔一定时间的时间间隔为30分钟。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于：步骤1)中所述燕麦麸蛋白溶液的质量浓度为3％，所加入的碱性蛋白酶与所述燕麦麸蛋白溶液中燕麦麸蛋白的配比为18000U/g_燕麦蛋白；步骤3)中所述酶解液以45L/h的料液流量循环，超滤膜的操作压力为0.07MPa，所述酶解-膜分离耦联反应的反应体系的pH值为7.3、温度为55℃。

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