CN102251001B - 一种植物蛋白抗氧化剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种植物蛋白抗氧化剂的制备方法，该方法包括以下步骤：（1）将植物蛋白进行预处理；（2）加入蛋白酶和氨基酸混合物进行反向调控酶解；（3）经过离子交换树脂分离纯化后获得强抗氧化性的分子量在1000-3000Da的酸性肽；（4）添加卵磷脂经过均质后进行热反应；（4）浓缩、喷雾干燥，得抗氧化产品。本发明所制备得到的抗氧化产品具有较高的抗氧化活性，可完全替代市面上常用的抗氧化剂，如BHT、植酸、生姜抽提物和异VC钠。
Description
技术领域
本发明涉及植物蛋白的高值化利用，具体涉及一种植物蛋白酸性抗氧化肽的制备方法。
背景技术
自从Harman提出自由基理论以来，许多研究证据表明人体氧化产生的自由基参与许多病例过程如心血管疾病、老年白内障、癌症、某些炎症及多种神经元病。目前使用的抗氧化剂大多是化学合成物如丁基羟基茴香醚BHA、二丁基羟基甲基BHT，虽然抗氧化效果很好，但对人体肝、脾、肺有害，具有蓄积性致癌作用。在最近的十年里，人们把目光转向来自于动植物的天然的、安全的抗氧化剂。已有专利报道采用各种酶或微生物水解动植物原料蛋白的水解产物中存在多种抗氧化肽，它们的抗氧化活性与原料蛋白相比更强，而且具有高安全性的特点。这些研究使人们对多肽的生物活性有了新的认识，也为抗氧化剂的开发提供了一种新的途径，但使用上述方法得到的抗氧化产物纯度较低，不利于它的广泛使用。
有研究报道指出含酸性氨基酸的肽，其抗氧化活性较高，其活性与酸性氨基酸侧链羧基螯合金属离子有关。有科研工作者从猪肌原纤维蛋白酶解物中分离到含有大量酸性氨基酸的抗氧化肽，首次发现酸性肽具有抗氧化活性，它们不含酪氨酸和组氨酸，酸性氨基酸侧链羧基与金属离子互作钝化金属离子的氧化作用，减弱自由基链反应，达到抗氧化效果。
近年来，科研工作者通过抑制醛和羧酸的氧化的实验来评价各种杂环类化合物的抗氧化性。结果发现多种杂环类化合物具有较强的抗氧化活性。从烘烤咖啡豆中分离得到的杂环化合物，可以预防由于氧化破坏导致的疾病，如癌症、动脉硬化、免疫力下降和衰老。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的上述不足，提供一种植物蛋白抗氧化剂的制备方法，具体技术方案如下。
一种植物蛋白抗氧化剂的制备方法，包括如下步骤：
（1）原料预处理：以植物蛋白为原料，加水使蛋白质量含量达到10%-15%，在100℃-121℃的温度下加热15min-30min，并过胶体磨得到植物蛋白浆液；
（2）控制酶解：在植物蛋白浆液中加入Alcalase或Papain中的一种或两种，以及氨基酸混合物，酶解至水解度为8%-12%，灭酶，离心，得酶解液,；
（3）离子交换树脂：将酶解液通过阳离子交换树脂，以pH值 5-7的水为洗脱剂，收集洗脱液；将阳离子交换树脂洗脱液通过阴离子交换树脂，以pH值2.5-4的水为洗脱剂，收集洗脱液,得酸性抗氧化肽水溶液；
(4)将酸性抗氧化肽水溶液浓缩至固形物质量含量为25%-30%,添加占浓缩后酸性肽水溶液质量5%-8%的卵磷脂，过均质机混合均匀,100-121℃反应60-90min，得热反应产物；
（5）真空浓缩洗脱液，喷雾干燥，得强抗氧化剂。
上述的植物蛋白酸性抗氧化肽的制备方法，所述步骤（1）中所述植物蛋白为花生蛋白、大豆蛋白及小麦蛋白。
上述的植物蛋白酸性抗氧化肽的制备方法，步骤（2）中所述氨基酸混合物为食品级精氨酸和赖氨酸按质量比2：1～6：1的混合物，总添加量为植物蛋白质量的2‰-8‰。
上述的植物蛋白酸性抗氧化肽的制备方法，步骤（3）中，所得酸性抗氧化肽有90%的肽分子量在1000-3000Da之间。
上述的植物蛋白酸性抗氧化肽的制备方法，步骤（4）中的卵磷脂为大豆卵磷脂或蛋黄卵磷脂。
上述的植物蛋白酸性抗氧化肽的制备方法，步骤（4）所述过均质机混合为在20～50MP下均质1～2次。
本发明与现有技术相比具有如下优点：
1、本发明制得的植物蛋白经过氨基酸反向调控酶解得到的酶解液具有较高的酸性氨基酸，且经过离子交换树脂的分离纯化得到的酸性肽，其抗氧化能力相当高，通过与卵磷脂热反应后能进一步增强肽的抗氧化活性，同时，热反应产物中含有较多具有强抗氧化性的的杂环化合物，所得最终产物具有较强的抗氧化活性。
2、本发明公开的抗氧化剂比市面上常用的抗氧化剂（BHT、植酸、生姜抽提物和异VC钠）的抗氧化性强2倍以上。
3、本发明公开的抗氧化剂的制备工艺简单，产品安全，可规模化生产。
氧自由基吸收能力（ORAC）的测定方法
基于ORAC反应在75 mmol·L -1磷酸盐缓冲液(pH =7.4)环境中进行，FL（荧光素钠盐）、AAPH（自由基产生剂）、标准抗氧化物质Trolox（维生素E水溶性类似物）以及待测样品均用该缓冲液溶解和稀释。具体测定操作为：在96孔板各微孔中分别加入待测样品20 μL后添加缓冲溶液20 μL及FL（70 nmol·L - 1 ）20μL，在37℃下预置15 min后，用多道移液器迅速在各孔中加入AAPH（12.8 mmol·L - 1 ）140 μL启动反应，并将微孔板置于荧光分析仪中在37℃下以激发波长485 nm，发射波长528 nm进行连续测定，每2 min测定一次各孔荧光强度，测定108min，荧光强度分别记为f0，f1，f2···f54。将记录的各微孔不同时间点的绝对荧光强度数据fi与初始荧光强度f0相比，折算成相对荧光强度，并根据公式如下公式统计荧光熄灭曲线下面积(AUCsample)值，
然后根据公式：
分别计算不同浓度Trolox和抗氧化剂net AUC值，其中AUC blank为没有抗氧化剂存在时自由基作用对照的AUC值。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的实施做进一步的说明，但本发明的实施和保护范围不限于此。
实施例1
（1）控制酶解；以花生粕为原料，加水使蛋白质含量达到11%，100℃灭菌30min，过胶体磨得到植物蛋白浆液；加入Alcalase和占花生蛋白重量2‰的食品级精氨酸和赖氨酸的混合物（重量配比3：1），酶解至水解度为8.4%，95℃灭酶25min，得酶解液；
（2）离子交换树脂：将酶解液通过阳离子交换树脂，以水（pH 7）为洗脱剂，收集洗脱液；将阳离子交换树脂洗脱液通过阴离子交换树脂，以水（pH 3.5）为洗脱剂，收集洗脱液,得酸性肽；
(3) 将酸性肽水溶液浓缩至固形物含量为25%（w/w）,添加5% (w/w)大豆卵磷脂，混合液在25MP下均质2次,100℃反应90min，得热反应产物；
（4）浓缩、喷雾干燥，得抗氧化肽：真空浓缩洗脱液，喷雾干燥，得抗氧化剂1。抗氧化剂1的ORAC值为1103.93μmolTrolox/g。
实施例2
（1）控制酶解；以大豆粕为原料，加水使蛋白质含量达到13%，100℃灭菌30min，过胶体磨得到植物蛋白浆液，加入Papain和占大豆蛋白质量8‰的食品级精氨酸和赖氨酸氨酸的混合物（重量配比4：1），酶解至水解度为10.6%，90℃灭酶30min，得酶解液；
（2）离子交换树脂：将酶解液通过阳离子交换树脂，以水（pH 6.5）为洗脱剂，收集洗脱液；将阳离子交换树脂洗脱液通过阴离子交换树脂，以水（pH 3.2）为洗脱剂，收集洗脱液；
(3) 将酸性肽水溶液浓缩至固形物含量为28%（w/w）,添加6% (w/w)大豆卵磷脂，混合液在50MP下均质1次,121℃反应60min，得热反应产物；
（4）浓缩、喷雾干燥，得抗氧化肽：真空浓缩洗脱液，喷雾干燥，得抗氧化肽产品2。抗氧化剂2的ORAC值为1006.97μmolTrolox/g。
实施例3
（1）控制酶解；以谷朊粉为原料，加水使蛋白质含量达到15%，100℃灭菌30min，过胶体磨得到植物蛋白浆液；加入Papain和占小麦面筋蛋白质量6‰食品级精氨酸和赖氨酸氨酸的混合物（重量配比6：1），酶解至水解度为8.8%，95℃灭酶25min，得酶解液；
（2）离子交换树脂：将活性炭洗脱液通过阳离子交换树脂，以水（pH 6）为洗脱剂，收集洗脱液；将阳离子交换树脂洗脱液通过阴离子交换树脂，以水（pH 4）为洗脱剂，收集洗脱液；
(3) 将酸性肽水溶液浓缩至固形物含量为30%（w/w）,添加8% (w/w)大豆卵磷脂，混合液在50MP下均质1次,121℃反应60min，得热反应产物；
（4）浓缩、喷雾干燥，得抗氧化肽：真空浓缩洗脱液，喷雾干燥，得抗氧化肽产品3。抗氧化剂3的ORAC值为1447.15μmolTrolox/g。
表1 产品中杂环化合物占总风味物质的比例，表2 产品与商业抗氧化剂ORAC值比较。
表1表明，本发明制备的植物蛋白抗氧化剂产品中富含多种杂环化合物，这些杂环化合物均有较强的抗氧化能力。
表2表明，本发明制备的植物蛋白抗氧化剂的ORAC值远远优于已有商品抗氧化剂，表明该抗氧化剂具有较强的抗氧化能力。
表1 产品中杂环化合物占总风味物质的比例
| 编号 | 风味物质 | 抗氧化肽产品1（%） | 抗氧化肽产品2（%） | 抗氧化肽产品3（%） |
| 1 | 2-乙呋喃 | 4.97 | 2.08 | 3.52 |
| 2 | 2-甲基二氢-3(2H)-呋喃酮 | 0.91 | 0.67 | 0.70 |
| 3 | 糠醛, 呋喃甲醛 | 17.17 | 9.81 | 7.38 |
| 4 | α-呋喃甲醇 | 1.66 | 1.02 | 1.61 |
| 5 | 2-戊基呋喃 | 3.49 | 2.79 | 1.42 |
| 6 | 3-苯基呋喃 | 0.42 | 0.24 | 0.31 |
| 7 | 2,3-二氢苯并呋喃 | 0.14 | 0.19 | 0.50 |
| 8 | 2-甲基嘧啶 | 0.64 | 0.75 | 1.11 |
| 9 | 乙烯基吡嗪 | 0.41 | 0.33 | 0.20 |
| 10 | 2-乙基-6-甲基吡嗪 | 3.54 | 2.55 | 4.41 |
| 11 | 2-乙基-3-甲基吡嗪 | 0.00 | 0.14 | 0.37 |
| 12 | 2-甲基-5-乙烯基吡嗪 | 0.07 | 0.12 | 0.28 |
| 13 | 2-乙酰吡啶 | 1.32 | 1.14 | 2.53 |
| 14 | 2-乙酰吡咯 | 2.77 | 3.05 | 7.31 |
表2 产品与商业抗氧化剂ORAC值比较
Claims (5)
1.一种植物蛋白抗氧化剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）原料预处理：以植物蛋白为原料，加水使蛋白质量含量达到10%-15%，在100℃-121℃的温度下加热15min-30min，并过胶体磨得到植物蛋白浆液；
（2）控制酶解：在植物蛋白浆液中加入Alcalase或Papain中的一种或两种，以及氨基酸混合物，酶解至水解度为8%-12%，灭酶，离心，得酶解液；所述氨基酸混合物为食品级精氨酸和赖氨酸按质量比2：1～6：1的混合物，总添加量为植物蛋白质量的2‰-8‰；
（3）离子交换树脂：将酶解液通过阳离子交换树脂，以pH值 5-7的水为洗脱剂，收集洗脱液；将阳离子交换树脂洗脱液通过阴离子交换树脂，以pH值2.5-4的水为洗脱剂，收集洗脱液,得酸性抗氧化肽水溶液；
(4)将酸性抗氧化肽水溶液浓缩至固形物质量含量为25%-30%,添加占浓缩后酸性肽水溶液质量5%-8%的卵磷脂，过均质机混合均匀,100-121℃反应60-90min，得热反应产物；
（5）真空浓缩洗脱液，喷雾干燥，得强抗氧化剂。
2.根据权利要求1所述的植物蛋白酸性抗氧化肽的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中所述植物蛋白为花生蛋白、大豆蛋白及小麦蛋白。
3. 根据权利要求1所述的植物蛋白抗氧化剂的制备方法，其特征在于，
步骤（3）中，所得酸性抗氧化肽有90%的肽分子量在1000-3000Da之间。
4.根据权利要求1所述的植物蛋白抗氧化剂的制备方法，其特征在于，
步骤（4）中的卵磷脂为大豆卵磷脂或蛋黄卵磷脂。
5.根据权利要求1～4任一项所述的植物蛋白抗氧化剂的制备方法，其特征在于，
步骤（4）所述过均质机混合为在20～50MP下均质1～2次。
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