CN112153976A

CN112153976A - 用于预防或治疗骨质疏松症的组合物

Info

Publication number: CN112153976A
Application number: CN201980018273.XA
Authority: CN
Inventors: 金洪植
Original assignee: Burns Co ltd
Current assignee: Burns Co ltd
Priority date: 2019-04-29
Filing date: 2019-09-19
Publication date: 2020-12-29
Anticipated expiration: 2039-09-19
Also published as: EP3750550B1; EP3750550A4; EP3750550A9; JP2021525222A; EP3750550A1; US20220118039A1; JP7089044B2; US11786572B2; US20210000900A1; KR102022983B1; CN112153976B; WO2020222369A1

Abstract

本发明涉及用于预防或治疗骨质疏松症的组合物，其包含龙胆草提取物和接骨木提取物，并且本发明的目的是提供用于预防或治疗骨质疏松症的组合物，其能够增加骨形成和抑制骨吸收。此外，本发明的另一目的是提供一种用于预防或治疗骨质疏松症的组合物，其通过包含天然产物龙胆草提取物和接骨木提取物而增加生物亲和性并且没有副作用，从而稳定地显示预防或治疗骨质疏松症的效果。

Description

用于预防或治疗骨质疏松症的组合物

技术领域

本申请要求基于2019年4月29递交的韩国专利申请No.10-2019-0049946的优先权的权益，并且将所述韩国专利申请文献中公开的全部内容并入作为本说明书的一部分。

本发明涉及用于预防或治疗骨质疏松症的组合物，其包含龙胆草(Gentianascabra)提取物和接骨木(Sambucus williamsii)提取物。

背景技术

随着我们进入老龄社会，骨代谢疾病作为主要问题出现，并且骨质疏松症占骨代谢疾病的最大比例。另一方面，骨质疏松症是这样一种疾病，其中由于钙代谢的不平衡而改变骨骼的组成，从而减少骨量并容易引起桡骨、股骨和椎骨的骨折，特别是在绝经后妇女中发病率最高，并且已报道雌激素分泌是主要原因。

骨重建甚至在骨生长结束后出现，通过该过程在成骨细胞的骨形成和破骨细胞的骨吸收之间维持体内平衡，并且正常条件下的骨组织具有骨形成和骨吸收的平衡。

成骨细胞祖细胞通过多种因子(例如BMP、ALP和TGF-β)分化而转化为成骨细胞，完全分化的成骨细胞通过非蛋白质和蛋白质组分以骨细胞的形式存在于骨基质中。另一方面，成骨细胞产生NK-kB配体的受体激活剂(RANKL)及其诱导受体(诱饵受体)OPG(护骨素)。

骨吸收的一个非常重要的过程是分化为破骨细胞，并且介导分化的主要配体是RANKL，并且当RANKL与作为破骨细胞祖细胞表面上的受体的RANK结合时，破骨细胞祖细胞成熟为破骨细胞，导致骨吸收。此外，在破骨细胞分化中起重要作用的基因是诸如NF-kB和c-FOS等物质。

然而，如果OPG(骨保护素)与RANKL结合，RANKL和RANK之间的结合被阻断，因此，破骨细胞的形成受到抑制，并且没有发生比所需更多的骨吸收。老龄骨的吸收或破坏是由血细胞(造血干细胞)产生的破骨细胞引起的，并且通过在骨中形成孔并将少量钙释放到血流中而用于维持身体功能。另一方面，由骨细胞产生的成骨细胞与胶原填充孔并覆盖钙和磷的沉积物(羟基磷灰石)以通过制造新的硬骨重建骨骼。

使骨开始分解并再次重新塑造成新骨的过程要花费约100天。婴儿时，骨钙在一年中改变100％，但成人后，每年约10％至30％的骨骼通过该过程被重建，并且破骨速率和成骨速率必须相同以保持与以前相同的骨密度。当这种重要骨中的平衡被破坏时，可能引起许多疾病，特别地，骨质疏松症是一种代表性的疾病。

作为已知的骨质疏松症的治疗方法，存在雌激素疗法、降钙素疗法、钙补充剂、维生素D衍生物疗法等，并且已经报道雌激素疗法和降钙素疗法是最常用的治疗方法，但是已经报道它们具有多重副作用和在施用时难以控制的缺点。为此，近年来，已经进行了通过开发无副作用且低成本的天然产品来治疗骨质疏松症的研究。

因此，作为使用天然产物的现有技术，韩国专利特开No.10-2017-0054115公开了用于预防或治疗骨质疏松症的药物组合物，其包含来自豆萌发胚芽的提取物，并且韩国专利No.10-178311公开了用于预防或治疗骨代谢疾病的组合物，其包含五味子(Schisandrachinensis)、杜仲(Eucommia ulmoides)和枸杞(Lycium barbarum)的组合提取物作为活性成分。

然而，上述现有技术表明，成骨细胞的增殖和分化能力或与成骨细胞相关的因子的表达可以通过使用天然产物来增加，但是由于现有技术没有公开破骨细胞对骨吸收的作用，因此有必要开发一种新的天然材料的骨质疏松症用治疗剂，其能够维持骨形成和骨吸收的体内平衡。

发明内容

技术问题

为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种用于预防或治疗骨质疏松症的组合物，其能够增加骨形成并抑制骨吸收。

此外，本发明的另一目的是提供一种用于预防或治疗骨质疏松症的组合物，其通过包含天然产物龙胆草提取物和接骨木提取物而增加生物亲和性并且没有副作用，从而稳定地显示预防或治疗骨质疏松症的效果。

技术方案

根据本发明的一个实施方式，本发明提供了一种用于预防或治疗骨质疏松症的组合物，其包含龙胆草提取物和接骨木提取物。

龙胆草提取物和接骨木提取物的混合重量比可以是1:0.1～10。

基于全部组合物的总重量，所述组合物以0.001重量％至100重量％的量包含龙胆草提取物和接骨木提取物。

龙胆草提取物和接骨木提取物可以通过热水提取进行提取。

所述组合物可以改善与骨形成相关的基因的表达。

与骨形成相关的基因可以是选自由ALP、骨钙素、BMP、TGF-β和护骨素组成的组中的一种或多种基因。

所述组合物可以抑制与骨吸收相关的基因的表达。

与骨吸收相关的基因可以是选自由NF-kB、c-FOS、NFATC-1、组织蛋白酶K和MMP-9组成的组中的一种或多种基因。

根据本发明的另一实施方式，本发明提供了一种制备用于预防或治疗骨质疏松症的组合物的方法。

所述制备组合物的方法可包括以下步骤：

1)将龙胆草和接骨木放入溶剂中加热，得到提取物；和

2)在减压下浓缩步骤1)获得的提取物。

上述步骤1)中的加热温度可以为80℃至100℃。

上述步骤2)可以在30℃至70℃下进行。

有利效果

本发明的用于预防或治疗骨质疏松症的组合物可以提供增加骨形成和抑制骨吸收的效果。

此外，本发明的用于预防或治疗骨质疏松症的组合物可以通过包含天然产物龙胆草提取物和接骨木提取物作为主要成分来增加生物亲和性并且没有副作用，从而稳定地提供预防或治疗骨质疏松症的效果。

附图说明

图1显示了根据本发明实施方式的提取物浓度的ALP活性测量结果，图1a、1b、1c、1d和1e分别显示了对应于参考例1、参考例2、实施例1、实施例2和实施例3的结果。

图2显示了根据本发明实施方式的提取物浓度的抗酒石酸酸式磷酸盐(TRAP)酶活性的测量结果，图2a、2b、2c、2d和2e分别显示了对应于参考例1、参考例2、实施例1、实施例2和实施例3的结果。

图3显示了根据本发明实施方式的提取物浓度的ALP基因表达水平的测量结果，图3a、3b、3c、3d和3e分别显示对应于参考例1、参考例2、实施例1，实施例2和实施例3的结果。

图4显示了根据本发明实施方式的提取物浓度的骨钙素基因表达水平的测量结果，图4a、4b、4c、4d和4e分别显示对应于参考例1、参考例2、实施例1、实施例2和实施例3的结果。

图5显示了根据本发明实施方式的提取物浓度的NFATC-1基因表达水平的测量结果，图5a、5b、5c、5d和5e分别显示了对应于参考例1、参考例2、实施例1、实施例2和实施例3的结果。

图6显示了根据本发明实施方式的提取物浓度的组织蛋白酶K基因表达水平的测量结果，图6a、6b、6c、6d和6e分别显示对应于参考例1、参考例2、实施例1、实施例2和实施例3的结果。

图7显示了根据本发明实施方式的提取物浓度的MMP-9基因表达水平的测量结果，图7a、7b、7c、7d和7e分别显示对应于参考例1、参考例2、实施例1、实施例2和实施例3的结果。

具体实施方式

在本发明中，为了与现有技术区别和清楚，以及为了便于掌握该技术，可以用夸大的表达来说明附图。另外，下文将要描述的术语是考虑到本发明中的功能而定义的术语，并且可以根据用户或操作者的意图或实践而变化，因此，这些术语的定义将必须基于贯穿本说明书的技术内容来进行。另一方面，实施方式仅仅是本发明的权利要求中呈现的要素的示例性内容，并不限制本发明的范围，本发明的范围应该基于本发明的整个说明书中的技术思想来解释。

本发明的一个实施方式的用于预防或治疗骨质疏松症的组合物包含龙胆草提取物和接骨木提取物作为活性成分。

本发明中使用的龙胆草是自生龙胆草(Gentiana scabra Bunge var.buergeri(Miquel)Maxim)主要分布在韩国、日本、中国东北和东西伯利亚，它是一种草本多年生植物，属于真双子叶纲、合瓣类、龙胆科、龙胆目，生长在山里的草地上。此外，它具有如已知功效那样的泻肝胆火盛的效果，用作消除湿热的试剂，用于泻肝胆火的试剂，苦味的胃药和利胆药，并且在消化、肝机能亢进和抗炎方面是有效的。

本发明人证实了作为龙胆草的新作用的促进骨形成和抑制骨吸收的作用，并且证实了龙胆草可以有效地用于预防或治疗骨代谢疾病中的骨质疏松症。

通常，已知龙胆草对于健胃、涨痛、疥疮、癫痫、盗汗、惊厥、蛔虫、心脏病、湿疹、胃炎、胃酸过多、胃酸过少、胃粘膜炎和胃病有效，但是本发明人首先证实它对于预防或治疗与骨代谢疾病有关的骨质疏松症有效。

在本发明的一个实施方式中，龙胆草可以是龙胆草的叶、芽、茎或根，但不限于此。优选是根。

本发明中使用的接骨木是属于接骨木属的夏绿灌木，并且具有通过激活血流来去除疼痛的功效，因此，它对于风湿型关节炎、下腰痛、骨折和外伤性出血是有效的，并且主要用于消除产后出血和挫伤。

本发明人证实，由于接骨木可以促进骨形成和抑制骨吸收，因此它可以有效地用于预防或治疗骨代谢疾病中的骨质疏松症。

在本发明中，术语“预防”是指通过施用组合物抑制或延迟骨质疏松症发作的所有作用。

在本发明中，术语“治疗”是指通过施用组合物改善或有益地改变由骨质疏松症引起的症状的所有作用。

在本发明的一个实施方式中，提取物可以通过选自溶剂提取法、超声提取法、超临界提取法以及通过发酵法和发泡法进行的提取法中的任何一种或多种方法获得，但不限于此。溶剂萃取方法的特征在于使用水、C₁-C₄低级醇或其混合溶剂。

在本发明中，作为提取方法，优选使用溶剂提取方法，更优选使用采用热水的溶剂提取法，但不限于此。

其中使用热水的溶剂提取方法不仅可以安全地提取天然产物中包含的活性成分，而且可以在不使用化合物的情况下萃取，从而减少最终产物或组合物可能产生的副作用并增加生物亲和性。

龙胆草提取物和接骨木提取物的混合重量比可以是1:0.1至10，优选1:0.4至2.5，但不限于此。其中，当混合重量比为1:0.1至10时，对骨形成的改善效果和对骨吸收的抑制效果可以相互平衡。

基于总组合物的总重量，龙胆草提取物和接骨木提取物的含量可以为0.001重量％至100重量％，优选为0.001重量％至50重量％，更优选为0.001重量％至20重量％，但不限于此。如果提取物的含量低于总组合物的0.001重量％，该浓度可能太低而不足以具有诱导骨形成和抑制骨吸收的效果。

基于总组合物，龙胆草提取物的含量可以是0.001重量％至99.999重量％，优选为0.001重量％至80重量％，更优选为30重量％至70重量％，但不限于此。

接骨木提取物的含量可以是0.001重量％至99.999重量％，优选为0.001重量％至80重量％，更优选为30重量％至70重量％，但不限于此。

组合物可以改善与骨形成相关的基因表达，其中所述基因表达是指其在成骨细胞祖细胞分化成成骨细胞的过程中或在成骨细胞变为骨细胞形式的过程中一起发生，并且其中所述基因可以是选自由ALP、骨钙素、BMP、TGF-β和护骨素组成的组中的一种或多种基因，优选为ALP和骨钙素，其是成骨细胞祖细胞分化成成骨细胞过程中最重要的因子，但不限于此。

ALP是存在于骨组织中的基因，并且已知当骨活跃生长时ALP增加其活性。

骨钙素是指在骨重建过程中由成骨细胞合成并与骨的细胞外基质结合的蛋白质。

此外，组合物可以抑制与骨吸收有关的基因表达，其中该基因表达是其指在分化为破骨细胞的过程中同时发生。其中所述基因可以是选自由NF-kB、c-FOS、NFATC-1、组织蛋白酶K和MMP-9组成的组中的一种或多种基因，优选是选自由NFATC-1、组织蛋白酶K和MMP-9组成的组中的一种或多种基因，但不限于此。

其中NFATC-1是在破骨细胞分化过程中表达增加的基因，而组织蛋白酶K和MMP-9是在破骨细胞分化过程继续时表达水平增加的基因。

本发明的组合物可以用作药物组合物，并且可以进一步包含选自由药学上可接受的载体、赋形剂和稀释剂组成的组中的一种或多种添加剂。因此，在本发明的药物组合物中进一步包括的添加剂的种类和量取决于本领域通常已知的那些。

本发明的组合物可包含药学上可接受的载体。包含药学上可接受的载体的组合物可以是各种制剂，如口服或肠胃外制剂。其使用稀释剂或赋形剂制备，例如填充剂、增量剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂和表面活性剂等，它们通常在配制时使用。用于口服施用的固体制剂包括片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂等，这些固体制剂通过将至少一种赋形剂例如淀粉、碳酸钙、蔗糖或乳糖、明胶等与一种或多种化合物混合来制备。除了简单的赋形剂外，还使用润滑剂如硬脂酸镁、滑石等。用于口服施用的液体制剂包括混悬剂、内用溶液、乳剂、糖浆剂等，并且除了通常使用的简单稀释剂如水和液体石蜡之外，还可以包括各种赋形剂，如润湿剂、甜味剂、调味剂、防腐剂等。用于肠胃外施用的制剂包括无菌水溶液、非水溶剂、混悬剂、乳剂、冻干制剂和栓剂。作为非水溶剂和悬浮溶剂，可以使用丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、可注射酯如油酸乙酯等。作为栓剂的基质，可以使用witepsol、macrogol、Tween 61、可可脂、laurinButter、甘油明胶等。

本发明的组合物可以通过将其适当地配制成以下的施用形式：口服施用剂型如片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、混悬剂、内用溶液、乳剂、糖浆剂等；和肠胃外施用剂，例如作为无菌可注射溶液等水溶液、非水溶剂、悬浮液和乳液、冻干制剂或栓剂等。

组合物可以通过任何常规途径施用，只要其可以到达靶组织。本发明的组合物可以根据需要通过腹膜内施用、静脉内施用、动脉内施用、肌内施用、骨内施用、子宫内施用、鞘内施用、皮下施用、皮内施用、口服施用、鼻内施用、肺内施用、直肠内施用、脑室内施用进行注射，但不限于此。此外，组合物可以通过任何能够将活性物质输送至靶细胞的装置施用。

本发明的组合物可以以药学上有效的量施用。

在本发明中，术语“药学上有效的量”是指足以以适用于医学治疗的合理的益处/风险比治疗疾病的量，并且有效剂量水平可以根据包括个体的种类和严重程度、年龄、性别、待感染病毒的类型、药物的活性、对药物的敏感性、施用时间、施用途径和排泄速率、治疗的持续时间、同时使用的药物等因素和医学领域熟知的其它因素来确定。

例如，基于龙胆草和接骨木的混合剂量，本发明的组合物可以每天0.01g至20g的量施用。具体地，在提取物的情况下，使用上述含量范围的龙胆草和接骨木制备的提取物可以被认为是每日剂量。

本发明的组合物可以作为单独的治疗剂施用或者可以与其它治疗剂联合施用，并且可以与常规治疗剂依次或同时施用。此外，可以单次或多次施用。考虑到所有上述因素，重要的是施用能够以最小量达到最大效果而没有副作用，并且可以由本领域技术人员容易地确定。

本发明的组合物可以单独使用或与使用手术、激素疗法、药物疗法和生物响应调节剂的方法联合使用，以预防或治疗骨质疏松症。

在另一实施方式中，本发明提供了用于预防或改善骨质疏松症的食品组合物，其包含龙胆草提取物和接骨木提取物作为活性成分。

其中龙胆草提取物和接骨木提取物与上述相同。

龙胆草提取物和接骨木提取物可以以可一直食用的食物的形式制备和摄取，并改善骨质疏松症。其中对食品中含有的龙胆草提取物和接骨木提取物的含量没有特别限制，但例如基于食品组合物总重量，其含量可以为0.001重量％至100重量％。当食品是饮料时，基于100ml，其含量可以例如为0.01g至60g，且例如为0.1g至60g。

此外，组合物可包括通常用于食品组合物中以改善气味、味道、视觉等的附加成分。例如，其可以包括维生素A、D、E、B1、B2、B6、B12、烟酸、生物素、叶酸、泛酸等。另外，其可以包括诸如锌(Zn)、铁(Fe)、钙(Ca)、铬(Cr)、镁(Mg)、锰(Mn)、铜(Cu)等的矿物。另外，其可以包括氨基酸如赖氨酸、色氨酸、半胱氨酸、缬氨酸等。此外，可以添加食品添加剂如防腐剂(山梨酸钾、苯甲酸钠、水杨酸、脱氢乙酸钠等)，杀菌剂(漂白粉和高级漂白粉、次氯酸钠等)，抗氧化剂(丁基羟基茴香醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)等)，着色剂(焦油色素等)，成色剂(亚硝酸钠等)，漂白剂(亚硫酸钠)，调味剂(MSG谷氨酸钠等)，甜味剂(甘素、环己氨基磺酸盐、糖精、钠等)，调味剂(香草醛、内酯等)，膨松剂(明矾、D-酒石酸氢钾等)，强化膳食补充剂，乳化剂，增稠剂(糊剂)，包衣剂，胶基，泡沫抑制剂，溶剂，改进剂等。根据食品的种类选择添加剂并以适当的量使用。

另一方面，可以使用龙胆草提取物和接骨木提取物制备用于改善骨质疏松症的功能性食品。

作为具体实例，可以使用食品组合物制备能够改善骨质疏松的加工食品，并且例如可以制备为糖果糕点、饮料、酒精饮料、发酵食品、罐装食品、牛奶加工食品、肉类加工食品或面条加工食品形式的功能性食品。其中糖果糕点包括饼干、馅饼、蛋糕、面包、糖果、果冻、口香糖、谷物(包括膳食替代产品如谷物薄片等)等。饮料包括饮用水、碳酸饮料、功能性运动饮料、果汁(例如苹果、梨、葡萄、芦荟、橘子、桃子、胡萝卜、番茄果汁等)、食酰(Sikhye)(糯米饮料)等。酒精饮料包括清酒、威士忌、烧酒(蒸馏酒)、啤酒、烈酒、果酒等。发酵食品包括酱油、豆酱、红辣椒酱等。罐装食品包括罐装海产品(例如罐装金枪鱼、罐装鲭鱼、罐装秋刀鱼、罐装马蹄螺等)、罐装肉(例如罐装牛肉、罐装猪肉、罐装鸡肉、罐装火鸡等)和罐装产品(例如罐装玉米、罐装桃子、罐装菠萝等)。牛奶加工食品包括奶酪、黄油、酸乳等。肉类加工食品包括猪肉片、牛肉片、鸡肉片、香肠，糖醋猪肉、肉块、Neobiani(腌制的烤牛肉片)等。面条加工食品包括挂面、细面、方便面、乌冬面、朝鲜冷面(冷面)、密封包装湿面等。除了这些之外，组合物可以用于蒸煮食品和汤等。

本发明中的术语“功能性食品”是与用于特殊健康用途的食品(FoSHU)相同的术语，并且是指具有高医疗和临床效果的食品，其被加工得有效地显示除营养供应之外的生物防治功能，其中所述食品可以以各种形式制备，例如片剂、胶囊、粉剂、颗粒、液体、丸剂等，以获得改善骨质疏松症的有用效果。

根据本发明的另一实施方式，本发明可以提供制备用于预防或治疗骨质疏松症的组合物的方法。

该组合物的制备方法包括以下步骤：

1)将龙胆草和接骨木放入溶剂中加热，得到提取物；和

2)在减压下浓缩步骤1)获得的提取物。

上述步骤1)是提取龙胆草和接骨木的活性成分的步骤，并且是通过用溶剂提取方法加热龙胆草和接骨木来有效提取活性成分的步骤。例如，可以是将龙胆草和接骨木分别放入水中并加热的步骤。

上述步骤1)中的加热温度可以为80℃至100℃。如果加热温度在80℃至100℃下进行，活性成分在执行过程中挥发或蒸发，同时快速提取活性成分。

上述步骤2)是在减压下浓缩上述步骤1)获得的龙胆草提取物和接骨木提取物的步骤。

此时，上述步骤2)可以在30℃至70℃下进行，当在此温度范围内浓缩时，可以减少浓缩时间。

在上述步骤2)之后，用于预防或治疗骨质疏松症的组合物的制备方法可以进一步包括以下步骤：

3)将上述步骤2)获得的浓缩提取物冻干；和

4)将上述步骤3)获得的粉末形式的龙胆草提取物和接骨木提取物混合。

上述步骤3)是将来自上述步骤2)的浓缩提取物冻干的步骤，通过该步骤可以获得粉末形式的龙胆草提取物和接骨木提取物。

然后，上述步骤4)是获得龙胆草提取物和接骨木提取物的混合物的步骤，并且可以由本领域技术人员容易地改变。

具体实施方式

在下文中，将描述本发明的优选实施方式。然而，本发明的实施方式可以以各种其他形式修改，并且本发明的范围不限于下面描述的实施方式。此外，提供本发明的实施方式以便向本领域技术人员更全面地描述本发明。

制备例1.龙胆草和接骨木提取物的制备

为了制备龙胆草提取物和接骨木提取物，将2L蒸馏水加入到各个100g原始样品中，并在90℃进行热水提取5小时。将过滤的提取液在50℃下减压浓缩，以通过冻干获得粉末形式的样品。龙胆草提取物和接骨木提取物的产率分别为15.4％和9.27％。

实施例

如下表1所列制备实施例，并根据上述制备例1制备表1所述的龙胆草提取物和接骨木提取物。

表1

实验例1.细胞毒性评价

在该实验例中，进行实验以证实当用本发明的接骨木提取物和龙胆草提取物处理时对细胞毒性的影响。

将1×10⁴个MC3T3-L1细胞接种到96孔板中，并将含有10％FBS的DMEM用作培养基。温育12小时后，每种提取物(实施例1至5)以100μg/ml至1000μg/ml处理并温育24小时。然后，向其中加入20μl的WST试剂，用箔阻挡光以最小化光引起的WST还原，并且反应进行3小时。使用iMARK^TM微板读数器(Bio-Rad Laboratories Headquarters，Hercules，CA，USA)在560nm波长下测量光密度。

用ED₅₀(细胞活力为50％时的浓度)表示的每种提取物的细胞毒性的获得结果示于下表2中。结果显示，本发明的龙胆草提取物和接骨木提取物即使在600μg/ml以上的高浓度下也是安全的。

表2

类别	ED<sub>50</sub>(μg/ml)
		参考例1	1779.12
参考例2	868.95
		实施例1	760.415
实施例2	814.69
		实施例3	678.93

实验例2.碱性磷酸酶活性(ALP活性)测量

在该实验例中，进行实验以证实当用本发明的龙胆草提取物和接骨木提取物浓缩处理时对碱性磷酸酶活性的影响。在另一方面，碱性磷酸酶(ALP，碱性磷酸酶)存在于大多数组织中，并且已知存在于骨组织中的ALP在骨生长活跃进行时增加其活性。

将5×10³个MC3T3-L1细胞接种到6孔板中，并加入50μg/ml抗坏血酸和10mMβ-甘油磷酸以诱导分化成成骨细胞。用浓度为50μg/ml、100μg/ml和200μg/ml的参考例1和2以及实施例1至3各自处理后，在5％CO₂培养箱中在37℃温育48小时，然后用PBS洗涤两次，向其中加入0.2％tritonX-100，随后在37℃培养箱中进行裂解30分钟。以2500rpm离心10分钟后，取上清液对蛋白质进行定量，向剩余的上清液中加入0.1N甘氨酸和100mM对硝基苯基磷酸酯(p-NPP)，在37℃温育30分钟，然后加入0.1N NaOH终止反应，测量405nm吸光度，计算经ALP酶转化为对硝基苯酚的量。结果如图1所示。图1中的NC是实验组，其中作为对照组没有进行处理。

如图1所示，证实了ALP活性随着各提取物浓度的增加而增加，并且证实了实施例1至3(图1c至1e)与参考例1(图1a)或参考例2(图1b)相比表现出更好的ALP活性。也就是说，证实了用龙胆草提取物和接骨木提取物处理时的ALP活性显著高于单独用龙胆草提取物或接骨木提取物处理时的ALP活性。因此，证实了本发明的龙胆草和接骨木具有优异的骨生长诱导效果。

实验例3.抗酒石酸酸性磷酸盐(TRAP)测量

在本实验例中，进行实验以证实当用本发明的龙胆草提取物和接骨木提取物浓缩处理时对破骨细胞分化程度的影响。具体地，通过测量当破骨细胞用于再吸收骨时TRAP酶的增大的活性，来证实对破骨细胞分化程度的影响程度如何。

另一方面，当破骨细胞用于再吸收骨，形成单核破骨细胞祖细胞，然后形成融合有细胞的多核成熟破骨细胞，并粘附于骨表面时，TRAP酶的活性增加。此外，TRAP在硝基苯基磷酸和ATP的存在下表现出活性，并且是唯一存在于破骨细胞中的溶骨酶。

首先，将1×10⁵个RAW 264.7破骨细胞前体细胞接种到6孔板中，并将RANKL以30ng/ml的浓度置于每个孔中，然后将用参考例1和2以及实施例1至3中的每一个处理的成骨细胞以50μg/ml、100μg/ml和200μg/ml的浓度用条件培养基处理并温育3天。用柠檬酸盐-丙酮和甲醛的混合溶液固定细胞后，制备50mM含有1.36mg/mL4-硝基苯基磷酸二钠盐和10mM酒石酸盐的柠檬酸盐缓冲液作为底物溶液，将底物溶液加入固定的细胞中，在5％CO₂培养箱中在37℃进行反应30分钟，然后用0.1N NaOH终止酶反应溶液的反应，在405nm波长下测量光密度三次，得到平均值和标准偏差，结果如图2所示。图2中的NC是实验组，其中作为对照组没有进行处理。

如图2所示，证实了随着各提取物浓度的增加，TRAP活性与未处理的实验组相比降低，并且证实了，与参考例1(图2a)或参考例2(图2b)相比，实施例1至3(图2c至2e)的TRAP酶活性更显著降低。也就是说，证实了用龙胆草提取物和接骨木提取物处理时的TRAP酶活性比单独用龙胆草提取物或接骨木提取物处理时更显著降低，因此证实了本发明的龙胆草提取物和接骨木提取物可以抑制骨吸收。

实验例4.前成骨细胞中的成骨细胞分化相关因子的表达的测量

进行实时PCR以证实当用龙胆草提取物和接骨木提取物处理时，成骨细胞分化相关因子是否在前成骨细胞中表达。首先，在将1×10⁵个MC3T3-E1细胞接种到12孔板中后，用参考例1和2以及实施例1至3中的每一个以50μg/ml、100μg/ml和200μg/ml的浓度处理，并温育48小时，然后回收细胞，并根据制造商的方案用RNeasy提取试剂盒(Qiagen，Gaithersburg，Maryland，USA)进行RNA提取。使用iScript cDNA合成试剂盒(Bio-RadLaboratories Headquarters，Hercules，CA，USA)合成cDNA。为了测量基因的表达，使用SYBR Green(iQ SYBR Green Supermix，Bio-Rad Bio-Rad Laboratories Inc.)进行实时定量PCR，并使用实时PCR(Applied Biosystems，FosterCity，CA，USA)作为装置。用于测量的基因的碱基序列如下表3所示。在实时PCR反应中，将2μl cDNA、10μl 2X SYBR混合物和1μl每种100pmol/μl正向和反向引物加入总共20μl内，其余用H₂O填充。PCR扩增步骤如下，扩增循环进行40个循环。在95℃下加热8分钟以热启动，然后在扩增步骤中重复在95℃下变性15秒，在55℃下退火30秒和在72℃下延伸30秒，并且在每个循环的延伸之后记录该值。完成所有循环后，进行解链曲线分析以证实引物的特异性。用Applied Biosystems提供的OneStep System软件v2.1分析结果。ALP基因表达水平的测定结果如图3所示，骨钙素基因表达水平的测定结果如图4所示。上述图3和图4的NC是实验组，其中没有进行成骨细胞分化诱导实验，作为对照组没有进行处理。

表3

如图3所示，证实了ALP基因的表达随着每种提取物浓度的增加而增加，并且证实了实施例1至3(图3c至3e)与参考例1(图3a)或参考例2(图3b)相比表现出更多的ALP基因表达。也就是说，证实了用龙胆草提取物和接骨木提取物处理时诱导ALP基因表达的效果优于单独用龙胆草提取物或接骨木提取物处理。因此，证实了本发明的龙胆草和接骨木具有优异的骨生长诱导效果。

如图4所示，证实了骨钙素(OC)的表达随着各提取物浓度的增加而增加，并且证实了实施例1至3(图4c至4e)与参考例1(图4a)或参考例2(图4b)相比显示出更多的骨钙素表达。也就是说，证实了用龙胆草提取物和接骨木提取物处理时诱导骨钙素表达的效果优于单独用龙胆提取物或接骨木提取物处理。另一方面，骨钙素(OC)是在骨重建过程中由成骨细胞合成的蛋白质，并且与骨的细胞外基质结合，因此证实本发明的龙胆草提取物和接骨木提取物可以诱导骨重建。

实验例5.前破骨细胞中的破骨细胞分化相关因子的表达的测量

进行实时PCR以证实当用龙胆草提取物和接骨木提取物处理时，破骨细胞分化相关因子是否在前破骨细胞中表达。首先，将5×10⁵个RAW 246.7细胞接种到12孔板中，并加入10ng/ml RNAKL和10ng/ml M-CSF以诱导分化成破骨细胞。将其用参考例1和2以及实施例1至3中的每一个以50μg/ml、100μg/ml和200μg/ml的浓度处理，并温育48小时，然后回收细胞，并根据制造商的方案用RNeasy提取试剂盒(Qiagen，Gaithersburg，Maryland，USA)进行RNA提取。使用iScript cDNA合成试剂盒(Bio-Rad Laboratories Headquarters，Hercules，CA，USA)合成cDNA。为了测量基因的表达，使用SYBR Green(iQ SYBR GreenSupermix，Bio-Rad Bio-Rad Laboratories Inc.)进行实时定量PCR，并使用实时PCR(Applied Biosystems，FosterCity，CA，USA)作为装置。用于测量的基因的碱基序列如上表3所示。在实时PCR反应中，将2μl cDNA、10μl 2X SYBR混合物和1μl每种100pmol/μl正向和反向引物加入总共20μl内，其余用H₂O填充。PCR扩增步骤如下，扩增循环进行40个循环。在95℃下加热8分钟以热启动，然后在扩增步骤中重复在95℃下变性15秒，在55℃下退火30秒和在72℃下延伸30秒，并且在每个循环的延伸之后记录该值。完成所有循环后，进行解链曲线分析以证实引物的特异性。用Applied Biosystems提供的One Step System软件v2.1分析结果。

成骨细胞分化由成骨细胞的结合启动，成骨细胞是核因子-kb配体(RANKL)的受体激活剂，它是从活化的T淋巴细胞分泌的破骨细胞诱导因子，并且它的受体RANK在破骨细胞祖细胞中表达。如果RANKL和RANK的结合进展，则c-fos和NFATC-1的表达增加，结果组织蛋白酶K和MMP9的表达增加，从而维持破骨细胞的分化。因此，在实验例5中，测量NFATC-1基因的表达水平，其结果如图5所示，测量组织蛋白酶K基因的表达水平，其结果如图6所示，测量MMP-9基因的表达水平，其结果如图7所示。上述图5和图7的NC是其中没有进行破骨细胞分化诱导实验且作为对照组没有进行处理的实验组，C是其中进行破骨细胞分化诱导实验但作为比较组没有进行处理的实验组。

如图5所示，证实了NFATC-1基因的表达随着各提取物浓度的增加而降低，并且证实了与参考例1(图5a)或参考例2(图5b)相比，实施例1至3(图5c至5e)的NFATC-1基因的表达水平显著降低。也就是说，证实了用龙胆草提取物和接骨木提取物处理时抑制NFATC-1基因表达的效果优于单独用龙胆草提取物或接骨木提取物处理。特别是，用实施例1至3以200μg/ml处理的结果证实，与在破骨细胞分化诱导后没有进行处理的实验组相比，NFATC-1基因的表达分别显著降低了54.96％、65.10％和76.56％。

如图6所示，证实了组织蛋白酶K基因的表达随着各提取物浓度的增加而降低，并且证实了与参考例1(图6a)或参考例2(图6b)相比，实施例1至3(图6c至6e)的组织蛋白酶K基因的表达水平显著降低。也就是说，证实了用龙胆草提取物和接骨木提取物处理时抑制组织蛋白酶K基因表达的效果优于单独用龙胆草提取物或接骨木提取物处理。特别是，用实施例1至3以200μg/ml处理的结果证实，与在破骨细胞分化诱导后没有进行处理的实验组相比，组织蛋白酶K基因的表达分别显著降低了46.98％、59.49％和74.98％。

如图7所示，证实了MMP-9基因的表达随着各提取物浓度的增加而降低，并且证实了，与参考例1(图7a)或参考例2(图7b)相比，实施例1-3(图7c至7e)的MMP-9基因的表达水平显著降低。也就是说，证实了用龙胆草提取物和接骨木提取物处理时抑制MMP-9基因表达的效果优于单独用龙胆草提取物或接骨木提取物处理。特别是，用实施例1至3以200μg/ml处理的结果证实，与在破骨细胞分化诱导后没有进行处理的实验组相比，MMP-9基因的表达分别显著降低了52.51％、58.17％和72.12％。

如上所述，已经参考附图中所示的示例描述了本发明，但是其仅仅是示例性的，并且应当理解，基于本领域的公知常识，各种修改和等效的其他示例是可能的。因此，本发明的真正技术保护范围基于下面将要描述的权利要求，并且必须基于上述发明的具体内容来确定。

<110> 金洪植

彭斯株式会社

<120> 用于预防或治疗骨质疏松症的组合物

<130> OP2019-310PCT

<160> 12

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GAPDH 正向引物

<400> 1

atggaaatcc catcaccatc t 21

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GAPDH 反向引物

<400> 2

cgccccactt gattttgg 18

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ALP 正向引物

<400> 3

ccgctttaac cagtgcaaca 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ALP 反向引物

<400> 4

cccgattcat cacggagatg 20

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Osteocalcin 正向引物

<400> 5

caggagggca gcgaggta 18

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Osteocalcin 反向引物

<400> 6

gctcccagcc attgataca 19

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NFATC-1 正向引物

<400> 7

tggcctcccg cttatctct 19

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NFATC-1 反向引物

<400> 8

ggataacgca ggcgaattgt 20

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Cathepsin K 正向引物

<400> 9

gataatgtga accatgcagt gttg 24

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Cathepsin K 反向引物

<400> 10

ccagtgcttg cttcccttct 20

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> MMP-9 正向引物

<400> 11

acgccacgca ttttcaaaa 19

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> MMP-9 反向引物

<400> 12

ggcccattcc ctccacat 18

Claims

1.一种用于预防或治疗骨质疏松症的组合物，其包含龙胆草提取物和接骨木提取物。

2.如权利要求1所述的用于预防或治疗骨质疏松症的组合物，其中，所述龙胆草提取物和所述接骨木提取物的混合重量比是1:0.1～10。

3.如权利要求1所述的用于预防或治疗骨质疏松症的组合物，其中，基于全部组合物的总重量，所述组合物以0.001重量％至100重量％的量包含龙胆草提取物和接骨木提取物。

4.如权利要求1所述的用于预防或治疗骨质疏松症的组合物，其中，所述龙胆草提取物和所述接骨木提取物通过热水提取进行提取。

5.如权利要求1所述的用于预防或治疗骨质疏松症的组合物，其中，所述组合物改善与骨形成相关的基因的表达。

6.如权利要求5所述的用于预防或治疗骨质疏松症的组合物，其中，所述与骨形成相关的基因是选自由ALP、骨钙素、BMP、TGF-β和护骨素组成的组中的一种或多种基因。

7.如权利要求1所述的用于预防或治疗骨质疏松症的组合物，其中，所述组合物抑制与骨吸收相关的基因的表达。

8.如权利要求7所述的用于预防或治疗骨质疏松症的组合物，其中，所述与骨吸收相关的基因是选自由NF-kB、c-FOS、NFATC-1、组织蛋白酶K和MMP-9组成的组中的一种或多种基因。

9.一种制备权利要求1所述的用于预防或治疗骨质疏松症的组合物的方法，其包括以下步骤：

1)将龙胆草和接骨木放入溶剂中加热，得到提取物；和

2)在减压下浓缩步骤1)获得的提取物。

10.如权利要求9所述的制备用于预防或治疗骨质疏松症的组合物的方法，其中，步骤1)中的加热温度为80℃至100℃。

11.如权利要求9所述的制备用于预防或治疗骨质疏松症的组合物的方法，其中，步骤2)在30℃至70℃下进行。