CN102363799B

CN102363799B - 一种富含芳香族氨基酸抗氧化剂的制备方法

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Publication number: CN102363799B
Application number: CN201110310304.4A
Authority: CN
Inventors: 赵谋明; 苏国万; 崔春; 郑淋
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2011-09-30
Filing date: 2011-09-30
Publication date: 2014-05-07
Anticipated expiration: 2031-09-30
Also published as: CN102363799A

Abstract

本发明公开了一种富含芳香族氨基酸抗氧化剂的制备方法，该方法包括以下步骤：（1）将植物蛋白进行预处理；（2）分步加入Alcalase蛋白酶和木瓜蛋白酶；（3）经过1000Da的超滤膜获得分子量小于1000Da的肽和氨基酸的混合物；（4）选用葡聚糖凝胶填料纯化分离得到富含芳香族氨基酸的寡肽与氨基酸混合物；（5）浓缩、喷雾干燥，得抗氧化产品。本发明所制备得到的抗氧化产品，比市面上常用的抗氧化剂，如BHT、植酸、生姜抽提物和异VC钠具有更高的抗氧化活性。在沙琪玛的生产过程中只要添加1%本发明获得的抗氧化剂，就能较好抑制沙琪玛产品储藏过程中脂肪的氧化和酸价超标，延长沙琪玛的货架期。

Description

一种富含芳香族氨基酸抗氧化剂的制备方法

技术领域

本发明涉及植物蛋白的高值化利用，具体涉及一种富含芳香族氨基酸抗氧化剂的制备方法。

背景技术

抗氧化剂可以延缓食品由于自身的氧化而造成的变色和变质，从而达到保质的目的。因此，越来越多油脂或含油的食品通过添加抗氧化剂来延长其保质期和提高其稳定性。合成的抗氧化剂，如丁基羟基茴香醚BHA、二丁基羟基甲基BHT相对于天然的抗氧化剂具有高效和便宜的优点而被食品企业广泛使用。但近年来由于这些合成抗氧化剂被怀疑可能会对人体肝、脾、肺有害，具有蓄积性致癌作用，而禁止在食品添加剂中使用。所有人们把目光转向来自于动植物的天然的、安全的抗氧化剂。已有报道发现通过酶解动植物蛋白得到的生物活性肽具较好的抗氧化活性。例如，中国专利200810023519.6中公开一种大米蛋白抗氧化活性肽的制备方法，以大米为原料，通过一系列的物理处理手段和生物酶解技术制备出分子量范围在392-1367Da之间，具有抗氧化活性的大米蛋白肽。但是该处理方法复杂，不利于它的广泛使用。中国专利200810103445.7和200810110762.1也报道了利用生物酶解技术，酶解血红蛋白大麻子粕可以得到具有较好的抗氧化活性的肽，但酶解产物中抗氧化肽含量有限，且肽段范围较宽，其作用的肽段含量不高。

有研究报道指出含芳香族氨基酸及以含有芳香族氨基酸残基的寡肽抗氧化活性较高，其抗氧化机理如下，色氨酸和酪氨酸具有抗氧化活性，是因为酚羟基和吲哚基团可以作为供氢体，形成酚和吲哚自由基，这两种自由基的稳定性高，与过氧化物自由基相比半衰期长，因此抑制了自由基链式反应的增殖和传递，起到抗氧化作用；而苯丙氨酸由于容易成为供氢体，清除自由基，从而起到抗氧化的作用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的上述不足，提供一种富含芳香族氨基酸抗氧化剂的制备方法。

本发明所述的抗氧化剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)原料预处理：以植物蛋白为原料，加水使蛋白含量达到10％-15％(w/w)，在100℃-121℃的温度下加热15min-30min，并过胶体磨得到植物蛋白浆液；

(2)控制酶解：在植物蛋白浆液中分步加入Alcalase和木瓜蛋白酶，酶解至水解度为15％-20％，灭酶，离心，得酶解液，；

(3)超滤分离：将酶解液通过1000Da的超滤膜，获得小于1000Da的肽和氨基酸的混合物；

(4)凝胶层析：选用葡聚糖凝胶填料Sephadex G-15装柱对上述肽和氨基酸混合物进行分离纯化，获得富含芳香族氨基酸寡肽和氨基酸的混合物；

(5)真空浓缩寡肽和氨基酸混合物，喷雾干燥，得含芳香族氨基酸抗氧化剂。

上述制备方法中，步骤(1)中选用植物蛋白为花生蛋白或大豆蛋白。

所述步骤(2)中分步添加蛋白酶的步骤为：先添加Alcalase在45℃～60℃的条件下进行酶解，当水解度达到6-8％时，添加木瓜蛋白酶继续酶解，直到水解度达到15-20％，85～95℃加热15～30min灭酶终止酶解反应；Alcalase和木瓜蛋白酶的添加量为植物蛋白质量的2‰-8‰。

所述步骤(4)中，浓缩超滤得到的分子量小于1000Da的肽和氨基酸混合物，使其总氮质量含量达到0.5％-1.0％，再上Sephadex G-15层析柱，以去离子水为洗脱液，洗脱速度为1-2ml/min，选择280nm吸收峰进行收集。

本发明的抗氧化剂比市面上常用的抗氧化剂，如BHT、植酸、生姜抽提物和异VC钠具有更高的抗氧化活性。在沙琪玛的生产过程中只要添加1％本发明获得的抗氧化剂，就能较好抑制沙琪玛产品储藏过程中脂肪的氧化和酸价超标，延长沙琪玛的货架期。

本发明与现有技术相比具有如下优点：

1、本发明选用主要作用于含有酪氨酸、苯丙氨酸及色氨酸的肽键的Alcalase和木瓜蛋白对植物蛋白进行酶解，可获得富含芳香族氨基酸的酶解液。通过超滤膜分离获得分子量小于1000Da的酶解液，然后选用对芳香族氨基酸具有吸附作用的葡聚糖凝胶填料对酶解液进行分离纯化，得到富含芳香族氨基酸的寡肽和氨基酸的混合物，该混合物是一种强抗氧化剂。

2、本发明公开的抗氧化剂比市面上常用的抗氧化剂(BHT、植酸、生姜抽提物和异VC钠)的抗氧化性强2倍左右。

3、本发明公开的抗氧化剂的制备工艺简单，产品安全，可规模化生产。

附图说明

图1抗氧化剂1的肽分子量分布图。

图2添加1％抗氧化剂2对沙琪玛在储藏过程中酸价的影响示意图。

图3添加1％抗氧化剂2对沙琪玛在储藏过程中过氧化值的影响示意图。

具体实施方式

氧自由基吸收能力(ORAC)的测定方法

基于ORAC反应在75mmol·L^-1磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)环境中进行，FL(荧光素钠盐)、AAPH(自由基产生剂)、标准抗氧化物质Trolox(维生素E水溶性类似物)以及待测样品均用该缓冲液溶解和稀释。具体测定操作为：在96孔板各微孔中分别加入待测样品20μL后添加缓冲溶液20μL及FL(70nmol·L^-1)20μL，在37℃下预置15min后，用多道移液器迅速在各孔中加入AAPH(12.8mmol·L^-1)140μL启动反应，并将微孔板置于荧光分析仪中在37℃下以激发波长485nm，发射波长528nm进行连续测定，每2min测定一次各孔荧光强度，测定108min，荧光强度分别记为f0，f1，f2…f54。将记录的各微孔不同时间点的绝对荧光强度数据fi与初始荧光强度f0相比，折算成相对荧光强度，并根据公式如下公式统计荧光熄灭曲线下面积(AUCsample)值，

AUC = 1 + Σ_{i = 1}^{54} f_{i} / f_{0}

然后根据公式：net AUC＝AUC_sample-AUC_blank分别计算不同浓度Trolox和抗氧化剂net AUC值，其中AUC blank为没有抗氧化剂存在时自由基作用对照的AUC值。

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，但本发明的实施不限于此。

实施例1

(1)控制酶解；以花生粕为原料，加水使蛋白质含量达到11％，100℃灭菌30min，冷却至55℃，加入花生蛋白质量4‰的Alcalase酶解至水解度6％，加入花生蛋白质量5‰木瓜蛋白酶使水解度达到16％，95℃灭酶25min，得酶解液；

(2)超滤分离：将酶解液通过1000Da的超滤膜，获得小于1000Da的肽和氨基酸的混合物；

(3)凝胶层析：浓缩超滤得到的分子量小于1000Da的肽和氨基酸混合物，使其总氮含量达到0.6％，上Sephadex G-15层析柱，以去离子水为洗脱液，洗脱速度为1ml/min，选择280nm吸收峰进行收集；获得富含芳香族氨基酸的寡肽和氨基酸的混合物；

(4)真空浓缩寡肽和氨基酸混合物，喷雾干燥，得抗氧化剂1。

抗氧化剂1的ORAC值为837.62μmolTrolox/g。

表1表明抗氧化剂1的水解氨基酸中有90.54％为芳香族氨基酸，游离氨基酸中有98.81％为苯丙氨酸。

图2表明肽的分子量主要集中在668Da。

实施例2

(1)控制酶解；以大豆粕为原料，加水使蛋白质含量达到13％，100℃灭菌30min，冷却至55℃，加入大豆蛋白质量的6‰Alcalase酶解至水解度8％，加入大豆蛋白质量的6‰木瓜蛋白酶使水解度达到18％，95℃灭酶25min，得酶解液；

(3)凝胶层析：浓缩超滤得到的分子量小于1000Da的肽和氨基酸混合物，使其总氮含量达到0.8％，上Sephadex G-15层析柱，以去离子水为洗脱液，洗脱速度为1ml/min，选择280nm吸收峰进行收集；获得富含芳香族氨基酸的寡肽和氨基酸的混合物；

(4)真空浓缩寡肽和氨基酸混合物，喷雾干燥，得抗氧化剂2。

抗氧化剂2的ORAC值为901.39μmolTrolox/g。

由图2可见，添加1％的抗氧化剂2能显著抑制沙琪玛在储藏过程中酸价的升高。室温储藏5个月后沙琪玛的酸价为0.711g/kg，而对照(未添加抗氧化剂)的酸价高达0.992g/kg。

由图3可见，添加1％的抗氧化剂2能显著抑制沙琪玛在储藏过程中过氧化值的升高。室温储藏5个月后沙琪玛的过氧化值为0.207g/kg，而对照(未添加抗氧化剂)的过氧化值高达0.437g/kg。

实施例3

(1)控制酶解；以大豆蛋白为原料，加水使蛋白质含量达到15％，100℃灭菌30min，冷却至55℃，加入Alcalase酶解至水解度10％，加入木瓜蛋白酶使水解度达到20％，95℃灭酶25min，得酶解液；

(3)凝胶层析：浓缩超滤得到的分子量小于1000Da的肽和氨基酸混合物，使其总氮含量达到1.0％，上Sephadex G-15层析柱，以去离子水为洗脱液，洗脱速度为1ml/min，选择280nm吸收峰进行收集；获得富含芳香族氨基酸的寡肽和氨基酸的混合物；

(4)真空浓缩寡肽和氨基酸混合物，喷雾干燥，得抗氧化剂3。

抗氧化剂3的ORAC值为874.28μmolTrolox/g。

表1产品与商业抗氧化剂ORAC值比较

表2抗氧化剂1的水解氨基酸和游离氨基酸组成

Claims

1.一种富含芳香族氨基酸抗氧化剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）原料预处理：以植物蛋白为原料，加水使蛋白含量达到10%-15%（w/w），在100℃-121℃的温度下加热15min-30min，并过胶体磨得到植物蛋白浆液；所述植物蛋白为花生蛋白或大豆蛋白；

（2）控制酶解：在植物蛋白浆液中分步顺次加入Alcalase和木瓜蛋白酶，酶解至水解度为15%-20%，灭酶，离心，得酶解液,；所述分步顺次加入Alcalase和木瓜蛋白酶具体为：先添加Alcalase在45℃～60℃的条件下进行酶解，当水解度达到6-8%时，添加木瓜蛋白酶继续酶解，直到水解度达到15-20%；所述灭酶为85～95℃加热15～30min灭酶终止酶解反应；所述Alcalase和木瓜蛋白酶的添加量为植物蛋白质量的2‰-8‰；

（3）超滤分离：将酶解液通过1000Da的超滤膜，获得小于1000Da的肽和氨基酸的混合物；

(4) 凝胶层析：选用葡聚糖凝胶填料Sephadex G-15装柱对上述肽和氨基酸混合物进行分离纯化，获得富含芳香族氨基酸寡肽和氨基酸的混合物；本步骤中，浓缩超滤得到的分子量小于1000Da的肽和氨基酸混合物，使其总氮质量含量达到0.5%-1.0%，再上采用葡聚糖凝胶填料的Sephadex G-15层析柱，以去离子水为洗脱液，洗脱速度为1-2ml/min,选择280nm吸收峰进行收集；

（5）真空浓缩寡肽和氨基酸混合物，喷雾干燥，得含芳香族氨基酸抗氧化剂。