KR20200000957A - 프로피오니바크테리움 후레우덴레이키, 이의 배양액 또는 이의 사균체를 유효성분으로 함유하는 골질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
프로피오니바크테리움 후레우덴레이키, 이의 배양액 또는 이의 사균체를 유효성분으로 함유하는 골질환의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 골질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 장기간 투여에도 안전성이 우수하고, 조골세포 분화 촉진능 및 조골세포내의 칼슘 함량 증가 효과가 현저하게 우수하여, 골다공증을 예방 및 치료할 수 있는 프로피오니바크테리움 후레우덴레이키, 이의 배양액 또는 이의 사균체를 유효성분으로 함유하는 골질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 골질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 안전성이 우수한, 프로피오니바크테리움 후레우덴레이키, 이의 배양액 또는 이의 사균체를 유효성분으로 함유하는 골질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
골다공증은 골강도의 약화로 인해 작은 충격에도 쉽게 골절될 가능성이 높아지는 골격계 질환이다. 골의 강도는 골량(quantity)과 골질(quality)에 의해 결정되는데 골량은 골밀도(Bone Mineral Density)에 의해 결정되며, 골질은 골의 구조, 무기질화의 정도 등에 의하여 결정된다. 골다공증은 나이가 들면서 뼈의 생성과 손실의 균형이 파괴됨에 따라서 서서히 진행되기 때문에 직접적으로 골절이 발생되기 전까지는 자각증상이나 임상적인 소견이 발견되지 않는 특성을 지닌다. 골다공증은 폐경(제1형)이나 노화(제2형)로 인한 일차성 골다공증과 특정 약물복용이나 수술, 만성질환 등에 의한 골소실이 증가하여 발생하는 이차성 골다공증으로 나뉘어지며, 일차성 골다공증은 무엇보다 예방이 중요시 되어야 한다(임영욱 외, 대한고관절학회지, Vol.21 No.1, pp. 6-16, 2009).
국내 지역 코호트 기반 연구결과에 따르면 2010년 기준, 50세 이상 성인의 요추 골다공증 유병률은 여성 24%, 남성 12.9%였다. 또한 국민건강보험 자료에 의하면 60세 이전의 대퇴골 골절 빈도는 인구 10,000명당 5명 이지만 60세 이후부터는 골절 발생률이 증가하며, 75세 이후는 여성이 43명, 남성은 29명으로 나타났다. 평균수명의 연장과 노인인구의 증가로 인해 현재 전세계적으로 골다공증 환자가 증가하는 추세이며, 전문가들은 앞으로도 이 수치가 더욱 증가할 것으로 예측하고 있으며 사회경제적인 부담이 뒤따를 것으로 보고 있다.
현재, 골다공증 치료 및 예방에 쓰이고 있는 약제로는 골 흡수를 억제하는 에스트로겐(Estrogen), 선택적 에스트로겐 수용체 조절제(SERM), Bisphosphonate, Calcitonin 등이 있으며 골 합성을 촉진시키는 제제인 부갑상선 호르몬이 있으나, 뇌졸중, 관상동맥질환, 정맥 혈전증, 열성홍조 등의 안전성 문제와 약제 고용량 사용 시, 골소실을 유발하는 문제점이 있다.
현재 이러한 치료 약제들의 부작용 때문에, 장기간 투여에도 안전성이 보장되면서 골형성을 촉진하고 골소실을 억제하는 새로운 제제에 대한 연구가 이뤄지고 있다. 최근에는 다양한 논문들에서 골다공증이 장내세균과 연관이 되어있다는 사실이 보고되고 있으며(Fraser L. Collins et al., Microbiology spectrum, Vol.5 No.4, 2017, doi: 10.1128/microbiolspec.BAD-0015-2016), 프로바이오틱스가 장 건강뿐만 아니라 골다공증 예방에도 도움을 준다는 결과가 발표되었다. 또한, 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 등의 유산균들이 동물모델에서 bone volume, bone mineral density를 증가시키는 효과를 보였으나(Kolsoom Parvaneh et al., The Scientific World Journal, Volume 2014, Article ID 595962, 6 pages, 2014), 프로피오니바크테리움 후레우덴레이키(Propionibacterium freudenreichii)의 골 형성 촉진 효과는 아직 알려지지 않은 실정이다.
이에, 본 발명자들은 장기간 투여에도 안정성이 우수하고, 골세포 분화 촉진능 및 조골세포내의 칼슘 함량 증가 효과가 현저하게 우수한 골질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 찾고자 예의 노력한 결과, 프로피오니바크테리움 후레우덴레이키, 이의 배양액 또는 이의 사균체를 투여하면, 장기간 투여에도 안전성이 보장되며, 조골세포 분화 촉진능 및 조골세포내의 칼슘 함량 증가 효과가 현저하게 우수하다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 장기간 투여에도 안정성이 우수하고, 골 분화를 촉진능이 우수한 골질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 골질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물 및 식품 첨가물을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 프로피오니바크테리움 후레우덴레이키(Propionibacterium freudenreichii), 이의 배양액 또는 이의 사균체를 유효성분으로 함유하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 프로피오니바크테리움 후레우덴레이키, 이의 배양액 또는 이의 사균체를 유효성분으로 함유하는 골질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 프로피오니바크테리움 후레우덴레이키, 이의 배양액 또는 이의 사균체를 유효성분으로 함유하는 골질환의 예방 또는 개선용 식품 첨가물을 제공한다.
본 발명에 따른 골질환의 예방 또는 치료용 조성물은 기존의 골다공증 치료제에 비해 장기간 투여에도 안전성이 우수하고, 조골세포 분화 촉진능 및 조골세포내의 칼슘 함량 증가 효과가 현저하게 우수하여, 골다공증을 예방, 개선 및 치료할 수 있다.
도 1은 P. freudenreichii을 조골세포에 처리하여 독성여부를 측정한 실험 결과를 나타내는 것이다.
도 2는 P. freudenreichii을 조골세포에 처리한 후 Alkaline phosphatase activity 변화를 측정한 실험 결과를 나타내는 것이다.
도 3은 P. freudenreichii을 조골세포에 처리한 후 칼슘축적 및 무기질화 정도를 Alizarin red S 염색을 통해 관찰한 실험 결과를 나타내는 것이다.
도 4는 P. freudenreichii을 조골세포에 처리한 후 분화에 관여하는 다양한 인자들의 유전자 발현량을 mRNA 수준에서 측정한 결과를 나타내는 것이다.
도 5는 P. freudenreichii을 조골세포에 처리한 후 조골세포 분화에 관여하는 대표적 인자인 RUNX2의 발현량을 면역형광염색을 통해 단백질 수준에서 측정한 결과를 나타내는 것이다.
도 6은 P. freudenreichii을 조골세포에 처리한 후 조골세포 분화정도를 나타내는 지표인 OPG/RANKL ratio를 mRNA 수준에서 측정한 결과를 나타내는 것이다.
도 7은 P. freudenreichii을 조골세포에 처리한 후 조골세포 분화정도를 나타내는 지표인 OPG/RANKL ratio를 단백질 수준에서 측정한 결과를 나타내는 것이다.
도 2는 P. freudenreichii을 조골세포에 처리한 후 Alkaline phosphatase activity 변화를 측정한 실험 결과를 나타내는 것이다.
도 3은 P. freudenreichii을 조골세포에 처리한 후 칼슘축적 및 무기질화 정도를 Alizarin red S 염색을 통해 관찰한 실험 결과를 나타내는 것이다.
도 4는 P. freudenreichii을 조골세포에 처리한 후 분화에 관여하는 다양한 인자들의 유전자 발현량을 mRNA 수준에서 측정한 결과를 나타내는 것이다.
도 5는 P. freudenreichii을 조골세포에 처리한 후 조골세포 분화에 관여하는 대표적 인자인 RUNX2의 발현량을 면역형광염색을 통해 단백질 수준에서 측정한 결과를 나타내는 것이다.
도 6은 P. freudenreichii을 조골세포에 처리한 후 조골세포 분화정도를 나타내는 지표인 OPG/RANKL ratio를 mRNA 수준에서 측정한 결과를 나타내는 것이다.
도 7은 P. freudenreichii을 조골세포에 처리한 후 조골세포 분화정도를 나타내는 지표인 OPG/RANKL ratio를 단백질 수준에서 측정한 결과를 나타내는 것이다.
본 발명에서는 프로피오니바크테리움 후레우덴레이키(Propionibacterium freudenreichii), 이의 배양액 또는 이의 사균체를 골다공증 치료제로 사용하면 장기간 투여에도 안전성이 우수하고, 조골세포 분화 촉진능 및 조골세포내의 칼슘 함량 증가 효과가 현저하게 우수하다는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 프로피오니바크테리움 후레우덴레이키, 이의 배양액 또는 이의 사균체를 유효성분으로 함유하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서, 상기 배양액은 프로피오니바크테리움 후레우덴레이키를 배양 배지에서 배양하여 수용한 배양액, 농축 배양액, 배양액 건조물, 배양 여과액, 농축 배양 여과액, 또는 배양 여과액의 건조물을 의미하는 것으로 상기 균주를 포함하는 것, 배양한 후 균주를 제거한 배양여액일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프로피오니바크테리움 후레우덴레이키는 프로피오니바크테리움 후레우덴레이키 MJ2 (Propionibacterium freudenreichii KCCM12272P)(한국미생물보존센터)인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프로피오니바크테리움 후레우덴레이키는 프로피오니바크테리움 후레우덴레이키 MJ2 (Propionibacterium freudenreichii KCCM12272P)(한국미생물보존센터)의 사균체인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서, 상기 사균체는 상응한 생균체를 열처리하거나 포르말린 또는 기타 살균제와 함께 처리하여 제조할 수 있으며 사균체는 실질적으로 죽어 있는 것이어도 사용가능하다. 또한, 본 발명에서 사용한 상기 사균체는 하기와 같은 방법으로 제조될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 프로피오니바크테리움 후레우덴레이키 MJ2 (Propionibacterium freudenreichii KCCM12272P)(한국미생물보존센터) 사균체는, 프로피오니바크테리움 후레우덴레이키를 혐기성 조건 및 20~40 ℃의 온도범위에서 30~50시간동안 배양한 다음, 열처리를 거쳐 수득되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 상기 배양 시 사용할 수 있는 배지의 종류는 특별히 제한하지 않으나, 예를 들면, RCM (Reinforced Clostridial Medium) 배지를 사용할 수 있다.
또한, 상기 배양 시 상기 균주가 접종된 배지의 10 내지 100배 부피로 신선한 배지를 추가하여 1 내지 5시간 더 배양할 수 있다.
본 발명에서, 상기와 같은 배양으로 얻어진 배양액을 원심분리하여, 균주를 얻고, 희석한 후, 열처리를 통해 사균 처리할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 조골세포 분화 촉진 및 뼈세포 내 칼슘 축적을 증가시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서, 상기 조성물은 골세포 분화 촉진에 의해 골 형성을 촉진시켜 골다공증을 예방할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 골질환은 골결손, 골다공증, 골다공증성 골절, 당뇨병성 골절, 불유합골절, 골형성 부전증, 골연화증 및 이로 인한 골절, 골형성 장애, 퇴행성 골질환 또는 부정교합 중에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 골질환은 골다공증인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서, 골질환은 골 형성 또는 골 재생에 의해 치료 가능한 모든 질병을 포함한다.
본 발명에서, 용어 '예방'은, 상기 프로피오니바크테리움 후레우덴레이키, 이의 배양액 또는 이의 사균체를 함유하는 조성물의 투여로 질환을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 또한, 본 발명에서 사용되는 용어 '치료'는, 상기 프로피오니바크테리움 후레우덴레이키, 이의 배양액 또는 이의 사균체를 함유하는 조성물의 투여로 질환의 증세가 호전되거나 완치되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 일 실시예에서, Propionibacterium freudenreichii MJ2 (Propionibacterium freudenreichii KCCM12272P)(한국미생물보존센터) 사균을 통해 골분화 효과를 확인하기에 앞서 in vitro 상에서 미성숙한 조골세포 hFOB 1.19 cell line (American Type Culture Collection, USA)을 이용하여 농도별 사균에 대한 세포 독성 시험을 진행하여 독성이 없음을 확인한 후(도 1), 조골세포 분화 촉진 및 뼈세포내 칼슘 축적을 확인하는 실험을 수행하였다. 그 결과, 대조군에 비해, P. freudenreichii 사균을 처리한 조골세포은 ALP 활성이 증가하고(도 2), 칼슘이 많이 침착되며(도 3), 조골세포 분화관련 유전자 발현이 증가하고(도 4), RUNX2 발현량이 증가하며(도 5), OPG/RANKL ratio가 증가함을 확인하였다(도 6 및 도 7).
본 발명에서, ALP는 cell membrane에 결합되어있는 glycoprotein으로서 골 형성의 지표가 되며 조골세포 자체의 활성정도와 분화를 평가하는 수단으로 사용되고 있다.
본 발명에서, BMP-2(Bone Morphogenetic protein), Smad(Sma and Mad proteins from Caneorhaditis elegans and Drosphila, respectively), Runx2(Runt-related transcription factor 2)는 BMP-2/RUNX2 signaling pathway를 통해 조골세포의 분화에 관여하는 중요한 인자들이다.
본 발명에서, RUNX2는 조골세포 분화에 관여하는 핵심인자로서 bone-specific한 인자들의 발현량을 조절한다.
본 발명에서, 파골세포(Osteoclast)에서 발현되는 RANKL(Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand)과 조골세포(Osteoblast)에서 발현되는 RANK(Receptor activator of nuclear factor kappa-B)가 결합하게 되면 파골세포의 분화가 진행되어 골 흡수를 촉진시키게 된다. 이 두가지 인자의 결합을 막는 것이 OPG(Osteoprotegrin)이며 RANK와 경쟁적으로 작용함으로써 파골세포의 활성화를 막게 된다. 따라서 OPG/RANKL ratio의 증가는 파골세포의 분화는 억제하고 조골세포의 분화를 촉진시킨다는 지표가 된다.
본 발명에서, 현재 골다공증 치료 및 예방에 쓰이고 있는 약제인 에스트로겐은 폐경 이후에 에스트로겐 결핍에 의해 가속화되는 뼈 교체율을 감소시키는 효과를 나타내지만, 부작용으로 뇌졸증이나 관상동맥질환 등이 증가하였고, 이 때문에 미국 식품의약품안전청에서는 다른 치료제를 사용할 수 없는 여성 중 골다공증 위험이 높은 여성에게만 사용할 수 있도록 승인하였다. 선택적 에스트로겐 수용체 조절제는 비스테로이드성 물질로서 에스트로겐 수용체에 결합하여 기관에 따라 에스트로겐 또는 항에스트로겐 작용을 한다. 가장 널리 사용되는 것은 랄록시펜(raloxifene)으로 폐경 후 여성의 골소실을 줄여주기 때문에 골절 예방으로 쓰이며 골밀도를 증가시키지는 못하며, 부작용으로는 호르몬 사용시와 유사하게 정맥 혈전증과 열성홍조의 악화가 있다. 골다공증 치료제로 호르몬의 사용이 감소한 반면에 비스포스포네이트(bisphosphonate)의 사용은 점차 증가하여 현재 골다공증 약물 치료제의 대부분을 차지하고 있다. 비스포스포네이트 제제는 체내에서 무기질 표면에 부착된 후 파골세포(Osteoclast)내로 들어가서 여러 생화학과정을 방해함으로서 파골세포의 기능을 억제한다. 폐경 골다공증 여성 환자를 대상으로 한 연구결과에 의하면 비스포스포네이트 투여로 인해 골밀도가 증가하였고 골절의 빈도도 유의하게 감소하였으며, 독성이나 특별한 부작용이 관찰되지 않았다. 하지만 비스포스포네이트 장기간 투여시 안전성에 대한 의문이 꾸준히 제기되고 있다. 부갑상선 호르몬은 저용량을 간헐적으로 주사할 때 골형성 작용을 보이지만, 고용량을 지속적으로 주입할 때는 반대로 골소실을 유발하는 상반된 효과를 나타낸다. 부갑상선 호르몬은 간헐적으로 투여되었을 때 조골세포(Osteoblast)의 수와 작용을 증가시켜 골형성을 촉진시키지만, 지속적으로 투여되면서 RANKL(Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand)의 발현을 증가시키고 OPG(Osteoprotegerin)의 발현을 억제함으로써 조골세포의 분화는 억제하고, 파골세포의 분화를 촉진시킴으로써 골흡수를 증가시킨다고 알려져 있다(박주성, 대한가정의학회지, 3:25-32, 2013; 김희선 외, 한국임상약학회지, Vol.24 No.2, pp. 98-105, 2014).
본 발명에 따른 조성물은 상기 문제점을 해결하며, 골질환 치료효과도 우수하다.
본 발명에 따른 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜 또는 위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 kg 당 0.1 mg 내지 100 mg, 바람직하게는 0.2 mg 내지 17 mg을 매일 또는 격일로 투여하거나 1일 1회 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
상기 조성물을 제제화할 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다.
경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환자, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 유산균 사균체 프로피오니바크테리움 후레우덴레이키 MJ2 (Propionibacterium freudenreichii KCCM12272P)에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러가지 부형제, 예를들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결 건조 제제, 좌제 등이 포함된다.
비수성용제, 현탁 용제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸 렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween)61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 프로피오니바크테리움 후레우덴레이키, 이의 배양액 또는 이의 사균체를 유효성분으로 함유하는 골질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 프로피오니바크테리움 후레우덴레이키는 프로피오니바크테리움 후레우덴레이키 MJ2 (Propionibacterium freudenreichii KCCM12272P)(한국미생물보존센터)인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 프로피오니바크테리움 후레우덴레이키는 프로피오니바크테리움 후레우덴레이키 MJ2 (Propionibacterium freudenreichii KCCM12272P)(한국미생물보존센터)의 사균체인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프로피오니바크테리움 후레우덴레이키 MJ2 (Propionibacterium freudenreichii KCCM12272P)(한국미생물보존센터) 사균체는, 프로피오니바크테리움 후레우덴레이키를 혐기성 조건 및 20~40 ℃의 온도범위에서 30~50시간동안 배양한 다음, 열처리를 거쳐 수득되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 골질환은 골결손, 골다공증, 골다공증성 골절, 당뇨병성 골절, 불유합골절, 골형성 부전증, 골연화증 및 이로 인한 골절, 골형성 장애, 퇴행성 골질환 또는 부정교합 중에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 골질환은 골다공증인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 유산균 사균체 프로피오니바크테리움 후레우덴레이키 MJ2 (Propionibacterium freudenreichii KCCM12272P)(한국미생물보존센터)가 첨가되는 식품의 종류에는 특별한 제한이 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소시지, 빵, 비스킷, 떡, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제, 유제품 및 유가공 제품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 가공 식품 및 건강 기능 식품을 모두 포함한다.
본 발명에 따른 식품 조성물이 음료 조성물인 경우, 필수 성분이 지시된 비율로 상기 화합물을 함유하는 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를들어, 포도당, 과당등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아추출물, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100g 당 일반적으로 약 1 g 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 g 내지 10 g이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 프로피오니바크테리움 후레우덴레이키, 이의 배양액 또는 이의 사균체를 유효성분으로 함유하는 골질환의 예방 또는 개선용 식품 첨가물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 프로피오니바크테리움 후레우덴레이키는 프로피오니바크테리움 후레우덴레이키 MJ2 (Propionibacterium freudenreichii KCCM12272P)(한국미생물보존센터)의 사균체인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서, "개선"은 본 발명의 식품 조성물을 이용하여 골질환의 증상이 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위라면 제한 없이 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 식품 첨가제는 여러가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 첨가 비율은 제한되지 않으나, 본 발명의 리놀레산 100 중량부당 0.1 내지 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명의 프로피오니바크테리움 후레우덴레이키 MJ2 (Propionibacterium freudenreichii KCCM12272P)(한국미생물보존센터) 사균체는 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로 건강기능식품 내 본 발명의 조성물의 양은 전체 식품 중량부당 0.1 내지 90 중량부로 할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1:
Propionibacterium freudenreichii
의 생균, 사균 및 배양 상등액 준비
본 발명에서 사용한 Propionibacterium freudenreichii MJ2 (KCCM12272P)는 한국미생물보존센터에 기탁한 균을 사용하였다.
Propionibacterium freudenreichii의 생균, 사균 및 배양 상등액을 제조하기 위하여, 배지 RCM (Reinforced Clostridial Medium)에 3차례 이상 활성화시킨 균을 접종 후, GasPak (Franklin lakes, NJ, USA)을 이용해 혐기 환경을 조성하고 37℃에서 36 ~ 40시간 배양하였다. 배양된 균액을 3,000 rpm에서 원심분리시켜 모은 생균을 생리식염수(PBS, Phosphate-buffered saline)에 109 CFU/ml이 되도록 희석하여, 열 처리를 통해 사균 처리하여 사용하였다.
실시예 2:
P. freudenreichii
사균의 조골세포(Osteoblast)에 대한 독성여부확인
2-1. 조골세포(Osteoblast)배양 및
P. freudenreichii
사균의 처리
조골세포(Osteoblast)를 Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 Ham’s(DMEM/F12) 배지에 10% FBS(fetal bovine serum), 100 units/mL penicillin과 100 μg/mL streptomycin을 첨가하여 37℃ incubator에 5% CO2-95% 공기 조성으로 배양하였다. 세포가 80% confluence하게 자라면 0.25% trypsin을 이용하여 세포를 떼어내고, 5 x 104 cells/mL로 cell수를 조정한 후, 96 well에 200 μL씩 seeding 하였다. 37℃ incubator 에서 하루 동안 안정화 시킨 후, 세포의 주기를 맞추기 위해 serum이 포함되지 않은 DMEM/F12배지로 세포를 하루 동안 starvation시켰다. 그 후, P. freudenreichii 사균 (1 x 106, 1 x 107, 1 x 108 CFU/ml)을 처리하여 21일 동안 배양하였다.
2-2.
P. freudenreichii
사균의 조골세포내 독성유무 측정
3일, 7일, 14일, 21일 후, 상등액을 제거하고 5 mg/mL MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) (Amresco, USA)를 DMEM/F12 배지에 1/10 희석해서 넣고 37℃ incubator에서 30분간 반응시킨다. 보라색 결정이 생기면 상등액을 제거 후 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 100 μL 넣어 결정을 용해시킨 후, 균에 의한 혼탁도를 없애기 위해 3,000 x g에서 5분간 원심분리하여 상등액만 새로운 96 well로 옮긴다. Microplate reader를 이용하여 540 nm의 파장으로 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 P. freudenreichii 사균은 조골세포에 대해서 독성을 나타내지 않았다.
실시예 3:
P. freudenreichii
사균에 의한 조골세포 내 Alkaline phosphatase(ALP)의 활성정도 측정
ALP는 cell membrane에 결합되어있는 glycoprotein으로서 골 형성의 지표가 되며 조골세포 자체의 활성정도와 분화를 평가하는 수단으로 사용되고 있다. 이에 P. freudenreichii 사균에 의한 ALP의 활성정도 변화를 pNPP Alkaline phosphatase assay kit(Anaspec, Fremont, CA, USA)를 이용하여 측정하였다.
3-1. 조골세포(Osteoblast)배양 및
P. freudenreichii
사균의 처리
조골세포(Osteoblast)를 Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 Ham’s(DMEM/F12) 배지에 10% FBS(fetal bovine serum), 100 units/mL penicillin과 100 μg/mL streptomycin을 첨가하여 37℃ incubator에 5% CO2-95% 공기 조성으로 배양하였다. 세포가 80% confluence하게 자라면 0.25% trypsin을 이용하여 세포를 떼어내고, 5 x 104 cells/mL로 cell수를 조정한 후, 6 well에 2 mL씩 seeding 하였다. 37℃ incubator 에서 하루 동안 안정화 시킨 후, 세포의 주기를 맞추기 위해 serum이 포함되지 않은 DMEM/F12배지로 세포를 하루 동안 starvation시켰다. 그 후, P. freudenreichii 사균 (1 x 106, 1 x 107, 1 x 108 CFU/ml)을 처리하여 21일 동안 배양하였다.
3-2.
P. freudenreichii
사균에 의한 조골세포내 ALP 활성정도 측정
7일, 14일, 21일 후, 상등액을 제거하고 세포를 PBS로 세척한 후, 세포 pellet을 모아 Triton X-100이 포함된 Lysis buffer를 넣고, 세포 부유액을 4℃에서 10분 동안 vortexing하여 세포를 용해시켰다. 2,500 x g에서 10분간 원심분리한 후, 상등액을 새로운 microcentrifuge tube에 모았다. 96 well plate에 상등액 50 μl와 p-Nitrophenyl-phosphate (pNPP) 기질을 50 μl 넣어 상온에서 빛을 차단한 상태로 30분간 반응시킨 후, microplate reader를 이용하여 405 nm의 파장으로 흡광도를 측정하였다. ALP 활성정도는 Bradford assay를 통해 단백질 농도를 측정하여 보정하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 P. freudenreichii 사균 108 CFU/ml을 14일 혹은 21일간 처리한 그룹이 대조군에 비해 유의하게 ALP 활성이 증가하였다.
실시예 4:
P. freudenreichii
사균에 의한 조골세포 내 칼슘축적 측정
조골세포가 분화되면서 칼슘과 같은 미네랄 물질이 침착되어 조골세포의 무기질화가 일어난다. 이에 P. freudenreichii 사균에 의해 조골세포의 분화진행정도 및 무기질화를 Alizarin red S staining을 통해 측정하였다.
4.1 조골세포(Osteoblast) 배양 및
P. freudenreichii
사균의 처리
조골세포(Osteoblast)를 Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 Ham’s(DMEM/F12) 배지에 10% FBS(fetal bovine serum), 100 units/mL penicillin과 100 μg/mL streptomycin을 첨가하여 37℃ incubator에 5% CO2-95% 공기 조성으로 배양하였다. 세포가 80% confluence하게 자라면 0.25% trypsin을 이용하여 세포를 떼어내고, 2.5 x 104 cells/mL로 cell수를 조정한 후, 12 well에 1 mL씩 seeding 하였다. 37℃ incubator 에서 하루 동안 안정화 시킨 후, 세포의 주기를 맞추기 위해 serum이 포함되지 않은 DMEM/F12배지로 세포를 하루 동안 starvation시켰다. 그 후, P. freudenreichii 사균 (1 x 106, 1 x 107, 1 x 108 CFU/ml)을 처리하여 28일 동안 배양하였다.
4.2 알리자린 레드 에스 염색(Alizarin red S staining)
7일, 14일, 21일, 28일 후, 상등액을 제거한 후, 세포를 PBS로 세척한 후 70% ethanol로 4℃에서 1시간 동안 고정시켰다. Ethanol을 제거한 후, 세포를 증류수로 2번 세척하고 40 mM Alizarin red S 용액(pH 4.2로 조정) 1 mL을 넣고 상온에서 빛을 차단한 상태로 10분간 염색하였다. 염색시약을 제거하고 증류수로 2번 세척한 후, 광학현미경을 통해 관찰하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 P. freudenreichii 사균을 7일, 14일, 21일, 28일간 처리한 그룹이 대조군에 비해 칼슘이 많이 침착되고 무기질화되어 농도 의존적으로 붉은색이 증가한 것을 확인할 수 있었다.
실시예 5:
P. freudenreichii
사균에 의한 조골세포 분화관련 유전자 발현
BMP-2(Bone Morphogenetic protein), Smad(Sma and Mad proteins from Caneorhaditis elegans and Drosphila, respectively), Runx2(Runt-related transcription factor 2)는 BMP-2/RUNX2 signaling pathway를 통해 조골세포의 분화에 관여하는 중요한 인자들이다. 이에 P. freudenreichii 사균처리에 의한 유전자들의 발현량을 mRNA 수준에서 측정하였다.
5.1 조골세포(Osteoblast)배양 및
P. freudenreichii
사균의 처리
조골세포(Osteoblast)를 Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 Ham’s(DMEM/F12) 배지에 10% FBS(fetal bovine serum), 100 units/mL penicillin과 100 μg/mL streptomycin을 첨가하여 37℃ incubator에 5% CO2-95% 공기 조성으로 배양하였다. 세포가 80% confluence하게 자라면 0.25% trypsin을 이용하여 세포를 떼어내고, 5 x 104 cells/mL로 cell수를 조정한 후, 6 well에 2 mL씩 seeding 하였다. 37℃ incubator 에서 하루 동안 안정화 시킨 후, 세포의 주기를 맞추기 위해 serum이 포함되지 않은 DMEM/F12배지로 세포를 하루 동안 starvation시켰다. 그 후, P. freudenreichii 사균 (1 x 106, 1 x 107, 1 x 108 CFU/ml)을 처리하여 21일 동안 배양하였다.
5.2 RNA 분리 및 발현량 측정
Trizol을 이용하여 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 Revert Aid First Strand cDNA kit(Fermentas, EU)를 이용하여 cDNA로 conversion한 후, DyNamo™HS SYBR Green qPCR kit(FINNZYMES, Finland) 시약으로 StepOnePlus™Real-Time PCR System(AppliedBiosystems, FosterCity, CA, USA) 기계를 사용하여 real time PCR을 진행하였다. 사용된 primer의 sequence는 GAPDH (Forward(서열번호 1): 5′- GAG TCA ACG GAT TTG GTC GT -3′, Reverse(서열번호 2): 5′- GAC AAG CTT GTT CTC AG -3′), BMP-2 (Forward(서열번호 3): 5′- CCC AGC GTG AAA AGA GAG AC -3′, Reverse(서열번호 4): 5′- GAG ACC GCA GTC CGT CTA AG -3′), Samd1 (Forward(서열번호 5): 5′- GGT TCC AAG ACA CAG CGA AT -3′, Reverse(서열번호 6): 5′- TGG GAG AGT GAG GGT AGG TG -3′), Smad5 (Forward(서열번호 7): 5′- AAC CTG AGC CAC AAT GAA CC -3′, Reverse(서열번호 8): 5′- GTG GCA TAT AGG CAG GAG GA -3′), Smad8 (Forward(서열번호 9): 5′- CCA CAG AAG CCT CTG AGA CC -3′, Reverse(서열번호 10): 5′- CCC AAC TCG GTT GTT CAG TT -3′), Smad4 (Forward(서열번호 11): 5′- AAA GGT GAA GGT GAT GTT TGG GTC -3′, Reverse(서열번호 12): 5′- CTG GAG CTA TTC CAC CTA CTG ATC C -3′), RUNX2 (Forward(서열번호 13): 5′- GCA GAC AGC TCA CAA AAC CA -3′, Reverse(서열번호 14): 5′- GGA AAA GGG GAG AAG GAG TG -3′)이다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 P. freudenreichii 사균 107 CFU/ml과 108 CFU/ml을 처리한 그룹이 대조군에 비해 유전자들의 발현량이 mRNA 수준에서 유의하게 증가하였다.
실시예 6:
P. freudenreichii
사균에 의한 RUXN2 단백질 발현 측정
RUNX2는 조골세포 분화에 관여하는 핵심인자로서 bone-specific한 인자들의 발현량을 조절한다. 이에 P. freudenreichii 사균처리에 의한 RUNX2의 발현량을 protein 수준에서 측정하였다.
6.1 조골세포(Osteoblast)배양 및
P. freudenreichii
사균의 처리
조골세포(Osteoblast)를 Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 Ham’s(DMEM/F12) 배지에 10% FBS(fetal bovine serum), 100 units/mL penicillin과 100 μg/mL streptomycin을 첨가하여 37℃ incubator에 5% CO2-95% 공기 조성으로 배양하였다. 세포가 80% confluence하게 자라면 0.25% trypsin을 이용하여 세포를 떼어내고, 1 x 104 cells/mL로 cell수를 조정한 후, Coverslip을 미리 깔아둔 24 well에 0.5 mL씩 seeding 하였다. 37℃ incubator 에서 하루 동안 안정화 시킨 후, 세포의 주기를 맞추기 위해 serum이 포함되지 않은 DMEM/F12 배지로 세포를 하루 동안 starvation시켰다. 그 후, P. freudenreichii 사균 (1 x 106, 1 x 107, 1 x 108 CFU/ml)을 처리하여 21일 동안 배양하였다.
6.2 면역형광염색
21일 후, 4% formaldehyde로 세포를 고정시킨 후에 Antibody를 이용해 면역형광염색을 진행하였다. 사용된 1차 Ab는 anti-RUNX2 (Abcam ab 23981)이고 2차 Ab는 Anti-rabbit, DyLight (Thermo 84546)이다. 염색을 진행한 후, confocal laser scanning microscope (Nikon, Tokyo, Japan)을 이용하여 세포를 관찰하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 P. freudenreichii 사균을 처리한 그룹이 대조군에 비해 RUNX2 발현량이 protein 수준에서 농도 의존적으로 증가함을 알 수 있었다.
실시예 7:
P. freudenreichii
사균에 의한 OPG, RANKL 유전자 발현
파골세포(Osteoclast)에서 발현되는 RANKL (Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand)과 조골세포(Osteoblast)에서 발현되는 RANK (Receptor activator of nuclear factor kappa-B)가 결합하게 되면 파골세포의 분화가 진행되어 골 흡수를 촉진시키게 된다. 이 두가지 인자의 결합을 막는 것이 OPG (Osteoprotegrin)이며 RANK와 경쟁적으로 작용함으로써 파골세포의 활성화를 막게 된다. 따라서 OPG/RANKL ratio의 증가는 파골세포의 분화는 억제하고 조골세포의 분화를 촉진시킨다는 지표가 된다. 이에 두 가지 인자의 유전자 발현량을 mRNA 수준에서 측정하였다.
7.1 조골세포(Osteoblast)배양 및
P. freudenreichii
사균의 처리
조골세포(Osteoblast)를 Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 Ham’s(DMEM/F12) 배지에 10% FBS(fetal bovine serum), 100 units/mL penicillin과 100 μg/mL streptomycin을 첨가하여 37℃ incubator에 5% CO2-95% 공기 조성으로 배양하였다. 세포가 80% confluence하게 자라면 0.25% trypsin을 이용하여 세포를 떼어내고, 5 x 104 cells/mL로 cell수를 조정한 후, 6 well에 2 mL씩 seeding 하였다. 37℃ incubator 에서 하루 동안 안정화 시킨 후, 세포의 주기를 맞추기 위해 serum이 포함되지 않은 DMEM/F12배지로 세포를 하루 동안 starvation시켰다. 그 후, P. freudenreichii 사균 (1 x 106, 1 x 107, 1 x 108 CFU/ml)을 처리하여 21일 동안 배양하였다.
7.2 RNA 분리 및 발현량 측정
Trizol을 이용하여 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 Revert Aid First Strand cDNA kit(Fermentas, EU)를 이용하여 cDNA로 conversion한 후, DyNamo™HS SYBR Green qPCR kit(FINNZYMES, Finland) 시약으로 StepOnePlus™Real-Time PCR System(AppliedBiosystems, FosterCity, CA, USA) 기계를 사용하여 real time PCR을 진행하였다. 사용된 primer의 sequence는 OPG (Forward(서열번호 15): 5′- TGA GGA GGC ATT CTT CAG GT -3′, Reverse(서열번호 16): 5′- CGC TGT TTT CAC AGA GGT CA -3′), RANKL (Forward(서열번호 17): 5′- AGG CCT TTC AAG GAG CTG TG -3′, Reverse(서열번호 18): 5′- TTG GAG ATC TTG GCC CAA CC -3′)이다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이 P. freudenreichii 사균 108 CFU/ml을 처리한 그룹이 대조군에 비해 OPG 유전자의 발현량은 증가하고, RANKL 유전자의 발현량은 거의 변화가 없어, 결과적으로 OPG/RANKL ratio가 증가함을 알 수 있었다.
실시예 8:
P. freudenreichii
사균에 의한 OPG, RANKL 단백질 발현
8.1 조골세포(Osteoblast) 배양 및
P. freudenreichii
사균의 처리
조골세포(Osteoblast)를 Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 Ham’s(DMEM/F12) 배지에 10% FBS(fetal bovine serum), 100 units/mL penicillin과 100 μg/mL streptomycin을 첨가하여 37℃ incubator에 5% CO2-95% 공기 조성으로 배양하였다. 세포가 80% confluence하게 자라면 0.25% trypsin을 이용하여 세포를 떼어내고, 5 x 104 cells/mL로 cell수를 조정한 후, 60-mm dish에 4 mL씩 seeding 하였다. 37℃ incubator 에서 하루 동안 안정화 시킨 후, 세포의 주기를 맞추기 위해 serum이 포함되지 않은 DMEM/F12배지로 세포를 하루 동안 starvation시켰다. 그 후, P. freudenreichii 사균 (1 x 106, 1 x 107, 1 x 108 CFU/ml)을 처리하여 21일 동안 배양하였다.
8.2 OPG, RANKL 단백질 발현 측정
21일 후, Pro-prep extraction solution(Intron, Seoul, Korea)을 통해 세포를 용해시키고 단백질을 추출하였다. Bradford assay를 통해 정량화한 단백질 20 μg을 전기영동하여 분리시키고 polyvinlidene difluoride(PVDF) membrane(Millipore, Bedford, MA, USA)에 transfer시켰다. 5% non-fat skimmed milk를 이용하여 membrane을 blocking시키고 순차적으로 1차 Ab[anti-β-actin (1:5,000 dilution, Thermo MA5-15739), anti-OPG (1:1,000 dilution, Genetex GTX55734), anti-RANKL (1:1,000 dilution, Genetex GTX32834)], anti-β-actin을 위한 2차 Ab [(anti-goat anti-mouse IgG (H+L) horseradish peroxidase conjugated antibody (NCI1430KR, Thermo Scientific)], anti-OPG와 anti-RANKL을 위한 2차 Ab [goat anti-rabbit IgG (H+L) horseradish peroxidase conjugated antibody (NCI1460KR, Thermo Scientific)]를 반응시킨 후, SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate kit(Thermo Fisher Scientific)를 이용해 밴드를 측정하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이 P. freudenreichii 사균을 처리한 그룹에서 OPG 발현량이 대조군에 비해 농도의존적으로 증가하고, RANKL 발현량은 거의 일정하게 나타나, 결과적으로 OPG/RANKL ratio가 증가하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Korea University Research and Business Foundation
<120> Compositions for Treatment or Prevention of Bone Diseases
Comprising Propionibacterium freudenreichii, it culture broth or
heat killed Propionibacterium freudenreichii as an active
ingredient
<130> DHP18-318
<160> 18
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH Forward primer
<400> 1
gagtcaacgg atttggtcgt 20
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH Reverse primer
<400> 2
gacaagcttg ttctcag 17
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BMP-2 Forward primer
<400> 3
cccagcgtga aaagagagac 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BMP-2 Reverse primer
<400> 4
gagaccgcag tccgtctaag 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Samd1 Forward primer
<400> 5
ggttccaaga cacagcgaat 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Samd1 Reverse primer
<400> 6
tgggagagtg agggtaggtg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Smad5 Forward primer
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aacctgagcc acaatgaacc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Smad5 Reverse primer
<400> 8
gtggcatata ggcaggagga 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Smad8 Forward primer
<400> 9
ccacagaagc ctctgagacc 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Smad8 Reverse primer
<400> 10
cccaactcgg ttgttcagtt 20
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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aaaggtgaag gtgatgtttg ggtc 24
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<212> DNA
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<220>
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ctggagctat tccacctact gatcc 25
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<211> 20
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RUNX2 Forward primer
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gcagacagct cacaaaacca 20
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ggaaaagggg agaaggagtg 20
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<220>
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tgaggaggca ttcttcaggt 20
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<220>
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<220>
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aggcctttca aggagctgtg 20
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RANKL Reverse primer
<400> 18
ttggagatct tggcccaacc 20
Claims (15)
- 프로피오니바크테리움 후레우덴레이키(Propionibacterium freudenreichii), 이의 배양액 또는 이의 사균체를 유효성분으로 함유하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 프로피오니바크테리움 후레우덴레이키는 프로피오니바크테리움 후레우덴레이키 MJ2 (Propionibacterium freudenreichii KCCM12272P)(한국미생물보존센터)인 것을 특징으로 하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 프로피오니바크테리움 후레우덴레이키는 프로피오니바크테리움 후레우덴레이키 MJ2 (Propionibacterium freudenreichii KCCM12272P)(한국미생물보존센터)의 사균체인 것을 특징으로 하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 프로피오니바크테리움 후레우덴레이키 MJ2 (Propionibacterium freudenreichii KCCM12272P)(한국미생물보존센터) 사균체는, 프로피오니바크테리움 후레우덴레이키를 혐기성 조건 및 20~40 ℃의 온도범위에서 30~50시간동안 배양한 다음, 열처리를 거쳐 수득되는 것을 특징으로 하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 조골세포 분화 촉진 및 뼈세포 내 칼슘 축적을 증가시키는 것을 특징으로 하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 골질환은 골결손, 골다공증, 골다공증성 골절, 당뇨병성 골절, 불유합골절, 골형성 부전증, 골연화증 및 이로 인한 골절, 골형성 장애, 퇴행성 골질환 또는 부정교합 중에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 골질환은 골다공증인 것을 특징으로 하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 프로피오니바크테리움 후레우덴레이키(Propionibacterium freudenreichii), 이의 배양액 또는 이의 사균체를 유효성분으로 함유하는 골질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- 제8항에 있어서, 상기 프로피오니바크테리움 후레우덴레이키는 프로피오니바크테리움 후레우덴레이키 MJ2 (Propionibacterium freudenreichii KCCM12272P)(한국미생물보존센터)인 것을 특징으로 하는 골질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- 제8항에 있어서, 상기 프로피오니바크테리움 후레우덴레이키는 프로피오니바크테리움 후레우덴레이키 MJ2 (Propionibacterium freudenreichii KCCM12272P)(한국미생물보존센터)의 사균체인 것을 특징으로 하는 골질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- 제10항에 있어서, 상기 프로피오니바크테리움 후레우덴레이키 MJ2 (Propionibacterium freudenreichii KCCM12272P)(한국미생물보존센터) 사균체는, 프로피오니바크테리움 후레우덴레이키를 혐기성 조건 및 20~40℃의 온도범위에서 30~50시간동안 배양한 다음, 열처리를 거쳐 수득되는 것을 특징으로 하는 골질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- 제8항에 있어서, 상기 골질환은 골결손, 골다공증, 골다공증성 골절, 당뇨병성 골절, 불유합골절, 골형성 부전증, 골연화증 및 이로 인한 골절, 골형성 장애, 퇴행성 골질환 또는 부정교합 중에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 골질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- 제12에 있어서, 상기 골질환은 골다공증인 것을 특징으로 하는 골질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- 프로피오니바크테리움 후레우덴레이키(Propionibacterium freudenreichii), 이의 배양액 또는 이의 사균체를 유효성분으로 함유하는 골질환의 예방 또는 개선용 식품 첨가물.
- 제14항에 있어서, 상기 프로피오니바크테리움 후레우덴레이키는 프로피오니바크테리움 후레우덴레이키 MJ2 (Propionibacterium freudenreichii KCCM12272P)(한국미생물보존센터)의 사균체인 것을 특징으로 하는 골질환의 예방 또는 개선용 식품 첨가물.
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|---|---|---|---|---|
| KR20220095021A (ko) | 2020-12-29 | 2022-07-06 | 한국코러스 주식회사 | 락토바실러스 쿠르바투스 WiKim38 균주 및 부형제를 포함하는 골 질환 개선, 예방 또는 치료용 조성물 |
| KR20220107541A (ko) * | 2021-01-25 | 2022-08-02 | 고려대학교 산학협력단 | 프로피오니박테리움 프레우덴레키 mj2 균주를 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염 예방, 치료, 또는 개선용 조성물 |
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| WO2022158922A3 (ko) * | 2021-01-25 | 2022-09-15 | 고려대학교 산학협력단 | 프로피오니박테리움 프레우덴레키 mj2 균주를 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염 예방, 치료, 또는 개선용 조성물 |
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