CN111821418A

CN111821418A - 用于抑制运动引发性肌肉损伤的组合物

Info

Publication number: CN111821418A
Application number: CN202010317006.7A
Authority: CN
Inventors: 东诚一郎; 角公一郎
Original assignee: Meiji Co Ltd
Current assignee: Meiji Co Ltd
Priority date: 2019-04-22
Filing date: 2020-04-21
Publication date: 2020-10-27
Also published as: JP2020176100A

Abstract

本发明为用于抑制运动引发性肌肉损伤的组合物。[课题]本发明的课题在于，提供为了抑制由运动诱发的肌肉损伤(运动引发性肌肉损伤)或起因于该运动引发性肌肉损伤的肌肉不良状态而使用的组合物、以及为了促进从运动引发性肌肉损伤或起因于该运动引发性肌肉损伤的肌肉不良状态恢复而使用的组合物。[解決手段]本发明的组合物的特征在于以含有BCAA二肽的蛋白水解物作为有效成分。

Description

用于抑制运动引发性肌肉损伤的组合物

技术领域

本发明涉及为了抑制由运动引发的肌肉损伤而使用的组合物、特别是作为饮食品等可简便地用于以人为代表的哺乳类的组合物。

背景技术

近些年，运动所具有的健康增进效果、抗衰老效果受到注目，进行体育运动、力量训练等运动的人口日益增加。另一方面，也指出了过度的运动、不习惯的运动会引起肌肉的障碍。具体而言，已知在进行伴随扩展性收缩的运动时，会引发延迟性肌肉疼痛(非专利文献1)、肌力下降(非专利文献2)和关节活动度的减少(非专利文献3)。另外，还报道了观察到作为反映出肌肉损伤的血液中标记物的肌酸激酶活性的上升(非专利文献4和5)。

像这样由运动诱发的肌肉损伤(以下也将其称为“运动引发性肌肉损伤”)成为肌肉功能降低、肌肉疲劳或肌肉疼痛的原因，相反也会使由运动带来的健康增进效果、抗衰老效果降低。因此，一直以来进行了具有抑制运动引发性肌肉损伤或促进其恢复的效果的成分的探索。作为具有这样的效果的成分，已知例如支链氨基酸(BCAA)(专利文献1)；可可块和/或其加工物(专利文献2)；儿茶素类(专利文献3)、以特定的比例含有9种氨基酸的组合物(专利文献4)；选自杜松子提取物、丝兰提取物、罗勒提取物、芥末油、紫玉米色素、生育酚类和叶绿素中的一种以上(专利文献5)；包含乳清蛋白或乳清蛋白的水解物的制备物(其中，不含有谷氨酰胺或支链氨基酸)(专利文献6、非专利文献6)。

然而，尚不知晓支链氨基酸(BCAA)二肽发挥这样的效果。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2000-26289号公报

专利文献2：日本特开2006-282573号公报

专利文献3：日本特开2010-111608号公报

专利文献4：国际公开WO2013/021891号小册子

专利文献5：日本特开2013-100272号公报

专利文献6：日本特表2009-539883号公报

非专利文献

非专利文献1：Med Sci Sports Exerc.,16:529-538,1984.

非专利文献2：Med Sci Sports Exerc.,24:512-520,1992.

非专利文献3：J Sci Med Sport 5(3):204-218,2002.

非专利文献4：Med Sci Sports Exerc.,24:512-520,1992.

非专利文献5：Int J Sports Med 13:471-475,1992.

非专利文献6：J Sci Med Sport 13(1):178-181,2010.

发明内容

发明要解决的问题

本发明的目的在于，提供为了抑制运动引发性肌肉损伤或/和促进运动引发性肌肉损伤的恢复而使用的组合物。进而本发明的目的在于，提供为了抑制发生起因于运动引发性肌肉损伤的肌肉不良状态(例如肌肉功能降低、肌肉疲劳或肌肉疼痛等)或/和促进从该肌肉不良状态恢复而使用的组合物。

用于解决问题的方案

本发明人等为了解决上述课题而进行了深入研究，结果发现：通过摄取含有由亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸这样的支链氨基酸(BCAA)构成的二肽(本发明中将其称为“BCAA二肽”)的蛋白水解物，从而由运动引起的肌肉损伤(运动引发性肌肉损伤)得以显著抑制；以及抑制肌肉损伤且从肌肉损伤的恢复也是良好的。另外，确认了：由于含有BCAA二肽的蛋白水解物的这种效果明显高于水解前的蛋白质、含有构成该蛋白质的氨基酸的组合物，因此该效果是含有BCAA二肽的蛋白水解物特征性具有的。

本发明是基于上述见解并进行深入研究而完成的，具有下述的实施方式。需要说明的是，如前所述，本说明书中，将支链氨基酸记为“BCAA”，将由支链氨基酸构成的二肽记为“BCAA二肽”，另外使用氨基酸的三个字母记号将构成该二肽的氨基酸序列记为“Xxx-Yyy”。

[1]一种含有由支链氨基酸构成的二肽的蛋白水解物在用于制造用于抑制运动引发性肌肉损伤的组合物中的应用。

[2]一种含有由支链氨基酸构成的二肽的蛋白水解物在用于制造用于促进运动引发性肌肉损伤的恢复的组合物中的应用。

[3]一种含有由支链氨基酸构成的二肽的蛋白水解物在用于制造用于抑制起因于运动引发性肌肉损伤的肌肉不良状态的组合物中的应用。

[4]一种含有由支链氨基酸构成的二肽的蛋白水解物在用于制造用于促进从起因于运动引发性肌肉损伤的肌肉不良状态恢复的组合物中的应用。

[5]根据[3]或[4]所述的应用，其中，前述肌肉不良状态为选自由肌肉功能降低、肌肉疼痛、肌肉感觉到倦怠感、肌肉僵硬和肌肉紧张组成的组中的至少1种状态。

[6].根据[1]～[5]中任一项所述的应用，其中，前述由支链氨基酸构成的二肽为选自由至少Ile-Leu、Val-Leu、Leu-Leu、Ile-Ile、Leu-Ile、Leu-Val和Ile-Val组成的组中的至少任一者。

[7]根据[1]～[6]中任一项所述的应用，其中，含有由支链氨基酸构成的二肽的蛋白水解物为含有由支链氨基酸构成的二肽的乳清蛋白水解物。

[8]根据[1]～[7]中任一项所述的应用，其中，前述组合物为用于哺乳类的药物、准药物或饮食品。

[9]根据[8]所述的应用，其中，前述饮食品为健康食品、功能性食品、营养辅助食品、功能性展示食品、特定保健用食品、患者用食品、婴幼儿用调制奶粉、孕产妇或哺乳期妇女用奶粉或为标示出用于抑制运动引发性肌肉损伤或/和促进运动引发性肌肉损伤的恢复的内容的饮食物。

[10]一种运动引发性肌肉损伤的非治疗的抑制方法或/和从运动引发性肌肉损伤恢复的非治疗的恢复促进方法，其特征在于，让待检测哺乳类摄取或对其给予含有由支链氨基酸构成的二肽的蛋白水解物。

[11]一种起因于运动引发性肌肉损伤的肌肉不良状态的非治疗的抑制方法或/和从肌肉不良状态恢复的非治疗的恢复促进方法，其特征在于，让待检测哺乳类摄取或对其给予含有由支链氨基酸构成的二肽的蛋白水解物。

[12]根据[10]或[11]所述的方法，其中，针对待检测哺乳类的含有由支链氨基酸构成的二肽的蛋白水解物的摄取或给予是在选自待检测哺乳类的运动前、运动中和运动后中的至少1个阶段对待检测哺乳类进行经口摄取或给予。

发明的效果

根据本发明，可以提供具有运动引发性肌肉损伤抑制效果的组合物。另外根据本发明，可以提供具有从运动引发性肌肉损伤恢复的恢复促进效果的组合物。进而根据本发明，可以提供具有抑制起因于运动引发性肌肉损伤的肌肉不良状态、具体而言选自由肌肉功能降低(包括肌力下降)、肌肉疼痛、肌肉感觉到倦怠感、肌肉僵硬和肌肉紧张组成的组中的至少一种状态的效果的组合物。进而另外根据本发明，可以提供具有从前述肌肉不良状态恢复的恢复促进效果的组合物。

作为本发明的组合物的有效成分而使用的含有BCAA二肽的蛋白水解物是长年用作食品的原料的乳清蛋白、酪蛋白、大豆蛋白质、小麦麸质或牛肉等蛋白质的水解物。因此，本发明的组合物即使长期持续服用也没有副作用的担心，在安全性高这点上是有利的。特别是乳清蛋白通常在天然乳酪的制造过程中在原料乳的凝乳过程之后被排出、废弃而成为产业废弃物。本发明的组合物中作为有效成分而包含的乳清蛋白水解物(Whey ProteinHydrolysate：WPH)可以通过将该成为产业废弃物的乳清蛋白作为原料进行再利用，因此可以说本发明在环境方面、经济方面也是有用的。

附图说明

图1示出试验例1的结果。是将待检测动物(雌性Wister大鼠)分为(A)乳清蛋白组(-黑色方块-)、(B)乳清肽组(-▲-)、(C)氨基酸混合物组(-◇-)和(D)对照组(-○-)(各组：n＝6)，对于在运动负荷30分钟前和运动负荷1小时后经口给药了各待检测试样的待检测动物，示出运动前一天(Pre)和从运动负荷起1天后(第1天)的肌力(％：平均值±SEM)的变化的图。图中，表示“a”和“b”的不同符号之间存在显著差异(Tukey-Kramer检验)。

图2示出试验例2的结果。是将待检测动物(雌性Wister大鼠)分为(A)乳清肽组(-●-)和(B)对照组(-○-)(各组：n＝7)，对于在运动负荷30分钟前和运动负荷1小时后经口给药了各待检测试样的待检测动物，示出对运动前(Pre)、从运动负荷起1天后(第1天)和从运动负荷起2天后(第2天)的下肢肌力进行比较的结果的图。图中，表示“a”和“b”的不同符号之间存在显著差异(Tukey-Kramer检验)。

图3示出试验例2的结果。是对于前述(A)乳清肽组和(B)对照组(各组：n＝7)，对从运动负荷起1天后(第1天)和从运动负荷起3天后(第3天)的血清中的骨骼肌肌钙蛋白I(skmTn-I)的浓度(ng/ml)进行比较的结果的图。图中，“*”表示对照组与乳清肽组之间存在显著差异(Student t-test检验(T检验))。

具体实施方式

(I)含有BCAA二肽的蛋白水解物

本发明中成为对象的含有BCAA二肽的蛋白水解物是含有由通过将蛋白质水解而制备的支链氨基酸(BCAA)构成的二肽的组合物。以下，将蛋白水解物(ProteinHydrolysate)简称为“PH”，将含有BCAA二肽的蛋白水解物简称为“含有BCAA二肽的PH”。

支链氨基酸(BCAA)是指在结构上具有支链的氨基酸，具体而言可以列举出亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)和缬氨酸(Val)。作为由BCAA构成的二肽(BCAA二肽)，具体而言，可以列举出Leu-Leu、Leu-Ile、Leu-Val、Ile-Ile、Ile-Leu、Ile-Val、Val-Val、Val-Leu和Val-Ile。优选为Leu-Leu、Leu-Ile、Leu-Val、Ile-Ile、Ile-Leu、Ile-Val和Val-Leu。本发明的含有BCAA二肽的PH可以含有这些BCAA二肽中的1种或组合含有2种以上，优选组合含有3种以上，更优选组合含有5种以上，进一步优选组合含有6种以上，特别优选组合含有7种以上。例如，本发明的含有BCAA二肽的PH可以含有选自由Leu-Leu、Leu-Ile、Leu-Val、Ile-Ile、Ile-Leu、Ile-Val和Val-Leu组成的组中的至少任一者。其中优选为：含有选自由Leu-Leu、Ile-Leu和Val-Leu组成的组中的至少任一者的含有BCAA二肽的PH，特别优选为：包含Leu-Leu、Leu-Ile、Leu-Val、Ile-Ile、Ile-Leu、Ile-Val和Val-Leu全部的含有BCAA二肽的PH。

本发明的含有BCAA二肽的PH中包含的这些二肽可以通过LC/MS、LC/MS/MS进行测定。具体而言，可以使用后述的制造例1所述的LC/MS法及其条件进行测定。例如，本发明的含有BCAA二肽的PH可以相对于蛋白质含量每1g以下述所示的比例包含下述的BCAA二肽。

Ile-Leu：0.05～25mg/g蛋白质、优选为0.05～20mg/g蛋白质、更优选为0.1～15mg/g蛋白质、进一步优选为0.5～10mg/g蛋白质。

Val-Leu：0.05～50mg/g蛋白质、优选为0.1～50mg/g蛋白质、更优选为0.5～25mg/g蛋白质、进一步优选为1～25mg/g蛋白质。

Leu-Leu：0.05～50mg/g蛋白质、优选为0.1～25mg/g蛋白质、更优选为0.1～15mg/g蛋白质、进一步优选为2～10mg/g蛋白质。

Ile-Ile：0.01～10mg/g蛋白质、优选为0.02～5mg/g蛋白质、更优选为0.01～3mg/g蛋白质、进一步优选为0.1～1mg/g蛋白质

Leu-Ile：0.01～10mg/g蛋白质、优选为0.01～5mg/g蛋白质、更优选为0.01～3mg/g蛋白质、进一步优选为0.01～1mg/g蛋白质。

Leu-Val：0.01～10mg/g蛋白质、优选为0.01～5mg/g蛋白质、更优选为0.05～3mg/g蛋白质

Ile-Val：0.01～10mg/g蛋白质、优选为0.05～10mg/g蛋白质、更优选为0.1～5mg/g蛋白质、进一步优选为0.1～3mg/g蛋白质。

此处“蛋白质含量”是指：含有BCAA二肽的PH中包含的氨基酸、及构成含有BCAA二肽的PH中包含的肽的氨基酸的总量。上述蛋白质含量可以利用凯氏定氮法进行测定而算出。实际上，凯氏定氮法可以如下计算：测定成为对象的含有BCAA二肽的PH中包含的氮，将该值乘以氮-蛋白换算系数(通常6.25)而计算。例如，本发明的含有BCAA二肽的PH是通过将蛋白质水解而得到的，因此利用上述方法计算出的含有BCAA二肽的PH的蛋白质含量理论上与水解前的蛋白质的蛋白质含量相同。

本发明的含有BCAA二肽的PH没有限制，优选相对于BCAA二肽总含量的Ile-Leu、Val-Leu和Leu-Leu所占的比例高。具体而言，将BCAA二肽总含量设为100％时，含有BCAA二肽的PH中包含的Ile-Leu、Val-Leu和Leu-Leu的比例(总量所占的比例)可以示例出60～95％的范围，优选为70～95％，更优选为80～95％。另一方面，将BCAA二肽总含量设为100％时，相对于BCAA二肽总含量的Ile-Ile、Leu-Ile、Leu-Val和Ile-Val所占的比例(总量所占的比例)可以示例出40～5％的范围，优选为30～5％，更优选为20～5％。

这样的含有BCAA二肽的PH如后述的制造例1所述那样，可以通过将源自动物或植物的各种蛋白质作为原料使其全部或一部分水解来制备。作为成为原料的动物性蛋白质，可以示例出源自乳的蛋白质(例如，包括酪蛋白、乳清蛋白(乳清蛋白))、源自蛋的蛋白质(例如，包括卵白蛋白质)和肉类(牛肉、猪肉、鸡肉等)或源自海鲜类的蛋白质。另外作为植物性蛋白质，可以列举出源自小麦的蛋白质(例如，包括麸质等)和源自大豆的蛋白质。由于BCAA的构成比例多，因此优选为动物性蛋白质。更优选为源自乳的蛋白质，特别优选为乳清蛋白(乳清蛋白)。

乳清蛋白是从乳中去除了酪蛋白、脂肪后的液体部分即乳清(Whey)中包含的球状蛋白质的混合物，包括α-乳清蛋白(α-La)、β-乳球蛋白(β-Lg)、免疫球蛋白、乳铁蛋白、牛血清白蛋白等蛋白质。本发明中，作为制备含有BCAA二肽的PH的原料使用的乳清蛋白可以是由乳、乳清精制而得到的乳清蛋白(精制乳清蛋白)，另外还可以是由乳、乳清分离而得到的粗精制的乳清蛋白(乳清蛋白含有物)。进而还可以使用包含乳清蛋白的饮食品、其原料(例如，除了乳蛋白质以外包含其它成分的组合物等)。该饮食品、其原料除了乳清蛋白之外还可以包含酪蛋白。

作为上述精制乳清蛋白，例如可以列举出α-乳清蛋白(α-La)、β-乳球蛋白(β-Lg)、免疫球蛋白、乳铁蛋白和包含这些中至少一者的蛋白质的混合物等。另外作为上述粗精制的乳清蛋白(乳清蛋白含有物)，可以列举出由牛乳制备的例如乳清的原液(甜乳清、酸乳清等)、其浓缩物、其干燥物(乳清粉等)、其冷冻物和它们的还原物等。另外，这些当中还可以包含脱盐乳清、乳清蛋白浓缩物(WPC)和它们的还原物。另外，作为包含乳清蛋白的饮食品或其原料，例如可以列举出原料乳、灭菌乳(牛乳等)、脱脂乳、成分调整牛乳、加工乳、乳制品(浓缩乳、奶粉、炼乳、发酵乳(酸奶等)、乳酸菌饮料、加工干酪类、冰激凌类、奶油类)和乳蛋白质浓缩物(MPC)、以及它们的浓缩物、它们的干燥物、它们的冷冻物等。此时，包含前述的乳清蛋白的原料、饮食品可以获得市售品来使用，还可以自己制备来使用。

本发明的含有BCAA二肽的PH可以通过将前述的蛋白质水解1次以上来制备。其手段和/或方法没有特别限制。水解可以利用公知的水解方法来实施，但优选可以利用基于蛋白水解酶的水解方法。

蛋白水解酶只要使乳清蛋白水解而生成发挥本发明的效果的含有BCAA二肽的PH，就没有特别限定。参考例如国际公开第2007/123200号等的记载，其种类、反应条件等可以任意设定。例如可列举出源自属于芽胞杆菌属(Bacillus)或曲霉属(Aspergillus)的微生物的蛋白水解酶；源自木瓜的木瓜蛋白酶、源自菠萝的菠罗蛋白酶、源自猕猴桃的猕猴桃蛋白酶等源自植物的蛋白水解酶；胰酶制剂(pancreatin)、胰蛋白酶、胃蛋白酶、糜蛋白酶等源自动物的蛋白水解酶。它们可以单独使用1种，或任意组合使用2种以上。另外，这些蛋白水解酶可以使用市售品。市售品的蛋白水解酶例如有PROTEASE M"AMANO"(Amano EnzymeInc.)、PROTEASE N"AMANO"(Amano Enzyme Inc.)、PROTEASE P"AMANO"(Amano EnzymeInc.)、PROTEASE A"AMANO"(Amano Enzyme Inc.)、TRYPSIN(NOVOZYME)、PEPSIN(和光纯药株式会社)、UMAMIZYME(Amano Enzyme Inc.)、FLAVORZYME(NOVOZYME)等，不限制于此。根据本发明的优选的方式，为了将蛋白质水解而使用的蛋白水解酶为选自由源自芽胞杆菌属的蛋白水解酶、源自曲霉属的蛋白水解酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶和FLAVORZYME(NOVOZYME)组成的组中的一种或两种以上。

本发明的含有BCAA二肽的PH可以通过使用将蛋白质水解的蛋白水解酶，从而制成富含前述的BCAA二肽的水解物。例如，为了使以乳清蛋白为代表的蛋白质水解而更多地生成Ile-Leu的二肽，优选通过组合源自芽胞杆菌属的蛋白酶和源自曲霉属的蛋白酶将乳清蛋白水解。另外，为了使以乳清蛋白为代表的蛋白质水解而更多地生成Leu-Leu和Leu-Val的二肽，优选用胃蛋白酶使乳清蛋白反应后，用源自曲霉属的蛋白酶进行反应。进而，为了使以乳清蛋白为代表的蛋白质水解而更多地生成Val-Leu、Ile-Val、Ile-Ile和Leu-Ile的二肽，优选使用源自曲霉属的蛋白酶将乳清蛋白水解。如此蛋白水解酶可以根据其特性和目的进行适宜选择地使用。

用于通过蛋白水解酶将蛋白质水解而生成期望的BCAA二肽的反应温度优选为20～80℃，更优选为25～75℃，进一步优选为30～70℃，进一步优选为35～65℃，进一步优选为40～60℃，特别优选为45～55℃。反应温度若为20℃以上，则能够通过蛋白水解酶使蛋白质有效地水解。另外，反应温度若为80℃以下，则能够抑制由蛋白水解酶变性导致的失活。对于该反应温度，鉴于所使用的蛋白质水解酶的最佳温度，可以设定为恒定的温度(1个阶段)，另外还可以设定为2个以上不同的温度(2个阶段以上)。在设定2个阶段以上的反应温度时，其顺序是任意的。

用于通过蛋白质水解酶将蛋白质水解而生成期望的BCAA二肽的反应时间没有限制，优选为2～48小时，更优选为2～36小时，进一步优选为2～24小时，进一步优选为2～18小时，进一步优选为2～14小时，进一步优选为4～12小时，进一步优选为6～10小时，特别优选为7～9小时。通过将蛋白水解酶的反应时间设为2小时以上，从而能将更多的蛋白质水解。为了使蛋白质有效地水解，反应时间优选控制在48小时以内。需要说明的是，在将设定反应温度设定为2个阶段以上时，可以在该反应时间的范围内任意设定2个阶段以上的反应温度。

用于通过蛋白质水解酶将蛋白质水解而生成期望的BCAA二肽的蛋白水解酶的添加量只要能够生成发挥本发明的效果的含有BCAA二肽的PH，就没有特别限制。例如可以列举出相对于蛋白质100g，优选为0.5～10g，更优选为0.7～5g，进一步优选为0.8～4g，特别优选为1～2g。

用于通过蛋白水解酶将蛋白质水解而生成期望的BCAA二肽的反应pH理想的是所使用的蛋白水解酶发生反应的pH范围，可以列举出更优选为该最佳pH或其附近。例如，组合使用源自芽胞杆菌属的蛋白水解酶和源自曲霉属的蛋白水解酶时，优选为pH5～9，更优选为pH5.5～8.5，进一步优选为pH6～8，特别优选为pH6.5～7.5。

鉴于所使用的蛋白质水解酶的最佳pH，该反应pH可以设定为恒定的pH条件(1个阶段)，另外，还可以设定为2个以上不同的pH条件(2个阶段以上)。在设定2个阶段以上的pH条件时，其顺序是任意的。

本发明的含有BCAA二肽的PH在刚制备后为液态，但为了提高其贮存性，可以实施各种加工处理。作为上述加工处理，只要不损害含有BCAA二肽的PH所具有的本发明的效果，就可以示例出例如冷冻、干燥(喷雾干燥、冷冻干燥)、浓缩、加热杀菌(板式加热杀菌、管式加热杀菌、间歇式加热杀菌、通电加热杀菌、通过微波进行的加热杀菌、蒸煮加热等间接加热杀菌、蒸汽喷射、蒸汽注入等直接加热杀菌)或非加热杀菌(光照射杀菌、辐射线照射杀菌、高压脉冲杀菌)。其中，从贮存稳定性和操作的容易度的方面考虑，优选的是：在制成含有BCAA二肽的PH后进行干燥(喷雾干燥、冷冻干燥)处理，预先制成干燥固体形态。

(II)以含有BCAA二肽的PH作为有效成分的组合物

如后述试验例2所示，包含含有BCAA二肽的PH的本发明的组合物(以下也简称为“本发明组合物”)通过让哺乳动物(包括人和非人动物)摄取或对其给予，从而能够抑制由运动诱发的肌肉损伤(运动引发性肌肉损伤)(参照图3)。另外其结果，如后述试验例1所示那样能够抑制以起因于运动引发性肌肉损伤而发生的肌力下降(肌肉功能降低)为代表的肌肉衰竭(参照图1)。另外如后述试验例2所示那样通过让哺乳动物摄取或对其给予本发明组合物，起因于运动引发性肌肉损伤而发生的肌肉功能降低等从肌肉不良状态的恢复也迅速(参照图2)。因此，包含含有BCAA二肽的PH的本发明的组合物作为用于抑制运动引发性肌肉损伤的组合物、以及作为用于抑制起因于运动引发性肌肉损伤的肌肉衰竭的组合物是有用的。进而本发明的组合物作为用于促进从运动引发性肌肉损伤恢复的组合物、以及作为用于促进从起因于运动引发性肌肉损伤的肌肉不良状态恢复的组合物是有用的。

本发明中“肌肉损伤”包括由一过性/强度的运动负荷导致的肌原纤维、肌纤维周围的结缔组织的微细的损伤。这样的肌肉损伤中还可以包括：进而由在损伤的修复过程中发生的炎症反应所引起的二次损伤、例如中性粒细胞等炎症性细胞的浸润、由酶反应所致的细胞的变性。

如后述试验例2所示，这样的肌肉损伤可以基于血液中的骨骼肌肌钙蛋白I浓度进行评价。骨骼肌肌钙蛋白I是由于肌肉的损伤而释放在血液中的蛋白质，将其作为生物标记物，通过测定血液中的骨骼肌肌钙蛋白I浓度，从而能够评价骨骼肌肉损伤的有无、其程度。具体而言，血液中的骨骼肌肌钙蛋白I浓度比安静时(运动前、即由运动所致的肌肉损伤之前)的浓度高时，可以判断发生了肌肉损伤，说明其浓度的高度成比例地损伤程度增高。血液中的骨骼肌肌钙蛋白I浓度的测定可以通过使用市售的钙蛋白I定量试剂盒进行简便地实施。例如，可以列举出Life Diagnostics公司的Skeletal Muscle Troponin-I ELISAKit，没有限制。此外，还可以通过测定已知由于肌肉损伤而释放在血液中的血清肌红蛋白或肌酸磷酸激酶的量来进行评价。另外，定性地，由于肌肉损伤而发生的肌肉疼痛也可以成为评价的对象。

本发明中“运动”是指诱发前述的肌肉损伤的运动，例如在进行不习惯的运动、很久以后进行的运动或者进行超过定期运动训练的水平的较强负荷的运动的情况下，容易引发肌肉损伤。作为引发肌肉损伤的运动，可以列举出特别是扩展性(eccentric，离心)肌肉收缩式运动或伴随其的运动。此处扩展性肌肉收缩式运动是使肌肉拉伸的同时发挥肌力的运动。尽管对上述内容没有特别限制，但本发明的运动可以示例出慢跑(Jogging)、快跑(running)、跳舞、水下运动(包括游泳)、滑冰、骑车、体操、瑜伽、伸展运动、重量训练、加压训练、登山、攀岩、各种体育运动(例如，球类(比赛)、羽毛球、芭蕾等)。

本发明中所谓的“肌肉损伤的抑制”是指：通过服用(给予、摄取)含有BCAA二肽的PH，而与未服用的情况相比，由运动诱发的肌肉损伤(运动引发性肌肉损伤)的程度低(运动引发性肌肉损伤的发生得到了抑制)。该情况可以通过对服用含有BCAA二肽的PH时与未服用含有BCAA二肽的PH时的、运动前后的上述血液中生物标记物的浓度差进行比较来评价。具体而言，服用了的情况与未服用的情况相比血液中生物标记物的浓度上升得到了抑制时，可以说通过服用含有BCAA二肽的PH使运动引发性肌肉损伤得到了抑制。

本发明中所谓的“肌肉损伤的恢复”是指：由运动而诱发的肌肉损伤恢复至安静时(运动前、即由运动导致的肌肉损伤之前)的肌肉状态或接近其的状态。具体而言可以通过如下方式进行判定：测定上述血液中生物标记物的浓度，对该浓度是否恢复至与安静时(运动前、即由运动导致的肌肉损伤之前)相同水平或与其接近的水平、以及其速度进行评价。该情况也可以通过对服用含有BCAA二肽的PH时与未服用含有BCAA二肽的PH时的、运动前后的上述血液中生物标记物的浓度进行比较来评价。具体而言，服用了的情况与未服用的情况相比血液中生物标记物的浓度迅速降低而恢复至安静水平时，可以说通过服用含有BCAA二肽的PH而促进了运动引发性肌肉损伤的恢复。

本发明中“肌肉不良”或“肌肉不良状态”是指：起因于前述的肌肉损伤而发生的肌肉(包括肌原纤维、肌纤维周围的结缔组织)的非正常状态。例如，包括由于对肌肉施加运动负荷而使肌肉损伤，由该肌肉损伤引起而发生肌肉的功能降低的状态。肌肉的功能降低包括肌力下降。需要说明的是，大鼠、小鼠等待检测动物的肌力可以利用后述的试验例1和2所述的方法并使用例如市售的大鼠踝关节用肌力测定装置来测定最大肌力而进行评价。另外，“肌肉不良状态”还包括由于肌肉损伤而出现一过性疾病症状(例如，肌肉疼痛、肌肉感觉到倦怠感、肌肉僵硬或肌肉紧张)的状态。

本发明中所谓的“肌肉不良状态的抑制”是指：通过服用(给予、摄取)含有BCAA二肽的PH，而与未服用的情况相比，由于运动引发性肌肉损伤而出现的肌肉不良状态的程度低(肌肉不良得到了抑制)。该情况也可以通过对服用含有BCAA二肽的PH时与未服用含有BCAA二肽的PH时的、运动前后的肌力差进行比较来评价。具体而言，服用了的情况与未服用的情况相比肌力下降得到了抑制时，可以说通过服用含有BCAA二肽的PH而使起因于运动引发性肌肉损伤的肌肉不良得到了抑制。需要说明的是，还可以以肌肉疼痛等疾病的症状作为指标来进行该评价。

本发明中所谓的“肌肉不良状态的恢复”是指：由于运动引发性肌肉损伤而出现的肌肉不良状态恢复至安静时(运动前、即由运动导致的肌肉损伤之前)的肌肉状态或与其接近的状态，具体而言可以通过如下方式判定：测定肌力，对该肌力是否恢复至与安静时(运动前、即由运动导致的肌肉损伤之前)相同水平或与其接近的水平、以及其速度进行评价。该情况也可以通过对服用含有BCAA二肽的PH时与未服用含有BCAA二肽的PH时的、运动后经过一定时间后的上述肌力进行比较来评价。具体而言，服用了的情况与未服用的情况相比肌力迅速降低而恢复至安静水平时，可以说通过服用含有BCAA二肽的PH而促进了起因于运动引发性肌肉损伤的肌肉不良状态的恢复。还可以以肌肉疼痛等疾病的症状作为指标来进行该评价。

本发明中“服用、给予或摄取”只要是进入哺乳动物(包括人和非人动物)的体内的方法就没有限制，优选可以示例出经口给药或摄取、经肠给药和在胃瘘等肠内被消化吸收的方式，可以根据成为对象的哺乳动物的状态、用途进行适宜选择。因此，本发明的组合物具有经口给药用或摄取用的形态、经肠给药用的形态和胃瘘用的形态，可以制成该形态。优选为经口摄取，本发明的组合物优选为具有经口摄取用的形态。

本发明组合物可以制成以哺乳类(人和除人之外的哺乳动物)作为对象的药物、准药物或饮食品的形态，在该用途中使用。优选制成饮食品的形态而作为饮食品使用。本发明组合物只要发挥本发明的效果，就可以除了本发明的含有BCAA二肽的PH之外，添加其它原料例如可食性原料(例如食品原材料)或/和可食性的添加物(例如食品添加物、药物添加物)。例如，为了对本发明组合物赋予嗜好性，可以添加甜味剂(砂糖类、液态糖类、果糖、麦芽糖、三温糖等)、糖醇(赤藻糖醇等)、高灵敏度甜味剂(例如甜菊糖、罗汉果、阿斯巴甜、三氯蔗糖、乙酰磺胺酸钾等)、酸味剂、香料、果汁、蔬菜汁、增稠多糖类、乳化剂、矫味剂、矫臭剂等。另外，出于对本发明组合物赋予追加的功能(营养功能、生理功能)的目的，还可以添加矿物质类(钙、铁、锰、镁、锌等)、维生素类、功能性原材料、益生菌乳酸菌等而制成本发明组合物。

本发明组合物制成药物或准药物的形态的情况，该组合物没有限制，可以具有例如片剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂、内服液体制剂、糖浆剂等经口给药形态。在此情况下，除了配混含有BCAA二肽的PH作为有效成分之外，可以根据需要配混赋形剂、结合剂、崩解剂、润滑剂、缓冲剂、稳定化剂、着色剂、矫味剂或矫臭剂等制成具有上述的经口给药形态的药物或准药物。

本发明组合物用于饮食用途的情况，该组合物没有限制，可以具有各种饮食品的形态。作为饮食品的形态，只要是溶液、悬浮液、乳浊液、粉末、固体成型物等能经口摄取的形态就没有特别限定。具体而言，例如可列举出蒸煮食品、罐头、微波食品、速溶汤、冻干食品等速食食品类；清凉饮料、带有果汁的饮料、带有蔬菜的饮料、带有豆乳的饮料、带有乳的饮料、乳饮料、粉末饮料、浓缩饮料、酒精饮料等饮料类；面包、通心粉、面、蛋糕混合料、面包粉等小麦粉制品；饴糖、软糖、焦糖、口香糖、巧克力、曲奇曲奇(cookie)、饼干(biscuits)、蛋糕(cake)、馅饼(pie)、小吃(snack)、薄脆饼(cracker)、棒状点心、果冻(jelly)、凝胶(gel)和日式点心、餐后甜点(dessert)等点心糖果类；酱汁、番茄加工调味料、风味调味料、烹调混合料、调料汁类、色拉调料类、汤类、咖喱/日式炖菜的调料类等调味料；加工油脂、黄油、人造奶油、蛋黄酱等油脂类；乳饮料、酸奶类、乳酸菌饮料、冰激凌类、奶油类等乳制品；农作物罐头、果酱(jam)/橘子酱(Marmalade)类、谷物等农产加工品；冷藏/冷冻食品等。饮食品优选为带有乳的制品，更优选为乳饮料、乳酸菌饮料等乳制品。饮食品的形态如所谓的营养强化剂、营养辅助食品那样与前述药物、准药物同样地还包括例如片剂、颗粒剂、细粒剂、散剂(粉末)、胶囊剂、内服液体制剂、糖浆剂等制剂形态。需要说明的是，这些制剂形态的组合物可以直接服用、根据需要与水等饮料一起服用，另外，还可以溶解/分散于水、牛乳等饮料、汤或其它配菜中进行服用/摄取。

另外，以人作为对象的饮食品还包括健康食品、功能性食品、营养辅助食品、功能性展示食品、特定保健用食品、患者用食品、婴幼儿用调制奶粉、孕产妇或哺乳期妇女用奶粉之类的分类的食品。本发明的饮食品还可以附有如下内容的标示：“抑制由运动导致的肌肉损伤或/和肌肉不良状态”、“保护免受由运动导致的肌肉损伤或/和肌肉不良状态”、“促进从由运动导致的肌肉损伤或/和肌肉不良状态恢复”等。需要说明的是，上述“肌肉不良状态”这样的述语还包括肌力下降、肌肉功能降低、肌肉疼痛、肌肉感觉到倦怠感、肌肉僵硬或肌肉紧张的含义。

需要说明的是饮食品以非人动物作为对象的情况，即本发明的组合物用作针对非人动物的饲料的情况，成为对象的非人动物包括：大鼠、小鼠、兔子、狗、猴子等实验动物：牛、猪、鸡和马等家畜；赛马、斗牛、斗犬等竞技用的动物；犬、猫等宠物。在制造饲料时，除了本发明的含有BCAA二肽的PH之外，可以根据需要配混其它原料(例如包含肉类的蛋白质、谷物类、糠、渣、糖类、蔬菜、维生素类或矿物质等)或/和添加剂(例如，凝胶化剂、保鲜剂、pH调节剂、调味料、防腐剂、营养补充剂等)，利用常规方法对饲料进行加工制造。

出于在市场上提供的目的，可以将本发明的组合物制成放入容器中的形态。作为放入容器中的形态，可以列举出将本发明的组合物制成固体状并填充至容器中的方式。作为上述固体状的形态，可以列举出粉末和颗粒。作为此时的容器，可以使用纸、袋、箱、罐、瓶等公知的容器。此时的容器的内容量没有特别限制，例如可示例出1～5000g、4～1000g、4～100g、4～30g等。

另外，出于在市场上提供的目的，可以将本发明的组合物制成放入容器中的饮料的形态。此处容器只要是饮料被填充而能够直接饮用的容器即可，可以使用纸容器、软包装、聚酯瓶(PET bottle)、罐、瓶等公知的容器。该饮料可以通过将上述粉末或颗粒分散溶解于饮用水中来制备。容器的容量没有特别限制，例如可示例出1～5000g、5～1000g、10～500g等。

根据本发明的一个实施方式，例如，本发明的组合物中，含有BCAA二肽的PH的BCAA二肽的总量可以以每一次给予(摄取)为0.1g以上(优选为1g以上)的方式摄取(给予)。可以优选每一次给予(摄取)的BCAA二肽的总量为0.1～40g，更优选为0.1～30g，进一步优选为1～30g，特别优选为1～20g，进一步优选为1～10g的方式进行摄取(给予)。

“一次给予(摄取)量”是指：在需要得到本发明的效果的状态下的每一次的量。例如，在1天中的规定时间进行一系列的运动(将其记为1次)时，表示在该运动前、运动中或/和运动后所给予或摄取的总量。

从抑制由运动引发的肌肉损伤或/和促进从其恢复的观点出发，将本发明的组合物向待检测哺乳类(人或非人哺乳动物)进行给予(摄取)的时期为运动之前、运动中或/和运动后。可以在优选运动前或/和运动后15分钟～240分钟、更优选在运动前或/和运动后30分钟～180分钟、进一步优选在运动前或/和运动后45分钟～135分钟进行摄取。另外，在未进行运动的情况下，可以在任意的时期进行给予(摄取)，但在餐前、餐中等相对空腹的时候给予(摄取)更容易被吸收，因此能够得到更高的效果。

根据本发明的別的实施方式，例如，本发明的组合物可以以一次给予(摄取)的单位包装形态来提供。具有该单位包装形态的本发明的组合物期望的是，在该单位中、作为一次给予(摄取)量以BCAA二肽总量换算计将前述含有BCAA二肽的PH制成0.1g以上(优选为1g以上)的形态。另外，期望的是，作为一次给予(摄取)量以BCAA二肽总量换算计制成40g以下(优选为30g以下)的形态。即，对于每单位包装的本发明的含有BCAA二肽的PH的含量，作为一次给予(摄取)量以BCAA二肽总量换算计可以为0.1～40g，优选为0.1～30g，更优选为1～30g，特别优选为1～20g，进一步优选为1～10g。此处，由“每一次给予(摄取)的单位包装形态”组成是指：每一次给予(摄取)的量是预先规定的形态，例如，作为能经口摄取特定量的饮食品，不仅指普通食品，还包括饮料(饮料剂等)、健康辅助食品、保健功能食品、营养强化剂等形态。“每一次给予(摄取)的单位包装形态”中，例如，液态的饮料、凝胶状·糊状·胶冻、粉末状·颗粒状·胶囊状·块状的固体状的食品等的情况，可列举出如下形态：在金属罐、玻璃瓶(瓶等)、塑料容器(聚酯瓶等)、袋、小袋、薄膜容器、纸箱等包装容器中而能够指定特定量(用量)的形态；或者，通过将每一给予(摄取)的量(用法、用量)标示于包装容器、网页等上，将用于计量的器具(汤勺等)另附于容器上而能够指定特定量的形态。本发明的组合物由于使用含有BCAA二肽的PH作为有效成分，因此与成为其原料的蛋白质相比，由加热导致的凝胶化少，因此，在饮料、胶冻等的制造工序中能够维持物性。另外，即使少量摄取本发明的组合物也发挥本发明的效果，因此作为一口大小的块状、能一口饮用的微型罐饮料等之类的形态，摄取/吞咽较为容易，因此能够改善对于孩子、高龄者的便利性。

本发明的组合物可以以配混了多种成分而成的组合物的形态来提供。本发明的组合物的形态只要发挥本发明的效果就没有特别限定，例如，可以采用固体状(粉末状、颗粒状、胶囊状、块状等)、半固体状、液态、凝胶状、糊状、胶冻状、糊剂状等形态，优选为粉末状、颗粒状、胶冻状。组合物包括食品组合物和药物组合物。

根据本发明的另一方案，可提供：包括将含有BCAA二肽的PH使哺乳动物(包括人或非人动物)摄取或对其给予的、运动引发性肌肉损伤抑制方法、促进运动引发性肌肉损伤的恢复的方法、起因于运动引发性肌肉损伤的肌肉不良状态的抑制方法和从起因于运动引发性肌肉损伤的肌肉不良状态恢复的方法。这些方法可以依据对于前述的本发明的组合物的记载内容进行实施。

此处，对于本发明的方法，可以用于哺乳类(人和非人哺乳动物)以及源自它们的试样(肌肉组织、肌肉细胞)中，可实现治疗的用途和非治疗的用途中的任一者。此处，“非治疗的”是指不包括对人进行手术、治疗或诊断的行为(即，对人进行的医疗行为)，具体而言，是指不包括医师或受到医师指示的人对人进行手术、治疗或诊断的方法。

[实施例]

以下列举制造例和实验例对本发明进行更详细地说明。其中，这些制造例和实验例是用于容易理解本发明而进行说明的一个例子，本发明不受这些的任何限制。需要说明的是，只要没有特别声明，则下述的制造例和实验例在室温(25±5℃)和大气压的条件下进行。另外，待检测试样中包含的蛋白质含量只要没有特别声明则使用凯氏定氮法进行测定。

制造例1

(1)含有BCAA二肽的蛋白水解物(干燥粉末物)的制造

分别将酪蛋白、大豆蛋白质、小麦麸质、乳清蛋白和牛肉各50g放入水1L中使其分散。将各自的分散液的pH调整为7.0后，加热至50℃，进行保温。在其中加入源自芽胞杆菌属的蛋白酶(PROTEASE M"AMANO"、Amano Enzyme Inc.)500mg和源自曲霉属的蛋白酶(PROTEASE N"AMANO"、Amano Enzyme Inc.)500mg，孵育8小时，然后在90℃下加热10分钟，由此使蛋白酶失活。通过对由此得到的溶液进行冷冻干燥而制成粉末状(粉末状蛋白水解物)。

(2)含有BCAA二肽的蛋白水解物的分析

将前述得到的粉末状蛋白水解物分别溶解于1000倍容量(体积比)的0.1％三氟乙酸(TFA)水溶液中，使用下述条件的LC/MS，对作为BCAA二肽的Ile-Leu、Val-Leu、Leu-Leu、Ile-Ile、Leu-Ile、Leu-Val和Ile-Val的含量进行定量。

[LC条件]

柱：Develosil ODS-HG-3(15mm×2mm)

流动相：A液：0.05％ TFA水溶液

B液：0.05％ TFA乙腈溶液

梯度洗脱：以如下方式进行梯度洗脱：

从流动相的通液开始起0分钟：A液97体积％和B液3体积％

从流动相的通液开始起40分钟后：A液80体积％和B液20体积％。

柱温：35℃

流速：0.2mL/分钟

[MS条件]

电离法：API-ES正

SIM离子：m/z 245

干燥气体：10L/分钟在350℃下

喷雾器：25psig

裂解电压：30V

EM增益：1

将由酪蛋白、大豆蛋白质、小麦麸质、乳清蛋白和牛肉制得的各粉末状蛋白水解物中包含的各种BCAA肽的量(mg/g蛋白质)示于表1。

[表1]

(mg/g蛋白质)

	Ile-Leu	Val-Leu	Leu-Leu	Ile-Ile	Leu-Ile	Leu-Val	Ile-Val
								酪蛋白水解物	0.64	2.98	0.80	0.07	0.13	0.49	1.80
大豆蛋白水解物	1.98	3.49	0.28	0.11	0.09	0.16	0.48
								小麦麸质水解物	2.22	2.56	0.12	0.40	0.04	0.09	0.24
乳清蛋白水解物	3.82	4.70	1.56	0.04	0.18	0.34	0.24
								牛肉水解物	2.45	3.40	0.40	0.27	0.11	0.18	0.78

制造例2

(1)含有BCAA二肽的蛋白水解物(干燥粉末物)的制造

将乳清蛋白50g放入水1L中使其溶解。将溶液调整至各种pH后，如下述(a)～(m)所示加入各种酶500mg进行水解处理。然后通过在90℃下加热10分钟而使蛋白酶失活。通过对由此得到的溶液进行冷冻干燥而获得粉末状的蛋白水解物。

(a)使用源自芽胞杆菌属的蛋白酶(PROTEASE M"AMANO"、Amano Enzyme Inc.)，在pH7和50℃的条件下反应8小时；

(b)使用源自曲霉属的蛋白酶(PROTEASE N"AMANO"、Amano Enzyme Inc.)，在pH7和50℃的条件下反应8小时；

(c)使用TRYPSIN(NOVOZYME)，在pH7和37℃的条件下反应8小时；

(d)使用PEPSIN(和光纯药株式会社)，在pH2.5和37℃的条件下反应8小时；

(e)使用FLAVORZYME(NOVOZYME)，在pH7和50℃的条件下反应6小时；

(f)使用源自曲霉属的蛋白酶(UMAMIZYME、Amano Enzyme Inc.)，在pH7和50℃的条件下反应6小时；

(g)使用源自曲霉属的蛋白酶(PROTEASE A"AMANO"、Amano Enzyme Inc.)，在pH7和50℃的条件下反应6小时；

(h)使用源自曲霉属的蛋白酶(PROTEASE P"AMANO"、Amano Enzyme Inc.)，在pH7和50℃的条件下反应6小时；

(i)分别使用上述(a)和(b)各500mg，在pH7和50℃的条件下反应8小时；

(j)使用上述(c)500mg并在pH7和37℃的条件下反应4小时后，使用(a)500mg并在pH7和50℃的条件下反应4小时；

(k)使用上述(c)500mg并在pH7和37℃的条件下反应4小时后，使用(b)500mg并在pH7和50℃的条件下反应4小时；

(l)使用上述(d)500mg并在pH7和37℃的条件下反应4小时后，使用(a)500mg并在pH7和50℃的条件下反应4小时；

(m)使用上述(d)500mg并在pH7和37℃的条件下反应4小时后，使用(b)500mg并在pH7和50℃的条件下反应4小时。

对于利用上述方法制得的蛋白水解物，与制造例1同样地使用LC/MS进行分析，确认了在全部蛋白水解物中包含作为BCAA二肽的Ile-Leu、Val-Leu、Leu-Leu、Ile-Ile、Leu-Ile、Leu-Val和Ile-Val。由(i)的结果确认了：通过使(a)的源自芽胞杆菌属的蛋白酶和(b)的源自曲霉属的蛋白酶组合进行反应，从而可以得到富含Ile-Leu的蛋白水解物。另外，确认了：通过用(b)的源自曲霉属的蛋白酶进行反应，从而能够提高蛋白水解物中的Val-Leu、Ile-Ile、Leu-Ile或/和Ile-Val的含量。另外由(m)的结果确认了：通过用(d)的胃蛋白酶进行反应后，用(b)的源自曲霉属的蛋白酶进行反应，从而能够提高蛋白水解物中的Leu-Leu或/和Leu-Val的含量。

试验例1

以大鼠作为试验对象评价了含有BCAA二肽的蛋白水解物对于运动引发性肌肉损伤的抑制效果。

1.试验方法

(1)待检测动物/饲育条件

将待检测动物和饲育条件示于表2。从到货时起使其自由摄取普通饲料和自来水，进行10天环境驯化后，开始进行试验。需要说明的是，在进行试验时，为了使待检测动物的运动前一天的肌力值与体重均等而分为下述的4组、各组6只。

(A)乳清蛋白组：给予乳清蛋白(给予容量10mL/kg BW。各组相同。)

(B)乳清肽组：给予含有BCAA二肽的蛋白水解物

(C)氨基酸混合物组：给予氨基酸混合物

(D)对照组：代替上述给予超纯水

[表2]

待检测动物/饲育环境条件

(2)待检测试样

作为向待检测动物给予的待检测试样，准备了下述3种试样。

(a)乳清蛋白

使用乳清蛋白浓缩物(WPC)。该乳清蛋白中的蛋白质含量为79.3g/100g(TATUA公司·分析值)。表3示出构成该乳清蛋白的氨基酸组成比。如下述表所示，氨基酸总量100质量％中包含的支链氨基酸(Leu、Ile、Val)的比例为20.9质量％。以给予容量10mL/kg体重中的乳清蛋白的质量(干燥重量)为3.6g/kg体重的方式溶解于超纯水中而得到样品作为待检测试样。

[表3]

％

(b)乳清肽：含有BCAA二肽的蛋白水解物

作为乳清肽，使用通过将前述乳清蛋白依据制造例1利用蛋白酶进行水解而制得的乳清蛋白水解物(干燥粉末物)。该乳清肽中的蛋白质含量为79.1g/100g。将该乳清肽中包含的BCAA二肽的含量示于表4。该BCAA二肽的含量是依据制造例1所述的LC/MS法进行分析而得到的值。

[表4]

	Ile-Leu	Val-Leu	Leu-Leu	Ile-Ile	Leu-Ile	Leu-Val	Ile-Val
								mg/g乳清肽	4.27	6.11	6.55	0.524	0.145	0.896	0.985
mg/g蛋白质	5.40	7.72	8.28	0.66	0.18	1.13	1.25

使前述的待检测试样乳清蛋白与蛋白质含量一致，将以给予容量10mL/kg体重中的乳清肽的质量(干燥重量)为3.6g/kg体重的方式溶解于超纯水中而得到样品作为待检测试样。

(c)氨基酸混合物

使用各种氨基酸(和光纯药)，制备由表3所示的乳清蛋白的氨基酸组成比组成的氨基酸混合物。使前述的待检测试样乳清蛋白与氮含量一致，将以给予容量10mL/kg体重中的氨基酸的总质量(干燥重量)为3.2g/kg体重的方式溶解于超纯水中而得到样品作为待检测试样。

(3)试验方法

对待检测动物(大鼠)进行驯化饲育后，分成4组(n＝6)，在第二天对各组的大鼠经口给药试验试样(给予容量10mL/kg体重)。此外在该经口给药30分钟后依据下述的方法进行强制性运动负荷，使其诱发肌肉损伤(0天)。另外从运动负荷起1小时后再次经口给药试验试样(给予量如前所述)。从运动负荷起1天后，依据下述的方法对全部待检测动物测定下肢肌力。

[强制运动负荷]

将大鼠在异氟醚麻醉下俯卧躺在大鼠踝关节用肌力测定装置的固定台上。将右下肢的膝盖压迫固定，将踝关节固定于平板上。将皮肤电极粘贴于腓，在刚开始电刺激(持续时间(Duration)：4ms，间隔(interval)：10ms，运行(train):150)后通过伺服电机使平板移动，以角速度180°/秒使踝关节背屈50度。需要说明的是，此处角速度是每单位时间(1秒)沿顺时针方向变化而产生的角度的量。这样的强制性运动负荷以每29秒1次的频率重复了40次。

[肌力测定法]

使用大鼠踝关节用肌力测定装置(大鼠·小鼠踝关节用肌肉功能评价运动装置：BioResearch Center,Co.,Ltd.)来进行大鼠的下肢肌力的测定。将大鼠在异氟醚麻醉下、俯卧固定于肌力测定装置的专用固定台上。将右下肢的膝盖压迫固定，固定于踝关节角度90°的方式平板上。将皮肤电极(Vitrode Vφ2VS-12JS3：日本光电)粘贴于右下肢的腓内侧部分和跟腱正上部，电刺激(持续时间(Duration)：4ms、间隔(Interval)10ms(刺激频率100Hz)，施加1次运行(Train)100(刺激时间1秒))，测定最大肌力。肌力测定共进行3次，采用最高的肌力值作为最大肌力。需要说明的是，第2次及之后的肌力测定从膝盖的压迫固定开始重复实施。

数据用平均值±标准误差表示。统计解析使用统计软件StatLight 2000(YukmusCo.,Ltd.)。组间的比较进行Tukey-Kramer的多重对比检验，组内的比较用成对t检验(paired t-test)进行检验，显著性水平低于5％。

2.试验结果

将自运动负荷之前一天(pre)开始至运动负荷1天后(运动次日)(第1天)为止的肌力变化示于图1。需要说明的是，图1示出将运动负荷前一天(Pre)的肌力设为100％时的相对值(％)。数据用平均值±标准误差表示。统计解析使用统计软件StatLight 2000(YukmusCo.,Ltd.)。组间的比较进行Tukey-Kramer的多重比较检验，组内的比较用paired t-test进行检验，显著性水平低于5％(试验例2也相同)。

如由图1可知的那样，确认了：对照组(-○-)在运动次日(第1天)的肌力与运动前(Pre)相比降低20.7％，相对于此，乳清肽组(-▲-)在运动次日的肌力与运动前相比降低至约4％，肌力的降低得到了显著抑制(p＝0.0028：Tukey-Kramer)。另一方面，乳清蛋白组(-黑色方块-)和氨基酸混合物组(-◇-)在运动次日的肌力与对照组的降低相比得到了抑制(约10～11％的降低)，但与对照组之间未观察到显著的差异。由该结果确认了，乳清肽(含有BCAA二肽的蛋白水解物)与乳清蛋白、氨基酸相比，通过在运动前或/和运动后将其经口摄取，从而抑制由运动导致的肌力下降的效果高。

另外由后述的试验例2的结果确认了，由运动导致的肌力下降是因运动负荷导致肌纤维损伤所引起的。由该结果可认为，通过在运动前或/和运动后经口摄取乳清肽(含有BCAA二肽的蛋白水解物)而使由运动引起的肌肉损伤得到了显著抑制(减轻)。

试验例2

作为乳清肽，使用以前述的表4所示的比例包含BCAA二肽的含有BCAA二肽的蛋白水解物，利用与试验例1同样的方法评价了将大鼠(参照表2)作为待检测对象的针对运动引发性肌肉损伤的抑制效果。

该乳清肽中的蛋白质含量为79.1g/100g。以给予容量10mL/kg体重中的乳清肽的质量(干燥重量)为3.6g/kg体重的方式、将该乳清肽溶解于超纯水中而得到样品作为待检测试样。

(1)试验方法

对待检测动物(大鼠)进行驯化饲育后，测定体重和肌力，为了使它们均等而分成下述的2组(n＝7)。

(A)乳清肽组：给予含有BCAA二肽的蛋白水解物

(B)对照组：代替上述给予超纯水

[肌力测定]

在次日，对各组经口给药待检测试样(给予容量10mL/kg体重)，在该经口给药30分钟后进行强制性运动负荷，引发肌肉损伤(0天)。从运动负荷起1小时后再次经口给药试验试样。测定从运动负荷起1天后和2天后共两次全部待检测动物的下肢肌力。

[血液中标记物]

作为肌肉损伤的指标(血液中标记物)，测定在运动后在血液中漏出的源自肌肉的蛋白：骨骼肌肌钙蛋白I(skm Tn-I)。具体而言，在从运动负荷起1天后测定肌力前、及从运动负荷起3天后由尾静脉採血，使用Rat Skeletal Muscle Troponin-I ELISA Kit(LifeDiagnostics)测定了制得的血清(200μL)中包含的骨骼肌肌钙蛋白I(skm Tn-I)量。

(2)试验结果

[肌力测定法]

将运动负荷前、从运动负荷起1天后(运动次日)(第1天)和从运动负荷起2天后(运动2天后)(第2天)的肌力的经时变化示于图2。需要说明的是，图2示出将运动负荷前一天(Pre)的肌力设为100％时的相对值(％)。由图2如可知的那样确认了，对照组(-○-)在运动次日(第1天)的肌力与运动前相比降低了30.6％，与此相对乳清肽组(-●-)在运动次日的肌力与运动前相比，降低了14.5％，肌力的降低得到了显著抑制(第1天:p＝0.0191、第2天:p＝0.0134：Tukey-Kramer)。进而确认了乳清肽组在从运动负荷起2天后(第2天)几乎恢复了肌力，与对照组相比肌力的恢复也快(肌力恢复促进)。

[血液中标记物]

对于各乳清肽组和对照组，将在从运动负荷起1天后(运动次日)(第1天)和3天后(第3天)测定了骨骼肌肌钙蛋白I(skm Tn-I)的结果示于图3。如图3所示，对照组中，确认了运动次日的血液中skm Tn-I浓度高，由于运动负荷而发生了肌肉损伤。与此相对乳清肽组，从运动次日(第1天)起血液中skm Tn-I浓度低，由该结果启示出乳清肽(含有BCAA二肽的蛋白水解物)抑制了由运动导致的肌纤维的损伤。特别是对于从运动负荷起3天后(第3天)的血液中skm Tn-I浓度，通过Student t-test检验证实了对照组与乳清肽组之间存在显著的差异(p＝0.0426)。

Claims

1.一种含有由支链氨基酸构成的二肽的蛋白水解物在用于制造用于抑制运动引发性肌肉损伤的组合物中的应用。

2.一种含有由支链氨基酸构成的二肽的蛋白水解物在用于制造用于促进运动引发性肌肉损伤的恢复的组合物中的应用。

3.一种含有由支链氨基酸构成的二肽的蛋白水解物在用于制造用于抑制起因于运动引发性肌肉损伤的肌肉不良状态的组合物中的应用。

4.一种含有由支链氨基酸构成的二肽的蛋白水解物在用于制造用于促进从起因于运动引发性肌肉损伤的肌肉不良状态恢复的组合物中的应用。

5.根据权利要求3或4所述的应用，其中，所述肌肉不良状态为选自由肌肉功能降低、肌肉疼痛、肌肉感觉到倦怠感、肌肉僵硬和肌肉紧张组成的组中的至少1种状态。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的应用，其中，所述由支链氨基酸构成的二肽为选自由至少Ile-Leu、Val-Leu、Leu-Leu、Ile-Ile、Leu-Ile、Leu-Val和Ile-Val组成的组中的至少任一者。

7.根据权利要求1～6中任一项所述的应用，其中，含有由支链氨基酸构成的二肽的蛋白水解物为含有由支链氨基酸构成的二肽的乳清蛋白水解物。

8.根据权利要求1～7中任一项所述的应用，其中，所述组合物为用于哺乳类的药物、准药物或饮食品。

9.根据权利要求8所述的应用，其中，所述饮食品为健康食品、功能性食品、营养辅助食品、功能性展示食品、特定保健用食品、患者用食品、婴幼儿用调制奶粉、孕产妇或哺乳期妇女用奶粉或为标示出用于抑制运动引发性肌肉损伤或/和促进运动引发性肌肉损伤的恢复的内容的饮食物。

10.一种运动引发性肌肉损伤的非治疗的抑制方法或/和从运动引发性肌肉损伤恢复的非治疗的恢复促进方法，其特征在于，让待检测哺乳类摄取或对其给予含有由支链氨基酸构成的二肽的蛋白水解物。

11.一种起因于运动引发性肌肉损伤的肌肉不良状态的非治疗的抑制方法或/和从肌肉不良状态恢复的非治疗的恢复促进方法，其特征在于，让待检测哺乳类摄取或对其给予含有由支链氨基酸构成的二肽的蛋白水解物。

12.根据权利要求10或11所述的方法，其中，针对待检测哺乳类的含有由支链氨基酸构成的二肽的蛋白水解物的摄取或给予是在选自待检测哺乳类的运动前、运动中和运动后中的至少1个阶段对待检测哺乳类进行经口摄取或给予。