KR100874187B1 - 뇌졸중 및 퇴행성 신경질환 예방 및 치료 효과를 갖는복합생약재 추출물을 포함하는 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신경세포 보호활성을 갖는 인삼 추출물, 자오가 추출물, 당귀 추출물 및 황금 추출물로 이루어진 복합생약재 추출물을 포함하는 뇌졸중 및 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료용 조성물 및 복합생약재 추출물의 제조방법에 관한 것으로, 상기 복합생약재 추출물은 뇌허혈에 의해 유도되는 신경세포 손상을 보호하는 효과가 탁월할 뿐만 아니라 인체에 무해하여, 신경세포의 사멸에 의해 발생되는 퇴행성 뇌질환 즉, 뇌졸중, 중풍, 치매, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 피크(Pick)병 및 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeld-Jakob)병 등을 예방 및 치료하기 위한 의약품 및 건강기능식품으로 사용할 수 있다.

Description

뇌졸중 및 퇴행성 신경질환 예방 및 치료 효과를 갖는 복합생약재 추출물을 포함하는 조성물{Composition comprising the extract of crude drug complex having neuroprotective activity for preventing and treating stroke and neurodegenerative diseases}

본 발명은 뇌졸중과 퇴행성 신경질환 예방 및 치료 효과를 갖는 복합생약재 추출물에 관한 것이다.

20 세기에, 인간의 평균 수명이 생명과학과 의학의 빠른 발달로 증가함에 따라, 노령인구 증가가 사회문제로 대두되고 있고 특히 신경계의 치명적인 기능성 질병인 뇌졸중, 알츠하이머 병, 파킨슨 병 등 노인성 신경 질환이 증가하였다.

신경계에서 신경세포의 성장, 분화 및 사멸은 일반적인 발달, 조직기 특이적인 기능의 확립 및 항상성 유지에 각각 중요한 조절 과정이다.

뇌혈관질환은 크게 2가지 형태로 분류될 수 있다. 하나는 뇌출혈 등에서 볼 수 있는 출혈성 뇌질환이고, 다른 하나는 뇌혈관의 폐쇄 등에 의해 나타나는 허혈성 뇌질환이다. 출혈성 뇌질환은 교통사고 등에 의해서 주로 나타나며, 허혈성 뇌 질환은 주로 노령의 사람들에서 자주 나타나는 질환이다.

대뇌에 일시적인 뇌허혈이 유발되는 경우, 산소와 포도당의 공급이 차단되어 신경세포에서는 ATP 감소, 부종(edema)이 발생되며, 결국 뇌의 광범위한 손상이 유발된다. 신경세포의 사멸은 뇌허혈이 있은 후 상당한 시간 경과 후에 나타나는데, 이를 지연성 신경세포사(delayed neuronal death)라고 한다. 지연성 신경세포사는 몽골리안 저빌(Mongolian gerbil)을 이용한 일과성 전뇌 허혈모델(transient forebrain ischemic model)을 통한 실험에서 살펴보면, 5분간 뇌허혈 유도 4일 후 해마(hippcampus)의 CA1 영역에서 신경세포사가 관찰되는 것으로 보고되고 있다(Kirino T, Sano K. Acta Neuropathol., 62, pp201-208, 1984; Kirino T. Brain Res., 239, pp57-69, 1982).

지금까지 가장 많은 사람들이 받아들이는 뇌허혈에 의한 신경세포사 기전으로는 2가지가 있다. 하나는 뇌허혈에 의해서 세포 바깥에 과도한 글루타메이트(glutamate)가 축적되게 되며, 이러한 글루타메이트가 세포내로 유입되어 결국 과도한 세포내 칼슘의 축적으로 신경세포사가 유발된다는 흥분성 신경세포사 기전(Kang TC, et al., J Neurocytol., 30, pp945-955, 2001)과 허혈-재관류시에 갑작스러운 산소 공급으로 인해 생체내 라디칼의 증가로 인해 DNA 및 세포질에 손상을 입어 유발된다는 산화성 신경세포사, 2가지 기전에 있다(Won MH, et al., Brain Res., 836, pp70-78, 1999; Sun AY, Chen YM. J. Biomed. Sci., 5 , pp401-414, 1998; Flowers F, Zimmerman JJ. New Horiz. 6, pp169-180, 1998).

이러한 기전적인 연구를 바탕으로 해서 뇌허혈시에 나타나는 신경세포사를 효과적으로 억제하는 물질을 탐색하거나, 물질에 대한 기전을 밝히는 연구가 많이 수행되고 있다. 그러나 아직까지 효과적으로 뇌허혈에 의한 신경세포사를 억제하는 물질은 거의 없는 실정이다.

지금까지 유일하게 뇌허혈 치료제로 FDA 공인 시판 중인 조직플라즈미겐활성자(tissue plasminogen activator, t-PA)는 혈전용해제로 뇌허혈을 유발시키는 혈전을 녹여 빠른 산소 및 포도당의 공급을 유도하는 물질이다. 따라서 직접적으로 신경세포를 보호하는 것이 아니기 때문에 빠른 사용이 필요하며, 혈전용해제라는 특징 때문에 과량의 사용이나, 자주 사용시에는 혈관벽이 얇아져 결국 출혈성 뇌혈관질환을 유발하게 된다.

또한 초기의 칼슘 유입을 효과적으로 억제하기 위한 칼슘채널 억제제(calcium channel blocker)인 MK-801의 경우 임상적 테스트가 실행이 되었으나 그 부작용으로 인해 약물을 폐기한 바 있다.

한편 국내의 경우, 다수의 천연물질이 뇌졸중 예방에 효과가 있는 건강식품으로 시판되고 있으나 이들 대부분은 과학적인 검증을 거치지 않은 것이 많으며 오히려 건강식품 남용의 원인이 되기도 하여 사회적인 문제가 되고 있다.

따라서, 오랫동안 사용되어 그 안전성이 입증된 천연자원들을 객관적으로 검증하여 뇌질환 치료 및 예방효과를 갖는 천연물질을 개발하고자 하는 노력이 시급히 요구된다.

인삼은 오가피 나무과에 속하는 다년생 약초로서 각종 생리활성을 가지는 사포닌(Saponin)계 유도체 화합물이 주요약효를 가지며, 진세노사이드(Ginsenoside) 의 함량이 품질의 지표가 된다고 보고되고 있다. 한방처방에서는 건위소화약, 정장지사약, 진통진경약으로 되는 처방 등에 사용되며 약리작용으로는 혈당강하작용, 항암효과, 혈청단백 합성 촉진, 항체생산 촉진 작용, 중추 흥분 작용, 항피로작용 등이 있다(Chung B. S. and Shin M. K. HyangyakDaesachcheon, Youngrimsa pp439-444, 1998)

자오가는 가시오가피(AcantIopanax senticosus HARMAS)라고도 하며, 국내에서 오가피 또는 오갈피로 알려져 있으며, 오가피는 두릅나무과로 다수의 종이 있으나 이들 중 가시가 있는 것을 가시오가피라 한다. 동물실험 결과 가시오가피는 심한 혈액순환장애와 산소결핍 증상이 있는 생명체의 저항성을 증진시키는 기능과 효과를 나타내었고, 물리적(추위, 열과 순환운동, 강제적 부동등), 화학적, 생물학적 악영향에 대해서 저항력을 증진시킬 뿐 아니라, 체내의 대량의 항체형성에도 효과를 나타내었다(Chung B. S. and Shin M. K. HyangyakDaesachcheon, Youngrimsa pp433-435, 1998).

당귀 (Angelica sinensis DIELS)는 산형과에 속하는 다년생 약초로서 한방처방에서는 각종 부인과질환, 갱년기 장애, 불임 등을 치료하기 위한 목적으로 사용되었으며, 현재는 부정맥, 허혈성 중풍, 뇌동맥 경화,빈혈, 혈전페새겅 혈관염, 고혈압 및 불면들에 응용되어지고 있다. 약리작용으로는 항혈전작용, 조혈작용, 심장수축억제작용, 혈관이완작용, 혈중지질농도 강하를 통한 죽상동맥경화 억제작용, 면역조절작용, 항암작용 및 항염증작용 등이 보고되고 있다(Chung B. S. and Shin M. K. HyangyakDaesachcheon, Youngrimsa pp406-408, 1998).

황금(Scutellaria baicalensis GEORGI)은 쌍떡잎식물 통화식물목 꿀풀과의 여러해살이풀로 산지의 풀밭에서 자라며, 한국, 중국, 몽골 및 시베리아 동부 등지에 분포한다. 한방에서 뿌리를 해열, 이뇨, 지사, 이담 및 소염제로 이용하며, 약용식물로 재배한다(Chung B. S. and Shin M. K. HyangyakDaesacheon, Youngrimsa pp864-865, 1998).

그러나, 인삼, 자오가, 당귀 및 황금을 포함하는 복합생약재 추출물의 뇌질환 치료효과에 대해서는 참고문헌으로 본문에 삽입된 상기 인용문헌의 어디에도 보고되거나 기재된 바가 없다.

몇가지 생화학적 실험을 통하여 상기 복합 생약재 추출물이 신경 성장 및 분화에 대한 효과를 관찰하고 뇌졸중 및 퇴행성 신경질환의 주 원인인 신경 세포사멸을 억제하는 역할을 하는지 확인하기 위하여 본 발명자들은 동물모델을 사용하여 4가지 감각 운동 기능 테스트를 실시하였고 마지막으로 상기 추출물이 신경 세포사멸을 억제함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 이러한 목적은 하기의 본 발명의 상세한 설명에 의해 보다 명확해질 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인삼, 자오가, 당귀 및 황금을 포함하는 복합생약재 추출물을 유효성분으로 함유하는 신경세포보호에 의해 뇌졸중 및 퇴행성 신경 질환 치료 및 예방용 약학적 조성물을 제공한다.

바람직하게는, 상기 인삼, 자오가, 당귀 및 황금을 포함하는 복합생약재 추출물은 1-5: 2-7: 2-7: 1 보다 바람직하게는 2: 5 : 4: 1의 비율이다.

상기 추출물은 물, 메탄올, 에탄올과 같은 저급 알코올, 바람직하게는 메탄올 또는 그의 혼합물로 식물을 추출하여 수득된 추출물을 포함한다.

본 발명은 생리학적으로 허용가능한 첨가제와 함께 인삼, 자오가, 당귀 및 황금을 포함하는 복합생약재 추출물을 유효성분으로 함유하는 신경세포보호에 의해 뇌졸중 및 퇴행성 신경 질환 치료 및 예방용 건강식품 또는 식품 첨가제를 제공한다.

신경세포사에 의하여 유발되는 퇴행성 뇌질환으로는 뇌졸중, 중풍, 치매, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 피크(Pick)병 및 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeld-Jakob)병이 포함될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 조성물 전체 중량에 대해 상기 추출물을 약 0.01 내지 50% 중량으로 포함할 수 있다.

상기 건강식품은 건강식품, 건강 음료 등으로 만들어질 수 있고 분말, 과립, 정제, 츄잉정, 캡슐, 음료 등으로 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 추출물은 구체적으로 하기 과정에 의해 제조된다.

본 발명의 인삼, 자오가, 당귀 및 황금을 포함하는 복합생약재 추출물은 다음과 같이 제조될 수 있다; 황금을 제외한 건조하고, 자르고, 분쇄하고 5 내지 35 배, 바람직하게는 약 10배 부피의 증류수, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등 또는 그들의 혼합물, 바람직하게는 열수와 혼합한다; 용액은 섭씨 20 내지 100도, 바람직하게는 섭씨 60 내지 100도에서 1 내지 24시간 동안 열수 처리하고 열수, 냉수, 환류추출 추음파 추출을 1 내지 5회, 바람직하게는 2 내지 3회 연속적으로 추출한다; 잔여물은 꿀과 남아있는 건조된 황금에 추가하여 열수와 48 내지 120시간, 바람직하게는 96시간 동안 추가적으로 추출한다; 수득한 추출물은 여과하여 상층액을 수득하여 섭씨 20 내지 100도, 바람직하게는 50 내지 70도에서 회전 증발기로 농축한 후 물, 저급 알코올 또는 그의 혼합물에 용해될 수 있는 복합생약의 건조 추출분말을 수득하기 위해 진공 동결 건조, 열풍건조 또는 분무건조에 의해 건조하고 열풍 건조한다.

본 발명의 또 다른 실시예에서, 본 발명의 생약재 추출물은 다음으로 구성되는 단계를 포함한다; (a) 인삼, 자오가에 약 5내지 25 배, 바람직하게는 2 내지 8배의 증류수,메탄올, 에탄올, 부탄올 등과 같은 저급알코올 또는 그들의 혼합물, 바람직하게는 열수를 추가하여, 섭씨 20도 내지 100도, 바람직하게는 60도에서 100도의 온도에서 1 내지 24시간 환류추출하여 추출물을 수득하고 여과 및 건조하여 농축된 추출물을 수득하는 단계; (b) 백복령 가루 및 꿀을 생지황 즙과 잘 혼합하여 첨가한 다음, 48 내지 120 시간, 바람직하게는 96시간 동안 열수로 추출하면서 황금을 첨가하여 본 발명의 복합생약재 추출물을 수득하는 단계.

따라서, 본 발명은 또한 상기 제조방법에 의한 복합생약재 추출물을 제공한다.

추가적으로 극성 용매 및 비-극성 용매 용해가능한 본 발명의 추출물은 다음의 단계에 과정에 의해 제조될 수 있다; 상기 단계에 의해 제조된 추출물을 물에 현탁하고 1 내지 100, 바람직하게는 1 내지 5 배 부피의 비극성 용매(에틸 아세테이트, 클로로포름, 헥산 등)와 혼합하고; 비극성 용매 용해층을 모아 본 발명의 비극성 용매 용해성 추출물을 수득하고 남아있는 극성 용매 용해성 층은 모아서 물, 저급 알코올 또는 그들의 혼합물에 용해가능한 본 발명의 극성 용매 용해가능 추출물을 수득한다. 또한, 상기 과정은 당업계 통상의 잘 알려진 방법, 예를 들어, 문헌(Harborne J.B., Phytochemical methods: A guide to modern techniques of plant analysis. , 3rd Ed., pp6-7, 1998)에 기재된 방법대로 변형되거나 분획하거나 또는 가능한 분획 또는 화합물을 분리할 수 있다.

상기 복합 생약재 추출물이 MCAo 동물모델에서 발생한 국소뇌허혈에 의한 신경 손성에 효과가 있는지 알아보기 위한 실험을 통하여, 추출물이 국소 뇌허혈에 의한 신경세포사멸을 억제하고 신경보호 활성을 나타냄을 확인하였다.

또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 활성성분으로 신경세포를 보호하여 뇌졸중 및 퇴행성 신경질환 치료 및 예방용 상기 복합 생약재 추출물을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

따라서, 본 발명은 상기 제조방법으로부터 수득되는 신경세포 보호활성을 갖는 복합생약재 추출물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 추가적으로 통상의 담체, 어드쥬반트 또는 희석제를 당업계에 잘알려진 방법을 사용하여 함께 포함할 수 있다. 상기 담체는 용법 및 복용법에 따라 적합한 성분으로 사용되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 적당한 희석제는 레밍턴의 약학(Mack Publishing co, Easton PA) 텍스트에 목록으로 기재되어 있다.

하기의 제제화 방법 및 첨가제는 단지 예일 뿐, 본 발명을 제한하는 것은 아니다.

본 발명에 따른 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체, 어드쥬번트 또는 희석제, 예를 들어, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 포함하는 약학적 조성물로 제공될 수 있다. 제형은 추가적으로, 충전제, 항-응고제, 증량제, 습윤제, 향신료, 붕해제, 방부제 등을 사용하여 조제된다. 본 발명의 조성물은 당업계에 잘 알려진 방법을 이용하여 환자에게 투여 후 활성 성분을 빠르게, 지속적으로, 천천히 방출하도록(속방형, 지속형 서방형, 서방형) 제제화될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 조성물은 일반적으로 주사를 위해 사용되는 기름, 프로필렌글리콜(propylene glycol) 또는 다른 용매에 용해될 수 있다. 담체의 적절한 예는 생리학적 식염수, 폴리프에틸렌 글리콜, 에탄올, 식물성 기름, 이소프로필 미리스테이트 등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 국소 투여를 위해 본 발명의 추출물은 연고나 크림 형태로 제제화될 수 있다.

본 조성물을 포함하는 약학적 제제는 각각 통상의 방법에 따라 산제, 정제, 캡슐제, 연성 캡슐제, 수성 약제, 엘릭시르 필(elixir pill), 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 또는 크림, 연고, 로션, 젤, 밤, 패치, 페이스트, 분무액, 에어로졸 등의 국소 제형 또는 용액, 현탁액, 이멀전 등의 주사 제형으로 제제화될 수 있다.

약학적 복용 형태의 본 발명의 조성물은 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용될 수 있고 또한 단독으로 또는 적당히 함께 사용될 수 있고 다른 약학적으로 활성이 있는 성분과 함께 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물 또는 조성물의 바람직한 복용량은 환자의 상태 및 체중, 심한 정도, 제형, 경로 및 투여기간에 따라 달라질 수 있고 당업계 숙련자에 의해 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 얻기 위해서는 본 발명의 추출물이 1일당 체중 1 kg 당 10 g/kg, 바람직하게는 1 내지 3 g/kg 의 양으로 투여되는 것이 권장된다. 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 복용량은 하루에 한번 또는 몇 회에 나눠서 투여될 수 있다. 조성물에 있어서, 본 발명의 추출물의 양은 전체 조성물의 중량에 대해 0.01 내지 50% 중량, 바람직하게는 0.5 내지 40% 중량으로 포함된다.

본 발명의 약학적 조성물은 다양한 경로를 통해서 포유류와 같은 동물(렛드, 마우스, 사육용 동물 또는 인간)에게 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막, 수막강내, 경막외 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 신경세포 보호활성을 갖는 인삼 추출물, 자오가 추출물, 당귀 추출물 및 황금 추출물로 이루어진 복합생약재 추출물을 포함하는 뇌졸중 및 퇴행성 뇌질환의 예방 및 향상용 건강식품을 제공한다. 건강식품은 상기 추출물 0.01 내지 80 중량 %, 아미노산 0.001 내지 5 중량 %, 비타민 0.001 내지 2 중량 %, 당 0.01 내지 20 중량 %, 유기산 0.001 내지 10 중량 % 및 약학적으로 허용가능한 식품 첨가제인 적당량의 감미료 및 향료를 첨가하여 제조될 수 있다.

상기 복합 생약재 추출물은 신경세포 보호활성에 의해 뇌졸중 및 퇴행성 뇌질환의 예방 및 향상용 식품 및 음료에 첨가될 수 있다.

또한, 본 발명의 추출물은 예를 들어, 분유, 성장기 분유, 성장기 식이와 같은 어린이 및 유아의 식품에 포함시켜 신경세포 보호에 의해 뇌졸중 및 퇴행성 뇌질환을 예방 및 향상시킬 수 있다.

상기 조성물은 음식, 첨가제 또는 음료에 첨가될 수 있는데, 이 때 식품이나 음료 내의 상기 추출물의 양은 일반적으로 건강식품 조성물 전체 식품 질량에 대해 약 0.1 내지 80 w/w %, 바람직하게는 1 내지 50 w/w % 이고 건강 음료 조성물 100㎖에 대해 1 내지 30g, 바람직하게는 3 내지 10 g이다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 기본 성분으로 상기 추출물을 표시된 비율로 포함하고 다른 액체 성분에는 특별한 제한이 없으며 다른 성분은 다양한 방취제 또는 통상의 음료와 같은 천연의 탄수화물일 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 예는 글루코스, 프럭토스 등과 같은 단당류; 말토스, 수크로스 등과 같은 이당류; 텍스트린, 클로덱스트린 등과 같은 통상의 당 및 자일리톨 및 에리스리톨 등과 같은 알코올 당이다. 상기 외에 다른 방취제로서, 타우마틴과 같은 천연 방취제, 레바우디오사이드 A, 글리시리진 등과 같은 스테비아 추출물 및 사카린, 아스파탐 등과 같은 방취제가 유용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 일반적으로 본 발명의 음료 조성물 100㎖에 대해 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 5 내지 12 g일 수 있다.

상기 조성물 외에 다양한 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 상기 외에 다른 성분은 천연 과일 쥬스, 과일 쥬스 음료 및 야채 음료를 제조하기 위한 과일 쥬스일 수 있는데 상기 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용될 수 있다. 성분비는 그다지 중요하지 않으나 일반적으로 본 발명의 조성물 100 w/w % 당 약 0 내지 20 w/w % 이다. 상기 추출물을 포함하는 식품의 예는 다양한 식품, 음료, 껌, 비타민 종합제, 건강 개선 식품 등이다.

본 발명의 조성물은 추가적으로 시트르산, 푸마르산, 아디프산, 착트산, 말산과 같은 유기산, 인산, 인산나트륨, 인산칼륨, 파이로포스페이트, 폴리포스페이트와 같은 인산, 폴리페놀, 케테킨, 알페-토코페롤, 로즈마리 추출물, 비타민 C, 녹차 추출물, 리코리스 뿌리 추출물, 키토산, 탄닌산, 피트산 등과 같은 천연 항-산화물 중 하나 또는 그 이상을 포함할 수 있다.

상기 본 발명의 추출물은 20 내지 90%의 고농도 액체, 분말 또는 과립형일 수 있다.

유사하게 본 발명의 상기 추출물은 추가적으로 적어도 하나의 락토즈, 카세인, 덱스트로주, 글루코스, 수크로스 및 소르비톨을 포함할 수 있다.

본 발명의 추출물은 독성 및 부작용이 없다. 따라서 안전하게 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물, 용도 및 제조에 있어서, 다양한 변형 및 변화가 가능함은 당업계 숙련자에게 자명하다.

도 1은 MCAo 2 시간 후 및 재관류 24시간 후에 TTC로 염색하고 디지털 카메라로 촬영한 결과 뇌경색을 보이는 뇌 절편 사진이고,

도 2는 대조군, 양성 대조군 및 본 발명의 추출물의 흰쥐 MCAo 모델에서 신경보호 활성에 대한 비교그림이고(각각의 검은 점은 각 흰쥐에 대한 개별 값을 나타낸다),

도 3 내지 6은 감각 운동 기능에 대한 본 발명의 추출물의 회복 효과를 나타낸 그림으로서,

도 3은 20시간 째 측정된 로타로드 테스트 결과를 나타낸 그림이고,

도 4는 21시간 째 측정된 근력측정(prehensile traction) 결과를 나타낸 그림이고,

도 5는 22시간 째 측정된 빔 밸런스 테스트 결과를 나타낸 그림이고,

도 6은 MCAo 후 23시간 째 측정된 풋 폴트(foot fault) 테스트 결과를 나타낸 그림이다.

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 복합생약재 추출물의 제조(1)

인삼, 자오가, 당귀 및 황금은 시중에서 구입하여 경희대학교 한의과대학 본초학교실의 검증을 받아 실험에 사용하였다. 먼저 인삼 660 g을 3ℓ의 3차 증류수로 2시간 동안 환류추출한 후 수득된 추출물을 감압농축 및 동결건조기(Spec 3000, Bio-Rad Co. U. S. A.)로 동결건조하여 추출물 200 g을 얻었다. 자오가는 300 g 을 상기와 동일한 방법으로 수행하여 추출물 20 g을 얻었다. 당귀는 350 g으로 추출물 50 g을 얻었다. 황금은 80 g으로 추출물 10 g을 얻었다.

상기의 추출물을 추출하기전의 약재의 용량으로 하여 2:5:4:1의 비율로 하여 혼합하여 하기의 실험에서 시료로 사용하였다.

실시예 2. 복합생약재 추출물의 제조(2)

인삼, 자오가, 당귀 및 황금은 시중에서 구입하여 경희대학교 한의과대학 본초학교실의 검증을 받아 실험에 사용하였다.

인삼, 자오가, 당귀 및 황금 약재를 2:5:4:1의 비율로 혼합하여 혼합약재 1,200g을 3 ℓ의 3차 증류수로 2시간 동안 환류추출하였다. 수득된 추출물을 감압농축 및 동결건조기(Speed Spec 3000, Bio-Rad Co. U. S. A) 동결건조하여 추출물 (163.54 g)을 얻어 시료로 사용하였다.

실험예 1: MCAo 실험 모델

상기 실시예 1에서 수득한 복합생약재 추출물의 신경세포손상 방어 효과를 측정하기 위하여 제아 등(Zea LE., et al., Stroke, 20, pp84-91, 1989)의 방법을 응용한 혈관내 봉합사 삽입법(intraluminal suture method)을 사용하였다.

실험방법은 하기와 같다:

방법

실험동물로 280 g 내외, 8주령의 스프래그 도울리계(Sprague-Dowley) 수컷 흰쥐를 한국 샘타고사에서 구입하여 사료와 물을 충분히 공급하면서 1주일간 실험환경에 적응시킨 다음 실험에 착수하였다.

흰쥐를 70 % N₂O와 30 % O₂가 섞인 혼합가스에 5 %의 아이소프루레인(isoflurane)으로 전신마취를 한 후 한 쪽은 채혈을 위한 주사기를, 다른 한쪽은 혈압측정용 프로브(probe)를 삽입하여 혈압을 관찰하였으며, 채혈을 한 후 혈당 및 혈액가스를 분석하여 관찰하였다. 목 전방 부위 중앙의 피부를 절개하고 오른쪽 경동맥과 외경동맥(ECA)을 주위조직과 신경들로부터 조심스럽게 분리하였다. 외경동맥 분지인 상부갑상선동맥과 후두동맥을 전기소작기로 소작하고 내경동맥의 분지인 익돌근구개동맥을 전기소작하고 외경동맥을 자르고 프로브를 외경동맥에서 내경동맥으로 삽입하였다. 프로브는 4-0 나일론실이 23 mm의 혈관에 대한 접착력을 증가시키기 위해 활성화제로 고형화된 폴리실로산과 같은 실리콘 성분으로 코팅되는 단계에 의해 만들었다. ICA는 코팅된 프로브의 약 10 mm 결찰하여 삽입지점으로부터 20 mm 또는 그 이하에 다다르도록 하여 저항이 느껴지도록 삽입되었다. 프로브는 동시에 폐쇄부전을 막기 위해 동시에 고정하였다. 피부 절개 부위는 다시 봉합하여 흰쥐는 마취된 상태에서 자연스럽게 회복되었다. 삽입된 프로브는 MCA 혈액의 흐름을 방해하여 국소허혈을 유발하였다. 2시간 후에, 흰쥐는 다시 마취되어 경동맥의 혈액 흐름을 제거하기 위해 다시 마취하였다. 그리고나서 22시간 후에, 흰쥐를 희생하여 뇌를 적출하고 뇌조직을 현미경으로 관찰하였다.

체온이 37 ± 0.5℃가 되게 유지하면서 관찰하였다. 꼬리는 절개하고 말단조직은 제거하여 6 개의 뇌 슬라이스를 2mm 두께로 브레인 매트릭스에 의하여 수득하였다. 2%의 트리페닐테트라졸륨 클로라이드(TTC) 용액 적정량을 살린 용액으로 희석하고 9웰 플레이트에 부었다. 브레인 슬라이스를 첨가하고 섭씨 37도에서 30분간 염색하였다. 염색된 조직은 디지털 카메라(Olympus Co. c2500L 모델, USA)로 촬영하였다. 뇌경색 부위의 부피는 OPTIMAS 프로그램(Media Cybernetics Co., 6.51 버전)으로 계산하였다. 부종의 부피를 제외한 우반구의 확한 뇌경색 부위 부피(A)를 측정하기 위해서 뇌경색의 실제 부피는 다음의 수학식 1 및 2로 계산하였다.

뇌경색 비율(%) = (A-B/A)×100

A: 정상 좌반구의 부피(mm³), B: 교정된 뇌경색의 부피 (mm³)

교정된 뇌경색의 부피(mm³)

= (정상 좌반구의 부피) - (손상 반구의 정상 부위 부피)

약물 처리

유발 직후 및 120분에 대조군에는 물을, 시험군에는 상기 실시예 1의 복합생약재 추출물을 시료로 경구투여 하였다. 이 때 뇌동맥의 팽창을 피하고 약물의 용량에 따른 효능을 알아보기 위하여 복합생약재 추출물을 80, 400 및 2000 mg/kg으로 각각 흰쥐 체중 100 g당 0.3 ㎖씩의 부피로 3차 증류수로 희석하여 폐색 2 시간 및 4 시간 후에 두 번 투여하였다. 양성 대조군으로 동물은 동일한 방법으로 45 mg/kg 의 미노사이클린으로 처리하였다.

복합생약재 추출물의 뇌조직 및 뇌신경 보호 효과를 측정한 결과를 도 1 및 2에 나타내었다. 도 1에서 두 뇌조직 절편을 비교하여 보면, 대조군에 비하여 복합생약재 추출물을 투여한 군은 TTC가 염색이 안된 사멸된 부위의 면적이 적고, TTC로 염색되어 흑적색이 된 부위의 면적이 적다는 것을 알 수 있었다. 참고로, TTC로 뇌조직을 염색하면 손상으로 인하여 조직이 사멸한 부위는 흰색으로 염색이 안된 상태로 되며, 정상 부위의 조직은 흑적색인 상태로 된다.

또한, 도 2를 보면, 대조군으로 물 투여군은 뇌경색비율(%)이 34.7 ± 1,77 % 인데 반하여, 양성대조군으로 사용한 미노사이클린을 45 mg/kg 투여시 뇌경색비율은 20.5 ± 2.85 % 였다. 또한, 복합생약재 추출물 80, 400 및 2000 mg/kg 투여시 각각 34.7 ± 4.19 %, 25.6 ± 1.86 % 및 23.4 ± 2.40 %의 뇌조직 손상을 보여 농도 의존적으로 뇌조직 손상에 대한 보호효과를 보였다. 특히 복합생약재 추출물 400 및 2000 mg/kg 투여시 대조군에 비하여 각각 29 % 및 34 %의 신경조직 보호효과를 나타내었으며, 양성대조군인 미노사이클린(minocycline) 45 mg/kg에 비하여 70 및 81 %의 보호효과를 보였다.

실험예 2. 복합생약재 추출물의 감각운동기능 회복 효과

뇌손상은 신체 감각 운동기능 손실도 가져오므로 상기 실시예 1의 복합생약재 추출물의 뇌손상에 의한 균형감각, 운동기능 및 근육조화 등 감각 운동기능 실조에 대한 보호(회복) 효과를 하기와 같은 여러 실험을 통하여 측정해보았다.

문헌에 기재된 잘 알려진 방법을 변형하여 사용하였다.

2-1. 로타로드 테스트(rotarod test)

상기 실시예 1의 복합생약재 추출물이 뇌허혈 유발 20 시간 후 감각운동기능에 미치는 효과를 평가하기 위하여 로타로드 테스트(rotarod test)를 실시하였다. 로타로드 테스트는 뇌손상 모델 특히 중풍 모델이나 척수신경 손상 모델에 있어서 뇌손상과 매우 밀접한 결과를 보이는 테스트 중의 하나로서 감각운동기능 실조를 평가하기에 매우 적합하다. 로타로드 테스트를 위해 바지레사(basile사, 이탈리아)의 로타로드를 사용하였으며 2분에 RPM이 25까지 오르는 가속회전으로 실험에 임하였다. 실험동물로 중풍을 유발한 흰쥐는 봉의 가운데에 균형을 잡게 놓은 후 로드에 회전을 시작한 시간부터 흰쥐가 떨어질 때까지의 시간을 측정하여 평가하였다. 각 흰쥐마다 5회 실시하여 최고 값과 최저 값을 제외한 중간 3개의 값을 평균 내어 데이터로 사용하였다.

도 3에 중풍 유발 후 20 시간에 측정한 로타로드 테스트 결과를 나타내었다. 샴군이 24.7 ± 6.32초(p<0.01), 대조군이 24.7 ± 6.32초 동안 운동한 반면 복합생약재 추출물은 80, 400 및 2000 mg/kg 투여시 각각 15.1 ± 7.14초, 74.1 ± 12.59초 및 63.1 ± 10.08초를 보여 400 mg/kg의 투여용량에서 대조군에 비하여 유의성 있게 감각 운동기능 실조에 대한 보호효과를 나타내었다(P<0.001).

3-2. 프리헨실 트렉션 테스트(prehensile traction test)

상기 실시예 1의 복합생약재 추출물이 뇌허혈 유발 후 21시간에 근육의 근력에 미치는 영향을 평가하기 위하여 웰리스(Wallace. J.E., et al., J. Gerontol., 35, pp364-370, 1980)의 방법을 변형한 프리헨실 트렉션 테스트 (prehensile traction test)를 실시하였다. 이 방법은 흰쥐의 발 근육의 근력을 평가하는데 좋은 방법이다.

먼저, 흰쥐를 3 cm의 사각 봉에 매달리게 하여 떨어질 때까지의 시간을 측정하며, 매번 5회 실시하여 중간의 3개 값을 평균내어 테이터로 사용하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 것처럼, 대조군은 6.6 ± 0.90초를 버틴 반면 복합생약재 추출물은 80, 400 및 2000 mg/kg 투여시 각각 7.2 ± 2.08초, 11.0 ± 1.58초 및 7.0 ± 2.31초를 보여 400 mg/kg의 투여용량에서 대조군에 비하여 유의성있게 운동기능 실조에 대한 보호효과를 나타내었다(P<0.05).

2-3. 균형대 테스트(balance beam test)

상기 실시예 1의 복합생약재 추출물이 뇌허혈 유발 후 22시간에 균형감각에 미치는 효과를 측정하기 위하여 균형대 테스트(balance beam test)를 푸루넨 등(Puurunen K., et al., Neuropharmacology, 40, pp597-606, 2001)의 방법을 약간 변형하여 하기와 같이 실시하였다. 본 테스트는 흰쥐의 균형감각을 측정하여 전정운동(vestibulomotor)의 기능을 측정하는 방법으로 중풍 유발 후 뇌기능 손상을 측정하는 데 좋은 테스트 중의 하나이다.

먼저, 너비 2.5 cm, 길이 122 cm의 나무로 된 봉을 바닥에서 약 42 cm 높이에 걸쳐 놓고, 흰쥐를 중심에 균형을 잡게 놓은 후 30초간 흰쥐의 행동을 보고 3명의 관찰자가 그 점수를 매기는데 점수의 평가기준은 다음과 같다. 0점; 봉에 균형을 잡을 수 없는 상태, 1점; 30 초간 균형을 잡기만 하고 다른 움직임이 없는 상태, 2점; 30 초간 균형을 잡고 봉의 길이 방향으로 몸을 트는 상태, 3점; 2점에 몸을 튼 상태에서 봉의 길이 방향으로 걷되 스텝의 50 % 이상이 미끄러지는 상태, 4 점; 3점에서 50 %이하로 미끄러지는 상태, 5점; 4점에서 1스텝정도 미끄러지는 상태, 6점: 5점에서 미끄러지는 스텝이 없이 자유롭게 걷는 상태로 정하여 실시하였다. 흰쥐마다 매 3회 실시하여 평균값을 데이터로 사용하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 것처럼, 샴군은 3.4 ± 0.39 점, 대조군은 1.5 ± 0.19점을 보인 반면 복합생약재 추출물은 80, 400 및 2000 mg/kg 투여시에 각각 1.6 ± 0.25점, 2.7 ± 0.18점 및 2.1 ± 0.23점을 보여 400의 투여용량에서 대조군에 비하여 유의성있게 운동기능 실조에 대한 보호효과를 나타내었다(P<0.001, P<0.05).

2-4. 풋 포울트 테스트(Foot fault test)

상기 실시예 1의 복합생약재 추출물이 중풍 유발 후 23시간에 운동기능에 미치는 효과를 측정하기 위하여 마크르라프(Markgraf CG., et al., Brain Res., 575, pp238-246, 1992)의 풋 포울트 테스트(Foot fault test)의 방법을 약간 변형하여 하기와 같이 실시하였다. 이 테스트는 중풍 유발 후 운동 조화와 정밀한 운동을 측정하는데 좋은 방법이다.

먼저, 간격이 2.5 cm, 직경 2mm의 철사로 된 너비 23.5 cm, 길이 43.5 cm의 격자를 바닥에서 약 92 cm위에 걸쳐놓고 흰쥐를 중앙에 놓은 다음, 60 초 동안 앞발의 전체의 스텝에서 환측 스텝으로 미끄러져 격자 사이로 빠지는 수의 비율로 3회 실시하여 평균값을 데이터로 사용하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 것처럼 샴군은 16.0 ± 0.14 %(p<0.01) 대조군은 16.6 ± 2.87 %의 풋 슬립(foot slip)을 보인 반면, 복합생약재 추출물은 80, 400 및 2000 mg/kg 투여시 각각 20.5 ± 6.25 %, 10.7 ± 2.25 % (p<0.01) 및 15.4 ± 2.12 %를 보여 400 mg/kg의 투여용량에서 대조군에 비하여 운동기능 실조에 대한 보호경향을 나타내었다.

실험예 3. 급성독성 실험

방법(1)

ICR계 마우스(몸무게 25 ± 5 g)와 스프라그 도올리 랫트(235 ± 10 g, 중앙 실험 동물)를 각각 10마리씩 4군으로 나누어 본 발명의 복합생약재 추출물 각각 250, 500, 1000 및 5000 ㎎/㎏ 및 용매(O.2 ml)를 경구투여한 후 2주간 독성여부를 관찰한 결과 4군 모두에서 사망한 예가 한 마리도 없었고 외견상 대조군과 별다른 증상을 찾아볼 수 없었다.

방법(2)

ICR계 마우스와 스프라그 도올리 랫트를 각각 10마리씩 4군으로 나누어 본 발명의 복합생약재 추출물 각각 25, 250, 500 및 725 ㎎/㎏ 및 용매(O.2 ml)를 경구투여한 후 24시간 동안 독성여부를 관찰한 결과 4군 모두에서 사망한 예가 한 마리도 없었고 외견상 대조군과 별다른 증상을 찾아볼 수 없었다.

실험 결과, 본 발명의 복합생약재 추출물은 급성독성이 거의 없음이 확인되었다.

하기에 본 발명의 복합생약재 추출물을 포함하는 약학조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

복합생약재 추출물 분말 20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

복합생약재 추출물 분말 50 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

복합생약재 추출물 50 mg

결정성 셀룰로오스 100 mg

락토오스 100 mg

마그네슘 스테아레이트 2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

복합생약재 추출물 50 mg

주사용 멸균 증류수 적당량

pH 조절제 적당량

주사제는 활성성분을 용해시키고 pH를 약 7.5까지 조절하고 모든 성분을 2 ml 앰플에 충전하여 멸균하고 통상의 주사제 제조방법에 따라 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

복합생약재 추출물 분말 0.1~80 g

당 5~10 g

시트르산 0.05~0.3%

카라멜 0.005~0.02％

비타민 C　　　　　　　　　　　　　　　　　 　 　0.1~1%

정제수 79~94%

이산화탄소 가스 0.5~82%

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6. 건강 식품의 제조

복합생약재 추출물 분말 1000 ㎎

비타민 혼합물 적정량

비타민 A 아세테이트 70 ㎎

비타민 E 1.0 mg

비타민 B₁ 0.13 mg

비타민 B₂ 0.15 mg

비타민 B6 0.5 mg

비타민 C 0.2 mg

바이오틴 10 mg

아미드 니코틴산 1.7 mg

폴산(Folic acid) 50 mg

칼슘 판토텐산 0.5 mg

미네랄 혼합물 적당량

황산제일철 1.75 mg

산화아연 0.82 mg

마그네슘 카보네이트 25.3 mg

모노포타슘 포스페이트 15 mg

디칼슘 포스페이트 55 mg

포타슘 시트레이트 90 mg

칼슘 카보네이트 100 mg

마그네슘 클로라이드 24.8 mg

상기 비타민 및 미네랄 혼합물은 매우 다양하게 사용될 수 있는데 이는 본 발명의 범주를 벗어나지 않는다.

제제예 7. 건강 음료의 제조

복합생약재 추출물 분말 1000 ㎎

시트르산 1000 ㎎

올리고사카라이드 100 g

아프리콧 농축 2 g

타우린 1 g

증류수 900ml

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 인삼 추출물, 자오가 추출물, 당귀 추출물 및 황금 추출물은 뇌허혈시 발생되는 신경세포사를 저해하는 효과가 탁월할 뿐만 아니라 인체에 무해하여 신경세포의 괴사에 의해 발생되는 퇴행성 뇌질환을 예방 및 치료하기 위한 용도로 사용가능하다.

Claims (5)

1. 신경세포 보호활성을 갖는 인삼 추출물, 자오가 추출물, 당귀 추출물 및 황금 추출물로 이루어진 복합생약재 추출물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료용 약학조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알콜 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 용매에 가용한 추출물인 약학조성물.
3. 제 1항에 있어서, 상기 퇴행성 뇌질환은 뇌졸중, 중풍, 치매, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 피크(Pick)병 또는 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeld-Jakob)병인 것인 약학조성물.
4. 신경세포 보호활성을 갖는 인삼추출물, 자오가 추출물, 당귀 추출물 및 황금 추출물로 이루어진 복합생약재 추출물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 및 개선용 건강기능식품.
5. 제 4항에 있어서, 분말, 과립, 정제, 츄잉정, 캡슐 또는 음료의 형태인 것을 특징으로 하는 건강기능식품.

Images