WO2019088478A1 - 유산균 유래의 세포밖 베지클을 포함하는 면역조절용 조성물 - Google Patents

유산균 유래의 세포밖 베지클을 포함하는 면역조절용 조성물 Download PDF

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WO2019088478A1
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lactic acid
extracellular vesicles
lactobacillus
acid bacteria
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조은경
김완일
이태룡
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Definitions

  • an immunomodulating composition comprising an extracellular vesicle derived from lactic acid bacteria as an active ingredient is disclosed.
  • extracellular vesicles Most animal cells have the ability to secrete extracellular vesicles of intracellular origin with varying sizes and components, and such extracellular vesicles include the blood, urine, saliva, and cell culture fluids It is found in all biological fluids. Prokaryotic or eukaryotic cells are also known to secrete extracellular vesicles.
  • the extracellular vesicles are small in size, ranging from about 20 nm in diameter to about 5 ⁇ m in diameter, and are heterogeneous in their size and composition. Exosome (about 20 to 100 nm) And include a number of different species such as ectosomes, microvesicles (about 100-1,000 nm), microparticles, apoptotic bodies (about 1-5 ⁇ m), and the like.
  • the different types of extracellular vesicles can be determined by their origin, diameter, density in sucrose, shape, sedimentation rate, lipid composition, protein marker or secretion mode (i.e. signal (inducible) ) Or the like).
  • the microfilament is a membrane vesicle having an irregular shape of about 100 to 1,000 nm, which is originated from the plasma membrane (originating from the plasma membrane) toward the outside of the plasma membrane, and contains a marker including an integrin, selectin, CD40 ligand and the like, a phosphatidylserine- ≪ / RTI >
  • exosomes are the smallest membrane vesicles having a cup shape of about 20 to 100 nm (< 200 nm) and originate from the endosomes (originating from the endosomes) of the late endosomes and generally contain CD63, CD9 tetraspanin, It is known to have lipids including TSG101,
  • extracellular vesicles reflect the state of secretory cells (donor cells), and exhibit various biological activities depending on the secretion from certain cells. They transfer genetic material and proteins between cells, -to-cell communication.
  • lactic acid bacteria which is a representative microorganism useful for the human body, is a bacterium that decomposes sugars such as glucose or lactose to produce organic acids such as lactic acid and acetic acid. Lactic acid bacteria have been used to produce fermented foods such as fermented milk, cheese, and butter through a fermentation process of producing an organic acid from a sugar. However, the immunomodulatory effect of extracellular vesicles as a complex physiologically active substance derived from lactic acid bacteria has not been disclosed.
  • the present invention aims to provide an immunomodulating composition
  • an extracellular vesicle which is a complex physiologically active substance derived from a lactic acid bacterium, as an active ingredient.
  • the present disclosure provides an immunomodulating composition comprising an extracellular vesicle derived from lactic acid bacteria as an active ingredient.
  • the lactic acid bacterium may be a strain of the genus Latobacillus .
  • the Lactobacillus spp. Strain may be Lactobacillus plantarum .
  • the Lactobacillus plantarum may be Lactobacillus plantarum APsulloc 331261 with accession number KCCM 11179P.
  • the extracellular vesicle may be exosomes.
  • the extracellular vesicles may have a diameter of 20 to 200 nm.
  • the composition may be one which induces differentiation into M2 type macrophages.
  • the composition may be one that increases expression of at least one selected from the group consisting of CCL19, CCL20, and VEGFA, M2 type macrophage differentiation markers.
  • the composition may be one that reduces the expression of one or more selected from the group consisting of CCR2, SOCS3, and HLA-DRa, which are M1 type macrophage differentiation markers.
  • the composition may be a cosmetic composition.
  • the composition may be a food composition.
  • the technique disclosed in this specification has an effect of providing an immunomodulating composition comprising an extracellular vesicle, which is a complex physiologically active substance derived from lactic acid bacteria, as an effective ingredient.
  • Figure 1 is a step-by-step illustration of the process of separating extracellular vesicles from lactic acid bacteria in one embodiment of the present disclosure.
  • FIG. 2A shows a transmission electron microscope photograph of the extracellular vesicles derived from lactic acid bacteria according to one test example of the present specification.
  • FIG. 2B shows the result of measurement of the extracellular vesicle size derived from lactic acid bacteria according to one test example of the present specification.
  • FIG. 3 shows the results of measuring the effect on cell proliferation and cytotoxicity of dermal fibroblasts treated with extracellular vesicles derived from lactic acid bacteria according to a test example of the present specification (**, p ⁇ 0.01).
  • FIG. 4 shows the results of confirming the effect of extracellular vesicles derived from lactic acid bacteria on undifferentiated macrophages according to one test example of the present specification.
  • Fig. 5 shows the results of confirming the effect of lactic acid bacteria-derived extracellular vesicles on undifferentiated macrophages according to one test example of the present specification.
  • FIG. 6 shows the results of examining the effect of extracellular vesicles produced from lactic acid bacteria on the expression level of M1 type macrophage markers according to one test example of the present specification.
  • FIG. 7 shows the results of comparing the effects of lactic acid bacteria-derived extracellular vesicles and lactic acid bacteria cells on immune cells according to one test example of the present specification.
  • the present disclosure provides an immunomodulating composition comprising an extracellular vesicle derived from lactic acid bacteria as an active ingredient.
  • the present disclosure provides an immunomodulatory method comprising applying an extracellular vesicle derived from a lactose-producing bacteria in an amount effective for immunomodulation to a subject in need thereof.
  • the disclosure provides lactic acid-derived extracellular vesicles for immunomodulation of a subject.
  • the present disclosure provides non-therapeutic uses of lactic acid-derived extracellular vesicles for immunomodulation of a subject.
  • the present disclosure provides the use of an extracellular vesicle derived from a lactic acid bacterium for preparing an immunomodulating composition.
  • the lactic acid-derived extracellular vesicle may be applied to, administered with, or applied to a subject in the form of a composition, such as a cosmetic composition, a pharmaceutical composition or a food composition.
  • a composition such as a cosmetic composition, a pharmaceutical composition or a food composition.
  • the lactic acid-derived extracellular vesicle may be applied to the skin of the subject.
  • the immunomodulation may be to increase the number of M2 type macrophages and decrease the number of M1 type macrophages.
  • active ingredient refers to an ingredient that exhibits the desired activity alone, or may be used in combination with a carrier or the like, which itself is not active, to exhibit the desired activity.
  • the lactic acid bacterium may be a strain of the genus Latobacillus .
  • the Lactobacillus sp. Strain may be preferred to Lactobacillus plantarum in terms of increasing the yield of extracellular vesicles including immunomodulatory efficacy and exosome. Lactobacillus plantarum has an effect of providing excellent immunomodulatory effect and efficiency of obtaining exosome.
  • the Lactobacillus plantarum may be Lactobacillus plantarum APsulloc 331261 with accession number KCCM 11179P.
  • extracellular vesicle refers to a vesicle secreted from a cell and released into the extracellular space, and refers to a membrane-structured necrosis in which the inner and outer regions are separated by a lipid bilayer.
  • the extracellular vesicles have plasma membrane lipids, plasma membrane proteins, nucleic acids, and cytoplasmic components, which indirectly determine the nature and state of the cells. It acts as an extracellular carrier that mediates cell-cell communication by transferring membrane components, mRNAs, miRNAs, proteins (growth hormone, cytokine, etc.)
  • the extracellular vesicles may be isolated in a lactic acid bacteria culture.
  • the extracellular vesicle is one that precipitates in ultracentrifugation of lactic acid bacteria culture at 100,000 x g or more, specifically 100,000 to 200,000 x g, or 100,000 to 150,000 x g, or 150,000 to 200,000 x g .
  • the extracellular vesicle may have a diameter of 20 to 500 nm.
  • the extracellular vesicle is at least 20 nm, at least 30 nm, at least 40 nm, at least 50 nm, at least 60 nm, at least 70 nm, at least 80 nm, at least 90 nm or at least 100 nm, Or less, 450 nm or less, 400 nm or less, 350 nm or less, 300 nm or less, 250 nm or less, 200 nm or less, 150 nm or less or 100 nm or less.
  • the extracellular vesicles may have a diameter of 20 to 200 nm.
  • the diameter may be an average diameter.
  • the extracellular vesicle may be exosomes.
  • the extracellular vesicle may be one in which the membrane component is chemically or physically modified, for example, so as to efficiently perform the desired function in the target cell.
  • the membrane component of the extracellular bezacl is modified by a chemical method using a thiol group (-SH) or an amine group (-NH 2 ), or the extracellular bezle is modified with a target inducing substance, a cell membrane fusion substance, And the membrane component may be chemically modified by chemically bonding the glycol.
  • the extracellular vesicles may be separated by centrifugation, ultracentrifugation, differential centrifugation, Equilibrium Density Centrifugation, density gradient, but it can be separated by using one or more methods selected from the group consisting of filtration, dialysis and free-flow electrophoresis, but the method of separating the extracellular vesicles is limited to this no.
  • Density gradients are the most commonly used method of distinguishing substances of different densities. Specific examples of this method include ficoll, glycerol, sucrose, cesium chloride, iodixanol iodixanol), but the present invention is not limited thereto.
  • the density gradient can be used with ultracentrifugation and the like.
  • gel filtration or ultrafiltration can be used to select extracellular vesicles.
  • dialysis may be used instead of filtration to remove small molecules.
  • free-flow electrophoresis can be used.
  • the centrifugation in step (1) is performed at 1,000 to 20,000 x g, or 1,500 to 20,000 x g, or 1,500 to 15,000 x g, or 1,500 to 10,000 x g for 30 to 60 minutes .
  • the centrifugation may be performed stepwise by changing the speed or time.
  • the cells are centrifuged at a low speed of 1,500 to 2,000 x g to separate and remove the lactic acid bacteria strain from the culture medium.
  • the cells and the supernatant are separated and centrifuged at 10,000 to 20,000 x g at high speed to further remove cell- Water and the like can be removed.
  • the filtration in step (2) may be performed with a filter having a size of 0.3 to 0.5 mu m.
  • the purity of the culture solution centrifuged through the filtration step can be increased.
  • the ultracentrifugation in step (3) is performed at 100,000 x g or more, specifically 100,000 to 200,000 x g, or 100,000 to 150,000 x g, or 150,000 to 200,000 x g for 1 to 5 hours can do.
  • (4) suspending the obtained precipitate may be further included.
  • the lactic acid-derived extracellular vesicle, or a composition comprising it may be one which induces differentiation into M2 type macrophages.
  • M2 type macrophages play a role in creating new blood vessels to repair the wound and reconstitute the tissue. Therefore, the composition comprising the extracellular vesicle of lactic acid bacterium according to the present invention as an active ingredient may have a skin regeneration effect.
  • the lactic acid-derived extracellular vesicle, or composition comprising it may be one that increases the number of M2-type macrophages in a subject.
  • the lactic acid-derived extracellular vesicle, or composition comprising it may be one that reduces the number of M1 type macrophages in a subject.
  • the lactic acid-derived extracellular vesicle, or composition comprising it may be one that increases expression of one or more selected from the group consisting of M2 type macrophage differentiation markers CCL19, CCL20, and VEGFA.
  • the Lactobacillus-derived extracellular vesicle, or composition comprising it may be one that reduces expression of one or more selected from the group consisting of M1 type macrophage differentiation markers CCR2, SOCS3, and HLA-DRa .
  • the composition may be a lyophilized formulation.
  • the composition may be a ready-to-use sealed package or a lyophilized formulation in a packaging container.
  • the present invention relates to a composition
  • a composition comprising an extracellular vesicle derived from lactic acid bacteria as an active ingredient and having a lyophilized formulation; And an immunomodulating kit comprising sterile water or purified water.
  • the kit may be in a ready-to-use sealed packaging or packaging container.
  • the composition may be a cosmetic composition.
  • the cosmetic composition may further contain, in addition to the active ingredient, a functional additive and a component included in a general cosmetic composition.
  • the functional additives may include water-soluble vitamins, oil-soluble vitamins, polymer peptides, polymeric polysaccharides, sphingolipids and seaweed extracts.
  • the other ingredients that can be included in the composition include humectants, emollients, surfactants, organic and inorganic pigments, organic powders, ultraviolet absorbents, preservatives, bactericides, antioxidants, plant extracts, pH adjusters, alcohols, Accelerators, coolants, antiperspirants, purified water, and the like.
  • the formulation of the cosmetic composition is not particularly limited and may be appropriately selected according to the purpose.
  • the formulation of the present invention is a paste, cream or gel, animal fiber, plant fiber, wax, paraffin, starch, tracant, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc or zinc oxide may be used as the carrier component .
  • lactose When the formulation of the present invention is a powder or a spray, lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate or polyamide powder may be used as a carrier component.
  • a spray in particular, / Propane or dimethyl ether.
  • a solvent, a solvent or an emulsifier is used as a carrier component, and examples thereof include water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene glycol, , 3-butyl glycol oil, glycerol aliphatic ester, polyethylene glycol or sorbitan fatty acid esters.
  • the formulation of the present invention is a suspension
  • a carrier such as water, a liquid diluent such as ethanol or propylene glycol, a suspending agent such as ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol ester and polyoxyethylene sorbitan ester, Cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar or tracant, etc.
  • a suspending agent such as ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol ester and polyoxyethylene sorbitan ester, Cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar or tracant, etc.
  • the carrier component is selected from aliphatic alcohol sulfate, aliphatic alcohol ether sulfate, sulfosuccinic acid monoester, isethionate, imidazolinium derivative, methyltaurate, sarcosinate, fatty acid amide Ether sulfates, alkylamidobetaines, aliphatic alcohols, fatty acid glycerides, fatty acid diethanolamides, vegetable oils, linolenic derivatives or ethoxylated glycerol fatty acid esters.
  • the formulation of the present invention is a soap, an alkali metal salt of a fatty acid, a fatty acid hemiester salt, a fatty acid protein hydrolizate, isethionate, a lanolin derivative, an aliphatic alcohol, a vegetable oil, glycerol, have.
  • the composition may be a pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition may further contain, in addition to the active ingredient, a preservative, a stabilizer, a wetting agent or an emulsifying accelerator, a pharmaceutical adjuvant such as a salt and / or a buffer for controlling osmotic pressure, and other therapeutically useful substances, And can be formulated into various oral or parenteral dosage forms accordingly.
  • oral administration agent examples include tablets, pills, hard and soft capsules, liquids, suspensions, emulsions, syrups, powders, powders, granules, granules and pellets, , Diluents (such as lactose, dextrose, sucrose, mannitol, sorbitol, cellulose and glycine), lubricants (such as silica, talc, stearic acid and magnesium or calcium salts thereof and polyethylene glycols) .
  • Diluents such as lactose, dextrose, sucrose, mannitol, sorbitol, cellulose and glycine
  • lubricants such as silica, talc, stearic acid and magnesium or calcium salts thereof and polyethylene glycols
  • the tablets may also contain binders such as magnesium aluminum silicate, starch paste, gelatin, tragacanth, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose and polyvinylpyrrolidine, optionally mixed with starch, agar, alginic acid or its sodium salt Such as disintegrants, absorbents, coloring agents, flavoring agents, and sweetening agents.
  • binders such as magnesium aluminum silicate, starch paste, gelatin, tragacanth, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose and polyvinylpyrrolidine, optionally mixed with starch, agar, alginic acid or its sodium salt
  • disintegrants such as disintegrants, absorbents, coloring agents, flavoring agents, and sweetening agents.
  • the tablets may be prepared by conventional mixing, granulating or coating methods.
  • parenteral administration forms may be transdermal dosage forms, and may be formulations such as injections, drops, ointments, lotions, gels, creams, sprays, suspensions, emulsions, suppositories, But is not limited thereto.
  • the dosage of the active ingredient is within the level of ordinary skill in the art and the daily dose of the drug depends on various factors such as the degree of progress of the subject to be administered, the age of onset, age, health condition,
  • the composition may be administered in an amount of 1 / / kg to 200 mg / kg in one aspect, and 50 / / kg to 50 mg / kg in another aspect, divided into 1 to 3 times a day, Are not intended to limit the scope of the invention in any way.
  • the pharmaceutical composition may be an external preparation for skin, and the external preparation for skin may include any substance applied outside the skin, and may include various formulations of medicines.
  • the composition may be a food composition.
  • the food composition may be in a liquid or solid form and may be in the form of, for example, various foods, beverages, gums, tea, vitamin complexes, health supplements and the like and may be in the form of powders, granules, tablets, capsules or beverages .
  • the food composition of each formulation can be blended with the ingredients commonly used in the field in addition to the active ingredient without difficulty by those skilled in the art depending on the purpose of formulation or use, and synergistic effect can be obtained when the composition is applied simultaneously with other ingredients.
  • liquid components that can be contained in addition to the active ingredients disclosed in this specification, and may include various flavoring agents or natural carbohydrates such as ordinary beverages as additional ingredients.
  • natural carbohydrate include common saccharides such as disaccharides such as monosaccharide, glucose and fructose, polysaccharides such as maltose and sucrose, dextrin and cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol and erythritol .
  • natural flavors e.g., tau martin, stevia extract, rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.
  • synthetic flavors e.g., saccharin, aspartame, etc.
  • the ratio of the natural carbohydrate may be generally about 1 to 20 g, and in one aspect about 5 to 12 g per 100 ml of the composition disclosed herein.
  • the food composition may include flavors such as various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), synthetic flavors and natural flavors, colorants and heavies (cheese, chocolate, etc.), pectic acid and its salts, Salts, organic acids, protective colloid thickeners, pH adjusting agents, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonating agents used in carbonated drinks, and the like.
  • flavors such as various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), synthetic flavors and natural flavors, colorants and heavies (cheese, chocolate, etc.), pectic acid and its salts, Salts, organic acids, protective colloid thickeners, pH adjusting agents, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonating agents used in carbonated drinks, and the like.
  • flesh for the production of natural fruit juices and vegetable beverages can be used independently or in combination.
  • the proportion of the additive may vary, but is generally selected in the range of from 0.001 to about 20 parts by
  • extracellular vesicles containing exosomes were isolated from lactobacillus strains as lactic acid bacteria. More specifically, extracellular vesicles originating from lactic acid bacteria were prepared using Lactobacillus plantarum APsulloc 331261 (Accession No .: KCCM11179P) strain.
  • Step 1 The culture of the cultured Lactobacillus sp. Strain was centrifuged at 1,800 x g at 4 DEG C for 20 minutes to separate and remove the Lactobacillus sp. Strain from the culture broth. That is, the cells and the culture supernatant were separated through a low-speed centrifugation process.
  • Step 2 In the step 1, the centrifuged culture was centrifuged at 10,000 x g for 20 minutes at 4 ° C using a high-speed centrifugal separator to further remove cell or cell-related debris and residues.
  • Step 3 The purity of the culture solution was increased by filtering the culture solution centrifuged in step 2 through a 0.45 mu m Battletop filter.
  • Step 4 The extracellular vesicles containing exosome were separated by ultracentrifugal centrifugation at 150,000 x g for 3 hours at 4 ° C.
  • Step 5 In the step 4, the supernatant was removed after ultra-high speed centrifugation, and the extracellular vesicle pellet containing the remaining exosome was resuspended in a buffer solution (HEPES buffer).
  • HEPES buffer a buffer solution
  • Step 6 Extracellular vesicles (EVs) containing exosomes resuspended in the buffer solution in step 5 were stored at -70 ° C and used in the following test (see FIG. 1).
  • Lactobacillus cells were prepared using the strain Lactobacillus plantarum APsulloc 331261 (Accession No .: KCCM11179P) strain used in Example 1 and used in the following test. That is, the lactic acid bacterium according to the present comparative example means a whole cell which has not undergone the process of separating the extracellular vesicles.
  • the extracellular vesicles from the lactic acid bacteria isolated in Example 1 were analyzed by a transmission electron microscope and a dynamic light scattering (DLS) to determine the shape and size of the extracellular vesicles. As a result, nm (see Figs. 2A and 2B).
  • the polydispersity index (PDI) value indicates the heterogeneity index, and it is confirmed that the extracellular vesicles isolated are relatively stable and homogeneous.
  • the average diameter of the isolated extracellular vesicles was found to be about 50 to 60 nm, more specifically 55.46 nm.
  • the extracellular vesicles (0.1 to 10 ⁇ g / ml) derived from the lactic acid bacteria isolated in Example 1 were treated with human fibroblast (Hs68) to confirm the effect on cell proliferation and cytotoxicity.
  • human fibroblast Hs68 was cultured in a CO 2 incubator, treated with 0.1 ⁇ g / ml, 1 ⁇ g / ml and 10 ⁇ g / ml of extracellular vesicles isolated from lactic acid bacteria in Example 1, -free conditions.
  • As a positive control 5 ng / ml of TGF- ⁇ was treated.
  • the cells were then incubated for another 2 hours with a 5% CCK-8 solution. Cell viability and cytotoxicity were measured at 450 nm and compared with the control.
  • Example 1 The extracellular vesicles from the lactic acid bacteria isolated in Example 1 were treated with undifferentiated monocytic THP1 and further induced with phorbol 12-myristate 13-acetate to induce the expression of macrophage differentiation markers Respectively.
  • THP1 cells were treated with 10 ⁇ g / ml EV and 20 nM PMA simultaneously or separately for 48 hours, and the cells were collected to purify RNA and synthesize cDNA.
  • CDNA derived from 100 ng of RNA was used for qRT-PCR analysis and the results were corrected with GAPDH gene.
  • the extracellular vesicles derived from the isolated lactic acid bacteria induced the expression of macrophage differentiation markers such as CD14 and ICAM-1 to a degree similar to that of the PMA treatment condition even in the absence of PMA,
  • the expression of CCR2, a marker of M1 was reduced and showed synergistic effect with simultaneous treatment with PMA.
  • the extracellular vesicles from the isolated lactic acid bacteria effectively induced macrophage differentiation to replace PMA.
  • Example 1 The extracellular vesicles derived from lactic acid bacteria isolated in Example 1 were treated with undifferentiated human monocytic THP1 to confirm the differentiation pattern of macrophages.
  • nM PMA was pre-treated for 48 hours in undifferentiated human macrophages (monocytic THP1).
  • 10 ⁇ g / ml EV or M1 and M2 were treated for cytokines for induction of differentiation for additional 48 hours, and then representative gene expression of M1 and M2 was compared.
  • 20 ng / ml IFN-gamma and 10 pg / ml LPS were treated with 20 ng / ml interleukin 4 (R & D Systems, # 204-IL) and 20 ng / ml interleukin 13 R & D Systems, # 213-ILB).
  • RNA was purified and cDNA was synthesized. CDNA derived from 100 ng of RNA was used for qRT-PCR analysis and the results were corrected with the GAPDH gene.
  • M1 type macrophage markers The expression level of M1 type macrophage markers was confirmed by treating the extracellular vesicles from the lactic acid bacteria isolated in Example 1 on macrophages differentiated into M1 type by using PMA (phorbol 12-myristate 13-acetate).
  • nM PMA was first pretreated with 20 nM PMA for undifferentiated human macrophages, and then the following experiment was performed under the condition that there is PMA (left graph in FIG. 6) and no condition (right graph in FIG. 6).
  • 10 ⁇ g / ml EV or M1 inducible cytokine (20 ng / ml IFN-gamma, 10 pg / ml LPS) were first treated for 48 hours, followed by M1 differentiation-inducing cytokines or EVs Samples were obtained after 48 hours of treatment. Cells were harvested to purify RNA and cDNA was synthesized.
  • HLA-DR alpha which is a marker of M1 macrophages
  • Example 1 The effect of extracellular vesicles from the lactic acid bacteria isolated in Example 1 and the lactic acid bacteria prepared in Comparative Example 1 on the immune cells was compared.
  • extracellular bezicel and lactic acid bacteria derived from the same amount of lactic acid bacteria were treated.
  • the cells were harvested to purify RNA and cDNA was synthesized.
  • CDNA derived from 100 ng of RNA was used for qRT-PCR analysis and the results were corrected with the GAPDH gene.
  • the extracellular vesicles originating from the same amount of lactic acid bacteria showed a higher or similar ability to induce or suppress the expression of the genes related to the differentiation of immune cells as compared with the lactic acid bacteria cells themselves.
  • Example 1 The effect of extracellular vesicles derived from lactic acid bacteria isolated in Example 1 on the cytotoxicity of the lactic acid bacteria prepared in Comparative Example 1 was compared.
  • human fibroblast Hs68 was cultured in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C, and the extracellular vesicles originating from the lactic acid bacteria isolated in Example 1 and the lactic acid bacteria prepared in Comparative Example 1 were respectively incubated with 1-20 ⁇ g / ml Lt; / RTI > Thereafter, the supernatant was collected and LDH activity was measured. Cytotoxicity was measured using the Pierce TM LDH Cytotoxicity Assay Kit according to the manufacturer's instructions.
  • compositions according to one aspect of the present disclosure are described below, but are applicable to various other formulations, which are not intended to be limiting, but rather to illustrate only specifically.
  • Ointments were prepared in a conventional manner according to the compositions shown in Table 1 below.
  • the cosmetic formulations were prepared in a conventional manner according to the compositions shown in Table 2 below.
  • Lotions were prepared in a conventional manner according to the composition shown in Table 3 below.
  • Creams were prepared in a conventional manner according to the composition shown in Table 4 below.
  • the packs were prepared in a conventional manner according to the composition shown in Table 5 below.

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Abstract

본 명세서에는 유산균 유래 세포밖 베지클을 유효성분으로 포함하는 면역조절용 조성물이 개시된다. 상기 유산균은 락토바실러스 플란타룸일 수 있으며, 상기 조성물은 M2 유형 대식세포로의 분화를 유도하고 M1 유형 대식세포 분화 마커인 CCR2, SOCS3 및 HLA-DRα로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 발현을 감소시키는 효과가 있다.

Description

유산균 유래의 세포밖 베지클을 포함하는 면역조절용 조성물
본 명세서에는 유산균 유래 세포밖 베지클을 유효성분으로 포함하는 면역조절용 조성물이 개시된다.
대부분의 동물세포는 다양한 크기와 성분을 갖는 세포 내 기원의 세포밖 베지클 (extracellular vesicle)를 분비할 수 있는 능력을 가지고 있으며, 이러한 세포밖 베지클은 혈액, 소변, 타액 및 세포 배양액을 포함하는 모든 생물학적 유체 (biological fluids)에서 발견된다. 원핵세포 또는 진핵세포 또한 세포밖 베지클을 분비하는 것으로 알려져 있다.
세포밖 베지클은 작게는 직경 약 20 nm부터 크게는 직경 약 5 ㎛의 크기를 갖는 막 구조 소낭체로서, 그 크기와 구성에서 이질성이 있고, 엑소좀 (exosome, 약 20~100 nm), 엑토좀 (ectosome), 마이크로소낭 (microvesicle, 약 100~1,000 nm), 마이크로입자 (microparticle), 세포자멸체 (apoptotic body, 약 1~5 ㎛) 등의 다수의 상이한 종을 포함한다.
상기 세포밖 베지클의 상이한 유형은 이의 기원, 직경, 자당 (sucrose)에서의 밀도, 형상, 침강 속도, 지질 조성물, 단백질 마커 또는 분비 방식 (즉, 신호(유도성)에 의한 것인지 자발적(구성적)인 것인지) 등에 기초하여 구별된다. 예컨대, 마이크로소낭은 약 100 내지 1,000 nm의 불규칙한 형상을 갖는 막 소낭으로서 원형질막 바깥쪽을 향하여 출아 (원형질막에서 기원)되며, 인테그린, 셀렉틴, CD40 리간드 등을 포함하는 마커, 포스파티딜세린을 포함하는 인지질을 갖는 것으로 알려져 있다. 한편, 엑소좀은 약 20 내지 100 nm (<200 nm)의 컵 형상을 갖는 가장 작은 막 소낭으로서 후기 엔도좀의 안쪽에서 출아 (엔도좀에서 기원)되며, 일반적으로 CD63, CD9의 테트라스파닌, TSG101, ESCRT을 포함하는 마커, 콜레스테롤, 스핑고미엘린, 세라마이드, 포스파티딜세린을 포함하는 지질을 갖는 것으로 알려져 있다.
이와 같은 세포밖 베지클은 분비하는 기원 세포 (공여 세포)의 상태를 반영하며, 어떤 세포에서 분비되었는가에 따라 다양한 생물학적 활성을 나타내고, 세포들 사이에 유전 물질과 단백질을 옮기면서 세포 간 상호작용 (cell-to-cell communication)에 중요한 역할을 한다.
한편, 인체에 유익한 대표적인 미생물인 유산균은 포도당 또는 유당과 같은 당을 분해하여 젖산이나 초산과 같은 유기산을 생성하는 균이다. 유산균은 당으로부터 유기산을 만드는 발효 과정을 거쳐 발효유, 치즈, 버터와 같은 발효 식품을 제조하는 데에 사용되고 있으나, 유산균 유래의 복합 생리 활성 물질인 세포밖 베지클의 면역조절 효능에 대해서는 개시된 바가 없다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
한국 공개특허공보 제10-2017-0109822호
일 측면에서, 본 명세서는 유산균에서 유래한 복합 생리 활성 물질인 세포밖 베지클을 유효성분으로 포함하는 면역조절용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
일 측면에서, 본 명세서는 유산균 유래 세포밖 베지클을 유효성분으로 포함하는 면역조절용 조성물을 제공한다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 유산균은 락토바실러스 (Latobacillus) 속 균주일 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 락토바실러스 속 균주는 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum)일 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 락토바실러스 플란타룸은 기탁번호가 KCCM11179P인 락토바실러스 플란타룸 APsulloc 331261인 것일 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 세포밖 베지클은 엑소좀인 것일 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 세포밖 베지클은 20 내지 200 nm의 직경을 갖는 것일 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 조성물은 M2 유형 대식세포로의 분화를 유도하는 것일 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 조성물은 M2 유형 대식세포 분화 마커인 CCL19, CCL20 및 VEGFA로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 발현을 증가시키는 것일 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 조성물은 M1 유형 대식세포 분화 마커인 CCR2, SOCS3 및 HLA-DRα로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 발현을 감소시키는 것일 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 조성물은 화장료 조성물일 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 조성물은 식품 조성물일 수 있다.
일 측면에서, 본 명세서에 개시된 기술은 유산균에서 유래한 복합 생리 활성 물질인 세포밖 베지클을 유효성분으로 포함하는 면역조절용 조성물을 제공하는 효과가 있다.
도 1은 본 명세서의 일 실시예에서 유산균으로부터 세포밖 베지클을 분리하는 과정을 단계별로 나타낸 것이다.
도 2a는 본 명세서의 일 시험예에 따른 유산균 유래 세포밖 베지클의 투과전자현미경 촬영 결과를 나타낸 것이다.
도 2b는 본 명세서의 일 시험예에 따른 유산균 유래 세포밖 베지클의 크기 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 명세서의 일 시험예에 따라 유산균 유래 세포밖 베지클을 피부 섬유아세포에 처리한 후 세포 증식 및 세포 독성에 미치는 영향을 측정한 결과를 나타낸 것이다 (**; p<0.01).
도 4는 본 명세서의 일 시험예에 따라 유산균 유래 세포밖 베지클이 미분화된 대식세포에 미치는 영향을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 명세서의 일 시험예에 따라 유산균 유래 세포밖 베지클이 미분화된 대식세포에 미치는 영향을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 명세서의 일 시험예에 따라 유산균 유래 세포밖 베지클이 M1 유형 대식세포 마커의 발현량에 미치는 영향을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 명세서의 일 시험예에 따라 유산균 유래 세포밖 베지클과 유산균 세포가 면역세포에 미치는 영향을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 명세서의 일 시험예에 따라 유산균 유래 세포밖 베지클과 유산균 세포가 세포 독성에 미치는 영향을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
일 측면에서, 본 명세서는 유산균 유래 세포밖 베지클을 유효성분으로 포함하는 면역조절용 조성물을 제공한다.
다른 측면에서, 본 명세서는 면역조절에 유효한 양의 유산균 유래 세포밖 베지클을 이를 필요로 하는 대상에게 적용하는 것을 포함하는 면역조절 방법을 제공한다.
다른 측면에서, 본 명세서는 대상의 면역조절을 위한 유산균 유래 세포밖 베지클을 제공한다.
다른 측면에서, 본 명세서는 대상의 면역조절을 위한 유산균 유래 세포밖 베지클의 비치료적 용도를 제공한다.
다른 측면에서, 본 명세서는 면역조절용 조성물을 제조하기 위한 유산균 유래 세포밖 베지클의 용도를 제공한다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 유산균 유래 세포밖 베지클은 조성물, 예컨대 화장료 조성물, 약학 조성물 또는 식품 조성물의 형태로 대상에게 적용하거나, 또는 투여하거나, 또는 도포하는 것일 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 유산균 유래 세포밖 베지클은 대상의 피부에 적용하는 것일 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 면역조절은 M2 유형 대식세포의 수를 증가시키고, M1 유형 대식세포의 수를 감소시키는 것일 수 있다.
본 명세서에서 "유효성분"은 단독으로 목적으로 하는 활성을 나타내거나, 또는 그 자체는 활성이 없는 담체 등과 함께 사용되어 목적으로 하는 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 유산균은 락토바실러스 (Latobacillus) 속 균주일 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 락토바실러스 속 균주는, 면역조절 효능 및 엑소좀을 포함하는 세포밖 베지클의 수율 증가 면에서 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum)이 바람직할 수 있다. 락토바실러스 플란타룸은 우수한 면역조절 효능 및 엑소좀 수득 효율을 제공하는 효과가 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 락토바실러스 플란타룸은 기탁번호가 KCCM11179P인 락토바실러스 플란타룸 APsulloc 331261인 것일 수 있다.
본 명세서에서 "세포밖 베지클"은 세포에서 분비되어 세포외 공간으로 방출된 베지클을 의미하는 것으로서, 지질 이중막에 의해 내부와 외부가 구분된 막 구조 소낭체를 의미한다. 세포밖 베지클은 세포막 지질 (plasma membrane lipid)과 세포막 단백질 (plasma membrane protein), 핵산 (nucleic acid), 세포질 성분 등을 가지고 있어 세포의 성질과 상태를 간접적으로 파악할 수 있게 해주며, 다른 세포 또는 조직에 결합하여 막 구성요소, mRNAs, miRNAs, 단백질 (성장 호르몬, 사이토카인 등) 등을 전달해 주고, 이들 전달 물질을 수용 세포에 전달해 줌으로써 세포-세포 간 소통을 매개하는 세포외 전달체로 작용한다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 세포밖 베지클은 유산균 배양액에서 분리된 것일 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 세포밖 베지클은 유산균 배양액의 100,000 ×g 이상, 구체적으로 100,000 내지 200,000 ×g, 또는 100,000 내지 150,000 ×g, 또는 150,000 내지 200,000 ×g의 초원심분리에서 침강하는 것일 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 세포밖 베지클은 20 내지 500 nm의 직경을 갖는 것일 수 있다. 다른 측면에서, 상기 세포밖 베지클은 20 nm 이상, 30 nm 이상, 40 nm 이상, 50 nm 이상, 60 nm 이상, 70 nm 이상, 80 nm 이상, 90 nm 이상 또는 100 nm 이상이면서, 또한 500 nm 이하, 450 nm 이하, 400 nm 이하, 350 nm 이하, 300 nm 이하, 250 nm 이하, 200 nm 이하, 150 nm 이하 또는 100 nm 이하의 직경을 갖는 것일 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 세포밖 베지클은 20 내지 200 nm의 직경을 갖는 것일 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 직경은 평균 직경을 의미하는 것일 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 세포밖 베지클은 엑소좀인 것일 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 세포밖 베지클은 예컨대, 표적 세포에서 원하는 기능을 효율적으로 수행할 수 있도록 막 성분이 화학적 또는 물리적으로 변형된 것일 수 있다. 예를 들어, 세포밖 베지클의 막 성분이 티올기 (-SH) 또는 아민기 (-NH2)를 이용하여 화학적인 방법으로 변형되거나, 세포밖 베지클에 표적유도 물질, 세포막융합 물질, 폴리에틸렌글리콜을 화학적으로 결합시켜 막 성분이 화학적으로 변형된 것일 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 세포밖 베지클은 원심분리 (centrifugation), 초원심분리 (ultracentrifugation), 분별 원심분리 (Differential Centrifugation), 등밀도 원심분리 (Equilibrium Density Centrifugation), 밀도 구배 (density gradient), 여과 (filtration), 투석 (dialysis) 및 자유 유동 전기이동 (free-flow electrophoresis)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 방법을 사용하여 분리할 수 있으나, 세포밖 베지클의 분리방법이 이에 제한되는 것은 아니다.
밀도 구배는 밀도가 다른 물질을 구분할 때 가장 많이 사용되는 방법으로서, 이 방법의 구체적인 예로는 피콜 (ficoll), 글리세롤 (glycerol), 수크로즈 (sucrose), 염화세슘 (cesium chloride), 이오딕사놀 (iodixanol) 등의 밀도 기울기 분리 재료를 이용하여 실시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 측면에서, 밀도 구배는 초원심분리 등과 함께 사용될 수 있다. 다른 측면에서, 세포밖 베지클을 선별하기 위해 겔 여과 (gel filtration) 또는 한외여과 (ultrafiltration)를 사용할 수 있다. 또 다른 측면에서, 크기가 작은 분자을 제거하기 위해 여과 대신 투석을 사용할 수 있다. 또 다른 측면에서, 자유 유동 전기이동을 사용할 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, (1) 유산균 배양액을 원심분리하여 상등액을 수득하는 단계; (2) 상기 수득된 상등액을 여과하는 단계; 및 (3) 상기 수득된 여과물을 초원심분리하여 침전물을 수득하는 단계;를 포함하여 유효한 활성을 나타내는 상기 유산균 유래의 세포밖 베지클을 제조할 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 (1) 단계에서 원심분리는 1,000 내지 20,000 ×g, 또는 1,500 내지 20,000 ×g, 또는 1,500 내지 15,000 ×g, 또는 1,500 내지 10,000 ×g에서 30 내지 60분 동안 실시할 수 있다. 이때, 상기 원심분리는 속도 또는 시간을 변화시켜 단계적으로 실시할 수도 있다. 예컨대, 1,500 내지 2,000 ×g에서 저속으로 원심분리하여 배양액으로부터 유산균 균주를 분리 및 제거하고 세포와 상등 배양액을 분리한 후, 10,000 내지 20,000 ×g에서 고속으로 원심분리하여 추가적으로 세포 또는 세포 관련 잔해 및 잔여물 등을 제거할 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 (2) 단계에서 여과는 0.3 내지 0.5 ㎛ 크기의 필터로 여과할 수 있다. 상기 여과 공정을 통해 원심분리된 배양액의 순도를 높일 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 (3) 단계에서 초원심분리는 100,000 ×g 이상, 구체적으로 100,000 내지 200,000 ×g, 또는 100,000 내지 150,000 ×g, 또는 150,000 내지 200,000 ×g에서 1 내지 5 시간 동안 실시할 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 (3) 단계 후, (4) 상기 수득된 침전물을 현탁하는 단계를 더 포함할 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 유산균 유래 세포밖 베지클, 또는 이를 포함하는 조성물은 M2 유형 대식세포로의 분화를 유도하는 것일 수 있다. M2 유형 대식세포는 새로운 혈관을 만들어 상처를 복구하고 조직을 재구성하는 역할을 한다. 따라서, 본 명세서에 따른 유산균 유래 세포밖 베지클을 유효성분으로 포함하는 조성물은 피부 재생 효과를 갖는 것일 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 유산균 유래 세포밖 베지클, 또는 이를 포함하는 조성물은 대상체에서 M2 유형 대식세포의 수를 증가시키는 것일 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 유산균 유래 세포밖 베지클, 또는 이를 포함하는 조성물은 대상체에서 M1 유형 대식세포의 수를 감소시키는 것일 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 유산균 유래 세포밖 베지클, 또는 이를 포함하는 조성물은 M2 유형 대식세포 분화 마커인 CCL19, CCL20 및 VEGFA로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 발현을 증가시키는 것일 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 유산균 유래 세포밖 베지클, 또는 이를 포함하는 조성물은 M1 유형 대식세포 분화 마커인 CCR2, SOCS3 및 HLA-DRα로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 발현을 감소시키는 것일 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 조성물은 동결건조된 제형일 수 있다. 상기 조성물은 즉시 사용 가능하도록 (ready-to-use) 밀봉된 포장재 또는 포장용기에 담긴 동결건조된 제형일 수 있다.
다른 측면에서, 본 명세서는 유산균 유래의 세포밖 베지클을 유효성분으로 포함하고 동결건조된 제형을 갖는 조성물; 및 멸균수 또는 정제수를 포함하는 면역조절용 키트를 제공한다. 상기 키트는 즉시 사용 가능하도록 (ready-to-use) 밀봉된 포장재 또는 포장용기에 담긴 것일 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 조성물은 화장료 조성물인 것일 수 있다.
상기 화장료 조성물에는 유효성분 이외에 기능성 첨가물 및 일반적인 화장료 조성물에 포함되는 성분이 추가로 포함될 수 있다. 상기 기능성 첨가물로는 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 성분을 포함할 수 있다. 이외에 포함되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한 (制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.
상기 화장료 조성물은 제형이 특별히 한정되지 않으며, 목적하는 바에 따라 적절히 선택할 수 있다. 예를 들어, 분말, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 샴푸, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클렌저로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 제형으로 제조될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 비누인 경우에는 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속염, 지방산 헤미에스테르염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알코올, 식물성 유, 글리세롤, 당 등이 이용될 수 있다.
예시적인 일 구현예에 따르면, 상기 조성물은 약학 조성물인 것일 수 있다.
상기 약학 조성물은 유효성분 이외에 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 약제학적 보조제 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 함유할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 다양한 경구 투여제 또는 비경구 투여제 형태로 제형화할 수 있다.
상기 경구 투여제는 예를 들면, 정제, 환제, 경질 및 연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 분제, 산제, 세립제, 과립제, 펠렛제 등이 있으며, 이들 제형은 유효성분 이외에 계면 활성제, 희석제 (예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로오스 및 글리신), 활택제 (예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및 폴리에틸렌 글리콜)를 함유할 수 있다. 정제는 또한 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로오스, 나트륨 카복시메틸셀룰로오스 및 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제, 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제 등의 약제학적 첨가제를 함유할 수 있다. 상기 정제는 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다.
또한, 상기 비경구 투여 형태로는 경피 투여형 제형일 수 있으며, 예를 들어 주사제, 점적제, 연고, 로션, 겔, 크림, 스프레이, 현탁제, 유제, 좌제 (坐劑), 패취 등의 제형일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 유효성분의 투여량 결정은 통상의 기술자의 수준 내에 있으며, 약물의 1일 투여 용량은 투여하고자 하는 대상의 진행 정도, 발병 시기, 연령, 건강상태, 합병증 등의 다양한 요인에 따라 달라지지만, 성인을 기준으로 할 때 일 측면에서 상기 조성물 1 ㎍/kg 내지 200 mg/kg, 다른 일 측면에서 50 ㎍/kg 내지 50 mg/kg을 1일 1 내지 3회 분할하여 투여할 수 있으며, 상기 투여량은 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.
상기 약학 조성물은 피부 외용제일 수 있으며, 상기 피부 외용제는 피부 외부에서 도포되는 어떠한 것이라도 포함될 수 있는 총칭으로서 다양한 제형의 의약품이 여기에 포함될 수 있다.
예시적인 일 구현예에 따르면, 상기 조성물은 식품 조성물인 것일 수 있다.
상기 식품 조성물은 액상 또는 고체 상태의 제형일 수 있고, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용될 수 있다. 각 제형의 식품 조성물은 유효성분 이외에 해당 분야에서 통상적으로 사용되는 성분들을 제형 또는 사용 목적에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 다른 원료와 동시에 적용할 경우 상승 효과가 일어날 수 있다.
본 명세서에 개시된 유효성분 외에 함유할 수 있는 액체 성분에는 특별한 제한점이 없으며, 통상의 음료와 같이 여러가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가성분으로 포함할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 예로는 모노사카라이드, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 말토스, 슈크로스 등의 폴리사카라이드, 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당 알코올 등이 있다. 상기의 향미제로는 천연 향미제 (예를 들어 타우마틴, 스테비아 추출물, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (예를 들어 사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 명세서에 개시된 조성물 100 ml 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 일 측면에서 약 5 내지 12 g일 수 있다.
상기 식품 조성물은 일 측면에서 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그 염, 알긴산 및 그 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 다른 측면에서 천연 과일 주스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있다. 상기 성분들은 독립적으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 상기 첨가제의 비율은 다양할 수 있으나, 본 명세서에 개시된 조성물 100 중량부 당 0.001 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 유산균 유래의 세포밖 베지클의 분리
본 실시예에서는 유산균으로 락토바실러스 속 균주를 사용하여 이로부터 엑소좀을 포함하는 세포밖 베지클을 분리하였다. 더욱 구체적으로, Lactobacillus plantarum APsulloc 331261 (Accession No.: KCCM11179P) strain을 이용하여 유산균 유래의 세포밖 베지클을 제조하였다.
(단계 1) 배양된 락토바실러스 속 균주의 배양액을 4 ℃에서 1,800 ×g으로 20분 동안 원심분리하여 배양액으로부터 락토바실러스 속 균주를 분리 및 제거하였다. 즉, 저속의 원심분리 공정을 통해 세포와 배양 상등액을 분리하였다.
(단계 2) 상기 단계 1에서 원심분리된 배양액을 고속원심분리기를 이용하여 4 ℃에서 10,000 ×g으로 20분 동안 원심분리하여 추가적으로 세포 또는 세포 관련 잔해 및 잔여물 등을 제거하였다.
(단계 3) 상기 단계 2에서 원심분리된 배양액을 0.45 ㎛ 바틀 탑 필터를 통해 여과함으로써 배양액의 순도를 증가시켰다.
(단계 4) 상기 단계 3에서 여과한 배양액을 4 ℃에서 150,000 ×g으로 3 시간 동안 초고속원심분리하여 엑소좀을 포함하는 세포밖 베지클을 분리하였다.
(단계 5) 상기 단계 4에서 초고속원심분리 후 상등액을 제거하고 남은 엑소좀을 포함하는 세포밖 베지클 펠릿 (pellet)을 완충용액 (HEPES 버퍼)에 재현탁시켰다.
(단계 6) 상기 단계 5에서 완충용액에 재현탁시킨 엑소좀을 포함하는 세포밖 베지클 (EVs)을 -70℃에서 저장하여 하기 시험에 이용하였다(도 1 참조).
비교예 1. 유산균 세포의 준비
상기 실시예 1에서 사용한 Lactobacillus plantarum APsulloc 331261 (Accession No.: KCCM11179P) strain을 이용하여 유산균 세포를 준비하여 하기 시험에 이용하였다. 즉, 본 비교예에 따른 유산균 세포는 세포밖 베지클의 분리 공정을 거치지 않은 원래 그대로의 세포 전체를 의미한다.
시험예 1. 유산균 유래의 세포밖 베지클 ( LEVs )의 확인
상기 실시예 1에서 분리한 유산균 유래의 세포밖 베지클을 투과전자현미경 (transmission electron microscope)과 DLS (Dynamic light scattering)로 그 형태와 크기를 분석한 결과, 대체로 구형을 이루고 직경이 약 20 내지 200 nm인 것을 확인하였다 (도 2a 및 2b 참조). PDI (polydispersity index) 값은 이질성 지수를 나타내는 것으로서 분리된 세포밖 베지클은 비교적 안정하고 동질의 분산 상태를 갖는 것을 확인하였다. 분리된 세포밖 베지클의 평균 직경은 약 50 내지 60 nm, 더욱 구체적으로 55.46 nm인 것으로 나타났다.
시험예 2. 세포 증식 및 세포 독성에 미치는 영향
상기 실시예 1에서 분리한 유산균 유래의 세포밖 베지클 (0.1~10 μg/ml)을 인체 섬유아세포 (Hs68)에 처리하여 세포 증식 및 세포 독성에 미치는 영향을 확인하였다.
구체적으로, 인체 섬유아세포 Hs68을 CO2 배양기에서 배양하고, 상기 실시예 1에서 유산균에서 분리된 세포밖 베지클 0.1 μg/ml, 1 μg/ml, 10 μg/ml을 처리한 후 48시간 동안 serum-free 조건에서 배양하였다. 양성 대조군으로는 5 ng/ml의 TGF-β를 처리하였다. 이후, 5% CCK-8 용액이 들어 있는 배지로 교환한 후 2시간 동안 추가 배양하고, 최종적으로 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 세포 증식 및 세포 독성을 대조군과 비교하여 산정하였다.
그 결과, 도 3에서 보는 바와 같이 유산균 유래의 세포밖 베지클은 세포 증식에 영향을 미치지 않고 세포 독성이 없어 안전함을 확인하였다.
시험예 3. 미분화된 대식세포에 미치는 영향 1
상기 실시예 1에서 분리한 유산균 유래의 세포밖 베지클을 미분화된 인체 대식세포 (monocytic THP1)에 처리하였고, 또한 PMA (phorbol 12-myristate 13-acetate)로 분화를 유도하여 대식세포 분화마커들의 발현을 확인하였다.
구체적으로, THP1 세포들을 48시간 동안 10 ㎍/ml EV와 20 nM PMA를 동시에 혹은 개별 처리한 후, 세포들을 수거하여 RNA를 정제하고 cDNA를 합성하였다. 100 ng의 RNA로부터 유래한 cDNA를 qRT-PCR 분석에 이용하였으며 GAPDH 유전자로 결과값을 보정하였다.
그 결과, 도 4에서 보는 바와 같이 분리한 유산균 유래의 세포밖 베지클은 강력한 분화 유도제인 PMA가 없는 상태에서도 대식세포 분화마커들인 CD14, ICAM-1의 발현을 PMA 처리 조건과 유사한 정도로 유도하였고, M1의 마커인 CCR2의 발현을 감소시켰으며, PMA와 동시 처리 시 시너지 효과를 보였다. 즉, 분리한 유산균 유래의 세포밖 베지클은 PMA를 대체할 수 있을 정도로 효과적으로 대식세포 분화를 유도하였다.
시험예 4. 미분화된 대식세포에 미치는 영향 2
상기 실시예 1에서 분리한 유산균 유래의 세포밖 베지클을 미분화된 인체 대식세포 (monocytic THP1)에 처리하여 대식세포의 분화 양상을 확인하였다.
구체적으로, 미분화된 인체 대식세포 (monocytic THP1)에 20 nM PMA을 48시간 동안 먼저 선처리하였다. 10 ㎍/ml EV 혹은 M1, M2 각각의 분화 유도를 위한 사이토카인류들을 추가로 48시간 동안 처리한 후, M1과 M2 각각의 대표적인 유전자 발현을 비교하였다. M1 분화 유도를 위해서는 20 ng/ml IFN-gamma와 10 pg/ml LPS를 처리하였으며, M2 분화 유도를 위해서는 20 ng/ml interleukin 4 (R&D Systems, #204-IL)와 20 ng/ml interleukin 13 (R&D Systems, #213-ILB)을 사용하였다. 이후 각 세포들을 수거하여 RNA를 정제한 후 cDNA를 합성하였다. 100 ng의 RNA로부터 유래한 cDNA가 qRT-PCR 분석에 이용되었으며 GAPDH 유전자로 결과값을 보정하였다.
그 결과, 도 5에서 보는 바와 같이 분리한 유산균 유래의 세포밖 베지클을 미분화된 인체 대식세포에 처리하면 조직 손상 회복 및 재구성 능력이 있는 M2 type의 마커들인 CCL19, CCL20, VEGFA의 발현을 유도하는 반면, M1의 마커인 SOCS3, HLA-DRα의 발현은 감소시켰다. 이로부터 분리한 유산균 유래의 세포밖 베지클은 M2 분화 유도 효과를 보임을 알 수 있었다.
시험예 5. M1 유형 대식세포에 미치는 영향
PMA (phorbol 12-myristate 13-acetate)를 이용하여 M1 유형으로 분화시킨 대식세포에 상기 실시예 1에서 분리한 유산균 유래의 세포밖 베지클을 처리하여 M1 유형 대식세포 마커의 발현량을 확인하였다.
구체적으로, 미분화된 인체 대식세포에 20 nM PMA를 48시간 동안 먼저 선처리한 후, PMA가 있거나 (도 6의 왼쪽 그래프) 없는 조건(도 6의 오른쪽 그래프)에서 다음 실험을 수행하였다. 10 ㎍/ml EV 혹은 M1 유도성 사이토카인 (20 ng/ml IFN-gamma, 10 pg/ml LPS)을 선택적으로 48시간 동안 먼저 처리한 후, 연달아 각각 M1 분화 유도성 사이토카인 혹은 EV를 후속으로 48시간 동안 처리한 후 샘플들을 확보하였다. 세포들을 수거하여 RNA를 정제한 후 cDNA를 합성하였고, 100 ng의 RNA로부터 유래한 cDNA가 qRT-PCR 분석에 이용되었으며 GAPDH 유전자로 결과값을 보정하였다. EV 자체 효과, M1 분화 유도 억제 효과, M1으로 분화된 세포의 역방향 분화 효과를 분석하였다. 도 6의 오른쪽 그래프는 처음에 처리한 PMA를 제거하고 동일한 실험을 수행한 결과이다.
그 결과, 도 6에서 보는 바와 같이 두 조건 모두 M1 대식세포의 마커인 HLA-DR alpha의 발현이 EV의 사전/사후 처리에 의해 줄어드는 것을 확인할 수 있었다. 이로부터, 유산균 유래의 세포밖 베지클은 단핵구 (monocyte)를 대식세포로 분화시킬 수 있고, 그 중 조직 재생에 기여하는 M2 타입으로 분화를 유도하며, 기 분화된 M1 타입도 역분화 (dedifferentiation)시킬 수 있음을 확인하였다.
시험예 6. 면역세포에 미치는 영향 비교
상기 실시예 1에서 분리한 유산균 유래의 세포밖 베지클과 비교예 1에서 준비한 유산균 세포가 면역세포에 미치는 영향을 비교하였다.
구체적으로, THP1 세포의 활성에 미치는 영향을 분석하기 위해서 같은 양의 유산균 유래의 세포밖 베지클와 유산균을 처리하였다. 세포들을 수거하여 RNA를 정제한 후 cDNA를 합성하였다. 100 ng의 RNA로부터 유래한 cDNA가 qRT-PCR 분석에 이용되었으며 GAPDH 유전자로 결과값을 보정하였다.
그 결과, 도 7에서 보는 바와 같이 동일한 양의 유산균 유래의 세포밖 베지클이 유산균 세포 자체에 비해 면역세포의 분화 관련 유전자들의 발현을 유도하거나 억제하는 능력이 높거나 유사한 것으로 나타났다.
시험예 7. 세포 독성 비교
상기 실시예 1에서 분리한 유산균 유래의 세포밖 베지클과 비교예 1에서 준비한 유산균 세포가 세포 독성에 미치는 영향을 비교하였다.
구체적으로, 인체 섬유아세포 Hs68을 5% CO2 배양기에서 37 ℃에서 배양하고 실시예 1에서 분리한 유산균 유래의 세포밖 베지클과 비교예 1에서 준비한 유산균 세포를 각각 1~20 μg/ml로 72시간 동안 처리하였다. 이후, 상등액을 수거하여 LDH 활성을 측정하였다. 세포 독성은 PierceTM LDH Cytotoxicity Assay Kit를 사용하여 제조사의 지시에 따라 측정하였다.
그 결과, 도 8에서 보는 바와 같이 유산균 유래의 세포밖 베지클은 높은 농도로 처리 시 유산균 세포 전체를 이용하였을 때에 비해 세포 독성을 현저하게 완화시켜 일정 농도 이상으로 처리하였을 때 세포 독성으로부터 세포를 보호하는 효과가 우수함을 확인하였다.
본 명세서의 일 측면에 따른 조성물의 제형예를 아래에서 설명하나, 다른 여러 가지 제형으로도 응용 가능하며, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
[ 제형예 1] 연고
하기 표 1에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 연고를 제조하였다.
성분 함량(중량%)
실시예 1의 유산균 유래 세포밖 베지클 2.00
글리세린 8.00
부틸렌글리콜 4.00
유동파라핀 15.00
베타글루칸 7.00
카보머 0.10
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드 3.00
스쿠알란 1.00
세테아릴 글루코사이드 1.50
소르비탄 스테아레이트 0.40
세테아릴 알코올 1.00
밀납 4.00
정제수 잔량
합계 100.00
[제형예 2] 미용액형 제제
하기 표 2에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 미용액형 제제를 제조하였다.
성분 함량(중량%)
실시예 1의 유산균 유래 세포밖 베지클 2.00
히드록시에틸렌셀룰로오스(2% 수용액) 12.00
크산탄검(2% 수용액) 2.00
1,3-부틸렌글리콜 6.00
진한 글리세린 4.00
히알루론산나트륨(1% 수용액) 5.00
정제수 잔량
합계 100.00
[ 제형예 3] 로션
하기 표 3에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 로션을 제조하였다.
성분 함량(중량%)
실시예 1의 유산균 유래 세포밖 베지클 2.00
L-아스코르빈산-2-인산마그네슘염 1.00
수용성 콜라겐(1% 수용액) 1.00
시트르산나트륨 0.10
시트르산 0.05
감초 엑기스 0.20
1,3-부틸렌글리콜 3.00
정제수 잔량
합계 100.00
[제형예 4] 크림
하기 표 4에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 크림을 제조하였다.
성분 함량(중량%)
실시예 1의 유산균 유래 세포밖 베지클 2.00
폴리에틸렌글리콜모노스테아레이트 2.00
자기유화형 모노스테아르산글리세린 5.00
세틸알코올 4.00
스쿠알렌 6.00
트리2-에틸헥산글리세릴 6.00
스핑고당지질 1.00
1,3-부틸렌글리콜 7.00
정제수 잔량
합계 100.00
[제형예 5] 팩
하기 표 5에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 팩을 제조하였다.
성분 함량(중량%)
실시예 1의 유산균 유래 세포밖 베지클 2.00
폴리비닐알코올 13.00
L-아스코르빈산-2-인산마그네슘염 1.00
라우로일히드록시프롤린 1.00
수용성 콜라겐(1% 수용액) 2.00
1,3-부틸렌글리콜 3.00
에탄올 5.00
정제수 잔량
합계 100.00
이상, 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시 태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.
[수탁번호]
기탁기관명 : 한국미생물보존센터
수탁번호 : KCCM11179P
수탁일자 : 20110328
[미생물기탁증]
Figure PCTKR2018011787-appb-I000001
Figure PCTKR2018011787-appb-I000002

Claims (11)

  1. 유산균 유래 세포밖 베지클을 유효성분으로 포함하는 면역조절용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 유산균은 락토바실러스 (Latobacillus) 속 균주인, 면역조절용 조성물.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 락토바실러스 속 균주는 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum)인, 면역조절용 조성물.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 락토바실러스 플란타룸은 기탁번호가 KCCM11179P인 락토바실러스 플란타룸 APsulloc 331261인 것인, 면역조절용 조성물.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 세포밖 베지클은 엑소좀인 것인, 면역조절용 조성물.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 세포밖 베지클은 20 내지 200 nm의 직경을 갖는 것인, 면역조절용 조성물.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물은 M2 유형 대식세포로의 분화를 유도하는 것인, 면역조절용 조성물.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물은 M2 유형 대식세포 분화 마커인 CCL19, CCL20 및 VEGFA로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 발현을 증가시키는 것인, 면역조절용 조성물.
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물은 M1 유형 대식세포 분화 마커인 CCR2, SOCS3 및 HLA-DRα로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 발현을 감소시키는 것인, 면역조절용 조성물.
  10. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물은 화장료 조성물인, 면역조절용 조성물.
  11. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물은 식품 조성물인, 면역조절용 조성물.
PCT/KR2018/011787 2017-10-31 2018-10-05 유산균 유래의 세포밖 베지클을 포함하는 면역조절용 조성물 WO2019088478A1 (ko)

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