EA021506B1 - Композиция для увеличения отношения trp/lnaa в плазме крови и способ ее получения - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение касается композиции для увеличения отношения Trp/LNAA в плазме крови и поддержания такого отношения в течение периода времени от 15 до 240 мин, содержащей от 10 до 90% гидролизата лизоцима со степенью гидролиза DH от 5 до 45 и от 90 до 10% негидролизованного лизоцима. Композиция по изобретению может быть использована в качестве нутрицевтика для профилактики или лечения улучшения настроения, когнитивных способностей, аппетита, внимательности, бдительности, характера и качества сна, обеспечения успокаивающего действия, снятия депрессии, улучшения контроля за эмоциональными реакциями или полового поведения и при производстве указанного нутрицевтика. Изобретение также касается способа получения заявленной композиции.

Description

(57) Настоящее изобретение касается композиции для увеличения отношения Тгр/ΕΝΑΑ в плазме крови и поддержания такого отношения в течение периода времени от 15 до 240 мин, содержащей от 10 до 90% гидролизата лизоцима со степенью гидролиза ЭН от 5 до 45 и от 90 до 10% негидролизованного лизоцима. Композиция по изобретению может быть использована в качестве нутрицевтика для профилактики или лечения улучшения настроения, когнитивных способностей, аппетита, внимательности, бдительности, характера и качества сна, обеспечения успокаивающего действия, снятия депрессии, улучшения контроля за эмоциональными реакциями или полового поведения и при производстве указанного нутрицевтика. Изобретение также касается способа получения заявленной композиции.

Область техники

Настоящее изобретение касается композиций, которые включают триптофан.

Уровень техники

Уровни серотонина в мозге коррелируют с настроением, внимательностью, активностью, засыпанием и качеством сна, эффектами, снижающими тревожность, депрессией, эмоциональным контролем, аппетитом и половым поведением. Имеется множество публикаций, в которых изменения в уровнях серотонина в мозге коррелируют с доступностью натуральной аминокислоты Ь-триптофана (Тгр или XV). Поскольку такая корреляция существует, способы повышения уровней триптофана в плазме крови привлекают пристальное внимание. Сообщалось, что количество триптофана около 1 г в день на индивидуума обеспечивает клинически достоверные эффекты (Маткик с1 а1., Ат. 1. С1ш. ΝιιΙγ. 2005; 81, 1026-1033). Один из способов увеличения уровней триптофана в плазме крови включает употребление белковых препаратов, обогащенных белком молочной сыворотки альфа-лактальбумином. Препараты альфалактальбумина легко доступны и содержат относительно высокую концентрацию триптофана. Однако подходы, в которых предоставляется альфа-лактальбумин сам по себе (см., например, ΌΕ 4130284 и 1Р 2279700), не учитывают, что основным определяющим фактором уровней триптофана и серотонина в мозге является не концентрация одного триптофана в плазме крови, а так называемое отношение Ττρ/ΕΝΑΑ (Реги81тот аиб ΧνιιΠιηαη. §с1еисе 1971, 173, 149-152). Это отношение Ττρ/ΕΝΑΑ представляет собой молярное отношение триптофана к уровням Больших Нейтральных Аминокислот (Ьатде №и1та1 Αιηίηο Ас1Й8, ΕΝΑΑ, то есть к сумме тирозина, фенилаланина, лейцина, изолейцина и валина) в плазме крови. Эти ΕΝΑΑ конкурируют с триптофаном за поступление в мозг, вероятно из-за того, что используется один и тот же механизм транспорта через гематоэнцефалический барьер. Таким образом, самым эффективным путем увеличения концентраций триптофана в мозге является применение препаратов с высоким отношением Ττρ/ΕΝΑΑ. Большое число публикаций, в частности νθ 02/46210, посвящено получению пептидных фракций из альфа-лактальбумина, имеющих улучшенные отношения Ττρ/ΕΝΑΑ.

Применение свободного триптофана, то есть свободной аминокислоты, было бы самым простым и дешевым способом предоставления препаратов с высоким отношением Ττρ/ΕΝΑΑ. Однако во многих странах существует законодательство, которое строго регулирует применение свободного триптофана. Максимально допустимые уровни свободного триптофана в разных лекарственных формах в разных странах варьируют. Для обеспечения поставки дополнительного пищевого триптофана в более натуральном виде более новые подходы имеют целью предоставление богатых триптофаном белков. Как отмечалось выше, альфа-лактальбумин, а также его гидролизаты приобрели популярность в качестве безопасного способа для повышения уровней триптофана в сыворотке крови. Однако применение альфалактальбумина в качестве отправной точки для богатых триптофаном препаратов несет с собой недостатки в плане максимальных отношений Ττρ/ΕΝΑΑ и стоимости. Альфа-лактальбумин и беталактоглобулин являются основными белковыми компонентами молочной сыворотки. Поскольку полное разделение альфа-лактальбумина и бета-лактоглобулина в промышленном масштабе является трудновыполнимым, из этого следует, что экономически приемлемые по затратам препараты альфалактальбумина будут содержать также и бета-лактоглобулин. В то время как альфа-лактальбумин имеет молярное содержание триптофана 5,3%, содержание триптофана в бета-лактоглобулине составляет только 2%. В то время как альфа-лактальбумин имеет молярное отношение Ττρ/ΕΝΑΑ 0,11, беталактоглобулин имеет молярное отношение Ττρ/ΕΝΑΑ не более чем 0,04. Таким образом, очевидно, что любое загрязнение препаратов альфа-лактальбумина бета-лактоглобулином будет существенно снижать отношение Ττρ/ΕΝΑΑ в конечном продукте.

С учетом высокой заинтересованности в препаратах, которые модулируют уровни серотонина в мозге, имеется потребность в улучшенных способах производства белковых и пептидных препаратов, обладающих высоким отношением Ττρ/ΕΝΑΑ, которые можно широко применять в различных пищевых продуктах и нутрицевтиках.

Раскрытие изобретения

Настоящее изобретение касается способа производства содержащих триптофан композиций, включающих соединенные вместе, предпочтительно смешанные композицию связанного триптофана в составе пептидов, которая предпочтительно растворима в воде и которая имеет отношение Ττρ/ΕΝΑΑ больше чем 0,1, предпочтительно больше чем 0,15, и/или свободный триптофан; и композицию связанного триптофана в составе полипептидов, которая предпочтительно растворима в воде и которая имеет отношение Ττρ/ΕΝΑΑ больше чем 0,15.

Композиция связанного триптофана в составе пептидов предпочтительно получается путем гидролиза лизоцима, предпочтительно лизоцима куриных яиц, для получения гидролизата со значением ΌΗ (степени гидролиза) между 5 и 45, и не обязательно фракционирования, обогащения или очистки гидролизата, например, путем удаления части пептидов, содержащих аргинин или лизин. Предпочтительно композиция связанного триптофана в составе полипептидов представляет собой интактный лизоцим, предпочтительно лизоцим куриных яиц.

Настоящее изобретение также касается композиции, которая включает триптофан, где от 10 до 90%,

- 1 021506 предпочтительно от 20 до 80% триптофана присутствует в виде свободного триптофана или связанного триптофана в составе пептидов, и от 10 до 90%, предпочтительно от 20 до 80% триптофана присутствует в виде связанного триптофана в составе полипептидов. Композиция необязательно включает свободный триптофан в дополнение к связанному триптофану в составе пептидов. Обычно менее чем 10% триптофана будет присутствовать в форме свободного триптофана, предпочтительно от 0 до 5%, более предпочтительно от 0 до 2% и наиболее предпочтительно от 0 до 1% триптофана, присутствующего в композиции настоящего изобретения, будет представлять собой свободный триптофан также и в случае, когда в композиции присутствует связанный триптофан в составе пептидов. Как правило, в одной дозировке для употребления будет применяться от 0,1 до 20 г композиции настоящего изобретения.

Предпочтительно больше чем 30 мол.%, предпочтительно больше чем 40 мол.%, более предпочтительно больше чем 50 мол.%, еще более предпочтительно больше чем 60 мол.%, все еще более предпочтительно больше чем 70 мол.% и наиболее предпочтительно больше чем 80 мол.% связанного триптофана в составе пептидов присутствует в форме ди- или трипептида. Более того, предпочтительно больше чем 40 мол.%, более предпочтительно больше чем 50 мол.%, еще более предпочтительно больше чем 60 мол.%, все еще более предпочтительно больше чем 70 мол.% и наиболее предпочтительно больше чем 80 мол.% связанного триптофана в составе полипептидов присутствует в форме интактного белка, предпочтительно лизоцима.

Другой аспект настоящего изобретения касается композиции настоящего изобретения или лизоцима в качестве нутрицевтика, предпочтительно в качестве лекарства, или применения композиции настоящего изобретения в качестве нутрицевтика, предпочтительно в качестве лекарства, или применения композиции настоящего изобретения для производства нутрицевтика, предпочтительно лекарства, в котором нутрицевтик, предпочтительно лекарство, предпочтительно применяется для профилактики или лечения, направленного на улучшение настроения, познавательных способностей, аппетита, активности, внимательности, засыпания и качества сна, снижение тревожности, депрессии, улучшение эмоционального контроля и полового поведения или применяется как ингредиент в производстве пищевых продуктов, кормов и пищевых добавок.

Кроме того, настоящее изобретение касается применения лизоцима или композиции настоящего изобретения для приема внутрь для увеличения отношения Тгр/Б-ΝΛΛ в плазме крови на период времени от 15 до 240 мин, предпочтительно от 30 до 240 мин после приема. Это увеличение сравнивается с отношением Тгр/ΕΝΆΆ в плазме крови непосредственно перед приемом композиции настоящего изобретения или лизоцима или в отсутствие приема композиции настоящего изобретения или лизоцима.

Предпочтительно композиция настоящего изобретения также включает углевод.

Осуществление изобретения

Предлагаемая содержащая триптофан композиция включает две четко различающиеся фракции, которые при пероральном приеме обеспечивают высокие отношения Тгр/ΕΝΆΆ в плазме крови в течение длительного времени. Одна фракция включает связанный триптофан в составе пептидов, и, следовательно, содержащий триптофан пептид находится в легко абсорбируемой форме низкомолекулярных пептидов, или свободный триптофан. Эта фракция в случае содержащего триптофан пептида включает большое количество ди- и трипептидов, содержащих триптофан. Другая фракция включает связанный триптофан в составе полипептидов, и, следовательно, содержащий триптофан полипептид, предпочтительно находящийся в форме интактного белка, после перорального приема высвобождает содержащийся в нем триптофан только очень медленно. Таким образом, настоящая заявка на изобретение описывает новую комбинацию этих двух богатых триптофаном фракций, которая при пероральном употреблении быстро повышает и поддерживает высокие уровни Тгр/ΕΝΆΆ в плазме крови в течение более длительного времени по сравнению с применением только пептидной фракции, содержащей триптофан. Связанный триптофан в составе пептидов, присутствующий в низкомолекулярной фракции, предпочтительно происходит из лизоцима куриных яиц, связанный триптофан в составе полипептидов или высокомолекулярная фракция предпочтительно представляет собой лизоцим, например интактный лизоцим куриных яиц, или другой источник связанного триптофана в составе полипептидов, такой как интактный белок с высоким отношением Тгр/ΕΝΆΆ. Предпочтительно полипептид, содержащий триптофан, представляет собой белок, который может противостоять протеолитическому расщеплению в условиях желудка. Предпочтительно такой связанный триптофан в составе полипептида, такого как интактный белок, подобно интактному лизоциму, может противостоять протеолитическому расщеплению в условиях желудка, как описано в тесте на устойчивость к протеазам (см. материалы и методы).

Легко поглощаемая содержащая триптофан пептидная фракция является предпочтительно растворимой в воде, имеет предпочтительно значение ΌΗ (степени гидролиза) выше чем 15, более предпочтительно значение ΌΗ выше чем 20, отношение Тгр/ΕΝΆΆ больше чем 0,10, предпочтительно больше чем 0,15, и предпочтительно включает пептиды Λ\ν (как дипептид) или ΟΝ\ν (как трипептид), боле предпочтительно Αν и ΟΝ\ν. Примерами пригодной содержащей триптофан пептидной фракции являются гидролизаты лизоцима и альфа-лактальбумина, гидролизат лизоцима является предпочтительной содержащей триптофан пептидной фракцией.

Фракция связанного триптофана в составе полипептидов, предоставляющая триптофан с более мед- 2 021506 ленной скоростью, обычно имеет значение ΌΗ ниже 10, предпочтительно ниже 5. Интактный белок имеет значение ΌΗ, равное 0. Фракция связанного триптофана в составе полипептидов предпочтительно является растворимой в воде. Более того, фракция связанного триптофана в составе полипептидов имеет отношение Тгр/Б-ΝΛΛ больше чем 0,15 и устойчива к протеолитическому расщеплению в условиях, преобладающих в желудке человека. Тест ίη νίίτο для последнего требования представлен в разделе материалы и методы настоящей заявки на изобретение.

Как отмечалось выше, композиция настоящего изобретения предпочтительно включает углевод для стимуляции, например, секреции инсулина.

Настоящее изобретение касается композиции, включающей фракцию свободного триптофана или связанного триптофана в составе пептидов, а также фракцию связанного триптофана в составе полипептидов. Фракция связанного триптофана в составе пептидов имеет молярное отношение Тгр/ΤΝΑΑ по меньшей мере 0,1, предпочтительно по меньшей мере 0,15, и более предпочтительно между 0,15 и 1,8 и включает предпочтительно по меньшей мере один, предпочтительно по меньшей мере два разных пептида, которые предпочтительно растворимы в воде. Предпочтительно эта композиция включает Αν (как дипептид) или ΟΝν (как трипептид), предпочтительно Αν и ΟΝν, и наиболее предпочтительно Αν и ΟΝν, где молярное отношение Αν к ΟΝν находится между 1 к 2 и 10 к 1, предпочтительно между 1 к 2 и 5 к 1. Более того, содержащие триптофан пептиды богаты триптофаном и включают по меньшей мере один, предпочтительно по меньшей мере два разных ди- или трипептида, где пептид(ы), выбираемый(ые) из ди- или трипептидов, присутствует(ют) в количестве по меньшей мере 5 мол.% от общего количества ди- и трипептидов, и в составе которых присутствует больше чем 30 мол.%, предпочтительно больше чем 40 мол.%, более предпочтительно больше чем 50 мол.%, еще более предпочтительно больше чем 60 мол.%, все еще более предпочтительно больше чем 70 мол.% и наиболее предпочтительно больше чем 80 мол.% связанного триптофана в составе пептидов в форме ди- или трипептида. Фракция связанного триптофана в составе пептидов предпочтительно представляет собой гидролизат лизоцима или очищенный или фракционированный гидролизат лизоцима. Мы обнаружили, что этот гидролизат согласно настоящему изобретению быстро генерирует высокие отношения Тгр/ΕΝΑΑ в плазме крови ίη νίνο. Совершенно неожиданно было обнаружено, что отношения Тгр/ΕΝΑΑ, определяемые в плазме крови, были выше, чем отношение Тгр/ΕΝΑΑ в исходном гидролизате, когда он принимался в достаточно высокой дозе. Достаточно высокая доза представляет собой предпочтительно дозу больше чем 10 г, больше чем 12 г или больше чем 14 г гидролизата лизоцима. Еще одним преимуществом этой фракции является то, что содержащие триптофан пептиды являются очень маленькими, так что даже в комбинации с богатыми белком продуктами с менее предпочтительными отношениями Тгр/ΕΝΑΑ гидролизат может немедленно генерировать высокие отношения Тгр/ΕΝΑΑ в плазме крови. Композиция настоящего изобретения может дополнительно включать свободный триптофан, например, свободный триптофан может быть добавлен в композицию. Предпочтительно эта композиция не содержит больше чем 1% (по весу, в расчете на сухое вещество) свободного триптофана в том случае, когда в ней присутствует связанный триптофан в составе пептидов.

Предпочтительно фракция связанного триптофана в составе полипептидов имеет молярное отношение Тгр/ΕΝΑΑ больше чем 0,15, предпочтительно между 0,15 и 0,5, интактный лизоцим имеет отношение Тгр/ΕΝΑΑ, равное 0,23. При употреблении в пищу фракция связанного триптофана в составе полипептидов также обеспечивает появление связанного триптофана в составе пептидов, однако связанный триптофан в составе пептидов, который образуется ίη νίνο из фракции связанного триптофана в составе полипептидов, становится доступным для всасывания в кишечнике гораздо позже, чем связанный триптофан в составе пептидов из фракции связанного триптофана в составе пептидов. Преимуществом является и то, что всасывание в кишечнике связанного триптофана в составе пептидов, образующихся из фракции связанного триптофана в составе полипептидов, происходит гораздо позже по времени, чем всасывание в кишечнике свободного триптофана или связанного триптофана в составе пептидов из фракции связанного триптофана в составе пептидов в том случае, когда обе фракции употребляются одновременно. Мы обнаружили, что такое замедленное высвобождение триптофана может быть достигнуто путем перорального приема интактных белков, которые устойчивы к ферментативному гидролизу в желудке человека. Предпочтительно такие интактные белки имеют высокое отношение Тгр/ΕΝΑΑ.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения вкус композиции смесей гидролизованного лизоцима и (интактного) лизоцима является улучшенным по сравнению с композицией, включающей гидролизованный лизоцим без (интактного) лизоцима.

Другим аспектом настоящего изобретения является применение лизоцима или композиции, которая включает фракцию свободного триптофана или связанного триптофана в составе пептидов в комбинации со связанным триптофаном в составе полипептидов и необязательно углеводом для улучшения настроения, облегчения предменструального синдрома (РМ§), улучшения познавательных способностей, активности, внимательности, засыпания и качества сна, снижения тревожности, депрессии, улучшения эмоционального контроля или полового поведения или для применения в качестве ингредиента в производстве пищевых продуктов, корма для домашних животных, кормов, пищевой добавки или композиции нутрицевтика для улучшения настроения, улучшения познавательных способностей, аппетита, активно- 3 021506 сти, внимательности, засыпания и качества сна, снижения тревожности, депрессии, улучшения эмоционального контроля или полового поведения. Помимо свободного триптофана или связанного триптофана в составе пептидов, связанного триптофана в составе полипептидов и необязательно углевода, композиция может также включать соединения, рекомендованные для питания мозга, для облегчения стресса или депрессии или для улучшения внимания, настроения, познавательных способностей или характера сна.

Раскрывается пищевой продукт (включая питание для новорожденных), корм для домашних животных, корма, пищевая добавка или композиция нутрицевтика, включающие композицию настоящего изобретения или полученную согласно способу настоящего изобретения, или предпочтительно композицию согласно настоящему изобретению, включающую пептиды ΟΝ\ν (как трипептид), 8\ν (как дипептид) или Αν (как дипептид) в комбинации с интактным лизоцимом куриных яиц.

Согласно другому воплощению раскрывается применение содержащей триптофан композиции настоящего изобретения для повышения отношения Тгр/ΕΝΑΑ в плазме крови в пределах 90 мин, предпочтительно в пределах 60 мин, более предпочтительно в пределах 30 мин и наиболее предпочтительно в пределах 15 мин после приема внутрь пептидов или композиции, или для производства композиции нутрицевтика для повышения отношения Тгр/ΕΝΑΑ в плазме крови в пределах 90 мин, предпочтительно в пределах 60 мин, более предпочтительно в пределах 30 мин и наиболее предпочтительно в пределах 15 мин после приема внутрь композиции. Согласно еще одному воплощению раскрывается применение содержащей триптофан композиции настоящего изобретения для поддержания повышенного отношения Тгр/ΕΝΑΑ в плазме крови на периоды после 90 мин, предпочтительно между 120 и 240 мин, более предпочтительно после 150 мин после приема внутрь композиции. Согласно еще одному другому воплощению раскрывается применение лизоцима или содержащей триптофан композиции настоящего изобретения для производства композиции нутрицевтика для поддержания повышенного отношения Тгр/ΕΝΑΑ в плазме крови на периоды после 90 мин, предпочтительно между 120 и 240 мин, более предпочтительно после 150 мин после приема внутрь композиции.

Настоящее изобретение предоставляет композицию, включающую триптофан в виде свободного триптофана и/или в связанной форме в составе пептидов, который очень хорошо обеспечивает эффективное повышение отношения Тгр/ΕΝΑΑ в плазме крови через очень короткий промежуток времени, и связанный триптофан в составе полипептидов для поддержания высокого отношения Тгр/ΕΝΑΑ в плазме крови в течение более продолжительного периода времени по сравнению с ситуацией, когда в композиции отсутствует связанный триптофан в составе полипептидов. Этот эффект особенно заметен в интервале от 90 до 240 мин после приема внутрь композиции настоящего изобретения. Мы подчеркиваем, что эти две включающие триптофан фракции в комбинации с углеводом вносят свой вклад в быстро достигаемое и продолжительное повышение отношения Тгр/ΕΝΑΑ.

Согласно одному аспекту настоящего изобретения легко всасываемый, связанный триптофан в составе пептидов может быть получен из лизоцима, предпочтительно лизоцима куриных яиц, путем ферментативного (пре-)гидролиза в промышленном способе, то есть лизоцим (куриных яиц) предпочтительно предоставляется в форме гидролизата. При предоставлении в форме гидролизата всасывание в желудочно-кишечном тракте содержащих триптофан пептидов значительно облегчается. Фракция связанного триптофана в составе полипептидов предпочтительно представлена интактным белком с высоким отношением Тгр/ΕΝΑΑ, который не деградирует или только незначительно деградирует в желудке человека. Предпочтительно этот интактный белок представляет собой лизоцим куриных яиц. Альфа-лактальбумин из коровьего молока, который часто применяется для повышения отношений Тгр/ΕΝΑΑ в плазме крови, не может рассматриваться в качестве подходящего источника связанного триптофана в составе полипептидов, поскольку эта молекула имеет более низкое отношение Тгр/ΕΝΑΑ, чем лизоцим. Композиция согласно настоящему изобретению характеризуется присутствием смеси легко всасываемого свободного триптофана и/или связанного триптофана в составе пептидов, таких как гидролизат лизоцима, и связанного триптофана в составе полипептидов, устойчивых к протеазам, таких как интактный белок, предпочтительно лизоцим. Не обязательно данная композиция может включать углевод или свободный триптофан. Предпочтительно композиция настоящего изобретения производится путем смешивания свободного триптофана и/или связанного триптофана в составе пептидов, предпочтительно в виде гидролизата, и связанного триптофана в составе полипептидов, предпочтительно в виде интактного белка, такого как лизоцим, в весовых отношениях (измеренных на сухой вес белка) в диапазоне от 1:3 до 1:0,2. Более предпочтительно композиция включает гидролизат и интактный белок в отношении на сухой вес белка от 1:1 до 1:0,4. Как легко всасываемая фракция, так и устойчивая к протезам белковая фракция характеризуются молекулярными отношениями Тгр/ΕΝΑΑ выше чем 0,10, предпочтительно выше чем 0,15. Композиции могут предоставляться в виде порошков, жидкостей или паст. Жидкости или пасты могут иметь нейтральные или кислые значения рН. Предпочтительно смеси имеют значение рН ниже 5, более предпочтительно ниже 4.

В еще одном воплощении настоящего изобретения лизоцим куриных яиц превращается в гидролизат, включающий пептидную композицию, в которой больше чем 50 мол.%, предпочтительно больше чем 60 мол.%, более предпочтительно больше чем 75 мол.% содержащихся в ней пептидов имеют моле- 4 021506 кулярный вес меньше 500 Да. При этом распределение по молекулярным весам пептидов в гидролизате должно проводиться так, как это описано в разделе материалы и методы настоящей заявки на изобретение.

Важным преимуществом легко всасываемой фракции является то, что триптофан, находящийся в виде свободного триптофана или в составе ди- и трипептидов, транспортируется через стенку кишечника в кровоток немедленно после перорального употребления. Как следствие, уровни триптофана в плазме крови возрастают практически сразу, что оказывает прямой эффект на уровни серотонина в мозге. Данные, представленные в примерах 6 и 11 настоящей заявки на изобретение, показывают, что остатки триптофана, представленные в форме таких ди- и трипептидов, очень быстро обеспечивают высокие отношения Ττρ/ΕΝΆΆ. С этой точки зрения, вероятно, остатки триптофана, представленные в форме этих ди- и трипептидов, являются даже более эффективными, чем свободный триптофан. Согласно способу настоящего изобретения получаемая водорастворимая пептидная фракция имеет значение молекулярного отношения Ττρ/ΕΝΆΛ по меньшей мере 0,1, предпочтительно по меньшей мере 0,15, при условии, что анализ аминокислотного состава гидролизата проводится так, как это описано в разделе материалы и методы настоящей заявки на изобретение.

Еще одним важным преимуществом предоставления триптофана в форме ди- и трипептидов является то, что поглощение этих пептидов в желудочно-кишечном тракте происходит настолько быстро, что они могут употребляться в комбинации с другой содержащей белки пищей, такой как молочные продукты, которые обычно имеют менее желательное отношение Ττρ/ΕΝΆΛ и, кроме того, обеспечивают эффективное увеличение отношения Ττρ/ΕΝΆΛ в плазме крови уже в течение периода 90 мин, предпочтительно 60 мин, более предпочтительно 30 мин после употребления.

Таким образом, настоящее изобретение предоставляет применение лизоцима и/или композиции настоящего изобретения для получения повышенного отношения Ττρ/ΕΝΆΆ в плазме крови в течение 90 мин, предпочтительно 60 мин, более предпочтительно 30 мин после употребления пептидов, или для производства композиции нутрицевтика для получения повышенного отношения Ττρ/ΕΝΆΆ в плазме крови в течение 90 мин, предпочтительно 60 мин, более предпочтительно 30 мин после употребления пептидов. Повышенное отношение Ττρ/ΕΝΆΆ в тексте настоящего изобретения означает повышение этого отношения по сравнению с ситуацией до приема или употребления композиции настоящего изобретения.

Термин белок или полипептид в используемом здесь значении означает цепь, включающую более чем 30 аминокислотных остатков.

Термин интактный белок или интактный полипептид в используемом здесь значении означает белок с молекулярным весом, идентичным молекулярному весу природного белка при их сравнении методом δΌδ-ΡΆΟΕ (электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия), который описан в разделе материалы и методы.

Устойчивость к протеазам интактного белка определяется так, как это описано в разделе материалы и методы.

Термин пептид или олигопептид в используемом здесь значении означает цепь по меньшей мере из двух аминокислот, которые связаны друг с другом пептидной связью. Термины пептид и олигопептид рассматриваются как синонимы (как это обычно делается) и каждый термин может использоваться взаимозаменяемо, как требуется по контексту.

Под композицией или фракцией (фракция и композиция в данном контексте используются взаимозаменяемо), содержащей триптофан в составе пептидов или пептиды, содержащие триптофан, подразумевается композиция, которая включает по меньшей мере один пептид, содержащий триптофан. В тексте настоящего изобретения композиция, содержащая триптофан в составе пептидов или пептиды, содержащие триптофан, может включать только один пептид, предпочтительно эта композиция включает более чем один пептид. Под композицией или фракцией (фракция и композиция в данном контексте используются взаимозаменяемо), содержащей триптофан в составе полипептидов или полипептиды, содержащие триптофан, подразумевается композиция, которая включает по меньшей мере один полипептид, содержащий триптофан. В тексте настоящего изобретения композиция, содержащая триптофан в составе полипептидов или полипептиды, содержащие триптофан, может включать только один полипептид.

Пептид, содержащий триптофан, означает пептид, который включает по меньшей мере один аминокислотный остаток триптофана. Полипептид, содержащий триптофан, означает полипептид, который включает по меньшей мере один аминокислотный остаток триптофана.

Под связанным триптофаном в составе пептида подразумевается триптофан, который присутствует в виде аминокислоты в пептиде. Под связанным триптофаном в составе полипептида подразумевается триптофан, который присутствует в виде аминокислоты в полипептиде.

Содержащая триптофан композиция настоящего изобретения включает композицию содержащих триптофан пептидов и композицию содержащих триптофан полипептидов и, таким образом, будет включать по меньшей мере один содержащий триптофан пептид и по меньшей мере один содержащий триптофан полипептид.

Свободный триптофан означает триптофан в виде свободной аминокислоты и, таким образом, не

- 5 021506 является частью пептида или полипептида.

Водорастворимый пептид представляет собой пептид, который растворим в воде при рН 5,0.

Все формулы (олиго)пептидов и полипептидов или их последовательности написаны здесь слева направо в направлении от амино-конца к карбокси-концу в соответствии с общепринятой практикой. Используемый здесь однобуквенный код для обозначения аминокислот широко известен в данной области техники и может быть найден в ЗатЬтоок, с1 а1. (Мо1еси1аг С1ошп§: А ЬаЬота1огу Мапиа1, 2^й ей. Со1й 8ртшд НагЬог ЬаЬота1оту, Со1й 8ртшд НагЬог ЬаЬота1оту Рге88, Со1й 8ртшд НагЬог, ΝΥ, 1989).

Под белковым гидролизатом, гидролизатом или гидролизованным белком подразумевается продукт, который получен путем ферментативного гидролиза белка, обогащенный или фракционированный гидролизат представляет собой фракцию белкового гидролизата, например, обогащенную определенными пептидами, или в которой пептиды или полипептиды были удалены из гидролизата. Таким образом, обогащенный гидролизат представляет собой предпочтительно смесь пептидов (или пептидную смесь). Таким образом, пептидная смесь настоящего изобретения представляет собой смесь по меньшей мере двух, предпочтительно по меньшей мере трех, более предпочтительно по меньшей мере четырех пептидов, содержащих триптофан. Более предпочтительно смесь включает пептидную композицию, в которой больше чем 50 мол.%, предпочтительно даже больше чем 60 мол.% и наиболее предпочтительно больше чем 75 мол.% имеющихся пептидов имеют молекулярный вес меньше 500 Да. Отношение Ττρ/ΕΝΑΑ представляет собой молярное отношение триптофана по отношению к уровням других Больших Нейтральных Аминокислот (Ьатде №и1та1 Ашшо Ас1Й8, ΤΝΑΑ, то есть сумма тирозина, фенилаланина, лейцина, изолейцина и валина). За исключением отношения Ττρ/ΕΝΑΑ в плазме крови, отношение Ττρ/ΕΝΑΑ касается только связанных аминокислот в составе пептидов и/или полипептидов. Для отношения Ττρ/ΕΝΑΑ в плазме крови отношение Ττρ/ΕΝΑΑ касается свободных аминокислот. Таким образом, свободные триптофан, тирозин, фенилаланин, лейцин, изолейцин и валин не учитываются в отношении Ττρ/ΕΝΑΑ.

Связанные аминокислоты в составе пептидов представляют собой аминокислоты, которые являются частью пептидов, а не свободными аминокислотами. Отношение Τ\τ/Βί'ΆΑ представляет собой молярное отношение тирозина к уровням аминокислот с разветвленной боковой цепью (Вгапскей Скат Лтто Лс1й8. ВСΑΑ; то есть сумма лейцина, изолейцина и валина). Предпочтительно отношение Τ\τ/Βί'ΆΑ выше чем 0,1, предпочтительно выше чем 0,12.

Благоприятные характер и качество сна определяются как спокойный сон, который наступает в пределах 45 мин после отхода ко сну.

Настроение определяется как эмоциональное состояние ума и предпочтительно измеряется с применением Ртой1е о! Моой §1а1е8 сцв^коппапе (см. пример 6 настоящей заявки на изобретение).

Познавательные (когнитивные) способности определяются как комбинированное умение в таких областях, как принятие решений, обучение, память и языковые навыки.

Аппетит определяется как желание есть, стимулируемое чувством голода.

Бдительность определяется как внимательное или бдительное состояние ума, предпочтительно измеряемое с помощью Маск^ойк С1оск Τе8ΐ и Сткюа1 ΤπκΚίπβ Τа8к (см. пример 9 настоящей заявки на изобретение).

Под успокаивающими эффектами понимаются эффекты, которые приводят к устранению чувства страха, опасности или тревоги.

Депрессия определяется как состояние ума, которое характеризуется тяжелым и постоянным чувством отсутствия удовольствия.

Термин половое поведение в используемом здесь значении является синонимом либидо.

В патенте \УО 02/46210 описан способ для увеличения уровня триптофана в гидролизатах белка молочной сыворотки. В используемом способе сыворотка сначала гидролизуется при кислых значениях рН с применением одной или более кислых протеаз, предпочтительно пепсина, реннина, кислой протеазы грибов, химозина, папаина, бромелаина, химопапаина или фицина. Предпочтительно инкубация проводится при рН между 1,5 и 3,5 и условия подбираются таким образом, чтобы получаемые пептиды имели гидрофобную природу. Гидролиз специально проводится таким образом, чтобы остатки триптофана были включены в состав больших гидрофобных пептидов. Гораздо меньшее количество остатков триптофана присутствует в составе маленьких, более водорастворимых пептидов. На следующей стадии процесса рН повышается до значений от 4,0 до 6,0 для стимуляции преципитации этих больших пептидов, содержащих триптофан, что облегчает их избирательное извлечение из гидролизата молочной сыворотки. Триптофан присутствует только в относительно больших пептидах, поэтому поступление триптофана в кровь будет замедлено, что ограничивает возможности применения такого препарата в качестве ингредиента пищевых продуктов или напитков, особенно в комбинации с другими белками. Необходимо подчеркнуть, что интактный альфа-лактальбумин не рассматривается как фракция интактного белка согласно настоящему изобретению, поскольку он не является устойчивым к протеазам согласно данным теста, описанного в разделе материалы и методы.

Настоящее изобретение раскрывает простой способ гидролиза, начинающийся с белка, который является промышленно доступным и характеризуется высоким отношением Ττρ/ΕΝΑΑ. Способ гидролиза

- 6 021506 настоящего изобретения обеспечивает выход более чем 30% триптофана из белка и обеспечивает получение водорастворимой пептидной композиции, включающей триптофан. Тот факт, что большая часть остатков триптофана входит в состав ди- и трипептидов, означает немедленное поступление в кровоток. Как будет раскрыто далее, это свойство позволяет включать гидролизат в большое количество разнообразных пищевых продуктов или нутрицевтиков. Совершенно неожиданно настоящее изобретение также раскрывает, что при пероральном употреблении гидролизат согласно настоящему изобретению может обеспечивать более высокие отношения Ττρ/ΕΝΑΑ в плазме крови, чем отношение Ττρ/ΕΝΑΑ в самом гидролизате.

Согласно настоящему изобретению лизоцим куриных яиц применяется в качестве удобного исходного материала для композиции настоящего изобретения с высоким отношением Ττρ/ΕΝΆΛ, которая при пероральном употреблении приводит к быстрому и долговременному повышению отношения Ττρ/ΕΝΆΛ в крови. Лизоцим присутствует в белке куриных яиц в концентрации 3-4%. С учетом преимуществ его исключительно высокой изоэлектрической точки, лизоцим выделяется в промышленных масштабах из белка куриных яиц с применением стадии простой катионообменной хроматографии не обязательно с последующей стадией кристаллизации. Получаемый продукт является почти чистым и этот промышленно доступный продукт имеет молекулярное содержание триптофана 7,8% и молекулярное отношение Ττρ/ΕΝΆΆ по меньшей мере 0,15. Таким образом, лизоцим, то есть интактный белок, имеет такое отношение Ττρ/ΕΝΆΆ, которое значительно выше, чем таковое у альфа-лактальбумина и/или беталактоглобулина. Таким образом, гидролизаты лизоцима согласно настоящему изобретению предпочтительно имеют молярное отношение Ττρ/ΕΝΆΆ, которое выше чем 0,15, более предпочтительно молярное отношение Ττρ/ΕΝΆΆ выше чем 0,20, даже более предпочтительно молярное отношение Ττρ/ΕΝΆΆ выше чем 0,23, еще более предпочтительно молярное отношение Ττρ/ΕΝΆΆ выше чем 0,25, и наиболее предпочтительно молярное отношение Ττρ/ΕΝΆΆ выше чем 0,30. Как правило, молярное отношение Ττρ/ΕΝΆΆ является ниже чем 3,0. Таким образом, такой лизоцим является предпочтительным исходным материалом для триптофансодержащих пептидов или композиций и может применяться в качестве композиции связанного триптофана в составе полипептидов. Лизоцим (ЕС 3.2.1.17) представляет собой фермент, способный гидролизовать специфические пептидогликановые связи в клеточных стенках бактерий, что приводит к лизису клеток. Благодаря своему бактерицидному действию лизоцим играет важную роль в защите хозяина, предотвращая инфекции. В физиологических условиях молекула лизоцима очень устойчива к действию протеаз. Эта необычная устойчивость имеет под собой эволюционную основу: поскольку вторгающиеся в организм бактерии способны секретировать разнообразные протеазы, молекула лизоцима, которая чувствительна к таким протеазам, будет быстро инактивироваться. Его устойчивость к протезам хорошо иллюстрируется, например, лизоцимами желудка жвачных (ЭоЬюп е! а1., 1. ΒίοΙ. СЬет. 1984, 259 (18): 11607-11616). Со структурной точки зрения можно ожидать, что наличие в молекуле лизоцима четырех дисульфидных связей вносит свой вклад в устойчивость лизоцима к протеазам. На основании данных, представленных в примере 1 настоящего изобретения, лизоцим куриных яиц может считаться настолько устойчивым к протеолитической атаке, что маловероятно, что его молекула может быть эффективно переварена в проксимальной части кишечника человека. Следствием такой устойчивости к протезам является то, что несмотря на очень привлекательное отношение Ττρ/ΕΝΆΆ, интактный лизоцим не является подходящим источником для быстрого повышения уровней триптофана в плазме крови по той простой причине, что в физиологических условиях, имеющихся в желудочно-кишечном тракте, остатки триптофана высвобождаются не очень легко. Однако интактный лизоцим куриных яиц может быть ферментативно гидролизован в условиях, близких к нейтральным значениям рН (Ройет е! а1., 1. А§йс. Ροοά СЬет. 1984, 32, 334-339). Данные этой статьи согласуются с нашими наблюдениями, согласно которым лизоцим куриных яиц способен высвобождать связанный триптофан в составе пептидов в нижних отделах желудочно-кишечного тракта. В комбинации с упоминавшимся выше легко доступным заранее переваренным гидролизатом лизоцима это обеспечивает неожиданную возможность создания препарата, который при пероральном употреблении приводит к быстрому повышению отношения Ττρ/ΕΝΑΑ в плазме крови и к последующему медленному и продолжительному высвобождению триптофана, входящему в состав пептидов. Эти кинетические особенности воспроизводятся в уровнях Ττρ/ΕΝΑΑ в плазме крови, обеспечивая новые и неожиданные эффекты на содержание серотонина и дофамина в мозге.

При употреблении в качестве пищи белки, содержащиеся в пищевых продуктах, постепенно гидролизуются на более мелкие фрагменты, которые после этого транспортируются через стенку тонкого кишечника и поступают в кровь. В желудочно-кишечном тракте содержащиеся в пище белки гидролизуются множеством разных протеаз, которые секретируются желудком, поджелудочной железой и тонким кишечником. Эндопротеазы, такие как пепсин, трипсин и химотрипсин, расщепляют белки пищи на более мелкие олигопептиды. Из этих эндопротеаз только пепсин активен в кислой среде желудка. Трипсин и химотрипсин становятся активными в среде со значениями рН, близкими к нейтральным, которые преобладают в двенадцатиперстной кишке, тощей кишке и более дистальных отделах кишечника. Олигопептиды, образованные этими эндопротеазами, гидролизуются далее множеством других ферментов, таких как ди- и трипептидилпептидазы, с образованием ди- и трипептидов, и таких как амино- и карбок- 7 021506 сипептидазы, с образованием свободных аминокислот. За эффективный транспорт через стенку кишечника в кровоток отвечают системы переносчиков, специфические для транспорта свободных аминокислот или ди- и трипептидов. При употреблении в пищу свободные аминокислоты, ди- и трипептиды сразу попадают в кровоток. Пептиды большего размера, чем трипептиды, для своего поступления в кровоток требуют дополнительного ферментативного расщепления.

Установили, что содержащая триптофан композиция настоящего изобретения также является эффективной при её включении в пищевые матрицы с высоким содержанием белка, например в молочные продукты. Это является совершенно неожиданным, так как пищевые матрицы с высоким содержанием белка имеют высокие уровни ΕΝΑΑ и, таким образом, как можно было ожидать, должны снижать действие продуктов с высокими отношениями Ττρ/ΕΝΑΑ. Возможным объяснением этого неожиданного феномена является то, что обычные пищевые продукты содержат интактные, а не сильно гидролизованные белки. Типичное распределение гидролизата по размерам согласно настоящему изобретению представлено на фиг. 3. Согласно этой фигуре большинство пептидов, включающих триптофан и тирозин, имеют молекулярный вес меньше 500 Да. Учитывая очень высокий молекулярный вес триптофана (Мв = 186) и тирозина (Мв = 163) и тот факт, что свободный триптофан присутствует в гидролизатах в очень небольшом количестве, можно сделать вывод, что большинство этих пептидов будет представлять собой триили дипептиды. Поскольку при используемой длине волны триптофан имеет гораздо более высокое молярное поглощение, чем тирозин, пиковые значения будут относиться преимущественно к пептидам, включающим триптофан.

Поскольку содержащие триптофан ди- и трипептиды, присутствующие в содержащей триптофан композиции согласно настоящему изобретению, всасываются гораздо быстрее, чем, например, большие количества ΕΝΑΑ, присутствующие в негидролизованных белках матрицы, предполагаем, что это является причиной того, что даже в присутствии больших количеств белков матрицы могут быть получены высокие уровни Ττρ/ΕΝΑΑ.

Определенные ситуации требуют высоких уровней Ττρ/ΕΝΑΑ в плазме крови в течение длительных периодов времени. Например, чтобы улучшить и продлить сон, или в ситуациях, требующих повышенных когнитивных способностей в течение длительного времени. Композиции согласно настоящему изобретению являются очень важными также в ситуациях, которые требуют улучшения настроения, таких как описаны для случаев предменструального синдрома или для женщин в период после менопаузы. Тогда как связанный триптофан в составе пептидов, таких как гидролизат лизоцима, будет обеспечивать практически немедленное повышение отношения Ττρ/ΕΝΑΑ, медленное переваривание полипептидов, в составе которых находится связанный триптофан, таких как устойчивый к пепсину белок с высоким уровнем Ττρ/ΕΝΑΑ, будет гарантировать длительное высвобождение связанного триптофана в составе полипептидов в более удаленных отделах кишечника человека, что обеспечит повышенное отношение Ττρ/ΕΝΑΑ в плазме крови в период времени между 120 и 240 мин после употребления композиции настоящего изобретения.

Интересно отметить, что представленные нами экспериментальные данные также, вероятно, указывают на то, что гидролизат согласно настоящему изобретению может обеспечивать отношения Ττρ/ΕΝΑΑ в плазме крови волонтеров, которые выше, чем отношение Ττρ/ΕΝΑΑ в гидролизате, когда гидролизат дается в достаточно высокой дозе. Достаточно высокая доза предпочтительно представляет собой дозу больше чем 10 г, больше чем 12 г или больше чем 14 г гидролизата лизоцима. Хотя такой феномен неизвестен, и согласно имеющимся у нас сведениям не существует общепринятого объяснения этого эффекта, полагаем, что это может быть связано с исключительно высоким содержанием аргинина в молекуле лизоцима. Здесь раскрывается имеющаяся в настоящее время рабочая гипотеза для объяснения экспериментальных данных, показанных в примерах. Эта гипотеза предназначена для иллюстрации точки зрения авторов настоящего изобретения, но настоящее изобретение никак не связано или не ограничено этой гипотезой. Таким образом, настоящее изобретение никак не зависит от корректности данной гипотезы. Увеличение уровня инсулина в крови стимулирует транспорт аминокислот из крови в периферические ткани, особенно в мышцы. Однако это не затрагивает в значительной степени триптофана, поскольку триптофан в крови связан с белком плазмы альбумином. Вследствие этого повышенные уровни инсулина снижают концентрацию ΕΝΑΑ, но не триптофана, повышая, таким образом, отношение Ττρ/ΕΝΑΑ в крови. Поскольку употребление углеводов стимулирует секрецию инсулина и транспорт ΕΝΑΑ в периферические ткани, особенно в мышцы, при употреблении углеводов отношения Ττρ/ΕΝΑΑ в плазме крови увеличиваются (Есгпйгот апб \Уиг1тап. 1972, МеПЪоНкт, νοί. 21, Νο.4, 337-342). Известно также, что помимо употребления углеводов секреция инсулина стимулируется определенными аминокислотами. Если уровни аминного азота в плазме крови при инфузии индивидуальных аминокислот являются очень близкими, что ответы инсулина значительно варьируют. Р1оуб с1 а1. (1 С1ш ΙηνοδΙ 45(9): 1487-502) установили, что ответ инсулина уменьшается в следующем ряду аминокислот аргинин > лизин> лейцин > фенилаланин > валин > метионин. Учитывая тот факт, что лизоцим особенно богат аминокислотой аргинином, можно предположить, что запускаемый аргинином эффект стимуляции секреции инсулина приводит к высоким отношениям Ττρ/ΕΝΑΑ.

Поскольку углеводы известны своим стимулирующим действием на секрецию инсулина, гидроли- 8 021506 заты согласно настоящему изобретению предпочтительно готовятся в комбинации с углеводами. В добавление к присутствию быстро поглощаемого связанного триптофана в составе пептидов и медленно поглощаемого связанного триптофана в составе полипептидов предпочтительная композиция согласно настоящему изобретению включает углевод.

В одном воплощении настоящего изобретения лизоцим, предпочтительно лизоцим куриных яиц, ферментативно (пре-)гидролизуется промышленным способом, то есть композиция содержащих триптофан пептидов (из куриных яиц) предпочтительно предоставляется в форме гидролизата или обогащенного гидролизата. Предоставление содержащих триптофан пептидов в форме такого (обогащенного) гидролизата значительно облегчает всасывание триптофана в кишечнике. В другом воплощении настоящего изобретения лизоцим куриных яиц превращается в гидролизат или обогащенный гидролизат, включающий популяцию содержащих триптофан пептидов, в которой больше чем 50 мол.%, предпочтительно больше чем 60 мол.%, более предпочтительно больше чем 75 мол.% имеющихся пептидов имеют молекулярный вес меньше 500 Да. Предпочтительно такой (обогащенный) гидролизат не содержит больше чем 1% (по весу, в расчете на сухое вещество) свободного триптофана. Анализ молекулярного веса содержащих триптофан пептидов, присутствующих в гидролизате, проводится как это описано в разделе материалы и методы настоящего изобретения и проиллюстрирован на фиг. 3. Важным преимуществом последнего воплощения является то, что триптофан, входящий в состав ди- и трипептидов, транспортируется через стенку кишечника в кровоток сразу после перорального употребления. Вследствие этого уровни триптофана в плазме крови увеличиваются практически немедленно, что оказывает прямой эффект на уровни серотонина в мозге. Совершенно неожиданно результаты, представленные в примере 6 настоящего изобретения, показывают, что эффективность остатков триптофана, представленных в форме ди- и трипептидов, является даже более высокой, чем эффективность свободного триптофана. Это наблюдение показывает преимущества, предоставляемые настоящим изобретением.

Патент \УО 2006/009448 предоставляет белковые гидролизаты, полученные из белков куриного яйца, обладающие антигипертензивными свойствами, а также пищевые продукты и пищевые добавки, включающие эти гидролизаты. Этот документ раскрывает получение большого количества гидролизатов, включая гидролизаты, получаемые из лизоцима куриных яиц. Назначением всех этих гидролизатов является снижение давления крови или предотвращение повышений давления крови при пероральном употреблении людьми. В \УО 2006/009448 также описывается производство гидролизатов лизоцима, полученных в щелочных условиях с применением субтилизина (ЕС3.4.21.62; коммерческие названия Л1са1а5С или Рго1ех). Учитывая высокую степень гидролиза в процессе их получения, эти гидролизаты лизоцима содержат большую долю пептидов с молекулярным весом ниже 500 Да. Однако нигде в тексте \УО 2006/009448 нет ссылок на тот факт, что лизоцим представляет собой источник белка с высоким содержанием триптофана, что может оказывать положительное влияние на уровни серотонина в мозге. Не упоминается также, что гидролизаты лизоцима содержат водорастворимые пептиды, включающие большое количество триптофана и относительно низкое количество ΕΝΑΑ. В \УО 2006/009448 также не упоминается высокое содержание аргинина и лизина либо в лизоциме, либо в гидролизатах лизоцима. На основании данных, представленных в настоящей заявке на изобретение, установили, что высокое содержание триптофана в молекуле лизоцима в комбинации с высоким содержанием аргинина и лизина делает лизоцим идеальным исходным материалом для достижения высоких отношений Тгр/ΕΝΑΑ ίη νΐνο. Кроме того, в тексте \УО 2006/009448 не отмечается преимуществ, предоставляемых гидролизатом, применяемым в настоящем изобретении, при его совместном употреблении с другими содержащими белок пищевыми продуктами. Кроме применения мембранных фильтров, в тексте \УО 2006/009448 также не упоминаются способы получения из этих гидролизатов пептидных фракций, имеющих определенный аминокислотный состав, или применения специфических способов для увеличения содержания триптофана или для увеличения отношений Тгр/ΕΝΑΑ. Кроме того, не отмечается преимущества предоставления гидролизата высокодеградированного лизоцима в комбинации с не деградированным интактным лизоцимом.

Данные, представленные в примере 4 настоящей заявки на изобретение, показывают, что гидролизат лизоцима, полученный при инкубации лизоцима при щелочном рН с субтилизином, особенно богат дипептидом Л1а-Тгр (Α^ν). Это позволяет предполагать, что химически синтезированный дипептид Αν может выступать в качестве приемлемой альтернативы для данного гидролизата лизоцима. Хотя применение синтетического дипептида имеет очевидные сложности, связанные с законодательством, важным преимуществом является его коммерческая эффективность и его идеальное отношение Тгр/ΕΝΑΑ. Теоретически доступными являются двадцать содержащих триптофан дипептидов, однако наши исследования показали, что дипептиды Αΐα-Тгр (Αν) и §ег-Тгр (δν) обеспечивают наиболее предпочтительную возможность для повышения отношений Тгр/ΕΝΑΑ в плазме крови при применении синтетических дипептидов. Производство дипептидов Αν и δν путем химического синтеза является возможным с применением обычных способов (см., например, Ν. δе\γа16 апб Η.Ό. 1акиЬке Рерйбез: СНетМгу апб Βίοίοβν. Εάδ. νίΚγ-ΥΟΗ Уег1ад ОтЬН, 2002, Сйар1ег 4). Конкретные эффективные по стоимости способы химического синтеза пептидов, пригодные для промышленного производства, основаны на применении алкилхлорформиатов или пивалоилхлорида для активации карбоксильной группы в комбинации с

- 9 021506 применением метиловых эфиров для С-концевой защиты и бензилоксикарбонильной (Ζ) или третбутилоксикарбонильной групп для Ν-концевой защиты. Детальное описание способа эффективного по стоимости способа синтеза дипептида §ν представлено в примере 5. Комбинация такого химически синтезированного содержащего триптофан дипептида со связанным триптофаном в составе полипептидов, таких как устойчивый к пепсину белок с высоким отношением Ттр/ЬЫАА, предпочтительно интактный лизоцим, является новой.

Имея в доступности композицию согласно настоящему изобретению, можно предвидеть другие новые и неожиданные её применения, которые имеют технические и экономические преимущества.

Новым применением могло бы быть включение лизоцима и/или композиции настоящего изобретения в различные пищевые смеси для маленьких детей. Коровье молоко содержит 20% белка сыворотки, а человеческое молоко - от 40 до 60%. Вследствие этого коровье молоко содержит меньше альфалактальбумина и, следовательно, триптофана по сравнению с человеческим молоком. Обычно доношенные дети в норме употребляют детские смеси на основе коровьего молока, то есть продукты, которые не обеспечивают аминокислотного профиля, эквивалентного таковому материнского молока. Хотя последствия недостаточного употребления триптофана до конца не известны, продукты для детского питания с высоким содержанием триптофана могут иметь положительные эффекты на сознательное поведение и характер и качество сна у маленьких детей. Прямое указание на то, что высокий уровень триптофана в плазме крови обеспечивает быстрое засыпание и спокойный сон здоровых новорожденных, представлено в работе Уодтап аиб Ζοίδβΐ (Ν. Епд1. 1. Меб. 1983, Νον 10; 309(19): 1147-1149). В соответствии с этим настоящее изобретение предоставляет композиции для пищевых продуктов для маленьких детей, в которых повышен уровень триптофана.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения композиция согласно настоящему изобретению может применяться в заменителях пищевых продуктов. Например, νθ 2005/023017 описывает преимущества желатина в высоких дозировках как пригодного компонента в заменителях пищевых продуктов. Хотя желатин обеспечивает прекрасные органолептические свойства, он не обеспечивает требуемого аминокислотного баланса, например, он не содержит незаменимой аминокислоты триптофана. Таким образом, для того, чтобы получить композицию с необходимым аминокислотным балансом, как это требуется согласно ЕС ЭиесШ'е 96/8/ЕС, в такие содержащие желатин композиции должен добавляться триптофан. В νθ 2005/023017 триптофан предпочтительно добавляется в форме богатого триптофаном белка, например порошка яичного белка или цельного яичного порошка. Мы теперь установили, что содержащие триптофан композиции согласно настоящему изобретению обеспечивают улучшенное решение этой проблемы, поскольку данные гидролизаты поставляют триптофан в намного более концентрированной форме. Более того, лизоцим сам по себе содержит все незаменимые аминокислоты в необходимом количестве и, следовательно, представляет собой полноценный в питательном смысле белок, который идеально подходит на роль заменителя пищевых продуктов.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения лизоцим и/или композиция согласно настоящему изобретению применяется для улучшения характера и качества сна у новорожденных, детей и взрослых. Проблемы со сном широко распространены среди индивидуумов, принадлежащих к разным возрастным группам, и связаны с медицинскими нарушениями. Содержащие триптофан композиции согласно настоящему изобретению являются полезными для лечения связанных со сном проблем в целом, но они представляют собой полезный инструмент для преодоления проблем, связанных с когнитивными, психологическими, социальными и поведенческими нарушениями. Примерами этого являются достижение хорошей гигиены сна, преодоление проблем с засыпанием или нарушений циркадного ритма сна. Продукты также могут быть полезны для улучшения характера и качества сна и психического состояния, например, у пациентов, страдающих фибромиалгией. Синдром фибромиалгии представляет собой хронический болевой синдром, который сопряжен с тяжелыми нарушениями характера и качества сна и эмоциональным стрессом. Мы установили, что регулярное употребление композиции согласно настоящему изобретению и/или лизоцима улучшает характер и качество сна у индивидуумов, страдающих от связанных со сном проблем в целом.

Композиция согласно настоящему изобретению обеспечивает дополнительные преимущества, такие как предоставление (полу-)незаменимых аминокислот. Лизоцим имеет не только высокий уровень триптофана, но также содержит значительное число остатков тирозина. Тирозин является предшественником нейротрасмиттера дофамина и известно, что уровни тирозина в плазме крови влияют на уровни дофамина в мозге. Гидролизат лизоцима содержит не только меньше БЫЛА. чем другие известные пептиды с высоким содержанием триптофана, он также содержит меньше аминокислот с разветвленной боковой цепью (ВСАА), чем другие известные пептиды с высоким содержанием триптофана. Это является важным, поскольку известно, что ВСАА снижают доступность в плазме предшественника дофамина тирозина. Таким образом, его высокое отношение Ттр/ЬЫАА в комбинации с его высоким отношением Туг/ВСАА делает лизоцим уникальной молекулой. Следовательно, композиция согласно настоящему изобретению, включающая гидролизат лизоцима и интактный лизоцим, представляет собой очень хорошую пищу для мозга, то есть обеспечивает поставку незаменимых аминокислот, необходимых для обеспечения подходящих уровней нейротрансмиттеров. Известно, что дофаминовая система играет кри- 10 021506 тическую роль в обеспечении положительного подкрепления и в мотивации, а также известно, что она оказывает влияние на концентрацию, память, бдительность, внимание, принятие решений и психомоторную координацию. Как показано в примере 9 настоящего изобретения, употребление гидролизата лизоцима согласно настоящему изобретению обеспечивает достоверные положительные эффекты на бдительность, внимательность, концентрацию и психомоторную координацию. Эти результаты показывают, что можно ожидать, что композиция согласно настоящему изобретению будет стимулировать не только серотониновую систему, но и дофаминовую систему.

Некоторые группы людей могут получить пользу благодаря этому открытию. Например, женщины в период менопаузы обычно жалуются на пониженную способность к принятию решений, которую они связывают с неспособностью концентрироваться. Таким образом, композиция согласно настоящему изобретению особенно хорошо подходит для решения этих проблем у женщин из такой возрастной группы. В категории молодых женщин и женщин среднего возраста довольно обычным является предменструальный синдром. Этот синдром характеризуется большим разнообразием симптомов, однако часто встречаются жалобы на депрессию и неустойчивость настроения. Для разрешения этих проблем часто назначаются селективные ингибиторы обратного захвата серотонина, такие как флуоксетин, а для женщин с более мягкими симптомами рекомендуются изменения в диете и профилактика стресса. На основе результатов экспериментов, описанных в примерах 6 и 9 настоящего изобретения, композиция согласно настоящему изобретению обеспечивает прекрасное лечение в особенности таких умеренных случаев. Кроме того, недостаток дофамина связан с синдромом дефицита внимания и гиперактивности (айеийоиΗοΓίοίΙ НурегасОуПу Фкогбег, ΑΌΗΌ), и можно ожидать, что симптомы этого синдрома будут смягчаться при приеме композиции согласно настоящему изобретению. Наши данные о том, что положительные эффекты на постстрессовые проявления особенно выражены у устойчивых к стрессу субъектов являются неожиданными. Возможным объяснением этого может быть то, что испытывающие стресс люди со (сверх)активной серотониновой системой нуждаются в получении триптофана из напитков для восполнения их запасов серотонина и, следовательно, не могут использовать этот триптофан для улучшения своей способности к решению задач. Согласно этой точке зрения устойчивые к стрессу люди без сверхактивной серотонинергической системы не нуждаются в триптофане для восполнения их запасов серотонина и могут использовать этот триптофан для улучшения своего постстрессового поведения. Альтернативным объяснением может быть то, что эти эффекты в действительности являются результатом стимулирующего действия дофаминэргических процессов. Синтез дофамина может усиливаться ингредиентами пищи, богатыми тирозоном, особенно в случае комбинации с низкими уровнями аминокислот с разветвленной цепью (ВСАА). Эти рабочие гипотезы раскрываются здесь для объяснения экспериментальных данных, показанных в примерах, и приводятся для объяснения имеющейся в настоящее время точки зрения авторов изобретения. Однако настоящее изобретение никак не связано или не ограничивается этими гипотезами. Таким образом, настоящее изобретение не зависит от корректности этих гипотез. Как говорилось в другом месте, лизоцим имеет не только высокий уровень триптофана, но также включает в себя значительное число остатков тирозина.

Лизоцим и/или композиция согласно настоящему изобретению также увеличивает содержание цистеина в пищевых продуктах. Хотя цистеин и не является незаменимой аминокислотой, его концентрации во многих пищевых продуктах являются ограниченными. Эндогенный синтез цистеина требует наличия метионина, а подобно цистеину, концентрации метионина во многих пищевых продуктах являются ограниченными. Преимущества повышенного содержания цистеина в пище связаны, среди прочего, с его антагонистическим действием на эффект метионина, повышающий содержание гомоцистеина в сыворотке крови. Эти данные описаны в патенте \УО 03/055335. Композиция согласно настоящему изобретению также характеризуется высоким уровнем цистеина. Действительно, молекула лизоцима содержит даже больше остатков цистеина (8), чем остатков триптофана (6). В этом отношении композиция согласно настоящему изобретению является прекрасным источником для увеличения содержания цистеина в определенных продуктах. Было установлено, что повышенное содержание цистеина является важным для таких продуктов, как детское питание. Не только для детского питания на основе казеина или смесей казеина и белков молочной сыворотки, но также и для продуктов на основе сои и, на самом деле, для всех богатых белком продуктов, в которых основным источником белка являются белки, содержащие относительно небольшие количества триптофана или цистеина. Помимо белковых компонентов коровьего молока и желатина, примерами таких белков являются белок кукурузы, белок дрожжей, белок гороха, белок сои и белок риса. Кроме того, упоминавшиеся выше заменители пищевых продуктов, содержащие высокие дозы желатина, содержат недостаточные количества цистеина.

Лизоцим и/или композиция согласно настоящему изобретению, которая включает, например, диили трипептид, которые включают триптофан, особенно δ\ν (как дипептид) или Α\ν (как дипептид), может применяться в любой подходящей форме, такой как продукт питания или напиток, как продукты для специального питания (Рооб Гог §реаа1 ΝυΐΓίΙίοηαΙ Икек), как диетическая добавка, как нутрицевтик или даже в качестве кормов или корма для домашних животных. Содержащая лизоцим композиция может добавляться на любой стадии обычного процесса производства этих продуктов. При применении в пищевых продуктах или напитках продукты с относительно низким содержанием белка являются предпоч- 11 021506 тигельными для того, чтобы поддерживать высокое отношение Ττρ/ΕΝΑΑ в крови после употребления продуктов согласно настоящему изобретению. Важные пищевые продукты включают, например, хлебные батончики, шоколад и содержащие шоколад напитки, хлебобулочные изделия, такие как кексы и печенье, а также жидкие продукты, такие как супы или суповые порошки. Помимо молочных продуктов, таких как молоко и йогурт, другие подходящие напитки включают безалкогольные и алкогольные напитки, а также жидкие композиции для добавления в питьевую воду и жидкую пищу. Безалкогольные напитки предпочтительно представляют собой минеральную воду, спортивные напитки, фруктовые соки, лимонады, чаи, кофе, кофе без кофеина, концентрированные напитки, такие как концентраты шипучих напитков, энергетические напитки (например, напитки, содержащие глюкуронолактон, кофеин или таурин) и газированные напитки (например, шипучие напитки, содовые напитки и кола).

Предпочтительными комбинациями с лизоцимом и/или композицией согласно настоящему изобретению являются комбинации с соединениями, рекомендованными для питания мозга, такими как железо, цинк, магний, витамины (особенно В₂, В₆, фолиевая кислота и витамин С), омега-3 и докозагексаеновая (ΌΗΑ) жирные кислоты и содержащие их жиры, глюкоза, ГАМК, холин, фосфатидилсерин, кофермент 010. креатин, таурин и 5-гидрокситриптамин (5-НТР), или комбинации с соединениями, рекомендованными для облегчения стресса или депрессии, такими как валериана, шоколад, зверобой, 5-НТР, фосфатидилсерин, спирт, мелисса, зеленый чай или экстракты зеленого чая, ромашка или 3аденозилметионин, или комбинации с соединениями, рекомендованными для улучшения бдительности, такими как кофеин, гуарана, женьшень, гинкго билоба, зверобой и 5-НТР, или комбинации с соединениями, рекомендованными для улучшения настроения, такими как ГАМК, 5-НТР, ΡΕΑ, шоколад, зеленый чай или экстракты зеленого чая, гинкго билоба, шалфей или 3-аденозилметионин, или комбинации с соединениями, рекомендованными для улучшения сна, такими как пептиды молока, свободный триптофан, опиоидные пептиды или мелатонин. Примеры продуктов для специального питания включают категории спортивного питания, продуктов для похудения, детского питания и лечебного питания. Термин пищевые добавки в используемом здесь значении означает продукт, употребляемый в пищу (через рот), который содержит соединение или смесь соединений, предназначенных для пополнения диеты. Соединение или смесь соединений в этих продуктах могут включать витамины, минеральные вещества, травы или другие вещества растительного происхождения и аминокислоты. Пищевые добавки также могут представлять собой экстракты или концентраты и могут производиться во множестве форм, таких как таблетки, капсулы, мягкие гели, гелевые капсулы, жидкости или порошки.

Содержащая триптофан композиция настоящего изобретения и/или лизоцим могут также применяться как или в составе композиции нутрицевтика или в производстве нутрицевтика. Термин нутрицевтический в используемом здесь значении означает полезность применения как в пищевой, так и в фармацевтической областях. Лизоцим и/или нутрицевтические композиции согласно настоящему изобретению могут готовиться в любой форме, пригодной для введения в организм животного, включая организм человека, особенно в любой форме, которая является традиционной для перорального введения, например в твердой форме, такой как пищевые продукты или корма и добавки/дополнения к ним, заранее приготовленные смеси (премиксы) пищевых продуктов или кормов, таблетки, пилюли, гранулы, драже, капсулы и шипучие смеси, такие как порошки и таблетки, или в жидкой форме, такой как растворы, эмульсии или суспензии, такие как, например, напитки, пасты и масляные суспензии. Композиции с контролируемым (замедленным) высвобождением, включающие гидролизаты согласно настоящему изобретению, также являются частью настоящего изобретения. Кроме того, в нутрицевтические композиции настоящего изобретения могут добавляться мультивитаминные и минеральные добавки для получения адекватного количества важного пищевого компонента, который отсутствует в некоторых диетах. Мультивитаминные и минеральные добавки могут также быть полезными для профилактики заболеваний и защиты от недостатка и дефицита пищевых компонентов, которые возникают из-за специфического образа жизни.

В предпочтительном аспекте настоящего изобретения лизоцим и/или композиция могут применяться в качестве нутрицевтической или пищевой добавки, например, для улучшения настроения или для улучшения когнитивных функций, таких как обучаемость, память, внимательность и бдительность, например, у пожилых людей, но также и у более молодых людей, таких как студенты, которые готовятся к экзаменам, и у людей, играющих, например, в компьютерные или Интернет-игры. Как говорилось выше, для женщин в период перед и после менопаузы лизоцим и/или композиция согласно настоящему изобретению имеют особое значение. Лизоцим и/или композиция согласно настоящему изобретению также имеют особое значение для спортсменов, как для спортсменов-профессионалов с напряженными графиками интенсивных тренировок, так и для людей, занимающихся спортом на отдыхе, таких как игроки в теннис или гольф. Это означает, что настоящее изобретение касается применения гидролизата согласно настоящему изобретению, как это указано выше, и как средства для улучшения состояния, то есть для снижения раздражительности и усталости (в конечном счете, снижая риск перетренировки), для снижения или предотвращения или облегчения физической и умственной усталости, для обеспечения спокойного сна, то есть для борьбы с бессонницей и нарушениями сна и для улучшения сна, и для повышения энергии в более общем смысле, особенно для улучшения продукции энергии в мозге, у больных или здо- 12 021506 ровых индивидуумов. Более того, для улучшения когнитивных способностей в целом и особенно для поддержания или улучшения внимания и концентрации, памяти и возможности запоминания, способности к обучению, обработки лингвистической информации, принятия решений и интеллектуальной деятельности, для улучшения как кратковременной, так и долговременной памяти, для повышения остроты ума, для усиления умственной бдительности, для снижения умственной усталости, для поддержки хорошего когнитивного здоровья, для поддержания сбалансированных когнитивных функций. Если это необходимо для получения экономически выгодных композиций с высоким отношением Тгр/ΕΝΆΆ, гидролизаты согласно настоящему изобретению не обязательно включают свободный триптофан.

Перечень фигур

Фиг. 1. Молярное отношение Тгр/ΕΝΆΆ в плазме крови как функция от времени после употребления продуктов, описанных в примере 6. КЕР= гидролизат казеина, АЬАС= интактный альфалактальбумин, Тгр= свободный триптофан, ^ЕР8= обогащенный триптофаном гидролизат лизоцима, 8ΥΝ= синтетический дипептид 8ег-Тгр.

Фиг. 2. Плохое настроение (измеренное согласно тесту Ргой1е оГ Мооб 81а1е5 1еМ (РОМ8)) как функция от времени после употребления продуктов, описанных в примере 6. КЕР= гидролизат казеина, АЬАС= интактный альфа-лактальбумин, Тгр= свободный триптофан, ^ЕР8= обогащенный триптофаном гидролизат лизоцима, 8ΥΝ= синтетический дипептид 8ег-Тгр.

Фиг. 3. Распределение по размеру фракции водорастворимых пептидов гидролизата лизоцима. Применение метода для определения распределения молекулярных весов пептидов и белков, присутствующих в гидролизатах, детально описано в разделе материалы и методы, анализировался гидролизат лизоцима, полученный согласно способу, описанному в примере 3. Измерения поглощения при 214 нм отражают наличие пептидных связей. Измерения поглощения при 280 нм отражают присутствие ароматических боковых цепей триптофана и тирозина. Поскольку при этой длине волны триптофан обладает гораздо более высоким молярным поглощением, чем тирозин, максимальные значения относятся, главным образом, к пептидам, включающим триптофан.

Фиг. 4. Схема, показывающая дизайн проведения эксперимента, описанного в примере 9. Нщ1г восприимчивые к стрессу волонтеры; 1ο\ν: устойчивые к стрессу волонтеры; йубг: богатый триптофаном гидролизат лизоцима; р1аееЬо: гидролизат казеина.

Фиг. 5. Схема расписания типичного дня проведения эксперимента, описанного в примере 9. Эпик: употребление напитка, содержащего богатый триптофаном гидролизат или плацебо; Ь1ооб: взятие образца крови для определения уровней аминокислот в плазме; регГогтапсе: выполнение тестов перед и после некотролируемого стресса; 81ге88: арифметическая задача.

Фиг. 6. Отношения Тгр/к-ΝΛΛ в плазме крови (мкмоль/л) после приема плацебо (р1с) или гидролизата лизоцима (Тгр-йубг) в эксперименте, описанном в примере 9. Закрашенные значки: восприимчивые к стрессу субъекты; незакрашенные значки: устойчивые к стрессу субъекты.

Фиг. 7. Результаты теста МаскетогШ С1оск Тез!, проведенного, как описано в примере 9. Количество правильных ответов (вертикальная ось) после приема плацебо (р1с; левая часть графика) или богатого триптофаном гидролизата (Тгр-йубг; правая часть графика), перед (Рге-81ге88) или после (Ро81-81ге88) решения арифметической задачи. Закрашенные значки: восприимчивые к стрессу субъекты; незакрашенные значки: устойчивые к стрессу субъекты. Поскольку разные продукты давались в разные дни, корректное сравнение может быть сделано только между условиями перед стрессом и после стресса при применении одного и того же продукта и в пределах одного и того же дня.

Фиг. 8. Результаты теста СпОса1 Тгаскищ Такк, проведенного, как описано в примере 9. Лямбда СТ (показывающая конечный уровень сложности, который достигается субъектами) выражена после приема плацебо (р1с) или богатого триптофаном гидролизата (Тгр-йубг). Черные значки: восприимчивые к стрессу субъекты; серые значки: устойчивые к стрессу субъекты.

Фиг. 9. Электрофорез в присутствии додецилсульфата натрия лизоцима и белков молочной сыворотки, проинкубированных с пепсином при кислых значениях рН. Дорожка 1: исходный лизоцим; дорожка 2: лизоцим после переваривания пепсином; дорожка 3: исходные белки молочной сыворотки; дорожка 4: белки молочной сыворотки после переваривания пепсином; дорожка 5: пепсин сам по себе.

Фиг. 10. Кинетика отношений Трэ/к-КАА в плазме крови после приема гидролизованного лизоцима (Р2В = ромбы), интактного лизоцима (Ьуз = квадраты) и смеси интактного и гидролизованного лизоцима (Μίχ = треугольники). Все три продукта имели одинаковое содержание триптофана. Важно подчеркнуть, что все три продукта дают абсолютно одинаковые значения площади под кривой, что говорит о том, что гидролизат лизоцима как и сама молекула интактного лизоцима полностью перевариваются и поступают в кровь.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Материалы и методы

Материалы

Субтилизин под коммерческим названием Рго1ех 6Ь был получен от Сепепсог (Бекеп. Тйе №Шег1апЙ5). пепсин от 81дта и смесь трипсина и химотрипсина (Рогсше РЕМ) от №уо/уте5 (Вадзуаегф Иеитагк). Лизоцим был получен либо как ЭеКо/уте Ь (22% сухого вещества), либо как сухой гранулиро- 13 021506 ванный Эеко/уте С от ΌδΜ Рооб ЗреааПйек (Эс1Г1. Тйе №1йег1апбк).

Гидролизат казеина (КЕР) был получен, как описано Ебепк е1 а1. (1 Адпс Рооб Сйет., 53(20): 79507957, 2005). Казеинат натрия был интенсивно гидролизован с применением Рто1ех 6Ь и после снижения рН до 4,5 пролин-специфичной эндопротеазой до достижения значения ΌΗ >20%. После ультрафильтрации фильтрат был обработан нагреванием для инактивации любых оставшихся ферментативных активностей и высушен при распылении. Интактный альфа-лактальбумин (ЛЬЛС) был получен как Вюрите (>90% альфа-лактальбумина) от Эауксо Рообк йИегпайопак 1пс. (Ье 8еиет, ΜΝ); обогащенный триптофаном гидролизат лизоцима (^ЕР8) был получен, как описано в примере 4; синтетический дипептид Зет-Ттр (δΥΝ) был получен, как описано в примере 5; чистый Ь-триптофан (ТКР) был получен как Ь-1тур1орйап-400 от Огбйса, А1теге, Тйе №1йег1апбк.

Тест на протеазную устойчивость содержащих триптофан полипептидов, особенно интактных белков

Для оценки устойчивости белка в желудке человека 5 вес.% раствор интактного белка был проинкубирован с пепсином (8щша; 1 вес.% пепсина по отношению к интактному белку) в течение 2 ч при 37°С в буфере Ме 11уапе (0,2 М лимонная кислота плюс №₂НРО₄), рН 4,0. Степень устойчивости к протеазам была определена как процент белка, который не изменяется после инкубации с пепсином. Не изменяется означает, что молекулярный вес белка не изменяется в результате инкубации с пепсином, процент белка означает площадь под кривой после переваривания, умноженную на 100, и деленную на площадь под кривой до переваривания, площадь под кривой представляет собой площадь белковой полосы, имеющей исходный молекулярный вес, полученную с помощью количественного анализа по применяемому способу (см. ниже). Молекулярные веса сравнивались согласно данным 8Ό8электрофореза с последующим прокрашиванием по протоколу, описанному ниже. После прокрашивания геля было получено цифровое изображение с применением системы ОрОСо ннадтд кукЮт (1кодеп ЫГе Зшепсе; №'№'№Л8одеп-НГе-8с1епсе.сот), после чего проводился количественный анализ выбранных белковых полос с применением программного обеспечения То1а11аЬ ТЬ 100, версия 2006 (Шпйпеаг Иупатюк Ыб.; \\у\уу.попПпеаг.сот) под оболочкой \Утбо\У5 ХР. Согласно этому тесту белок является устойчивым к протеазам, если после инкубации с пепсином остается более чем 50% белка с исходным молекулярным весом.

Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (δΌδ-РАСЕ)

Чистота используемых препаратов лизоцима проверялась с помощью δΌδ-РАСЕ. Все используемые материалы для δΌδ-РАСЕ и прокрашивания были получены от 1пуйтодеп (Саг1кЬаб, СА, И8). Образцы готовили с применением 8Ό8 буфера для образцов, согласно инструкции производителя и разделяли в 12% В18-Тт18 гелях с применением буферной системы ΜΕδ-δΌδ согласно инструкции производителя. Прокрашивание проводили с использованием 8нпр1у В1ие 8аГе 81аш (коллоидный Соотак81е С250). До гидролиза лизоцим проявлялся на геле как одна полоса с молекулярным весом примерно 14 кДа.

ЬС/Μδ/Μδ анализ (жидкостная хроматография с масс-спектрометрией)

Для определения присутствия пептидов, содержащих триптофан (главным образом, ди- и трипептидов), в ферментативных гидролизатах белков, полученных по способу согласно настоящему изобретению, применялся метод НРЬС с масс-спектрометром с ионной ловушкой (Тйегто Е1ес1топ, Вгеба, 1йе №1йет1апб8), соединенный с насосом Р4000 (Тйегто Е1ес1топ, Вгеба, 1йе №1йег1апбк). Образующиеся пептиды были разделены с применением колонки 1пеп8Й 3 ΟΌδ 3, 3 мкм, 150x2,1 мм (Уапап Ве1дшт, Ве1дшт) в комбинации с элюцией градиентом 0,1% муравьиной кислоты в воде Μί11ί О ^бИроте, ВебГогб, ΜА, И8А; Раствор А) и 0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле (Раствор В). Градиент начинался со 100% Раствора А, раствор пропускался в течение 10 мин, затем линейно повышался до 20% раствора В за 25 мин и немедленно возвращался в исходные условия, в которых поддерживался 15 мин для стабилизации. Объем вводимого раствора составлял 50 мкл, скорость тока составляла 200 мкл в мин и температура колонки поддерживалась равной 55°С. Концентрация белка во вводимом образце составляла примерно 50 мкг/мл. Идентификация представляющих интерес пептидов основывалась на времени удержания, протонированности молекулы и применении Μ8/Μ8 для интересующих пептидов, при использовании оптимальной энергии столкновения примерно 30%. Количественное измерение специфических содержащих триптофан пептидов проводилось с помощью метода внешнего стандарта.

Для настройки оптимальной чувствительности в режиме Μ8 и для оптимальной фрагментации в режиме Μ8/Μ8 был использован тетрапептид УУРР (Мв = 410,2) с проведением постоянной инфузии 5 мкг/мл, что обеспечивало протонирование молекулы в режиме Μ8 и оптимальную энергию столкновения около 30% в режиме Μ8/Μ8, с генерацией серий В- и Υ-ионов.

Перед проведением ЬС/Μδ/Μδ ферментативные гидролизаты белков центрифугировали при комнатной температуре при 13000 об/мин в течение 10 мин, после чего супернатант разводили в отношении 1:100 деминерализованной водой, профильтрованной через систему для фильтрации воды Μ^11^ро^е (водой Μί11ίΟ).

Аминокислотный анализ

Содержание аминокислот в плазме крови было проанализировано методом ВЭЖХ (НРЬС) согласно

- 14 021506 уап Бук е! а1. (I. СЬготаФдг. 1993, 620: 143-148), как описано в примерах 6 или 11.

Другие аминокислотные анализы были проведены согласно методу ИсоТад, как описано в Инструкции для операторов системы аминокислотного анализа Лтшо ЛсИ ЛпайЩ 8ук1ет οί ^а!егк (МШогй ΜΑ, υδΑ). Для этого конечные образцы были высушены и прямо превращены в производные с помощью фенилизотиоцианата. Образовавшиеся производные аминокислот были количественно измерены с помощью метода ВЭЖХ, как это описано. Поскольку при обычном кислом гидролизе Тгр и Сук разрушаются, для количественного определения этих двух аминокислот применялись специальные методы. Для предотвращения разрушения Сук во время гидролиза эта аминокислота сначала окислялась до цистеиновой кислоты с помощью перекиси водорода и затем проводилось количественное определение. Анализ триптофана основывался на незначительно модифицированном методе ^а(егк. В этом методе аликвота раствора пептида высушивалась в вакууме и затем гидролизовалась в течение 1 ч при 150°С в атмосфере азота в 4 М метансульфоновой кислоте, содержащей 0,2% триптамина. Продукт реакции прямо количественно измерялся с использованием ВЭЖХ на колонке Α111όΛ ΑΡπη;·! С18 и флуоресцентной детекции.

Степень гидролиза

Степень гидролиза (Иедгее οί Нуйго1ук1к, ИН), получаемая при инкубации с различными протеолитическими смесями, определялась с помощью быстрого теста ОРА (№е1кеп, Р.М.; Ре1егкеп, Ό.; ЭатЪтапп, С. 1тргоуей теПюй ίοΓ йеЮгтиипд ίοοά рго1еш йедгее οί Нуйго1ук1к. 1оигпа1 οί Ροοά 8тепсе 2001, 66, 642-646).

Азот по Кьельдалю

Общий азот по Кьельдалю был измерен с помощью Иоте ПуесОоп Α^^κίκ. Аммиак, освобождающийся из содержащих белок растворов, количественно измерялся при 590 нм с использованием ТесаЮг 5000 Иоте 1п)есйоп 8ук1ет, оборудованной ΈΚΝ Ме11юй Саккейе 5000-040, компьютером РепΙίιιιη 4 с программным обеспечением 8ΘΡΙΑ и автоматическим устройством для забора проб ТесаЮг 5027 Αиΐοкатр1е^. Количество образцов, соответствующее диапазону чувствительности метода (0,5-20 мг/л), помещалось в пробирку для расщепления вместе с 95-97% серной кислотой и ЩекаЪ, и расщеплялось в соответствии с программой в течение 30 мин при 200°С, а затем в течение 90 мин при 360°С. После введения в систему ИΑδТΑК 5000 измерялся пик азота, из которого можно было рассчитать количество измеренного белка.

Распределение пептидов и белков, присутствующих в гидролизатах, по молекулярному весу Анализ распределения пептидов по размеру в образцах белков, обработанных протеазами, проводился с помощью автоматической системы ВЭЖХ, оборудованной насосом высокого давления, устройством для введения образцов, позволяющим вводить 10-100-микролитровый образец, и УФ-детектором, позволяющим измерять поглощение элюата с колонки при 214 нм.

Для этого анализа использовалась колонка 8ирегйех Рерййе НК 10/300 ОБ ^тешкат), уравновешенная буфером 20 мМ фосфат натрия/250 мМ хлорид натрия, рН 7,0. После введения образца (обычно 50 мкл) различные компоненты элюировались из колонки буфером в течение 90 мин при скорости протока 0,5 мл/мин. Систему калибровали с использованием в качестве маркеров молекулярного веса смеси цитохрома С (Мв 13500 Да), апротинина (Мв 6510 Да) и тетра-глицина (Мв 246 Да).

Далее настоящее изобретение иллюстрируется с помощью следующих примеров.

Пример 1

Лизоцим куриных яиц не расщепляется ни пепсином, ни смесью трипсин/химотрипсин

Для оценки его перевариваемости в желудочно-кишечном тракте человека лизоцим куриных яиц инкубировался ш уйго с пепсином и со смесью трипсина и химотрипсина. Обе инкубации проводились при тех значениях рН, которые преобладают в желудке (пепсин) и в двенадцатиперстной кишке (трипсин/химотрипсин). Для этого 5-процентный раствор (по весу) лизоцима инкубировался с ферментами (1% по весу фермента по отношению к лизоциму) в течение 2 ч при 37°С. Для предотвращения значительных изменений рН в результате протекающего гидролиза белка инкубация проводилась в буфере Мс Пуапе (0,2 М лимонная кислота плюс №₂НРО₄). Низкие значения ИН, которые были получены после двухчасового гидролиза при 37°С (см. табл. 1), показывают, что молекула лизоцима не деградирует в условиях, которые имитируют условия переваривания в желудке и в двенадцатиперстной кишке и тощей кишке, поскольку эффективный протеолиз, как ожидается, должен приводить к значению ИН по меньшей мере 10%. Таким образом, остатки триптофана, присутствующие в молекуле интактного лизоцима куриных яиц, не высвобождаются в желудочно-кишечном тракте, подтверждая, таким образом, тот факт, что молекулы триптофана, присутствующие в интактном лизоциме куриных яиц, не могут вносить свой вклад в уровни триптофана в плазме крови вскоре после его употребления.

- 15 021506

Таблица 1. Гидролиз лизоцима пепсином и смесью трипсин/химотрипсин

Фермент	рН в начале	рН в конце	ОН в начале (%)	ОН в конце (%)
Пепсин	2,8	2,4		2,4
Пепсин	3,6	3,2		< 1
Пепсин	4,6	4,3		1,0
			= 0
Трипсин/химотрипсин	4,6	4,3		< 1
Трипсин/химотрипсин	5,9	5,5		<1
Трипсин/химотрипсин	7,2	7,0		1,3

Пример 2

Лизоцим куриных яиц эффективно расщепляется субтилизином при повышенных значениях рН

Для оценки подверженности лизоцима ферментативному гидролизу при нефизиологических значениях рН и нефизиологических ферментативных условиях, раствор лизоцима инкубировался ίη νίίτο с субтилизином микробного происхождения (ЕС 3.4.21.62) при щелочных значениях рН. Для этого 5 вес.% раствор лизоцима инкубировался при рН 7,0, 8,0 и 9,0 с 12,5 мкл Рго1е\ 6Ь на 1 г присутствующего в растворе белка лизоцима. Инкубация проводилась в течение 3 ч при 60°С с постоянным поддерживанием рН на одном значении с помощью 1 М ΝαΟΗ. В конце инкубации были получены слегка мутные растворы без какого-либо значительного осадка. После стадии нагревания для инактивации субтилизина, были определены значения ΌΗ для разных условий инкубации согласно протоколу, описанному в разделе материалы и методы. В противоположность результатам, которые были получены в физиологических условиях (см. пример 1), инкубация в щелочных условиях с использованием субтилизина приводила к полному гидролизу лизоцима. Инкубация при рН 7,0 давала значение ΌΗ 6,3, инкубация при рН 8,0 давала значение ΌΗ 11,2 и инкубация при рН 9,0 давала значение ΌΗ 16,4. Последующий анализ продуктов реакции с помощью δΌδ-ΡΑΟΕ показал, что целая молекула лизоцима деградировала, то есть фрагменты молекулы с большим молекулярными весами в процессе инкубации с субтилизином не сохранились. Кроме того, анализ гидролизата с помощью ВЭЖХ на колонке Сгспунрак СК.+ (ΟαίοοΙ) показал, что даже после продолжительного нагревания при рН 9,0 не происходит значительной рацемизации содержащих триптофан пептидов.

Пример 3

Гидролиз лизоцима с использованием Рго1с\ и идентификация образующихся пептидов

Раствор, содержащий 10 вес.% чистого лизоцима, был доведен до рН 8,2 с помощью ΝαΟΗ и нагрет до 52°С. Гидролиз начинали добавлением 25 мкл Рго1с\/г белка, присутствующего в растворе. В условиях постоянного перемешивания и поддержания значения рН 8,2 гидролиз продолжался в течение 5,5 ч, в результате чего был получен почти прозрачный раствор, не содержащий видимого осадка. После стадии нагревания для инактивации Рго1е\. были взяты образцы для анализа ΌΗ. Полученные значения ΌΗ для раствора составили почти 30%. Прогретый раствор был подвергнут ультрафильтрации через фильтр с границей пропускания 10 кДа для получения совершенно прозрачной жидкости. Прозрачная жидкость использовалась для анализа ЬС/Μδ для определения распределения по молекулярному весу присутствующих в ней пептидов и белков, а также для ионообменной хроматографии.

Для получения картины распределения по молекулярному весу присутствующих в ней пептидов и белков прозрачная жидкость была проанализирована для определения молекулярных размеров, как описано в разделе материалы и методы. Полученные результаты (см. фиг. 3) четко показывают, что почти все пептиды, содержащие аминокислоты с ароматической боковой цепью (то есть триптофан, тирозин и фенилаланин), имеют молекулярный вес меньше 500 Да. С учетом высокого молекулярного веса этих аминокислот можно считать, что большинство этих маленьких пептидов представляет собой либо три-, либо дипептиды.

Анализ ЬС/Μδ был проведен согласно процедуре, описанной в разделе материалы и методы. Выбирая пептиды, содержащие триптофан (ν), в растворе можно обнаружить пептиды Αν, ΟΝν, νίΚ, ΝΑν, ννΑ, νΑν, ΑνΚ, δΕΟΝν и минорные количества пептидов νν и δΚνν. Уровень свободного триптофана в гидролизате после инкубации составил меньше чем 1% от общего содержания триптофана (в лизоциме).

Поскольку ди- и трипептиды легко всасываются с участием переносчиков пептидов, присутствующих в стенке кишечника, не остается сомнений, что остатки триптофана, имеющиеся в таких пептидах, будут быстро всасываться и обеспечивать повышенные уровни триптофана в плазме крови при пероральном употреблении гидролизатов лизоцима настоящего изобретения.

Пример 4

Повышение содержания триптофана в гидролизате

Лизоцим содержит неожиданно большое количество основных остатков аминокислот аргинина и лизина. Кроме того, молекула лизоцима содержит значительное количество кислых остатков глутамата и аспартата. Эти данные были использованы для разработки новаторского и элегантного способа для получения гидролизатов с повышенными отношениями Тгр/ΕΝΑΑ. Однако необходимым условием для этого способа очистки является то, что только очень незначительное количество остатков триптофана

- 16 021506 входит в состав пептидов, которые также содержат остаток аргинина или лизина, или остаток глутамата или аспартата. Как показано в примере 3, специфические условия проведения гидролиза приводят к получению только нескольких содержащих триптофан пептидов, содержащих также остаток аргинина, и к отсутствию пептидов, содержащих триптофан и остаток лизина, глутамата или аспартата.

Теория предсказывает, что максимальное различие по заряду между пептидами, содержащими и не содержащими остаток глутамата или аспартата, может быть достигнуто при значении рН около 3. Максимальное различие по заряду между пептидами, содержащими и не содержащими остаток аргинина или лизина, может быть достигнуто при значении рН около 5.

Для иллюстрации разделяющей способности этого подхода был получен гидролизат лизоцима по методике, описанной в примере 3. После этого рН гидролизата был доведен до рН 3,1 с помощью уксусной кислоты, и примерно 0,5 г белка было нанесено на колонку с 15 мл носителя δΡ §ербаго8е РР (ОБ НеаНЬсаге, О|едет. Ве1дшт), уравновешенную 20 мМ цитрата натрия, рН 3,1. После промывания колонки одним объемом натрий-цитратного буфера для удаления большинства пептидов, включающих глутамат или аспартат, буфер элюции был заменен на 20 мМ натрий-цитратный буфер с рН 5,1. При промывании колонки тремя объемами последнего буфера элюировался набор пептидов, содержащих триптофан. Согласно данным анализа ЬС/Μδ, в элюате в больших количествах присутствовали дипептид Αν и трипептиды ΟΝν, ΝΑν, ννΑ, νΑν, и в небольшом количестве пентапептид δΡΟΝν. Аминокислотный анализ разных фракций, элюируемых при рН 5,1, показал, что избирательная элюция обеспечивает получение раствора с молекулярным отношением Тгр/ΡΝΑΑ 1,75 и выходом триптофана почти 30%. Менее избирательная элюция обеспечивает получение раствора с молекулярным отношением Тгр/ΡΝΑΑ 0,4 и выходом триптофана 70%. После этого колонку промывали тремя объемами 20 мМ цитрата натрия, рН 7,1. Согласно данным ЬС/Μδ на этой стадии элюируются содержащие аргинин пептиды νίΚ, ΑνίΚ и, неожиданно, пептид νν.

Конечное промывание колонки 1 М ΝαΟΗ, водой и 1 М уксусной кислотой подготавливает колонку для следующего использования.

Пример 5

Химический синтез дипептида δе^-Т^р

Дипептид δе^-Т^р был синтезирован согласно стандартному методу синтеза пептидов. На первой стадии Ζ^γ-ΟΗ и Тгр-ОМе были соединены с помощью карбоангидридного метода (1. Αт. СНет. δο^ 1967, 5012) для получения защищенного (по концевым группам) дипептида Ζ-δе^-Т^р-ΟΜе. Для этой цели Тгр-ОМе.НС1 суспендировали в тетрагидрофуране (ТНР), после чего был добавлен ΐνметилморфолин (ΝΜΜ). Смесь перемешивали в течение 1 ч, после чего её добавляли к раствору Ζ^γ в смеси тетрагидрофуран/диметилформамид (ТНР/ΌΜΡ). К смеси был добавлен второй эквивалент ΝΜΜ, после чего смесь охлаждали до -15°С. К смеси добавляли изобутилхлорформ(и)ат с такой скоростью, чтобы внутренняя температура не превышала -15°С. После этого смесь перемешивали 3 ч, оставляли нагреваться до комнатной температуры и удаляли осадок ΝΜΜ.ΗΟ путем фильтрации. Фильтрат выдерживали в течение ночи при 4°С, после чего образовавшийся дополнительный преципитат удаляли фильтрованием и концентрировали фильтрат, упаривая его под вакуумом. Полученный материал очищали колоночной хроматографией (δίΟ₂, этилацетат/гептан). Объединенные фракции концентрировали, промывали водой для удаления следов оставшегося ΌΜΡ и концентрировали под вакуумом.

На второй стадии был проведен ферментативный гидролиз Ζ-δе^-Т^р-ΟΜе с использованием Л1са1аке 2.5 Ь ΌΧ (Ιηΐ. 1. Рерббе Рго!еш Кек. 1990, 52) с последующим каталитическим гидрогенолизом с выходом нужного пептида в виде беловатого твердого вещества. Для этой цели очищенный Ζ-δе^-Т^р-ΟΜе растворяли в 1ВиОН и воде и добавляли Α1са1а5е 2.5 Ь ΌΧ (Νονοζνιικκ, Вадкуаегб, Эешпагк). Смесь перемешивали, пока (почти) весь исходный материал не был переработан. После этого смесь концентрировали под вакуумом и экстрагировали осадок водой при рН 7. Водную смесь экстрагировали этилацетатом для удаления остатков исходного материала, после чего подкисляли водную фазу. Желаемый продукт, то есть Ζ-δе^-Т^р-ΟΗ, был выделен экстракцией этилацетатом, экстракт был высушен над сульфатом натрия и сконцентрирован под вакуумом.

На третьей стадии был получен дипептид δе^-Т^р-ΟΗ. Для этого концентрированный Ζ-δе^-Т^р-ΟΗ растворяли в МеОН и воде (1:1), добавляли Р6/С и перемешивали смесь при избыточном давлении (5 бар) в атмосфере водорода. После завершения реакции катализатор и большинство продукта отделяли фильтрацией и отбрасывали фильтрат. Фильтр интенсивно промывали водой Μί11ίρ и концентрировали фильтрат под вакуумом, получая дипептид δе^-Т^р-ΟΗ в виде белого или беловатого твердого вещества. Дополнительную очистку проводили путем перемешивания продукта в смеси ацетон-вода и отделения пептида фильтрацией. Полученный таким способом продукт является пригодным для перорального употребления.

Пример 6

Влияние разных источников триптофана на отношения Тгр/ΡΝΑΑ в плазме крови и настроение здоровых волонтеров

Целью настоящего исследования был анализ уровней Тгр/ΡΝΑΑ в плазме крови и настроения здо- 17 021506 ровых волонтеров после приема различных препаратов, содержащих триптофан. Было исследовано влияние следующих препаратов:

интактный альфа-лактальбумин (см. материалы и методы); гидролизованный казеинат (БЫ >20%; см. материалы и методы);

обогащенный триптофаном гидролизат лизоцима с высоким отношением Ττρ/ΕΝΑΑ (см. пример 4); синтетический дипептид 8^ (пример 5); свободный Ь-триптофан (см. материалы и методы).

В исследовании участвовало 18 здоровых студентов (9 мужчин и 9 женщин: возраст от 18 до 30 лет). Критериями исключения из участия в исследовании были хронические и острые заболевания, история психиатрических и других болезней, употребление лекарств или наркотиков, употребление алкоголя (> 2 доз в день), метаболические, гормональные заболевания или заболевания кишечника и нерегулярное питание или ненормальный стиль питания (оценивались по анкетированию о состоянии здоровья и образе жизни). Участвующие в эксперименте субъекты имели нормальный индекс массы тела (Войу-Мазз 1пйех, ВМ1 в кг/м² между 20-25), женщины опрашивались относительно пользования контрацептивами. Женщины принимали участие в эксперименте во время средней стадии фолликулярной фазы (дни 4-10), если участницы пользовались контрацептивами, они принимали участие в эксперименте, когда действительно принимали таблетки. Участники эксперимента были некурящими и не употребляли какой-либо алкоголь перед и во время исследования. Все участники исследования подписали информированное согласие (1п£огшей Сопзеп! Еогш). Исследование проводилось в соответствии с принципами европейского сообщества по правилам проведения качественных клинических исследований (ЕС ρτΐπ^ρ^ о£ Соой СНтса1 РгасИсе, ССР), принятыми 52-й Генеральной ассамблеей Международной медицинской ассоциации (^МА, ЕЛпЬигдЬ, 8со11апй, Ос1оЬег 2000).

Участников исследования инструктировали не принимать пищу в течение ночи, разрешались только вода или чай без сахара. Во время пяти экспериментальных утренних сессий участники посещали лабораторию для мониторинга концентраций Ττρ/ΕΝΑΑ в плазме крови и настроения после употребления напитка, содержащего разные концентрации Ττρ или ΕΝΑΑ. Порядок употребления разных напитков был взаимно сбалансирован, и четыре экспериментальных дня были разделены периодом в одну неделю. В утро каждого эксперимента участникам давали 312 мл напитка, содержащего разные концентрации триптофана (Ττρ) или ΕΝΑΑ (табл. 2). Все напитки содержали 0,10 г подсластителя (ацесульфама) и были разведены чистой водой до объема 312 мл. Проводящий исследование ассистент не знал состава напитков, употребляемых участниками.

Таблица 2. Белковый/аминокислотный состав применяемых напитков

Источник белка	Гидролизат казеина	Интактный альфа- лактальбумин	Гидролизат лизоцима, обогащенны й Тгр	Зег- Тгр	Свободный Ь-Тгр
Используемый код	КЕЕ	АЬАС	ΨΕΡ3	8ΥΝ	ΤΚΡ
граммы	20	15	300 мл раствора	1,20	0,82
Тгр(г)	0,40	0,80	0,80	0,80	0,80
Тгр/ЬИАА (молярное)	0,04	0,10	и	СО	со

Образцы крови отбирали дважды - перед и через 15, 30, 60, 90, 120, 180 и 210 мин после приема напитков в 5 мл вакуумированные пробирки, содержащие гепарин натрия, после чего центрифугировали при 5000 об/мин в течение 5 мин при 4°С. Полученные супернатанты смешивали с сульфосалициловой кислотой (4 мг/100 мкл) и замораживали и хранили при -80°С до проведения анализа. Аминокислотный анализ плазмы проводили методом ВЭЖХ на колонке 2-3 мкм В1зсЬо£ 8ρЬе^^зо^Ь ОБ8 II, как описано уап Еук е! а1. (I. Сйтоша1о§г. 1993, 620: 143-148). Отношения Ττρ/ΕΝΑΑ в плазме рассчитывали путем деления молярной концентрации триптофана в плазме на сумму молярных концентраций в плазме больших нейтральных аминокислот валина, изолейцина, лейцина, тирозина и фенилаланина. Статистический анализ проводили с помощью многомерного и одномерного дисперсионного анализа (ΜΑΝΟνΑ и ΑΝΟνΑ) данных повторных измерений с использованием программного обеспечения Сепега1 Ыпеат Мойе1 (ОЬМ: 8Р88 12.0 для \\лпс1о\уз). Все статистические данные рассчитывались с уровнем значимости Р = 0,05.

Значения Ττρ/ΕΝΑΑ в плазме крови

Прежде всего дисперсионный анализ повторных измерений с учетом влияния Условия и Времени для каждого субъекта на отношение Ττρ/ΕΝΑΑ в плазме крови выявил достоверный эффект Времени и Условия и достоверное взаимодействие Условие х Время. Максимальные достоверные увеличения отношения Ττρ/ΕΝΑΑ в плазме были обнаружены (см. фиг. 1) после употребления 8ΥΝ (увеличение на 263% через 60 мин) и ΑΈΡ8 (увеличение на 255% через 90 мин). Увеличение отношения Ττρ/ΕΝΑΑ после употребления этих двух продуктов происходило достоверно быстрее и достигало больших значений, чем после употребления ΤΡΡ (увеличение на 191% через 120 мин) или ΑΕΑΟ' (увеличение 67% после 120 мин). После употребления РЕЕ наблюдалось достоверное снижение отношения Ττρ/ΕΝΑΑ, начиная с 60 и до 210 мин (-27%).

- 18 021506

Обнаруженное нами увеличение отношения Ττρ/ΕΝΑΑ на 255% после употребления νΕΡδ значительно превышает обнаруженное ранее увеличение на 50-70% после употребления интактного альфалактальбумина ((Маткик е1 а1., 2000; Вооу е1 а1., 2006) и все обнаруживаемые ранее увеличения на 20-45% при употреблении других пищевых продуктов, подобных углеводам ((Магкик, 2003). Поскольку считается, что 40-50% изменение отношения Ττρ/ΕΝΑΑ в плазме достаточно для изменения уровней триптофана и синтеза и высвобождения 5-НТ в мозге (Магкик е1 а1., 2000), можно ожидать, что обнаруженное увеличение на 255% будет вызывать гораздо большее увеличение доступности триптофана и 5-НТ в мозге, что, как следствие, может также приводить к более значительному высвобождению функционально активного 5-НТ в мозге.

Профиль настроения (Ртой1е о£ Мооб δΙΟΌΚ, ΡΟМδ)

Изменение настроения у разных участников эксперимента измеряли с применением версии бумага-и-карандаш - сокращенной голландской версии анкеты Ртой1е о£ Мооб δΕι^κ (\ν;·ι16 аиб МейеиЬегдЬ, №6 Τί)ά^Ητ Ркусйо1, 1990, 45: 86-90) в виде визуальной аналоговой шкалы (νΑδ) в диапазоне от сильно не согласен до сильно согласен. Опросник ΡΟМδ включает 5 разных подразделов для настроения, начиная от Злости, Депресии, Усталости и Напряженности, которые указывают на плохое настроение, до Бодрости, указывающей на хорошее настроение.

Дисперсионный анализ повторных измерений с учетом влияния факторов Условия и Времени для каждого субъекта на общую оценку настроения выявил достоверное влияние Времени и достоверное взаимодействие Условие х Время, указывая на то, что изменение настроения во времени достоверно различается в разных условиях. Сравнимое улучшение настроения было обнаружено через 60 мин после употребления νΕΡδ и ΤΚΡ, но только в случае с νΕΡδ настроение и дальше улучшалось до 210 мин после употребления напитка по сравнению с ΤΚΡ. В отличие от этого, изменений настроения после употребления ΚΕΡ и ЛБЛС обнаружено не было. Отсутствие влияния на настроение после приема интактного альфа-лактальбумина сравнимо с данными предшествующих исследований, в которых были обнаружены умеренные положительные эффекты на настроение после приема интактного альфалактальбумина и только у восприимчивых к стрессу субъектов в условиях острого стресса (Магкик е1 а1., 2000; Магкик е1 а1., 2000, Магкик, 2003). Хотя похоже, что настроение также улучшается после употребления δΥΝ, этот эффект был недостоверным при данной постановке эксперимента.

Полученные результаты позволяют предполагать, что значительное увеличение на 255% отношения Ττρ/ΕΝΑΑ в плазме может быть достаточным для улучшения настроения нормальных невосприимчивых к стрессу субъектов. Основываясь на предшествующих результатах можно ожидать, что эти положительные эффекты обогащенного триптофаном гидролизата лизоцима на настроение будут даже больше у восприимчивых к стрессу людей в условиях сильного умственного стресса (Магкик, 2003). В противоположность нашим ожиданиям, не было обнаружено достоверных улучшений настроения после употребления синтетического дипептида. Этот неожиданный результат может быть связан с конкретной постановкой эксперимента или с различиями в биодоступности триптофана из этих разных источников. Таблица 3. Изменения в концентрациях аминокислот (мкмоль/л) в плазме крови после употребления гидролизата казеина (ΚΕΡ), интактного альфа-лактальбумина (ΑΕΑΟ') или обогащенного триптофаном гидролизата лизоцима (νΕΡδ)

Время (мин)

Аминокислота	Условие	0	30	60	90	120	180	210
Июлей цин	КЕР	0,07	0,10	0,18	0,15	0,12	0,09	0,08
	АЬАС	0,08	0,12	0,20	0,22	0,18	0,12	0,11
	νΕΡδ	0,07	0,09	0,09	0,14	0,09	0,08	0,09
Лейцин	КЕР	0,12	0,19	0,31	0,26	0,22	0,17	0,16
	АЬАС	0,13	0,22	0,37	0,38	0,28	0,21	0,20
	νΕΡδ	0,13	0,14	0,14	0,13	0,13	0,13	0,14
Фенилаланин	ΚΕΡ	0,06	0,08	0,10	0,08	0,08	0,06	0,06
	АЕАС	0,07	0,09	0,11	0,10	0,09	0,07	0,07
	νερ$	0,07	0,07	0,07	0,06	0,10	0,06	0,07
Тирозин	ΚΕΡ	0,06	0,07	0,12	0,11	0,09	0,07	0,07
	АЬАС	0,06	0,08	0,12	0,12	0,10	0,08	0,08
	νΕΡδ	0,06	0,07	0,07	0,06	0,06	0,06	0,06
Валин	ΚΕΡ	0,24	0,28	0,45	0,42	0,38	0,32	0,30
	АЕАС	0,26	0,30	0Д8	0,42	0,35	0,29	0,28
	νΕΡδ	0,26	0,27	0,25	0,25	0,25	0,25	0,26
Триптофан	ΚΕΡ	0,06	0,07	0,08	0,08	0,07	0,06	0,05
	АЬАС	0,07	0,09	0,18	0,23	0,19	0,13	0,12
	νΕΡδ	0,07	0,13	0,21	0,23	0,20	0,14	0,13
ΕΝΑΑ	ΚΕΡ	0,52	0,67	1,14	1,01	0,86	0,73	0,65
	АЕАС	0,60	0,82	1,14	1,22	1,10	0,86	0,82
	νΕΡδ	0,62	0,60	0,65	0,60	0,68	0,55	0,64
Тгр/ΕΝΑΑ	ΚΕΡ	0,11	0,09	0,08	0,08	0,08	0,08	0,08
	АЬАС	0,12	0,12	0,15	0,18	0,2	0,18	0,17
	νΕΡδ	0,11	0,19	0,36	0Д9	0,35	0,25	0,22

Таблица 4. Изменения концентраций аминокислот (мкмоль/л) в плазме крови во времени после употребления свободного Ь-Ττρ (ΤΚΡ) или синтетического дипептида 8\ν (8ΥΝ)

Время (мин)

Аминокислота	Условие	0	30	60	90	120	180	210
Изолейцин	ТКР	0,07	0,07	0,07	0,06	0,07	0,07	0,07
	5ΥΝ	0,06	0,07	0,06	0,06	0,06	0,06	0,07
Лейцин	ТИР	0,13	0,13	0,12	0,12	0,12	0,12	0,13
	5ΥΝ	0,11	0,14	0,12	0,12	0,12	0,12	0,13
Фенилаланин	ТКР	0,07	0,07	0,06	0,06	0,06	0,06	0,06
	5ΥΝ	0,06	0,07	0,06	0,06	0,06	0,06	0,06
Тирозин	ТКР	0,06	0,06	0,06	0,05	0,06	0,05	0,05
	5ΥΝ	0,05	0,06	0,05	0,05	0,05	0,05	0,05
Валин	ТКР	0,25	0,25	одз	0,22	0,23	0,22	0,23
	5ΥΝ	0,21	0,26	0,22	0,22	0,22	0,21	0,23
Триптофан	ТКР	0,07	0,07	0,17	0,18	0,18	0,13	0,11
	8ΥΝ	0,06	0,13	0,21	0.18	0,15	0,11	0,10
ЫМАА	ТКР	0,62	0,59	0,55	0,50	0,58	0,52	0,53
	5ΥΝ	0,50	0,58	0,48	0,47	0,45	0,48	0,54
Тгр/ЪМАА	ТКР	0,11	0,12	0,29	0,31	0,32	0,24	0,20
	5ΥΝ	0,11	0,22	0,40	0,37	0,31	0,22	0,19

Пример 7

Г идролиз больших количеств лизоцима

При гидролизе больших количеств лизоцима использовался способ, описанный в примере 3, в который были внесены некоторые незначительные модификации. Раствор, содержащий 7,3 вес.% чистого лизоцима, нагревался до 65°С, после чего значение рН доводили до 8,2 с помощью ΝαΟΗ. Г идролиз начинали добавлением 25 мкл Рто!ех 6 Ь/г сухого вещества. Гидролиз продолжался в течение 2 ч при постоянном перемешивании и поддержании рН 8,2 и при температуре 53°С. После этого рН раствора увеличивали до 9,0 и проводили инкубацию еще 3,5 ч, в результате чего был получен раствор с небольшим осадком. После этого рН раствора снижали до 4,5 и раствор охлаждали до температуры ниже 4°С. Для получения полностью прозрачного раствора жидкость фильтровали через фильтр Ζ 2000 П11ег (Ра11), после чего избыток воды и солей удаляли нанофильтрацией. Полученный концентрат подвергали υΗΤ обработке (сверхвысокой температурой) в течение 7 с при 120°С, выпаривали и окончательно высушивали с помощью распыления для получения гидролизата лизоцима в сухом виде. Полученный таким образом продукт имел молярное отношение Ττρ/ΕΝΑΑ около 0,19.

Пример 8

Приготовление напитка, содержащего гидролизат лизоцима

Следующий рецепт иллюстрирует приготовление земляничного напитка, не содержащего жиров и содержащего гидролизат лизоцима. К 10 г порошка гидролизата лизоцима (полученного согласно примеру 7) были добавлены 40 г глюкозы, 2,4 г лимонной кислоты, 0,38 г яблочной кислоты, 0,15 г сукралозы и 0,15 г земляничного ароматизатора (Ви!еге88еисе, Ζааηάат,ΤЬе №!Ьет1аи48). Эта смесь порошков сразу растворялась в 1 л воды для получения готового к употреблению напитка с высоким отношением Ττρ/ΕΝΑΑ и высоким отношением Τυγ/ΒΕΆΛ. Данная смесь порошков пригодна, например, для приготовления пакетированных форм. Пакетированные жидкие продукты могут быть получены с помощью разнообразных известных способов.

Пример 9

Влияние гидролизата лизоцима на решение задач после стресса у чувствительных к стрессу и устойчивых к стрессу волонтеров

Целью данного исследования было сравнение влияния гидролизата лизоцима, полученного согласно способу, описанному в примере 7, и плацебо (гидролизат белка казеина, см. пример 6) на уровни Ττρ/ΕΝΑΑ в плазме крови и, как следствие, на выполнение тестов после стресса. Используемые тесты известны как тесты на бдительность (внимательность) и на зрительно-моторный контроль у индивидуумов.

В данном исследовании принимало участие сорок индивидуумов, двадцать мужчин и двадцать женщин. На основе данных предварительного опроса половина группы была классифицирована как устойчивая к стрессу, а вторая половина - как чувствительная к стрессу. Критерии для участия индивидуумов в исследовании или для исключения из исследования, а также общие требования для проведения эксперимента были такими же, как описанные в примере 6. Схема проведения эксперимента представлена на фиг. 4, и схема одного типичного дня эксперимента представлена на фиг. 5.

В утро проведения исследования индивидуумы прибывали в лабораторию. После этого они получали либо напиток, содержащий гидролизат лизоцима, либо плацебо, то есть напиток, содержащий гидролизат казеина. Состав исследуемого напитка и напитка плацебо приведены в табл. 5.

- 20 021506

Таблица 5. Состав применяемых напитков

Источник белка	Гидролизат казеина	Гидролизат лизоцима
сокращение	р1с	Тгр-НуЗг
г порошка/300 мл	13,6	14,4
Вода	286 г	285 г
Подсластитель	0,1 я	0,1 6
г Тгр/300 мл ОтношениеТгр/ΕΝΑΑ	0,4	0,8
(молярное)	0,04	0,19

Через 90 мин после употребления 300 мл напитка были взяты образцы крови для определения уровней Ττρ/ΕΝΑΑ (см. пример 6). После этого как группе устойчивых к стрессу, так и группе чувствительных к стрессу волонтеров предлагали выполнить тест, после чего подвергали стрессу. Этот стресс состоял из арифметической задачи, которая должна была выполняться в условиях шума. Субъектов убеждали, что наличие или отсутствие шума зависит от выполнения ими теста. На самом деле, арифметические задачи были построены таким образом, чтобы все попытки всех субъектов оказались неудачными. Известно, что такая постановка эксперимента вызывает психологический стресс и воспринимается как неконтролируемая (Ре1ег8, М.Ь., ОойаетГ, О.Ь.К, ВаШеих, Κ.Ε. е! а1. (1998). Сагйюуа8си1аг апй са!ес1ю1атше ге8|эо8е 1о еxρе^^теηΐа1 81ге88: еГГесй о! теп1а1 еГГоП апй со1Иго11аЫ1Пу. Р8ускопеигоепйосгто1оду. 23, 1-17). После арифметической задачи был повторно выполнен первый тест для количественной оценки влияния стресса на выполнение теста под влиянием действующих отношений Ττρ/ΕΝΑΑ в крови.

Проводимые тесты были тестом Маквортса с часами (Маск^ойк С1оск 1е81 (Маск^ойк, Ν. (1948) Τке Ьтеакйо^п оГ ущПапсе йитшд ρ^о1опдей У18иа1 8еагск. Оиаг! 1 Εχρ Р8уск. 1, 6-21)) и Критическим тестом на Слежение (Спйса1 ΤπκΓίιΐβ Τа8к (1ех Н.К. е! а1., (1966) Α спксаГ' Гтаскшд 1а8к Гог тап-тасЫпе ге8еагск ге1аГей Го Гке оρе^аΐо^'8 еГГесйуе йе1ау Рте. ΝΑδΑ СопГгасГ Κορ ΝΑδΑ СК.:1-105)).

Тест МаскетотГЪ С1оск Το81 широко применяется для оценки бдительности, внимательности и концентрации в течение длительного периода времени. Субъекты сидят перед экраном компьютера, на котором изображено 60 расположенных по кругу точек, изображающих секундные отметки на часах. Точки вспыхивают на короткое время в направлении движения часовой стрелки со скоростью одна точка каждые 500 мс. Обычно вращение происходит по одному скачку (по одной точке). Субъектам объясняют, что изредка, с нерегулярными интервалами, движение происходит двойным скачком (через точку), то есть одна точка в нормальной последовательности пропускается. При этом субъект должен нажать на кнопку так быстро, как только возможно. В целом, в течение 45-минутного теста происходит тридцать таких событий. В течение каждого следующего 15-минутного периода происходит по десять событий с интервалами от 8 с до 7,2 мин.

Тест на слежение СпРса1 ΤπκΚίιΐβ Τа8к применяется как тест на перцептивно-моторные способности, который позволяет количественно оценить способность контролировать появляющийся сигнал об ошибке в задаче на компенсаторную перцептивно-моторную координацию первого порядка. Во время выполнения этого теста субъект должен контролировать нестабильный курсор на экране компьютера с помощью чувствительного джойстика (ручки управления). Ошибки проявляются как горизонтальные отклонения курсора от средней точки по горизонтальной линейной шкале. Субъект должен стараться удерживать нестабильный курсор в центре оси, чтобы свести отклонение к нулю, постоянно делая компенсирующие движения джойстиком. Частота отклонений курсора увеличивается как стохастическая, линейная функция от времени, так что субъекту приходится делать компенсаторные движения с прогрессивно увеличивающейся частотой. Кроме того, компенсаторные ответы субъекта увеличиваются по частоте с увеличивающейся лаг-фазой (ответ добавляется, а не вычитается из ошибки), вследствие чего контроль теряется. Частота, при которой субъект теряет контроль является критической частотой. Тест повторяется пять раз и рассчитывается средняя критическая частота без учета самого низкого и самого высокого значения как зависимая переменная данного теста.

Отношения Ττρ/ΕΝΑΑ в плазме, измеренные через 90 мин после употребления напитка, выявили достоверное (Р<0,0001) влияние используемых экспериментальных условий на изменения отношения Ττρ/ΕΝΑΑ в плазме. Прием гидролизата лизоцима (Ττρ-куйт) увеличивал значение Ττρ/ΕΝΑΑ в плазме до 0,25 (мкмоль/л). Прием гидролизата казеина (ρ1^') - до отношения Ττρ/ΕΝΑΑ 0,08 (мкмоль/л) (фиг. 6). Значения для концентрации каждой исследуемой аминокислоты представлены в табл. 6.

Таблица 6. Концентрации аминокислот (мкмоль/л) после употребления (ρ1Χ') или гидролизата лизоцима (Ττρ-куйт)

	Туг	Уа1	Не	РЬе	Ьей	Тгр	ШЛА	Тгр/Ι.ΝΑΑ
р1с	90	315	107	63	168	60	744	0,082
Тгр-Ьу4г	73	266	120	58	152	167	670	0,250

После употребления гидролизата казеина выполнение обеими группами индивидуумов теста Маск\уог1к С1оск Το81 достоверно ухудшилось после стресса. Однако употребление богатого триптофаном гидролизата лизоцима предотвращало такое ухудшение выполнения теста в устойчивой к стрессу группе. Совершенно неожиданно богатый триптофаном гидролизат лизоцима не предотвращал такого

- 21 021506 ухудшения выполнения теста в чувствительной к стрессу группе. Полученные данные представлены в виде графика на фиг. 7.

В тесте СпБса1 Τπκ1<ίη§ Τ;·ΐδ1< значение лямбда СТ показывает конечный уровень сложности, который был достигнут субъектами. Чем выше значение лямбда СТ, тем лучше контроль. Данные, полученные в этом исследовании, показывают, что после стресса значение лямбда СТ было достоверно выше после употребления богатого триптофаном гидролизата. Среди устойчивых к стрессу индивидуумов наблюдалось увеличение значений на 16% по сравнению со значениями, полученными при использовании плацебо. Совершенно неожиданно в этом тесте значения лямбда СТ в группе чувствительных к стрессу индивидуумов не показали достоверных различий между богатым триптофаном гидролизатом и плацебо.

Пример 10

Устойчивость к протеазам лизоцима и альфа-лактальбумина

Вместе с бета-лактоглобулином альфа-лактальбумин составляет основную массу белков молочной сыворотки. Благодаря своему высокому отношению Ττρ/ΕΝΑΑ изолированные фракции альфалактальбумина, а также гидролизаты альфа-лактальбумина являются популярными для повышения уровней триптофана в плазме крови. Хотя альфа-лактальбумин и лизоцим куриных яиц оба имеют необычно высокие отношения Ττρ/ΕΝΑΑ, в других отношениях эти две молекулы являются совершенно разными. Согласно настоящему изобретению, для поддержания высокого отношения Ττρ/ΕΝΑΑ в плазме крови в течение длительного времени молекула с высоким отношением Ττρ/ΕΝΑΑ должна быть устойчивой к пепсину. Здесь демонстрируем, что в отличие от лизоцима куриных яиц альфа-лактальбумин не является устойчивым к пепсину.

Это было показано в следующем эксперименте. Для имитации условий, имеющихся в желудке человека, 5 вес.% растворы лизоцима и белка молочной сыворотки (Βίρτο от Эах'йсо) инкубировались с пепсином (1 вес.% пепсина Зщта/вес лизоцима или белков молочной сыворотки) в течение 2 ч при 37°С при рН 4 в буфере Ме 1капе (0,2 М лимонная кислота плюс Ν;·ι₂ΗΡΘ₄). После инкубации оба раствора нагревали в течение 5 мин при 80°С для остановки реакции и небольшие аликвоты разделяли с помощью δΌδ-ΡΑΟΕ (см. материалы и методы) для оценки целостности различных молекул, обработанных пепсином.

Фиг. 9 четко показывает, что количество интактного лизоцима куриных яиц недостоверно уменьшилось после инкубации с пепсином в кислой среде. Из белков молочной сыворотки беталактоглобулина и альфа-лактальбумина бета-лактоглобулин остался практически интактным, а альфалактальбумин почти полностью деградировал. Из этого следует, что как лизоцим, так и беталактоглобулин являются устойчивыми к протеазам согласно данным теста, описанного в разделе материалы и методы, и что альфа-лактальбумин не является устойчивым к протеазам. Это говорит о том, что в отличие от лизоцима альфа-лактальбумин не может считаться подходящим источником связанного триптофана в составе полипептидов. Несмотря на то, что бета-лактоглобулин является устойчивым к деградации пепсином, эта молекула не является подходящим донором триптофана из-за своего очень низкого отношения Ττρ/ΕΝΑΑ (0,04).

Пример 11

Пролонгирование высоких уровней Ττρ/ΕΝΑΑ с помощью комбинации гидролизата лизоцима с интактной молекулой

Для демонстрации преимущества комбинации композиции связанного триптофана в составе пептидов и связанного триптофана в составе полипептидов было проведено исследование, в котором участвовали 15 здоровых индивидуумов. Критериями для исключения были хронические и текущие болезни на усмотрение исследователя, история психиатрических заболеваний, прием селективных ингибиторов обратного захвата серотонина (88ΚΙ), прием пищевых добавок, действие которых направлено на центральную нервную систему, таких как добавки, содержащие триптофан, эфедрин или зверобой, аллергия на куриные яйца, злоупотребление наркотиками, участие в любом другом исследовании, включающим употребление находящихся на стадии исследования или продвижения на рынок продуктов, непереносимость искусственных подсластителей, любое желудочно-кишечное заболевание (история болезни), которое влияет на функцию желудочно-кишечного тракта, на усмотрение исследователя, прием лекарств, мишенью которых является желудочно-кишечный тракт, таких как антациды. Наконец, для женщин критерием исключения также являлись беременность или применение не рекомендованного медициной метода контрацепции.

Процедура

Исследование было проведено согласно схеме рандомизированного двойного слепого перекрестного исследования с перерывом между приемами разных препаратов по меньшей мере в три дня.

Во время трех экспериментальных утренних сессий субъекты посещали лабораторию для мониторирования у них отношений Ττρ/ΕΝΑΑ в плазме крови после употребления напитков, содержащих либо 6 г интактного лизоцима, либо 6 г гидролизата лизоцима, либо 6 г смеси гидролизата и интактного продукта. Напитки подавались как стерильные продукты в бутылочках с соломинками. Интактный лизоцим был получен как Эеко/уте О. Гидролизат был получен, как описано в примере 7, а смесь включала 30

- 22 021506 мол.% триптофана в виде гидролизата и 70 мол.% триптофана в виде интактного лизоцима. Все напитки содержали 6 г происходящего из лизоцима белка, 0,10 г подсластителя (ацесульфама) и были разведены чистой водой до объема 300 мл. Проводящий исследование ассистент не знал состава напитков, употребляемых участниками.

Субъекты приходили в лабораторию от 8 до 9 ч утра и не ели перед этим по меньшей мере 8 ч. В недоминирующую руку субъектам вводили гибкую канюлю для взятия крови. Образцы крови брали перед (ΐ = 0) и после употребления одного из трех экспериментальных напитков в моменты времени ΐ = 15, 30, 60, 90 120, 180, 210 и 240 мин после употребления для измерения отношений Тгр/ЬЫАА в плазме крови. В течение этих 240 мин запрещалось употреблять любую пищу или напитки, за исключением воды.

Измерения плазмы

Примерно 5 мл крови собирали в пробирку с гепарином лития, перемешивали и немедленно помещали на лед. После этого образцы центрифугировали и 750 мкл плазмы смешивали с 5сульфосалициловой кислотой (4 мг/100 мл плазмы).

Полученные растворы центрифугировали при 13000 об/мин в течение 5 мин и к 20 мкл супернатанта добавляли 40 мкл внутреннего стандарта (160 мг альфа-аминоадипиновой кислоты в 2 л 1,2 мМ НС1).

Добавляли 50 мкл боратного буфера (из набора \ν;·ι^Γ5 АссО.Тад кН ай пг. 186003836), 40 мкл 0,4 М ЫаОН и 20 мкл реагента (из набора \νη^Γ5 АссО.Тад кй ай пг. 186003836), перемешивали и нагревали в течение 10 мин при 55°С. После этого 1 мкл вносили в колонку и проводили анализ, как описано νаη Еук е1 а1. (I. СЪтотаФдт. 1993, 620: 143-148).

Результаты

Отношение Тгр/БЫАА в плазме в зависимости от времени при употреблении трех разных напитков показано на фиг. 10. Все три напитка обеспечивали увеличение отношения Тгр/ΕΝΆΆ. Самое быстрое (в пределах 15 мин) и самое крутое увеличение наблюдалось после употребления гидролизата лизоцима. Интактный лизоцим обеспечивал гораздо более медленное увеличение отношения Ттр/ЬЫАА, но и снижение отношения Ттр/ЬЫАА во времени было гораздо более медленным. Смесь интактного и гидролизованного лизоцима обеспечивала промежуточную картину.

При анализе повторных измерений все три напитка демонстрируют достоверно различающуюся зависимость от времени (Р<0,001), что говорит о том, что все три кривые имеют достоверно разную форму. Следует отметить, что все три продукта обеспечивают абсолютно одинаковые значения площади под кривой, что говорит о том, что как гидролизат лизоцима, так и интактный лизоцим полностью расщепляются и поступают в кровь.

Пример 12

Комбинирование гидролизата лизоцима и интактного лизоцима улучшает вкус конечного продукта

При смешивании гидролизата лизоцима с интактной молекулой было отмечено значительное изменение во вкусовых ощущениях от конечного продукта. Были приготовлены смеси гидролизата и интактной молекулы в следующих отношениях в конечной концентрации 4 г/200 мл воды:

100% гидролизат лизоцима

70% гидролизат лизоцима - 30% лизоцим

50% гидролизат лизоцима - 50% лизоцим

30% гидролизат лизоцима - 70% лизоцим.

Во всех трех комбинациях конечная молярная концентрация триптофана была абсолютно одинаковой. Гидролизат был получен, как описано в примере 7, в качестве интактного лизоцима использовался гранулированный продукт Эеко/уше О.

Тогда как вкус гидролизата в чистом виде был слегка горьковатым, добавление негидролизованного продукта все больше и больше маскировало горький оттенок вкуса и компенсировало его продолжительным слегка сладким вкусовым ощущением. При вкусовых испытаниях опытные дегустаторы предпочитали смеси гидролизат/интактный лизоцим по сравнению с чистым гидролизатом.

Claims (18)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Композиция для увеличения отношения триптофана к уровню суммы тирозина, фенилаланина, лейцина, изолейцина и валина (отношение Ттр/ЬЫАА) в плазме крови и поддержания такого отношения в течение периода времени от 15 до 240 мин, содержащая от 10 до 90% гидролизата лизоцима со степенью гидролиза (ЭН) от 5 до 45 и от 90 до 10% негидролизованного лизоцима.
2. 2. Композиция по п.1, содержащая от 20 до 80% гидролизата лизоцима и от 80 до 20% негидролизованного лизоцима.
3. 3. Композиция по п.1, дополнительно содержащая менее 10% свободного триптофана в том случае, если в ней содержится менее 90% гидролизата лизоцима.
4. 4. Композиция по п.2, дополнительно содержащая менее 10% свободного триптофана в том случае, если в ней содержится менее 80% гидролизата лизоцима.
5. 5. Композиция по любому из пп.3, 4, содержащая менее 5% свободного триптофана.

   - 23 021506
6. 6. Композиция по п.5, содержащая менее 2% свободного триптофана.
7. 7. Композиция по п.6, содержащая менее 1% свободного триптофана.
8. 8. Композиция по любому из пп.1-7, включающая по меньшей мере один водорастворимый триптофансодержащий пептид, в которой отношение Ττρ/ΕΝΑΑ составляет по меньшей мере 0,10.
9. 9. Композиция по п.8, в которой отношение Ττρ/ΕΝΑΑ составляет по меньшей мере 0,15.
10. 10. Композиция по п.9, в которой отношение Тгр/ΕΝΑΑ составляет от 0,15 до 1,8.
11. 11. Композиция по любому из пп.8-10, которая включает дипептид или трипептид ΟΝ^.
12. 12. Композиция по любому из пп.8-11, включающая по меньшей мере два различных триптофансодержащих пептида, выбранных из дипептидов или трипептидов, причем каждый из выбранных дипептидов или трипептидов содержится в композиции в количестве по меньшей мере 5 мол.% от общего количества дипептидов и трипептидов.
13. 13. Композиция по п.12, которая включает дипептид Α^ и трипептид ΟΝ^.
14. 14. Композиция по любому из пп.1-13, в которой лизоцим представляет собой лизоцим куриных яиц.
15. 15. Способ получения композиции по любому из пп.1-14, включающий смешивание гидролизата лизоцима со степенью гидролиза (ЭН) от 5 до 45, негидролизованного лизоцима и при необходимости, свободного триптофана.
16. 16. Способ по п.15, отличающийся тем, что перед смешиванием гидролизат очищают или фракционируют.
17. 17. Применение композиции по любому из пп.1-14 в качестве нутрицевтического средства для улучшения настроения, когнитивных способностей, аппетита, внимательности, бдительности, качества сна, контроля за эмоциональными реакциями и сексуальным поведением, обеспечения успокаивающего действия и снятия депрессии.
18. 18. Применение композиции по любому из пп.1-14 для производства нутрицевтического средства для улучшения настроения, когнитивных способностей, аппетита, внимательности, бдительности, качества сна, контроля за эмоциональными реакциями и сексуальным поведением, обеспечения успокаивающего действия и снятия депрессии.