CN102154425B

CN102154425B - 非变性ⅱ型胶原蛋白生产方法

Info

Publication number: CN102154425B
Application number: CN 201110065733
Authority: CN
Inventors: 李洁; 朱大开; 龚辉
Original assignee: BEIJING HUADA JIERUI BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: BEIJING HUADA JIERUI BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2011-03-18
Filing date: 2011-03-18
Publication date: 2013-05-01
Anticipated expiration: 2031-03-18
Also published as: CN102154425A

Abstract

本发明公开了一种非变性Ⅱ型胶原蛋白生产方法，步骤包括：在去除杂质时，利用1:16w/w的胃蛋白酶，分别于PH6.5和PH2.5的环境下，于26～28℃搅拌水解24小时，得到去除杂质后的软骨材料，将得到的软骨材料粉碎成粉沫；提取胶原，得到非变性Ⅱ型胶原蛋白。本发明使非变性胶原的提取由实验室规模扩展到生产规模，基本满足了生产要求；本发明技术方案简便易行、标准化强、人为因素少、节省成本、产量高；本发明中，胶原蛋白的提取过程较简便，更有利于在规模生产。

Description

非变性Ⅱ型胶原蛋白生产方法

技术领域

本发明涉及胶原蛋白技术，具体说，涉及一种非变性Ⅱ型胶原蛋白生产方法。

背景技术

胶原蛋白是细胞外间质，最早人们关注的是细胞对生命活动的影响，通过研究发现细胞外间质对生命的意义亦非常重要，近十年来发现细胞外间质，特别是胶原蛋白、蛋白多糖等对人类健康和某些疾病的发生等起到关键的作用。医疗、保健品市场也越来越多的开发关于胶原蛋白相关的产品。

胶原是一个大家族，它仅存在于动物体内，植物中是没有胶原蛋白的。这是一个重要的原则。在动物体内胶原分布于骨骼、软骨、皮肤、筋膜等，胶原蛋白不同于其它蛋白质的双螺旋结构，而是三螺旋结构，即由三条氨基酸长链旋转组成。因其氨基酸长链的氨基酸序列不同，通过不同组合，又形成了不同类型的胶原，有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ等型胶原，它们分别分布于不同的组织中。而Ⅱ型胶原多分布于软骨中，所以我们提取Ⅱ型胶原应该选动物的透明软骨为最好的材料。在胶原这个大家族中，如果我们分分类，可以更清楚的看明白它们各自的位置，目前比较典型和容易理解的分类方式是按分子量分类。

胶原蛋白的“母亲”是成纤维细胞，是由成纤维细胞分泌产生胶原蛋白的。那么什么情况下成纤维细胞分泌产生胶原蛋白呢？这是动物机体内一个复杂的调节控制系统，它的机理尚未完全清楚，也就是说它的“父亲”是谁还不太确定。按分子量分，胶原有四个兄弟：“老大”是大分子胶原，即近乎完整的胶原分子，或只去掉两个肽端（N、C端）和三螺旋结构完整的胶原分子。分子量在20～30万道尔顿（D）左右；它具有生物活性和细胞吸附活性，通常把它称为“胶原”。“老二”是利用酸、碱、酶或升温法，将胶原的三螺旋结构打开，松解成三条彼此没有联系的肽链，这就是我们通常所说的“明胶”，医学界称为“变性胶原”；在动物体内这个过程往往是因为胶原分子老化和胶原方面的疾病所致，它的分子量就是单股肽链的分子量，一般在10万D左右，生产中，单股肽链通常被截成几段，那么“明胶”的分子量大约在1万～10万道尔顿D。“老三”是将明胶化的胶原进一步用酸、碱、酶、热等在溶液里处理，将肽链进一步切小，得到分子量在1千～1万道尔顿D之间的胶原，通常称之为“水解胶原蛋白”，因为分子量变小，所以“水解胶原蛋白”可溶于冷水，而明胶只能溶于热水，胶原则不溶于水。“老四”是在水解胶原蛋白的基础上再进一步“水解”，即用酸、碱、酶、热等打断氨基酸链的生物键，得到分子量小于1千的氨基酸片段，通常称其为“肽”，有“寡肽”、“多肽”等，就是由二、三个氨基酸和十几个氨基酸组成的一类胶原蛋白。综上，胶原的弟兄四个分别是：胶原、明胶、水解胶原蛋白、胶原肽。

目前市场应用的胶原蛋白技术都是将胶原通过酸、碱、酶法水解得到胶原蛋白，其实是一种变性胶原蛋白（明胶）的进一步分解的产品。其特点是分子量较小，分布普广泛，一般在几百到几千甚至一万道尔顿（D），但不具备细胞活性。而具备胶原完整结构的大分子胶原，其技术又多限于实验室规模，因为实验室规模可以满足繁琐的和较苛刻的工艺条件，但不利于大规模生产。

发明内容

本发明所解决的技术问题是提供一种非变性Ⅱ型胶原蛋白生产方法，胶原蛋白的提取过程较简便，有利于在规模生产。

本发明技术方案如下：

一种非变性Ⅱ型胶原蛋白生产方法，包括：

在去除杂质时，利用1:16w/w的胃蛋白酶，分别于PH6.5和PH2.5的环境下，于26～28℃搅拌水解24小时，得到去除杂质后的软骨材料；

将得到的软骨材料粉碎成粉沫，在将所述将软骨材料粉碎成细微粉沫时，采用深冷研磨机对所述软骨材料进行粉碎；

提取胶原，得到非变性Ⅱ型胶原蛋白，提取胶原时，将软骨粉沫置于反应罐中，于16～18度环境下，加0.5mol/L的乙酸，加入1%W/W浓度的胃蛋白酶，搅拌24小时，10000转/分离心，得上清液；取上清液，逐渐滴加入9mol/L的NaOH溶液，调节PH到6.5～7.2；盐析，加入NaCl至4.0mol/L，搅拌溶解后用12000转/分离心，沉淀后得到所述非变性Ⅱ型胶原蛋白。

进一步：还包括对得到的非变性Ⅱ型胶原蛋白进行纯化的步骤。

进一步：在所述纯化过程中，利用胶原蛋白不溶于水的性质，用去离子水洗涤胶原，搅拌均匀后，用12000转/分离心，重复洗涤、搅拌和离心，得到的沉淀即为所述非变性Ⅱ型胶原蛋白。

进一步：所述粉沫的细度为150～200目。

1、目前使用软骨材料作原料多数是人工加工，既耗时费力又不标准；本发明的优点是节约人力成本、原料处理的一致性好。

2、本发明对原料进行低温超微粉碎，一次性粉碎软骨材料，使粉碎后的软骨材料低于变性温度。

3、本发明使非变性胶原的提取由实验室规模扩展到生产规模，基本满足了生产要求。

4、本发明技术方案简便易行、标准化强、人为因素少、节省成本、产量高。

5、本发明中，胶原蛋白的提取过程较简便，更有利于在规模生产。

6、本发明中，纯化过程更有独创性，且简便易行，得率高。

附图说明

图1是本发明的生产流程图。

具体实施方式

如图1所示，是本发明的生产流程图，下面参考附图和优选实施例，对本发明的技术方案做详细描述。

1、获取符合需要的软骨材料。

原料取自动物的软骨，如猪关节软骨、鸡关节软骨、鸡胸软骨。取得原料后，原料通常不能直接使用，上边往往有残存的残余肉、软骨膜、钙化块等杂质，人工去除费时费力增加很大成本。本发明以ProteaseN：胃蛋白酶=1:16（w/w）的比例，分别于PH6.5和PH2.5的环境下，于26℃～28℃搅拌水解24小时，结果得到杂质基本去除，形态完整，符合提取要求的软骨材料。

2、将软骨材料粉碎成细微粉沫。

将软骨材料放入深冷研磨机，可以一次性粉碎成细微粉沫，其细度可到150～200目。因为软骨材料提取非变性Ⅱ型胶原蛋白，目前市售设备均存在研磨升热问题，而提取目标的变性温度为39℃～41℃，所以普通设备无法解决这一问题。

3、提取胶原。

将软骨粉沫置于反应罐中，于16℃～18℃环境下，加0.5mol/L的乙酸，加入1%（W/W）浓度的胃蛋白酶，搅拌24小时后，10000转/分离心，得上清液；取上清液，逐渐滴加入9mol/L的NaOH溶液，调节PH到6.5～7.2；盐析，加入NaCl至4.0mol/L，搅拌溶解后，用12000转/分离心，沉淀，得到的沉淀物即为非变性Ⅱ型胶原蛋白的粗制品。

4、对得到的胶原进行纯化。

利用胶原蛋白不溶于水的性质，用去离子水洗涤胶原，搅拌均匀后，用12000转/分离心，重复洗涤、搅拌和离心两次，得到的沉淀即为纯度超过95%的非变性Ⅱ型胶原蛋白。

Claims

1.一种非变性Ⅱ型胶原蛋白生产方法，包括：

提取胶原，得到非变性Ⅱ型胶原蛋白，提取胶原时，将软骨粉沫置于反应罐中，于16～18℃环境下，加0.5mol/L的乙酸，加入1%W/W浓度的胃蛋白酶，搅拌24小时，10000转/分离心，得上清液；取上清液，逐渐滴加入9mol/L的NaOH溶液，调节PH到6.5～7.2；盐析，加入NaCl至4.0mol/L，搅拌溶解后用12000转/分离心，沉淀后得到所述非变性Ⅱ型胶原蛋白。

2.如权利要求1所述的非变性Ⅱ型胶原蛋白生产方法，其特征在于：还包括对得到的非变性Ⅱ型胶原蛋白进行纯化的步骤。

3.如权利要求2所述的非变性Ⅱ型胶原蛋白生产方法，其特征在于：在所述纯化过程中，利用胶原蛋白不溶于水的性质，用去离子水洗涤胶原，搅拌均匀后，用12000转/分离心，重复洗涤、搅拌和离心，得到的沉淀即为所述非变性Ⅱ型胶原蛋白。

4.如权利要求1所述的非变性Ⅱ型胶原蛋白生产方法，其特征在于：所述粉沫的细度为150～200目。