CN102453741A - 一种高活性玉米降血压肽的制备方法及专用装置 - Google Patents

一种高活性玉米降血压肽的制备方法及专用装置 Download PDF

Info

Publication number
CN102453741A
CN102453741A CN2010105117723A CN201010511772A CN102453741A CN 102453741 A CN102453741 A CN 102453741A CN 2010105117723 A CN2010105117723 A CN 2010105117723A CN 201010511772 A CN201010511772 A CN 201010511772A CN 102453741 A CN102453741 A CN 102453741A
Authority
CN
China
Prior art keywords
corn
hypertensive
liquid
volume
corn anti
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN2010105117723A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102453741B (zh
Inventor
何慧
黄文浩
吕杰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Huazhong Agricultural University
Original Assignee
Huazhong Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Huazhong Agricultural University filed Critical Huazhong Agricultural University
Priority to CN 201010511772 priority Critical patent/CN102453741B/zh
Publication of CN102453741A publication Critical patent/CN102453741A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102453741B publication Critical patent/CN102453741B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M21/00—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses
    • C12M21/18—Apparatus specially designed for the use of free, immobilized or carrier-bound enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/02—Membranes; Filters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M27/00—Means for mixing, agitating or circulating fluids in the vessel
    • C12M27/02—Stirrer or mobile mixing elements
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/12—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/12—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of temperature
    • C12M41/18—Heat exchange systems, e.g. heat jackets or outer envelopes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/26—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of pH
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/40—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of pressure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/44—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of volume or liquid level

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Thermal Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明属于天然产物制备技术领域，具体涉及一种高活性玉米降血压肽的制备方法及专用装置。本发明的酶膜反应器包括反应罐；温控系统；自动pH滴定计；强力搅拌器；料液储罐；蠕动泵；控制阀；压力表；超滤膜组件；管道换热器；收集槽；液位控制器和纳滤膜组件等构成。本发明的工艺方法是，玉米黄粉经碱醇液提取得到浓缩玉米蛋白，将浓缩玉米蛋白高温预处理后，加入连续化酶膜反应器系统中，采用酶膜耦联技术制得玉米降血压肽后，再经过一个超滤膜组件对产品进行超滤分级，纳滤膜脱盐，获得高活性的玉米降血压肽。所得玉米降血压肽对血管紧张素转化酶(ACE)抑制活性保持在86％以上，蛋白质回收率达70％以上，并能显著降低自发性高血压大鼠的收缩压。

Description

一种高活性玉米降血压肽的制备方法及专用装置
技术领域
本发明属于天然产物制备技术领域，具体涉及一种利用连续酶法制备和在线多级膜分离集成技术制备具有血管紧张素转化酶(ACE)抑制作用的玉米降血压肽的方法及其专用装置。
背景技术
我国的玉米年产量占世界总产量的20％，仅次于美国，但是我国的玉米加工业主要是利用其中的淀粉，故只利用了玉米成分的50％～60％，其余的大部分以粗饲料或者当作“三废”处理和排放，不仅极大浪费了资源，而且易造成环境污染。而这些副产物中含有30％～60％以上的蛋白质，这些副产物被称为玉米蛋白粉亦称为玉米黄粉，研究如何充分利用玉米黄粉中的蛋白质资源，并提高其附加值，具有重要的现实意义。
高血压疾病是目前世界上死亡率最高的疾病，因此预防和治疗高血压疾病一直是人们关注的热点。1965年Ferreira首次从巴西蝮蛇(Bathrops jararaca)蛇毒里分离出了多肽物质，能抑制ACE的活性；ACE可作用于底物血管紧张素，使血管收缩，血压升高；同时能增强舒缓激肽的舒张血管作用，故被称为“缓激肽增强肽(bradykinin-potentiating peptide)”。此后陆续不断发现源于食物蛋白质的许多肽类亦具有抑制ACE的作用，从而具有降血压作用；Suh等人从玉米黄粉中分离出序列为Pro-Ser-Gln-Tyr-Tyr的一种膜结合蛋白肽，IC50为100μmol/L；Yano等在此基础上又分离出30余种玉米短肽，具有较低的IC50值。Miyoshi等报道了玉米醇溶蛋白酶解得到的Leu-Pro-Pro是迄今发现的玉米蛋白水解得到的最好的ACE抑制肽之一，效果与临床合成药物——卡托普利(Captopril)相当。
目前，大多用化学合成ACE抑制剂如Captopril，依那普利(Enalapril)，赖诺普利(Listinopril)等药物来治疗高血压。这类药物具有作用时间短，停药后血压易反弹等缺点。而且人工合成药物吸收排泄速度快，会引起咳嗽，丧失味觉，肾脏损伤及血管神经性水肿等副作用。各种天然来源ACE抑制活性肽，一般是只包括几个氨基酸残基的短肽，可以快速地通过消化粘膜进入血液循环，起到降血压的作用，并且它们对一些血压正常的动物或人无降血压作用，说明其对正常状态下的肾脏、血管的作用很小，具有安全性高，无毒副作用的特点。所以ACE抑制肽作为一种新的降压药物越来越受到人们的广泛关注。
目前酶法制备活性肽多采用间歇酶解工艺，但其存在多肽产率及反应转化率低、耗酶量大、产品质量不稳定等问题。而酶解-膜分离偶联技术集酶促反应、酶的回收利用和产物的分离纯化等工序于一体，可以提高酶的利用率，实现水解物在线膜分离，同时提高了生产效率和稳定了产品质量。目前有采用酶膜反应器法水解大豆分离蛋白的研究报道；有人将动态膜分离式酶反应器连续操作成功地用于生物酶法降解菊粉生产果糖工艺中；但利用酶解-膜分离偶联技术生产具有高血管紧张素转化酶(ACE)抑制活性的玉米降血压肽，目前尚未见文献报道。本发明旨在充分利用植物蛋白资源，大大提高玉米加工业副产品——玉米黄粉的附加值。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，利用酶解-膜分离偶联方法生产具有高ACE抑制活性的玉米降血压肽的方法及其专用装置。
本发明的技术方案如下：
一种高活性玉米降血压肽的制备方法，其包括一个连续化处理的酶膜反应系统，其步骤包括：
(1)向玉米黄粉中按体积∶体积之比为1∶15的料液比加入碱醇液，于55℃水浴中提取2h，3000r/min离心10min，取上清液备用；按体积∶体积之比为1∶1向所述的上清液中加入水，调节pH至6.3，按体积∶体积之比为5∶1加入2％浓度的NaCl溶液盐析，沉淀8h，于3500r/min离心10min，取沉淀于40℃烘干，研细，过80目筛得到浓缩玉米蛋白，备用；
(2)将步骤(1)浓缩玉米蛋白按质量浓度为1～4％，于100℃预处理30min后加入反应罐中，冷却至45℃，调节其pH至8.0，得到酶解玉米蛋白料液，备用，按酶与底物质量比为1.5％加入碱性蛋白酶，使玉米蛋白在反应罐中进行酶解反应，调节蠕动泵至流速为1～6L/min，进膜压力为0.6～3bar，使反应液连续循环地通过截留分子量为5000Da的一级超滤膜，得到分子量为5000Da以下的低聚肽级分产物，再将分子量为5000Da以上的低聚肽级分产物的截留液返回至反应灌中继续酶解，当循环开始后，通过液位控制器连续流加pH为8.0的酶解玉米蛋白料液，使反应罐中液面高度保持稳定；
(3)将步骤(2)的低聚肽级分产物进一步过截留分子量为3000Da的二级超滤膜分级后，收集膜透过液，得到分子量为3000Da以下的玉米降血压肽溶液，将得到的玉米降血压肽溶液用冷冻干燥法或喷雾干燥法干燥，得到玉米降血压肽；
(4)对步骤(3)得到的分子量在3000Da以下的玉米降血压肽溶液进行纳滤脱盐，其中：纳滤脱盐的工艺条件是：等容循环渗透次数在2～6次，使其体积浓缩倍数为2，操作压力为6～9bar，操作温度为25～30℃，调溶液的pH值至7～9得到脱盐后的玉米降血压肽溶液；
(5)将步骤(4)所得的脱盐后的玉米降血压肽溶液过0.45μm的微孔滤膜，采用反相高效液相色谱法进行表征；
(6)将步骤(5)所得的脱盐后的玉米降血压肽溶液继续用反相高效液相与质谱联用法表征其结构；
其中步骤(1)的碱醇液的配制方法如下：将0.1mol/L NaOH与95％浓度的乙醇按体积∶体积之比为45∶55混合；
步骤(3)的冷冻干燥条件是：真空度0.040mbar，加热温度从一20℃开始至18h以后缓慢升温，至温度为25℃，并保持到干燥终点；
步骤(3)的喷雾干燥条件是：进风温度120℃，进样速度为30mL/min，离心雾化器转速为20000r/min；
步骤(5)的高效液相分离条件为：Zorbax SB-C18 5μm柱，ID 4.6×250mm；流动相A为纯水+0.1％三氟乙酸，流动相B为乙腈+0.1％三氟乙酸；梯度洗脱：从0到45min，流动相A为从10％到35％，流速为1.0mL/min；紫外检测器在230nm处检测；
步骤(6)液质联用条件为如下：
液相色谱条件：Zorbax SB-C18 5μm柱，ID 4.6×250mm；流动相A为纯水+0.1％三氟乙酸，流动相B为乙腈+0.1％三氟乙酸；梯度洗脱：从0到50min，流动相A为从10％到35％，流速为1.0mL/min；紫外检测器在230nm处检测；
质谱测定条件：离子化方式为ESI+；质量扫描范围：m/z 50-1000；干燥气流速：10L/min；喷射压力：40psi；干燥气温度：325℃；毛细管出口电压：136V；
适用于上述方法的专用装置，该装置是连续化处理的酶膜反应系统，其特征在于，它包括一个反应罐(1)，温控系统(2)，自动pH滴定计(3)，强力搅拌器(4)，料液储罐(5)，蠕动泵(6)，控制阀(7)，压力表(8)，超滤膜组件(9)，管道换热器(10)，收集槽(11)，液位控制器(12)和纳滤膜组件(13)构成，其中所述的反应罐(1)与温控系统(2)，自动pH滴定计(3)，强力搅拌器(4)组成一个内部循环的反应系统，反应罐(1)装在高于超滤膜组件(9)水平位置的上方，其一端通过蠕动泵(6)、液位控制器与料液储罐(5)的出口端口连接，其底端的出口端通过蠕动泵(6)，控制阀(7)和压力表(8)与超滤膜组件(9)的入口端相连，超滤膜组件(9)回流端与控制阀(7)和压力表(8)相连，回流端出口与反应灌进口相连，超滤膜组件(9)透过端与收集槽(11)相连，该收集槽通过蠕动泵(6)与纳滤膜组件(13)相连，纳滤膜组件(13)透过液端通过管道与收集槽(11)相连。
本发明具有如下优点：
(1)由于膜分离是物理过程，故能使玉米降血压肽的高血管紧张素转化酶(ACE)抑制活性最大限度地保持。
(2)由于膜的截留作用，使用过的酶可重复被回收利用；
(3)酶解反应和分离技术相耦合，由于膜反应器的构造和传质等特点，可实现催化反应过程与分离过程的集成。
(4)具有可连续操作性，利用膜的半透性，实现反应过程和分离过程的连续进行，催化反应和渗透分离是不间断的。
(5)制得的玉米降血压肽活性高，能使自发性高血压大鼠(SHR)收缩压降低34.45mmHg，降血压效果显著。
(6)利用纳滤膜高效脱盐，能降低盐分对玉米降血压肽的不利影响。
附图说明
图1为本发明专用于玉米降血压肽制备的酶膜反应器及其系统的示意图。图中编号含义如下：1-反应罐；2-温控系统；3-自动pH滴定计；4-强力搅拌器；5-料液储罐；6-蠕动泵；7-控制阀；8-压力表；9-超滤膜组件；10-管道换热器；11-收集槽；12-液位控制器；13-纳滤膜组件。
图2玉米降血压肽的HPLC色谱图。图中：Mw(分子量)＜3kDa
图3玉米降血压肽的质谱总离子流图，图中：(TIC)Mw＜3kDa
图4肽链骨架断裂及其碎片离子命名。
图5质荷比为779.3的离子一级质谱图(左图)和二级质谱图(右图)。
图6质荷比为745.3的离子一级质谱图(左图)和二级质谱图(右图)。
图7质荷比为617.2的离子一级质谱图(左图)和二级质谱图(右图)。
图8玉米降血压肽制备工艺流程图。
具体实施方式
以下实例便于更好地理解本发明，下述实验材料与试剂如无特殊说明，均购自常规商业试剂公司，试剂为分析纯。
实施例1、制备工艺实施例
在酶膜反应器中水解玉米蛋白的实验装置如图1所示。
由图1，本发明的专用装置是一个连续化处理的酶膜反应系统，它包括一个反应罐1，温控系统2，自动pH滴定计3，强力搅拌器4，料液储罐5，蠕动泵6，控制阀7，压力表8，超滤膜组件9，管道换热器10，收集槽11，液位控制器12和纳滤膜组件13构成，其中所述的反应罐1与温控系统2，自动pH滴定计3，强力搅拌器4组成一个循环的反应系统，反应罐1装在安装位置高于所述超滤膜组件9的水平位置，其一端通过蠕动泵6、液位控制器与料液储罐5的出口端口连接，其底端的出口端通过蠕动泵6，控制阀7和压力表8与超滤膜组件9的入口端相连，超滤膜组件9回流端与控制阀7和压力表8相连，回流端出口与反应灌进口相连，超滤膜组件9透过端与收集槽11相连，该收集槽通过蠕动泵6与纳滤膜组件13相连，纳滤膜组件13透过液端通过管道与收集槽11相连。
本实施例的制备步骤如下：
(1)取玉米黄粉中600g，加入碱醇液9L(碱醇液的配置方法：将0.1mol/LNaOH与95％浓度的乙醇按体积∶体积之比为45∶55混合)，于55℃水浴中提取2h，3000r/min离心10min，取上清液(约7L)备用；按体积∶体积之比为1∶1向所述的上清液中加入水，调节pH至6.3，加入2％浓度的NaCl溶液2.8L(按溶液总体积∶NaCl溶液体积之比为5∶1加入)盐析，沉淀8h，于3500r/min离心10min，取沉淀于40℃烘干，研细，过80目筛得到浓缩玉米蛋白，备用；
(2)采用截留分子量(MwCO)为5kDa的超滤膜，反应开始前在反应器中加入7L去离子水，并加热至45℃，通过蠕动泵转速，控制循环液流速在4L/min，使去离子水在整个循环反应系统中全循环30min，排干反应器中的水(该过程为清洗罐体)，关闭泵。称取步骤(1)制备的浓缩玉米蛋白300g，按质量浓度为3％加入10L去离子水，于100℃预处理30min后加入反应罐中，冷却至45℃，调节其pH至8.0，得到酶解玉米蛋白料液，备用；加入碱性蛋白酶3.5g(按酶与底物质量比为1.5％)，使玉米蛋白在反应罐中进行酶解反应，调节蠕动泵至流速为1～6L/min，进膜压力为0.6～3bar，使反应液连续循环地通过截留分子量为5000Da的一级超滤膜，得到分子量为5000Da以下的低聚肽级分产物，再将分子量为5000Da以上的低聚肽级分产物的截留液返回至反应灌中继续酶解，当循环开始后，通过滴加1mol/L的NaOH反应液pH恒定在8.0；通过液位控制器连续流加pH为8.0的酶解玉米蛋白料液，使反应罐中料液体积恒定，水浴控制反应温度恒定为45℃，测试结果见表1所示。
(3)将步骤(2)的低聚肽级分产物进一步过截留分子量为3000Da的二级超滤膜分级，超滤操作条件同步骤(2)，收集膜透过液，得到分子量为3000Da以下的玉米降血压肽溶液，将得到的玉米降血压肽溶液用冷冻干燥法或喷雾干燥法干燥，得到玉米降血压肽，测试结果见表2所示。
(4)对步骤(3)得到的分子量在3000Da以下的玉米降血压肽溶液进行纳滤脱盐，其中：纳滤脱盐的工艺条件是：调溶液的pH值至7～9，等容循环渗透次数在2～6次，使其体积浓缩倍数为2，操作压力为7～9bar，操作温度为25～30℃。得到脱盐后的玉米降血压肽溶液，测试结果见表3、表4所示。
脱盐率(％)＝(1-Ci×Vi/C0×V0)×100
式中C0为初始料液中盐浓度，V0为初始料液体积，Ci为截留液中盐浓度，Vi为截留液体积
体外ACE抑制活性的测定方法
按血清血管紧张素I转换酶(紫外法)试剂盒(购自北京市海淀区中国人民解放军海军总医院)说明书进行实验操作。取ACE粗酶液0.15mL，加酶解玉米降血压肽0.07mL，加0.07mL的底物HHL(Hip-His-Leu)，混匀→37℃水浴中孵育60min，立即加入1mol/L的HCl 0.17mL终止反应，静置5min后加乙酸乙酯1.00mL进行萃取，强烈振荡1min，在3000r/min下离心5min，取酯层0.5mL，在120℃～130℃下蒸干，加1mol/LNaCl 3mL溶解残渣，于228nm处，以1mol/LNaCl溶液作参比比色，测值记作S；用水代替酶解肽，步骤同上，测得A值；用水代替ACE粗酶液和酶解肽液测得C值。计算公式如下：
ACE抑制率(％)＝(A-S)/(A-C)×100
本实施例具体测试结果分析如下：
表1连续制备过程中不同时间透过液对血管紧张素转化酶(ACE)抑制率及肽含量
Figure BSA00000309305900041
表1数据显示：在连续化制备5h过程中，得到的产物不仅质量高(即ACE抑制活性高)，且肽含量及质量均稳定，即产品能保持稳定的肽含量和高并稳定的ACE抑制活性。与间歇式制备方式相比，连续化生产方式即不断投料，并不断滤出合适的玉米降血压肽段，这不仅可以避免合适的玉米降血压肽段进一步水解，也可使蛋白酶的利用率提高，所以可使产品的质量提高。
表2不同分级肽的IC50值
Figure BSA00000309305900051
表2数据显示：不同级份的玉米降血压肽ACE抑制活性有较大的差异，经过Mw＜3kDa二次超滤膜分级后的透过液的IC50值分别为0.29mg/mL，相对于Mw＜5kDa的玉米降血压肽(一级产物)，其活性明显提高。
表3纳滤脱盐正交试验的因素及水平设置
Figure BSA00000309305900052
表4纳滤脱盐正交试验结果及分析
Figure BSA00000309305900053
由表4可知，各因素对脱盐效果的影响程度依次为pH＞循环渗透次数＞压力，比较各因素的K值，其最佳脱盐条件为A3B3C1，但因A因素水平2的K值(88.783)与水平3的K值(91.740)较接近；B因素水平2的K值(90.847)与水平3的K值(91.303)也较接近，考虑到节能降耗和经济因素，均改选水平2。所以确定实施脱盐条件为A2B2C1，即在8bar压力和pH＝7条件下，循环渗透4次，脱盐率接近96％。
实施例2本发明的玉米降血压肽干燥实施例
1实验方法
1.1玉米降血压肽溶液的冷冻干燥
将实施例1所得的玉米降血压肽溶液在温度45℃，压力0.095MPa条件下真空浓缩到原来体积的1/10，装于不锈钢托盘，液面高度2cm，置于冷冻干燥机内预冷，120min后物料温度达到-20℃时完全冻结，开始升温，真空度0.040mbar，加热温度从-20℃开始至18h以后缓慢升温，至温度为25℃，以物料温度达到25℃为干燥终点，进行冷冻干燥。
1.2玉米降血压肽溶液的喷雾干燥
将实施例1所得的玉米肽溶液在温度45℃，压力0.095MPa条件下真空浓缩到原来体积的1/5，进行喷雾干燥。本试验的出风温度控制在65～95℃之间。采用进风温度、进样速度和离心雾化器转速为考察因素，以干燥粉的得率为考察指标，进行正交试验设计，确定玉米肽喷雾干燥的最佳工艺，因素水平表见表5。
2结果分析
表5玉米降血压喷雾干燥因素水平表
Figure BSA00000309305900061
表6玉米降血压肽喷雾干燥实验结果表
Figure BSA00000309305900062
由表6极差分析可知，得出各因素对试验影响的主次关系为A＞C＞B。本试验确定的喷雾干燥的最佳工艺参数为进风温度120℃、进样速度为30mL/min、离心雾化器转速为20000r/min。
表7冻干粉末和喷雾干燥粉末蛋白含量和水分含量
Figure BSA00000309305900063
由表7知，两种干燥方法得到的玉米降血压肽产品蛋白质含量和水分含量差别不大，水分含量均在4％左右，达到很好的干燥效果。
实施例3本发明制备的玉米降血压肽结构表征与分析
1实验方法：
1.1反相-高效液相色谱法(RP-HPLC)分离玉米降血压肽
将经过超滤后的玉米降血压肽用RP-HPLC分析，条件如下：Agilent 1200型高效液相色谱仪，ZorbaxSB-C18 5μm柱，ID 4.6×250mm；流动相A为纯水+0.1％三氟乙酸，流动相B为乙腈+0.1％三氟乙酸；梯度洗脱：从0到45min，流动相A为从10％到35％，流速为1.0mL/min；紫外检测器在230nm处检测。
1.2高效液相色谱-质谱/质谱法(HPLC-MS/MS)分析
液相色谱条件：Zorbax SB-C18 5μm柱，ID 4.6×250mm；流动相A为纯水+0.1％三氟乙酸，流动相B为乙腈+0.1％三氟乙酸；梯度洗脱：从0到50min，流动相A为从10％到35％，流速为1.0mL/min；紫外检测器在230nm处检测。
质谱测定条件：离子化方式为ESI+；质量扫描范围：m/z 50-1000；干燥气流速：10L/min；喷射压力：40psi；干燥气温度：325℃；毛细管出口电压：136V。
2、结果分析
肽链骨架断裂及其碎片离子命名见附图(4)。准分子离子m/z为779.3的质谱峰(见附图5)，一级质谱图中779.3为对应的准分子离子峰[M+H]+，通过其一级及二级质谱图对其结构进行解析。在其二级质谱中m/z 761.3为[M-OH]+离子峰，由761.3-614.2＝147.1(y1-OH)，知处于C-末端的氨基酸为一个Phe(F)；614.2为b5离子，m/z 517.2为b4离子，b5-b4＝97.0，由此可知与C端F相连的为一个Pro(P)；m/z 404.1为b3离子，b4-b3＝113.1，由此可知与P相连的为一个Leu(L)残基或Ile(I)残基；m/z 257.0为b2离子，由此可知b2离子为[Q/KQ/K]+，由于Glu(Q)与Lys(K)分子量接近，从图谱中无法确定N-端两个氨基酸是由哪两个氨基酸组合的；b3-b2＝147.1，由此可知与L/I相连的为一个F残基；由此推断该肽的氨基酸序列为[QK][QK]F[IL]PF，I和L、Q和K尚无法确定。
准分子离子m/z为745.3与617.2，其分析过程与m/z＝779.3解析过程类似，过程省略，其一级质谱图和二级质谱图在附图6和图7中，解析得m/z＝745.3为[QK][QK][IL][IL]PF，m/z＝617.2为Q/KL/IL/IPF或L/IQ/KL/IPF。
将以上三种短肽的结构在三个蛋白质序列数据库(NCBInr.2010.03.30、SwissProt.2010.03.30、UniProtKB.2010.03.30)中对玉米蛋白序列进行检索比对，其中m/z为779.3、745.3和617.2在三个数据库中均能检索到符合条件的玉米降血压肽序列分别有47、17和49条，且m/z＝745.3、m/z＝779.3和m/z＝617.2对应的序列为QQLLPF、QQFLPF和QLLPF，故能排除异亮氨酸(I)和赖氨酸(K)的可能，此解析出的三种玉米降血压肽目前尚未见文献报道。
实施例4本发明制备的玉米降血压肽对小动物(大鼠)的降血压效果验证
实验材料：选用8周龄健康清洁级(SPF)级雄性自发性高血压大鼠(SHR)40只，体重200±10g，其收缩压≥180mmHg，SHR购自北京维通利华实验动物有限公司；另外，选用体重200±10g，健康SPF级雄性Wistar大鼠10只作正常对照组。
实验方法：将上述SHR和Wistar大鼠饲养在清洁级动物房，室温24℃，每日光照时间12h，喂食标准饲料(武汉天龙饲料有限公司)，自由进食和饮水。
采用尾动脉收缩压法测定SHR的收缩压(Systolic blood pressure，SBP)。测定之前，将大鼠在38℃条件下保温，稳定后进行测定，每次重复测定5次，取平均值即为SHR的收缩压。
玉米降血压肽(CP)的短期给药试验：
将上述SHR 40只，在实验室适应1周后，随机分为5组(每组8只)：
A组：SHR模型对照组，灌胃生理盐水
B组：阳性对照组，灌胃Captopril 2mg/kg·bw
C组：CP低剂量组，灌胃玉米降血压肽25mg/kg·bw
D组：CP中剂量组，灌胃玉米降血压肽50mg/kg·bw
E组：CP高剂量组，灌胃玉米降血压肽100mg/kg·bw
按设计好的剂量一次性给药后，观察各个实验组随时间变化的血压值，分别在给药0h、1h、2h、3h、4h、5h、7h时测定其血压值SBP。
玉米降血压肽的长期给药试验：
将上述SHR40只，在实验室适应1周后，随机分为5组：A′组～E′组，每组8只。另取同一鼠系的正常血压的Wistar-Kyoto大鼠8只，作为正常血压对照组灌胃高剂量玉米降血压肽。
A′组：SHR模型对照组，灌胃生理盐水。
B′组：阳性对照组，灌胃Captopril 2mg/kg·bw。
C′组：CP低剂量组，灌胃玉米降血压肽25mg/kg·bw。
D′组：CP中剂量组，灌胃玉米降血压肽50mg/kg·bw。
E′组：CP高剂量组，灌胃玉米降血压肽100mg/kg·bw。
F′组：Wistar-Kyoto组，灌胃玉米降血压肽100mg/kg·bw。
每天给药1次，连续给药1个月。在给药期间，每天测定大鼠体重1次，每6d测定大鼠SBP 1次。
统计分析：对SHR短期和长期给药试验结果，采用SPSS软件进行统计分析，组间差别的判定选用单因素方差分析和t检验，实验结果表示为平均值±标准差(X±SD)。
结果判定：短期及长期服用玉米降血压肽对SHR血压的影响
表8短期给药对自发性高血压大鼠收缩压(SHR)的影响
与模型对照组比较，**表示p＜0.01*表示p＜0.05
A：阳性对照组(2mg/kg·bw)               B：模型对照组(灌胃生理盐水)
C：CP低剂量组(25mg/kg·bw玉米降血压肽)  D：CP中剂量组(50mg/kg·bw玉米降血压肽)
E：CP高剂量组(100mg/kg·bw玉米降血压肽)
表8数据显示，除模型对照组外，其它各组在给药后血压开始下降，给药1h后血压值与模型对照组相比均极显著降低(p＜0.01)，各药物组在给药3h后血压值开始逐步回升，7h后基本恢复到灌胃前的水平。与模型组比较，阳性对照组(Captopril)在前三小时降压效果最为明显，给药1h后，血压降幅最大为38.44mmHg，其它组依次为CP高、中、低剂量组，其下降幅度分别为26.57mmHg、19.57mmHg和17.91mmHg。在CP的三个剂量组中，以CP高剂量组降压效果最为显著，灌胃1h后，连续4h保持血压值在较低水平，血压降低值达到极显著水平(p＜0.01)。虽然CP高剂量组降压效果不及Captopril，但其降压持续时间比Captopril长，且灌胃4h后，CP高剂量组降血压效果比Captopril更加显著；并且给药后三个CP剂量组的降血压效果均保持到给药后4h，血压值降幅均达极显著水平(p＜0.01)，这说明玉米降血压肽对SHR的降血压作用的持续性优于Captopril组。研究结果显示，玉米降血压肽具有良好的短期降血压活性。
表9长期给药对自发性高血压大鼠大鼠收缩压(SHR)的影响
Figure BSA00000309305900091
与模型对照组比较，**表示p＜0.01  *表示p＜0.05
A’：阳性对照组(2mg/kg·bw Captopril)     B’：模型对照组(灌胃生理盐水)
C’：CP低剂量组(25mg/kg·bw玉米降血压肽)  D’：CP中剂量组(50mg/kg·bw玉米降血压肽)
E’：CP高剂量组(100mg/kg·bw玉米降血压肽) F’：正常对照组(100mg/kg·bw玉米降血压肽)
从表9数据显示，对SHR灌胃不同剂量的CP和Captopril后，阳性对照组、CP低、中、高剂量组SHR的血压值随给药时间的增加不断下降，并且与模型对照组比较均呈极显著下降趋势(p＜0.01)。在连续灌胃的30d内，阳性对照组(Captopril)SHR血压下降最大值为39.39mmHg，下降幅度最为显著，CP高、中、低剂量组血压下降值分别为34.45mmHg、30.95mmHg和27.49mmHg，而正常血压的Wistar-Kyoto组服用高剂量的CP后血压始终保持在115mmHg左右。这说明长期服用玉米降血压肽可使SHR血压显著下降，而对正常大鼠的血压无影响。此外，对于CP的三个剂量组，随着剂量的增大，血压下降值增大，这说明CP的降血压活性与其剂量存在着相关性。上述结果提示，长期服用玉米降血压肽对高血压患者具有显著的降血压作用，而对正常血压者无副作用。
通过以上实验确证了本发明提供的连续酶解膜分离技术制备的玉米降血压肽，经超滤分离和纳滤脱盐后，表现出很好地短期和长期降血压效果。此食源性活性肽，无毒副作用，兼具有良好的营养性与生理活性，不仅可以适用于不用使用剂型的药用辅料及使用剂型包括片剂、胶囊剂或口服液；也可以作为功能性成分添加到食品中，增强食品的功能性或制成保健食品。同时，原料为工业生产副产物，成本低，来源广泛，具有良好的应用前景。

Claims (2)

1.一种高活性玉米降血压肽的制备方法，其包括一个连续化处理的酶膜反应系统，其步骤包括：
(1)向玉米黄粉中按体积：体积之比为1∶15的料液比加入碱醇液，于55℃水浴中提取2h，3000r/min离心10min，取上清液备用；按体积∶体积之比为1∶1向所述的上清液中加入水，调节pH至6.3，按体积∶体积之比为5∶1加入2％浓度的NaCl溶液盐析，沉淀8h，于3500r/min离心10min，取沉淀于40℃烘干，研细，过80目筛得到浓缩玉米蛋白，备用；
(2)将步骤(1)浓缩玉米蛋白按质量浓度为1～4％，于100℃预处理30min后加入反应罐中，冷却至45℃，调节其pH至8.0，得到酶解玉米蛋白料液，备用，按酶与底物质量比为1.5％加入碱性蛋白酶，使玉米蛋白在反应罐中进行酶解反应，调节蠕动泵至流速为1～6L/min，进膜压力为0.6～3bar，使反应液连续循环地通过截留分子量为5000Da的一级超滤膜，得到分子量为5000Da以下的低聚肽级分产物，再将分子量为5000Da以上的低聚肽级分产物的截留液返回至反应灌中继续酶解，当循环开始后，通过液位控制器连续流加pH为8.0的酶解玉米蛋白料液，使反应罐中液面高度保持稳定；
(3)将步骤(2)的低聚肽级分产物进一步过截留分子量为3000Da的二级超滤膜分级后，收集膜透过液，得到分子量为3000Da以下的玉米降血压肽溶液，将得到的玉米降血压肽溶液用冷冻干燥法或喷雾干燥法干燥，得到玉米降血压肽；
(4)对步骤(3)得到的分子量在3000Da以下的玉米降血压肽溶液进行纳滤脱盐，其中：纳滤脱盐的工艺条件是：等容循环渗透次数在2～6次，使其体积浓缩倍数为2，操作压力为6～9bar，操作温度为25～30℃，调溶液的pH值至7～9得到脱盐后的玉米降血压肽溶液；
(5)将步骤(4)所得的脱盐后的玉米降血压肽溶液过0.45μm的微孔滤膜，采用反相高效液相色谱法进行表征；
(6)将步骤(5)所得的脱盐后的玉米降血压肽溶液继续用反相高效液相与质谱联用法表征其结构；
其中步骤(1)的碱醇液的配制方法如下：将0.1mol/LNaOH与95％浓度的乙醇按体积∶体积之比为45∶55混合；
步骤(3)的冷冻干燥条件是：真空度0.040mbar，加热温度从-20℃开始至18h以后缓慢升温，至温度为25℃，并保持到干燥终点；
步骤(3)的喷雾干燥条件是：进风温度120℃，进样速度为30mL/min，离心雾化器转速为20000r/min；
步骤(5)的高效液相分离条件为：Zorbax SB-C18 5μm柱，ID 4.6×250mm；流动相A为纯水+0.1％三氟乙酸，流动相B为乙腈+0.1％三氟乙酸；梯度洗脱：从0到45min，流动相A为从10％到35％，流速为1.0mL/min；紫外检测器在230nm处检测；
步骤(6)液质联用条件为如下：
液相色谱条件：Zorbax SB-C18 5μm柱，ID 4.6×250mm；流动相A为纯水+0.1％三氟乙酸，流动相B为乙腈+0.1％三氟乙酸；梯度洗脱：从0到50min，流动相A为从10％到35％，流速为1.0mL/min；紫外检测器在230nm处检测；
质谱测定条件：离子化方式为ESI+；质量扫描范围：m/z 50-1000；干燥气流速：10L/min；喷射压力：40psi；干燥气温度：325℃；毛细管出口电压：136V；
2.权利要求1所述方法的专用装置，该装置是连续化处理的酶膜反应系统，其特征在于，它包括一个反应罐(1)，温控系统(2)，自动pH滴定计(3)，强力搅拌器(4)，料液储罐(5)，蠕动泵(6)，控制阀(7)，压力表(8)，超滤膜组件(9)，管道换热器(10)，收集槽(11)，液位控制器(12)和纳滤膜组件(13)构成，其中所述的反应罐(1)与温控系统(2)，自动pH滴定计(3)，强力搅拌器(4)组成一个内部循环的反应系统，反应罐(1)装在高于超滤膜组件(9)水平位置的上方，其一端通过蠕动泵(6)、液位控制器与料液储罐(5)的出口端口连接，其底端的出口端通过蠕动泵(6)，控制阀(7)和压力表(8)与超滤膜组件(9)的入口端相连，超滤膜组件(9)回流端与控制阀(7)和压力表(8)相连，回流端出口与反应灌进口相连，超滤膜组件(9)透过端与收集槽(11)相连，该收集槽通过蠕动泵(6)与纳滤膜组件(13)相连，纳滤膜组件(13)透过液端通过管道与收集槽(11)相连。
CN 201010511772 2010-10-18 2010-10-18 一种高活性玉米降血压肽的制备方法 Expired - Fee Related CN102453741B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 201010511772 CN102453741B (zh) 2010-10-18 2010-10-18 一种高活性玉米降血压肽的制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 201010511772 CN102453741B (zh) 2010-10-18 2010-10-18 一种高活性玉米降血压肽的制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102453741A true CN102453741A (zh) 2012-05-16
CN102453741B CN102453741B (zh) 2013-09-04

Family

ID=46037438

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN 201010511772 Expired - Fee Related CN102453741B (zh) 2010-10-18 2010-10-18 一种高活性玉米降血压肽的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN102453741B (zh)

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103014108A (zh) * 2012-12-08 2013-04-03 保龄宝生物股份有限公司 一种玉米低聚肽的制备方法
CN103667408A (zh) * 2013-11-21 2014-03-26 中国农业科学院农产品加工研究所 一种利用小麦蛋白制备肠营养肽的方法
CN105349607A (zh) * 2015-12-27 2016-02-24 宁波拜尔玛生物科技有限公司 一种高效提取甘露聚糖肽的方法
CN106591116A (zh) * 2016-11-22 2017-04-26 大连大学 一种消除酶解产物抑制酶活性的反应装置
CN106834117A (zh) * 2015-10-27 2017-06-13 苏州迪欧益生物科技有限公司 用于解除动物细胞贴附的酶反应器及智能酶反应工作站
CN108893513A (zh) * 2018-07-11 2018-11-27 中山市智联企业孵化器发展有限公司 一种玉米肽液提取装置及其制备方法
CN110760555A (zh) * 2019-11-27 2020-02-07 山东省鲁洲食品集团有限公司 以玉米淀粉工艺水制备玉米蛋白肽的方法
CN113302208A (zh) * 2018-12-21 2021-08-24 诺维信公司 玉米纤维处理系统及应用其的玉米湿磨淀粉加工系统

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
于国才、何慧 等: "超滤法制备高活性醒酒玉米肽以及pH值对超滤的影响", 《中国粮油学报》 *
王进、何慧 等: "玉米大豆复合ACE抑制肽的分离纯化及结构初探", 《中国粮油学报》 *
黄文凯: "膜分离方法制备免疫活性大豆肽的研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库（工程科技I辑）》 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103014108A (zh) * 2012-12-08 2013-04-03 保龄宝生物股份有限公司 一种玉米低聚肽的制备方法
CN103667408A (zh) * 2013-11-21 2014-03-26 中国农业科学院农产品加工研究所 一种利用小麦蛋白制备肠营养肽的方法
CN103667408B (zh) * 2013-11-21 2015-09-23 中国农业科学院农产品加工研究所 一种利用小麦蛋白制备肠营养肽的方法
CN106834117A (zh) * 2015-10-27 2017-06-13 苏州迪欧益生物科技有限公司 用于解除动物细胞贴附的酶反应器及智能酶反应工作站
CN105349607A (zh) * 2015-12-27 2016-02-24 宁波拜尔玛生物科技有限公司 一种高效提取甘露聚糖肽的方法
CN106591116A (zh) * 2016-11-22 2017-04-26 大连大学 一种消除酶解产物抑制酶活性的反应装置
CN108893513A (zh) * 2018-07-11 2018-11-27 中山市智联企业孵化器发展有限公司 一种玉米肽液提取装置及其制备方法
CN113302208A (zh) * 2018-12-21 2021-08-24 诺维信公司 玉米纤维处理系统及应用其的玉米湿磨淀粉加工系统
CN110760555A (zh) * 2019-11-27 2020-02-07 山东省鲁洲食品集团有限公司 以玉米淀粉工艺水制备玉米蛋白肽的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN102453741B (zh) 2013-09-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102453741B (zh) 一种高活性玉米降血压肽的制备方法
CN103052717B (zh) 一种工业化生产玉米降压活性肽的方法
CN103173511A (zh) 一种工业化生产小麦谷氨酰胺肽的方法
CN102925522A (zh) 一种采用酶解法制取鹿茸多肽干粉的方法
CN102512353B (zh) 一种竹荪水提取物及其制备方法与应用
CN106008669B (zh) 一种榛仁ace抑制肽及其制备方法
CN103740797B (zh) 一种利用高温花生粕制备高水解度功能性短肽的方法
CN103130869A (zh) 超声波辅助黄粉虫幼虫蛋白酶解制备的降血压肽及制备方法
CN107653289A (zh) 一种工业化生产红花籽活性肽及制备方法
CN100369928C (zh) 玉米蛋白粉降血压多肽与分离方法及其应用
CN104774255A (zh) 海蜇来源的生物活性肽及其制备方法
CN104877007A (zh) 牦牛乳乳清蛋白源ace抑制肽及其制备方法
CN107674902B (zh) 一种具有降血糖功能的驼血多肽及其制备方法
CN102399833A (zh) 赖氨酸的生产工艺
CN116143869A (zh) 一种青稞源活性寡肽及其制备方法和应用
CN106520878A (zh) 利用白酒丢糟制备活性肽的方法
CN102533917A (zh) 一种从胶原蛋白制备rgd活性多肽的方法
CN100352835C (zh) 玉米蛋白粉多肽与分离方法及其应用
CN107760747A (zh) 一种工业化生产地龙蛋白活性肽及制备方法
CN105803024B (zh) 一种以椰麸球蛋白为原料制备ace抑制肽的方法
CN111662360B (zh) 一种龟小肽及其制备方法和应用
CN110655553B (zh) 一种芝麻来源的ace抑制肽、制备方法及其在制备降血压药物方面的应用
CN103041366B (zh) 一种骨肽组合物及其制备方法
CN102276695B (zh) 具有降血压功能的多肽及其用途
CN109400687A (zh) 一种西兰花蛋白来源的ace抑制肽及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20130904

Termination date: 20171018

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee